CN108244099A - 一种大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存的方法。将大泷六线鱼的精液与抗冻液按体积比1∶10的比例混合，混合后经过分步降温处理，最终投入到液氮(‑196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂两部分组成。本发明获得的冻精对于大泷六线鱼人工繁育、种质保存、遗传多样性保护及可持续养殖等方面有着重要意义。
Description
技术领域
本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法。
技术背景
大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)又名欧式六线鱼，俗称黄鱼、黄棒子等，隶属于鲉形目(Scorpaeniformes)、六线鱼科(Hexagrammidae)、六线鱼属(Hexagrammos)。大泷六线鱼属近海冷温性底层鱼类，在我国黄、渤海以及日本、朝鲜和俄罗斯远东诸海都有分布，其肉味鲜美，有“北方石斑”之称。该鱼具有很强的低温耐性，生长迅速，肉质鲜嫩，可以活鱼上市，适宜在北方进行网箱养殖，具有极高的经济价值。近年来，由于养殖规模的不断扩大，加之对大泷六线鱼种质需求的不断扩大，大泷六线鱼的精子冷冻技术急需建立起来。鱼类精液的超低温保存在水产养殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义：可以使种质的长距离运输得以实现，有利于鱼类的杂交、选育以及基因多样性的保护。随着我国经济的飞速发展及海水污染的日益加剧，重要海水养殖优良品种种质保存已成为我国海水养殖业中亟待解决的问题。建立大泷六线鱼精子的超低温冷冻技术，无论是对其遗传多样性的保护，还是开展生物技术育种以及海水养殖业的可持续发展，都有着迫切的需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
将抗冻保护剂EG(乙二醇)与稀释液混合，制成比例为15％的抗冻液，并置于4℃冰箱备用。抗冻液由稀释液、抗冻剂两部分组成。其中，稀释液为NaCl 8g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaHCO3 0.35g/L；抗冻剂为15％(V/V)EG(乙二醇)。
选用1.8ml的冻存管，每管加入100μL鲜活精液，再加入1000μL的提前配制好的抗冻液(混合比1∶10)，随后放入4℃冰箱预冷，使抗冻剂充分渗入细胞中。
将分装后的精液先置液氮罐口下(-4～-10℃)预冷约15～20min，然后迅速降至液氮面上1-2cm处(-160～-180℃)15-20min，再投入液氮中保存)，保存至激活。
将分装保存于液氮中的大泷六线鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时将器皿提至液氮罐口下平衡5min，然后迅速将冻存管拿出，35℃恒温水浴约1min，轻轻摇动使其受温均匀，待只剩一点冰屑时取出。吸取精液，在添加有100μL10％(v/v)胎牛血清(BSA)的过滤海水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析系统(CASA)计算精子运动率等指标。随机取3个视野，检测运动的精子数量占视野中所有精子的比例，经检测解冻后精子运动率与鲜精差异不显著，95％以上的解冻后精子做快速的直线运动。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
一、本发明冷冻保存过程中采用EG作抗冻剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；
二、本发明冷冻保存过程中采用1.8ml冻存管，容积较大，保存精液量大；
三、降温前将抗冻保护剂与稀释液混合，制成混合液，并置于4℃冰箱备用，节省了时间，操作简便易行；
四、精子与抗冻液按比例每管加入100μL鲜活精液，再加入1000μL的抗冻液(混合比1∶10)，放入4℃冰箱预冷，使抗冻剂充分渗入细胞中起保护作用，具有重要生产意义。
五、本发明冷冻保存过程分段降温时，将分装后的精液先置液氮罐口下(-4～-10℃)预冷约15～20min，然后迅速降至液氮面上1-2cm处(-160～-180℃)15-20min，再投入液氮中保存)，保存至激活，适宜的降温速度是精子可以充分脱水同时又可使冷冻精子安全度过“危险温度区”的关键，整个保存过程时间较短；冷冻保存降温程序简便易操作，重复性稳定性好，冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于95％，与鲜精活力差异不显著；
六、本发明冷冻精子从液氮中取出后，解冻时将器皿提至液氮罐口下平衡5min，然后迅速将冻存管拿出，35℃恒温水浴约1min，轻轻摇动使其受温均匀，待只剩一点冰屑时取出，既可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的精子结构损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。
实施例1：
(1)2016年11月，自青岛海域捕获精巢发育良好的活体雄鱼8条，体重每条700g-1000g，用手轻轻挤压腹部有精液流出。将其置于干燥纱布上，蒸馏水冲洗生殖孔三次至无尿液、黏液残留，干净卫生纸擦净，轻轻在腹部沿鱼头至鱼尾方向挤压，将未经污染的精液收集在2ml离心管中。用计算机辅助精子分析系统(CASA)检测精子运动率，选择运动率高于95％的样品进行冷冻保存。
(2)抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂和蒸馏水组成，配置后置于0℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液为：HBSS溶液；抗冻剂浓度为15％EG(V/V)
抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，称取NaCl 8g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaHCO3 0.35g/L，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻液，具体为：取一烧杯加入15mL EG加入容量瓶中定容至100mL。
(3)将上述鲜精与抗冻液以体积1∶10(鲜精∶抗冻液)的比例混合，随后放入4℃冰箱预冷；
(4)将分装后的精液先置液氮罐口下(-4～-10℃)预冷约15-20min，然后迅速降至液氮面上1-2cm处(-160～-180℃)15-20min，再投入液氮中保存)，保存至激活。
(5)将上述精子冷冻保存2周后进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，解冻时将器皿提至盒口下平衡5min，然后迅速将冻存管拿出，35℃恒温水浴约1min，轻轻摇动使其受温均匀，待只剩一点冰屑时取出。
(6)吸取精液，在添加有100μL10％(v/v)胎牛血清(BSA)的过滤海水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标，激活后用显微镜检测冻精运动率(97.16％±1.33％)，平均直线速度、平均曲线速度、平均路径速度分别达到(46.52±15.70)μm/s、(25.08±5.23)μm/s、(42.24±13.61)μm/s，接近鲜精水平。
(7)激活后的冻精在平均直线运动速度，平均曲线运动速度和平均路径运动速度上均与鲜精差异不显著。
实施例2
(1)2015年11-12月份正值大泷六线鱼生殖期，于胶南增养殖站，亲鱼养殖车间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得鲜精。共采集大泷六线鱼50余尾，共计鲜精70ml，显微镜检测活力高于95％，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存；
(2)抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂和蒸馏水组成，配置后置于0℃冰箱预冷，待用；其中，稀释液为NaCl 8g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaHCO3 0.35g/L；抗冻剂浓度为15％EG(V/V)
(3)将上述鲜精与抗冻液以体积1∶10(鲜精∶抗冻液)的比例混合，随后放入4℃冰箱预冷；
(4)将分装后的精液先置液氮罐口下(-4～-10℃)预冷约15～20min，然后迅速降至液氮面上1-2cm处(-160～-180℃)15-20min，再投入液氮中保存，保存待激活。
(5)将上述冷冻保存2周后精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，
解冻时将器皿提至液氮罐口下平衡5min，然后迅速将冻存管拿出，35℃恒温水浴约1min，轻轻摇动使其受温均匀，待只剩一点冰屑时取出。
(6)吸取精液，在添加有100μL10％(v/v)胎牛血清(BSA)的过滤海水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标，激活后在显微镜检测冻精活力高于95％，且90％以上的冻精均作快速的直线运动。
(7)将冻精用于人工授精，受精率、孵化率均在80％以上，苗种成活率与鲜精无显著差异。
Claims (6)
1.一种大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：
将大泷六线鱼的精液与抗冻液按体积比1∶10的比例混合，混合后经过两步降温处理，最终投入到液氮(-196℃)，分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂两部分组成，其中稀释液为NaCl 8g/L，KCl 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，NaHCO30.35g/L溶液；抗冻剂为15％(抗冻剂的终浓度；V/V)EG(乙二醇)。
2.按权利要求1所述的大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：所述抗冻液是将抗冻保护剂与稀释液混合，制成比例为15％EG(V/V)的混合液，并置于4℃冰箱备用。
3.按权利要求1所述的大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：选用1.8ml的冻存管，每管加入100μL鲜活精液，再加入1000μL的抗冻液(混合比1∶10)，随后放入4℃冰箱预冷，使抗冻保护剂充分渗入细胞中。
4.按权利要求1所述的大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存的方法，其特征在于：将分装后的精液先置液氮罐口下(-4～-10℃)预冷约15～20min，然后迅速降至液氮面上1-2cm处(-160～-180℃)15-20min，再投入液氮中保存，保存至激活。
5.按权利要求1所述的大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：将分装保存于液氮中的大泷六线鱼冻精进行解冻，具体方法为：解冻时将器皿提至液氮罐口下平衡5min，然后迅速将冻存管拿出，35℃恒温水浴约1min，轻轻摇动使其受温均匀，待只剩一点冰屑时取出。
6.按权利要求1所述的大泷六线鱼精子高效超低温冷冻保存方法，其特征在于：吸取精液，在添加有100μL10％(v/v)胎牛血清(BSA)的过滤海水中激活，镜检其活力，然后用计算机辅助精子分析(CASA)系统计算精子运动率等指标。
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