CN110367241A - 一种鲤鱼精子保存液及其保存方法和激活方法 - Google Patents

一种鲤鱼精子保存液及其保存方法和激活方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鲤鱼精子保存液及其保存方法和激活方法，保存液包括体积比为1:1.25～2.6的抗冻剂和稀释液，稀释液包含0.9gNaCl、0.05gKCL和1.5g葡萄糖，以水为100mL计；所述抗冻剂为体积比为(2～3)：(2～3)：(1～2)的乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的混合物。保存时将保存液预冷后将精子和保存液混合，预冷后置于液氮的液面上方熏蒸，然后放置于液面上漂浮，最后投入液氮进行保存。激活时则将精子置于35～38℃下水浴10～12s，然后将精子和激活液混合进行洗脱激活。本发明通过优化保存液组分和配比、在添加抗冻剂后对精子进行预冷过渡和解冻激活时缩短水浴时间，大大提高了鲤鱼精子的复活率，有利于渔场提高授精成功率，增加经济效益。

Description

一种鲤鱼精子保存液及其保存方法和激活方法
技术领域
本发明涉及鱼类精子的保存方法，具体涉及一种鲤鱼精子保存液及其保存方法和激活方法。
背景技术
在渔业人工育苗生产过程中，常出现雄雌性成熟不同步，雄雌鱼不同区域，或者有些珍稀鱼种需要建立物种资源库等状况。要解决以上的问题，精子卵子的保存是一个最佳的途径。
超低温冷藏保存分为冰冻法和玻璃化两种。传统冰冻法使用简单、低浓度的抗冷凝剂，程序化缓慢降温来保存生物细胞活性。冰冻法冷藏过程中容易出现冰晶形成，细胞受到高渗透压和冰晶形成的机械损伤。玻璃化超低温冷藏则利用高浓度特殊聚合物和冰阻剂作为保存液，在急速降温时形成无冰晶的、高度粘稠的固体状态。不存在由于传统冰冻冷藏引起的负作用，如细胞内外冰晶形成的机械损伤，细胞外冰晶形成后高强渗透压损伤，而且不需要严格、精密的温度控制。在玻璃状态下，分子平移运动被显著抑制，标志着生物时间的有效终止，从而使100％生物活性也可以无限期保存。但保存液的性质会严重影响玻璃化超低温冷藏法保存细胞的效果，因此，目前对于保存液的研究正在成为热门领域之一。
鲤鱼作为一种比较常见的经济鱼，具有很大市场价值。只需采取一次精液成功保存下来，便可不再饲养或是少饲养公鱼，对于渔场生产而言，可以降低生产成本，提高经济效益。因此，提供一种鲤鱼精子保存液及其保存方法和激活方法具有现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种鲤鱼精子保存液及其保存方法和激活方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：
提供了一种鲤鱼精子保存液，包括体积比为1:1.25～2.6的抗冻剂和稀释液；所述稀释液，包含0.9gNaCl、0.05gKCL和1.5g葡萄糖，以水为100mL计；所述抗冻剂为乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的混合物，乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的体积比为(2～3)：(2～3)：(1～2)。抗冻剂由可渗透和非可渗透的几种溶液组成，弱化了抗冻剂的毒性，提高了精子的活力。
优选地，所述抗冻剂与所述稀释液的体积比为1:1.25。
优选地，所述抗冻剂与所述稀释液的体积比为1:2.6。
优选地，乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的体积比为2:2:1。
优选地，乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的体积比为3:3:2。
本发明还提供了一种鲤鱼精子的保存方法，包括以下步骤：
步骤1：将上述的保存液置于4℃的温度下预冷15～20min；
步骤2：准备鲤鱼精子并将鲤鱼精子和保存液按照1:9的体积比进行混合得到混合液，然后将混合液置于4℃的温度下预冷3～5min，让混合溶液与细胞充分发生作用，防止有的试剂都还没有完全渗透进细胞就直接放入液氮导致细胞冻伤死亡；
步骤3：将混合液置于液氮的液面上方6±2cm的位置熏蒸10～15min，然后放置于液面上漂浮5±1min，最后投入液氮进行保存。
优选地，准备的鲤鱼精子的运动率大于90％。
本发明还提供了一种上述方法保存的鲤鱼精子的激活方法，将上述方法保存的鲤鱼精子于35～38℃的温度下水浴10～12s，然后将鲤鱼精子和激活液混合进行洗脱激活。在解冻激活过程中传统采用的60～90s的时间过长，精子会因环境温度过高而导致死亡，10～12s的时间已经足够精子的解冻。
优选地，鲤鱼精子和激活液的体积比为1:5，所述激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
本发明的有益效果为：本发明通过优化保存液组分和配比、在添加抗冻剂后对精子进行预冷过渡和解冻激活时缩短水浴时间，大大提高了鲤鱼精子的复活率，有利于渔场提高授精成功率，增加经济效益。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：
(1)配制保存液：将0.9gNaCl、0.05gKCL和1.5g葡萄糖加入100mL水中作为稀释液备用；按照1：2.6的体积比将抗冻剂和稀释剂混合制成保存液，置于4℃冰箱预冷15～20min；其中，抗冻剂为乙二醇、蔗糖和DMSO(二甲基亚砜)按照2:2:1的体积比混合制成的混合物。
(2)提取鲤鱼精子：选取性成熟的鲤鱼，取精作为样本，然后放置于显微镜下进行观察筛选，筛选出运动率大于90％的样本作为本实施例的试验样。
(3)将预冷后的保存液和提取的鲤鱼精子的试验样按照9:1的体积比进行混合，搅拌均匀后转移至麦细管中，置于4℃冰箱预冷3～5min，然后置于液氮的液面上方6±2cm的位置熏蒸10～15min，然后置于液氮液面上漂浮5±1min后投入液氮中进行保存。
(4)经过一段时间后，将保存的鲤鱼精子的试验样取出，置于35～40℃的温度下水浴10～12s，然后按照1:5的体积比将鲤鱼精子的试验样与激活液混合进行洗脱激活，其中，激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
重复上述试验3次，得到3份激活后的鲤鱼精子。
实施例2：
(1)配制保存液：将0.9gNaCl、0.05gKCL和1.5g葡萄糖加入100mL水中作为稀释液备用；按照1：1.25的体积比将抗冻剂和稀释剂混合制成保存液，置于4℃冰箱预冷15～20min；其中，抗冻剂为乙二醇、蔗糖和DMSO(二甲基亚砜)按照3:3:2的体积比混合制成的混合物。
(2)提取鲤鱼精子：选取性成熟的鲤鱼，取精作为样本，然后放置于显微镜下进行观察筛选，筛选出运动率大于90％的样本作为本实施例的试验样。
(3)将预冷后的保存液和提取的鲤鱼精子的试验样按照9:1的体积比进行混合，搅拌均匀后转移至麦细管中，置于4℃冰箱预冷3～5min，然后置于液氮的液面上方6±2cm的位置熏蒸10～15min，然后置于液氮液面上漂浮5±1min后投入液氮中进行保存。
(4)经过一段时间后，将保存的鲤鱼精子的试验样取出，置于35～40℃的温度下水浴10～12s，然后按照1:5的体积比将鲤鱼精子的试验样与激活液混合进行洗脱激活，其中，激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
重复上述试验3次，得到3份激活后的鲤鱼精子。
对比例1：
(1)配制保存液：将0.9gNaCl、0.05gKCL和1.5g葡萄糖加入100mL水中作为稀释液备用；按照1：5.9的体积比将抗冻剂和稀释剂混合制成保存液，置于4℃冰箱预冷15～20min；其中，抗冻剂为乙二醇、蔗糖和DMSO(二甲基亚砜)按照5:5:3的体积比混合制成的混合物。
(2)提取鲤鱼精子：选取性成熟的鲤鱼，取精作为样本，然后放置于显微镜下进行观察筛选，筛选出运动率大于90％的样本作为本对比例的试验样。
(3)将预冷后的保存液和提取的鲤鱼精子的试验样按照9:1的体积比进行混合，搅拌均匀后转移至麦细管中，置于4℃冰箱预冷3～5min，然后置于液氮的液面上方6±2cm的位置熏蒸10～15min，然后置于液氮液面上漂浮5±1min后投入液氮中进行保存。
(4)经过一段时间后，将保存的鲤鱼精子的试验样取出，置于35～40℃的温度下水浴10～12s，然后按照1:5的体积比将鲤鱼精子的试验样与激活液混合进行洗脱激活，其中，激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
重复上述试验3次，得到3份激活后的鲤鱼精子。
对比例2：
(1)配制保存液：将0.9gNaCl、0.05gKCL和1.5g葡萄糖加入100mL水中作为稀释液备用；按照1：0.63的体积比将抗冻剂和稀释剂混合制成保存液，置于4℃冰箱预冷15～20min；其中，抗冻剂为乙二醇、蔗糖和DMSO(二甲基亚砜)按照4:4:3的体积比混合制成的混合物。
(2)提取鲤鱼精子：选取性成熟的鲤鱼，取精作为样本，然后放置于显微镜下进行观察筛选，筛选出运动率大于90％的样本作为本对比例的试验样。
(3)将预冷后的保存液和提取的鲤鱼精子的试验样按照9:1的体积比进行混合，搅拌均匀后转移至麦细管中，置于4℃冰箱预冷3～5min，然后置于液氮的液面上方6±2cm的位置熏蒸10～15min，然后置于液氮液面上漂浮5±1min后投入液氮中进行保存。
(4)经过一段时间后，将保存的鲤鱼精子的试验样取出，置于35～40℃的温度下水浴10～12s，然后按照1:5的体积比将鲤鱼精子的试验样与激活液混合进行洗脱激活，其中，激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
重复上述试验3次，得到3份激活后的鲤鱼精子。
对比例3：
采用市面上常用的Kurokura稀释液和抗冻剂作为保存液的组分，并采用传统保存方法进行试验，步骤如下：
(1)提取鲤鱼精子：选取性成熟的鲤鱼，取精作为样本，然后放置于显微镜下进行观察筛选，筛选出运动率大于90％的样本作为本对比例的试验样。
(2)按照1:8.2的体积比将鲤鱼精子的试验样和Kurokura稀释液(将0.36g NaCl，1g KCl，0.022g CaCl2，0.008g MgCl2和0.02g NaHCO3加入至100mL蒸馏水中配制得)混合得到混合液，然后置于4℃冰箱预冷10～30min，按照1：11.5的体积比将DMSO和混合液混合得到总混合液，将总混合液转移至麦细管中；将麦细管置于液氮的液面上方6cm的位置熏蒸15min，然后投入液氮中保存。
(3)经过一段时间后，将保存的鲤鱼精子的试验样取出，置于35～40℃的温度下水浴60～90s，然后按照1:5的体积比将鲤鱼精子的试验样与激活液混合进行洗脱激活，其中，激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
重复上述试验3次，得到3份激活后的鲤鱼精子。
对比例4：
采用市面上常用的Ringer稀释液和抗冻剂作为保存液的组分，并采用传统保存方法进行试验，步骤如下：
(1)提取鲤鱼精子：选取性成熟的鲤鱼，取精作为样本，然后放置于显微镜下进行观察筛选，筛选出运动率大于90％的样本作为本对比例的试验样。
(2)按照1:8.2的体积比将鲤鱼精子的试验样和Ringer稀释液(将0.78g NaCl，0.02g KCl，0.021g CaCl2和0.0021g NaHCO3加入至100mL蒸馏水中配制得)混合得到混合物，然后置于4℃冰箱预冷10～30min，按照1：11.5的体积比将DMSO和混合液混合得到总混合液，将总混合液转移至麦细管中；将麦细管置于液氮的液面上方6cm的位置熏蒸15min，然后投入液氮中保存。
(3)经过一段时间后，将保存的鲤鱼精子的试验样取出，置于35～40℃的温度下水浴60～90s，然后按照1:5的体积比将鲤鱼精子的试验样与激活液混合进行洗脱激活，其中，激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
重复上述试验3次，得到3份激活后的鲤鱼精子。
对比例5：
采用市面上常用的Ringer稀释液和抗冻剂作为保存液的组分，并采用传统保存方法进行试验，步骤如下：
(1)提取鲤鱼精子：选取性成熟的鲤鱼，取精作为样本，然后放置于显微镜下进行观察筛选，筛选出运动率大于90％的样本作为本对比例的试验样。
(2)按照1:8的体积比将鲤鱼精子的试验样和Ringer稀释液(将0.78g NaCl，0.02gKCl，0.021g CaCl2和0.0021g NaHCO3加入至100mL蒸馏水中配制得)混合得到混合液，然后置于4℃冰箱预冷10～30min，按照1:9的体积比将甲醇和混合液混合得到总混合液，将总混合液转移至麦细管中；将麦细管置于液氮的液面上方6cm的位置熏蒸15min，然后投入液氮中保存。
(3)经过一段时间后，将保存的鲤鱼精子的试验样取出，置于35～40℃的温度下水浴60～90s，然后按照1:5的体积比将鲤鱼精子的试验样与激活液混合进行洗脱激活，其中，激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
重复上述试验3次，得到3份激活后的鲤鱼精子。
实施例3：
分别取部分实施例1～2和对比例1～5中3次试验得到的3份激活后的鲤鱼精子置于载玻片上，在显微镜下观察激活后的鲤鱼精子，录得视频，通过软件OpenCASA分析得出每份激活后的鲤鱼精子中运动精子的数量和全部精子的数量，计算其百分比，即复活率，结果如表1所示。
表1鲤鱼精子的复活率
分组 第1次 第2次 第3次
实施例1 75％ 77％ 85％
实施例2 75％ 82％ 85％
对比例1 30％ 33％ 40％
对比例2 0％ 7％ 10％
对比例3 12.4％ 33％ 53.6％
对比例4 50.4％ 60％ 69.6％
对比例5 50％ 55％ 68％
由表1可知，使用本发明配比的保存液以及保存方法和激活方法得到的鲤鱼精子的复活率均高于75％，显著高于传统保存液和保存方法及激活方法所得到的鲤鱼精子。

Claims (9)

1.一种鲤鱼精子保存液，其特征在于，包括体积比为1:1.25～2.6的抗冻剂和稀释液；所述稀释液，包含0.9gNaCl、0.05gKCL和1.5g葡萄糖，以水为100mL计；所述抗冻剂为乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的混合物，乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的体积比为(2～3)：(2～3)：(1～2)。
2.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述抗冻剂与所述稀释液的体积比为1:1.25。
3.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，所述抗冻剂与所述稀释液的体积比为1:2.6。
4.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的体积比为2:2:1。
5.根据权利要求1所述的保存液，其特征在于，乙二醇、蔗糖和二甲基亚砜的体积比为3:3:2。
6.一种鲤鱼精子的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：将权利要求1～5任一项所述的保存液置于4℃的温度下预冷15～20min；
步骤2：准备鲤鱼精子并将鲤鱼精子和保存液按照1:9的体积比进行混合得到混合液，然后将混合液置于4℃的温度下预冷3～5min；
步骤3：将混合液置于液氮的液面上方6±2cm的位置熏蒸10～15min，然后放置于液面上漂浮5±1min，最后投入液氮进行保存。
7.根据权利要求6所述的保存方法，其特征在于，准备的鲤鱼精子的运动率大于90％。
8.一种如权利要求6所述方法保存的鲤鱼精子的激活方法，其特征在于，将权利要求6所述方法保存的鲤鱼精子于35～38℃的温度下水浴10～12s，然后将鲤鱼精子和激活液混合进行洗脱激活。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，鲤鱼精子和激活液的体积比为1:5，所述激活液为质量分数为0.65％的NaCl溶液。
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