DE60103297T2

DE60103297T2 - Verfahren zur kryokonservierung von gewebe oder organen verschieden von blutgefässen mittels vitrifizierung

Info

Publication number: DE60103297T2
Application number: DE60103297T
Authority: DE
Inventors: S. Bijan KHIRABADI; C. Ying SONG; G. Kelvin BROCKBANK
Original assignee: Organ Recovery Systems Inc
Current assignee: Organ Recovery Systems Inc
Priority date: 2000-10-19
Filing date: 2001-10-18
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2021-10-19
Also published as: JP2004511497A; WO2002032225A2; WO2002032225A3; DE60103297D1; EP1326492B1; EP1326492A2; AU1179202A; AU2002211792B2; CA2426169A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Regierung der Vereinigten Staaten besitzt eine bezahlte Lizenz an dieser Erfindung und das Recht, unter bestimmten Umständen vom Patentinhaber die Lizenzierung an Dritte unter angemessenen Bedingungen zu verlangen, wie dieses durch die Bedingungen der Kooperationsübereinkunft Nr. 70NANB7H3071 festgelegt ist, die von der NIST gewährt wurde.
Der Nachschub an lebensfähigem Gewebe und lebensfähigen Zellen für autologe Implantation und heterologe Transplantation (hier nachstehend gemeinsam als Transplantation bezeichnet) und für Studien ist zum Teil durch die Zeit begrenzt, während der ein Gewebe oder ein Organ in lebensfähigem Zustand erhalten werden kann. Ein Verlängern der Zeitspanne, in der ein Gewebe oder ein Organ lebensfähig bleibt, kann die Wahrscheinlichkeit, dass ein spezielles Gewebe oder ein spezielles Organ einen Empfänger oder Forscher in einem lebensfähigen Zustand erreicht, drastisch erhöhen.
Die Transplantation von Gewebe, sei es natürlich oder künstlich hergestellt, einschließlich von vaskularisierten oder avaskulären Geweben, einschließlich aber nicht beschränkt auf Muskel- und Knochenskelettgewebe, wie Knorpelgewebe, Meniskii, Muskeln, Bändern und Sehnen, Haut, cardiovaskulärem Gewebe wie Herzklappen und Myocardium, Neuronalgewebe, Peridontalgewebe, Drüsengewebe, Organgewebe, Langerhans'schen Inseln, Hornhaut, Harnleiter, Harnröhre, Brustgewebe und Organen, ganz oder Teile davon wie Pankreas, Blase, Niere, Leber, Darm und Herz kann von dem Verlängern der Zeitspanne profitieren, während der solche Gewebe und solche Organe lebensfähig bleiben.
Vaskularisierte Gewebe und vaskularisierte Organe, sowohl menschliche als auch tierische, können durch Vitrifikation erfolgreich für die Transplantation gelagert werden. Vorausgesetzt, dass bedeutsame immunologische Probleme gelöst werden, können aus Tieren gewonnene Transplantate eines Tages eine unbegrenzte Versorgung mit vaskularisierten Geweben und vaskularisierten Organen bereitstellen, die vor der Transplantation in einem vitrifizierten Zustand gelagert werden können.
Avaskuläre Gewebe können ebenfalls für die Transplantation verwendet werden. So behandelt z.B. ein auf Kniechirurgie spezialisierter orthopädischer Chirurg im Durchschnitt zwischen 10 und 20 Patienten im Jahr, die traumatische Gelenkflächenknorpelgewebeverletzungen über die gesamte Dicke erlitten haben. Diese Patienten können alle Kandidaten für eine Knorpelgewebeimplantation sein. Etwa 30 % aller Risse des vorderen Kreuzbandes (ACL) sind mit einem Knorpelgewebedefekt über die gesamte Dicke verbunden, der, selbst nach einer Operation, häufig unerkannt bleibt. Es wurde z.B. geschätzt, dass 20,4 % der 392 568 Patienten, die 1996 Knorpelgewebereparaturen erhielten, Kandidaten für ein Knorpelgewebeimplantat waren.
Mit der Zeit verschlimmern sich die meisten Defekte über die gesamte Dicke und führen zu merklichen Behinderungen im Gelenk. Da Knorpelgewebe avaskulär ist, ist das Rekrutieren von Zellen, um das Heilen über einen Teil der Dicke zu unterstützen, schwierig. Im Gegensatz dazu haben Defekte über die gesamte Dicke das Potential für eine teilweise Heilung, wenn Techniken wie Abrasionsarthoplastik eingesetzt werden. Unglücklicherweise resultieren diese Prozeduren im Allgemeinen in mechanisch schlechteren, fibrösen Narben.
Frische osteochondrale Allotransplantate haben sich für die Transplantation als effektiv und funktional erwiesen. Die beschränkte Erhältlichkeit von frischen Allotransplantatgeweben hat jedoch die Verwendung von osteoartikulärem Allotransplantatbänken für die Langzeitlagerung notwendig gemacht. Obwohl Kryokonservierung, die das Einfrieren einschließt, ein bevorzugtes Verfahren zum Lagern von Geweben ist, bis diese gebraucht werden, führen die konventionellen Protokolle zum Tod von 80 bis 100 % der Chondrozyten und zur Beschädigung der extrazellulären Matrix aufgrund von Eisbildung. Diese schädlichen Auswirkungen sind die Haupthindernisse, die ein erfolgreiches klinisches Ergebnis verhindern. Verschiedene Studien unter Verwendung von tierischen Gelenkflächenknorpelgewebemodellen und menschlichen Knorpelgewebebiopsien haben im Anschluss an konventionelle Kryokonservierungsverfahren, die entweder Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Glycerin als Kälteschutzmittel verwenden, nicht mehr als 20 % Chondrozytenlebensfähigkeit gezeigt. Solche Ergebnisse schränken die Möglichkeit der Transplantation oder Implantation von entnommenem Knorpelgewebe stark ein.
Die Niedertemperaturkonservierung von biologischen Geweben und biologischen Organen, d.h. die Kryokonservierung, ist das Objekt eines großen Forschungsaufwands gewesen. Die Kryokonservierung kann durch Einfrieren oder durch Vitrifikati on angegangen werden. Wenn das Organ oder das Gewebe eingefroren wird, können sich in dem Organ oder dem Gewebe Eiskristalle bilden, die dessen Struktur mechanisch zerstören und somit dessen Fähigkeit beschädigen können, richtig zu funktionieren, nachdem es in einen Empfänger transplantiert wurde. Organisierte Gewebe und Organe sind gegenüber mechanischer Beschädigung durch während des Einfrierens gebildeter Eiskristalle besonders anfällig.
Selbst wenn alle Kryokonservierungsvariablen geregelt werden, gibt es eine Grenze, die im Wesentlichen eine Funktion aus Gewebevolumen und Geometrie ist (einschließlich jeglicher damit verbundener Fluide und Verpackungsmaterialien), jenseits derer traditionelle Kryokonservierungsverfahren nicht konsistent funktionieren. So überleben z.B. in kryokonservierten Herzklappen-Allotransplantaten die Blättchenfibroplasten gut (70 bis 90 %), aber weder die endothelialen Zellen noch die Glattmuskelzellen des mit der Klappe verbundenen Aortagewebes überleben. Die Kryokonservierung kann außerdem für isolierte Langerhans'sche Inseln effektiv sein, aber die Konservierung von Inseln in biotechnologisch hergestellten Kapseln kann technisch schwierig sein. Haut ist aufgrund der dünnen flachen Struktur des Gewebes relativ einfach zu konservieren. Es scheint jedoch, dass das Auftauen von hautähnlichen Produkten technisch schwierig sein kann, und zwar aufgrund des engen Fensters für Fehler während des Erwärmens, außerhalb dessen es zu Eiswachstum kommen kann, das zu Gewebebeschädigung führt. In all diesen Beispielen bestehen diese Probleme aufgrund von Eisbildung entweder innerhalb der Zellen, der extrazellulären Matrix, der Kapsel oder im Fall von Herzklappenendothelium aufgrund der Kompression im Lumen der damit verbundenen Arterie.
Im Gegensatz dazu bedeutet Vitrifikation Verfestigung wie in einem Glas, ohne die Bildung von Eiskristallen. Die Prinzipien der Vitrifikation sind bekannt. Im Allgemeinen ist die niedrigste Temperatur, auf die eine Lösung unterkühlt werden kann, ohne dabei einzufrieren, die homogene Keimbildungstemperatur T_h, bei der sich Eiskristalle bilden und wachsen und bei der aus der Lösung ein kristalliner Feststoff gebildet wird. Vitrifikationslösungen weisen eine Glasübergangstemperatur T_g auf, bei der der gelöste Stoff vitrifiziert oder ein nicht kristalliner Feststoff wird. Aufgrund der Kinetik der Keimbildung und des Kristallwachstums ist es für Wassermoleküle effektiv unmöglich, sich bei Temperaturen, die weit unter T_g liegen, für die Kristallbildung auszurichten. Zusätzlich dazu wird beim Abkühlen der meisten verdünnten wässrigen Lösungen auf die Glasübergangstemperatur T_h vor T_g erreicht und die Eiskeimbildung findet statt, was es unmöglich macht, die Lösung zu vitrifizieren. Um solche Lösungen zur Konservierung von biologischen Materialien durch Vitrifikation nutzbar zu machen, ist es daher notwendig, die Eigenschaften der Lösung so zu verändern, dass Vitrifikation anstatt von Eiskristallkeimbildung und von Wachstum stattfindet. Es ist außerdem wichtig, dass jegliche Lebensfähigkeit und Gewebefunktion durch das gesamte Vitrifikationsverfahren beibehalten wird.
Obwohl es allgemein bekannt ist, dass hohe hydrostatische Drücke T_g erhöhen und T_h erniedrigen, ist die Vitrifikation der meisten verdünnten Lösungen durch das Anwenden von Drücken oft unmöglich oder unpraktisch. Insbesondere verursa chen bei vielen Lösungen, die durch das Anwenden von Druck vitrifizierbar sind, die benötigten Drücke unannehmbar schwere Verletzungen an ungeschützten Biomaterialien während deren Vitrifikation. Obwohl es außerdem bekannt ist, dass zahlreiche gelöste Stoffe, wie die normalerweise eingesetzten Kälteschutzmittel wie DMSO, T_g anheben und T_h absenken, nähern sich die Konzentrationen in Lösung an DMSO oder ähnlichen gelösten Stoffen, die hoch genug sind, um die Vitrifikation zu ermöglichen, typischerweise der eutektischen Konzentration und sind im Allgemeinen für biologische Materialien toxisch.
Eine Art von Schädigung, die durch Kälteschutzmittel verursacht wird, ist osmotische Beschädigung. Kryobiologen haben in den 1950er von den osmotischen Effekten der Kälteschutzmittel und der Notwendigkeit gelernt, diese Effekte zu steuern, um eine Beschädigung während des Zugebens und Entfernens von Kälteschutzmitteln zu isolierten Zellen und Geweben zu verhindern. Ähnliche Lektionen wurden gelernt, als die Kryobiologen zu Studien über das Durchspülen von ganzen Organen mit Kälteschutzmitteln überging. Ein Beachten der Prinzipien der Osmose war essentiell, um in den Organen eine Toleranz gegenüber der Zugabe von Kälteschutzmitteln zu induzieren.
Trotz der Anstrengung, die schädlichen osmotischen Effekte von Kälteschutzmitteln zu steuern, werden noch immer Grenzen der Toleranz gegenüber Kälteschutzmitteln beobachtet. Es scheinen echte, inhärente toxische Effekte von Kälteschutzmitteln zu existieren, die von den vorübergehenden, osmotischen Effekten dieser chemischen Mittel unabhängig sind.
Studien der Erfinder und Anderer haben Verfahren untersucht, um die nicht osmotische, inhärente Toxizität von Kälteschutzmitteln zu steuern. Die Ergebnisse zeigen, dass verschiedene Techniken allein oder in Kombination wirksam sein können. Diese schließen Folgendes ein, nämlich (a) die Verwendung von spezifischen Kombinationen von Kälteschutzmitteln, deren Effekte die Toxizitäten untereinander aufheben; (b) das Aussetzen an Kälteschutzmittel in Trägerlösungen, die für diese speziellen Kälteschutzmittel optimiert sind; (c) die Verwendung von nicht durchdringenden Mitteln, die einen Teil der ansonsten benötigten durchdringenden Mittel ersetzen können und somit das Innere der Zelle vor einem Aussetzen an zusätzliche intrazelluläre Mittel schützen; und (d) Minimieren der Zeit, die innerhalb des Konzentrationsbereichs der schnellen zeitabhängigen Toxizität verbracht wird.
Einige dieser Techniken stehen möglicherweise in Konflikt mit der Notwendigkeit, die osmotischen Kräfte zu regeln. So reduziert z.B. ein Erniedrigen der Temperatur die Einfluss- und Ausflussgeschwindigkeit von Kälteschutzmitteln, wodurch deren osmotische Effekte verlängert und intensiviert werden. In ähnlicher Weise maximiert ein Minimieren der Zeit des Aussetzens an Kälteschutzmittel deren mögliche osmotische Effekte. Es muss daher ein Gleichgewicht zwischen dem Steuern der osmotischen Beschädigung und dem Steuern der Toxizität gefunden werden. Mittel zum Erreichen dieses Gleichgewichts sind im US-Patent Nr. 5,723,282 für Fahy et al. beschrieben. Dieses Patent beschreibt jedoch kein spezielles Verfahren, das für Knorpelgewebe oder andere Gewebe zu verwenden ist, für die die Vitrifikation eine mögliche Technik zur verbesserten Kryokonservierung darstellt. Zusätzlich dazu beschreibt dieses Patent auch keine Protokolle zum Abkühlen oder Erwärmen des Organs oder des Gewebes.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Vitrifizieren von Geweben, einschließlich vaskularisierten Geweben und avaskulären Geweben, oder Organen gerichtet, die keine Blutgefäße sind. Das Verfahren weist Folgendes auf, nämlich Eintauchen des Gewebes oder des Organs in ansteigende Konzentrationen einer Kälteschutzmittellösung bei einer Temperatur höher als –5°C bis zu einer für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration; schnelles Abkühlen des Gewebes oder des Organs auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur (T_g); und weiteres Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über der Glasübergangstemperatur auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur, um das Gewebe oder das Organ zu vitrifizieren.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zum Entnehmen eines Gewebes oder eines Organs, das kein Blutgefäß ist, aus dem Zustand der Vitrifikation in einer Kälteschutzmittellösung gerichtet. Das Verfahren weist Folgendes auf, nämlich langsames Erwärmen eines vitrifizierten Gewebes oder Organs in einer Kälteschutzmittellösung auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur; schnelles Erwärmen des Gewebes oder des Organs in der Kälteschutzmittellösung auf eine Temperatur über –75°C und Reduzieren der Konzentration des Kälteschutzmittels durch Eintauchen des Gewebes oder des Organs in abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zum Behandeln von Geweben oder Organen gerichtet, die keine Blutgefäße sind, so dass die Lebensfähigkeit auf einem hohen Level gehalten wird. So stellt die Erfindung z.B. sicher, dass die Zell- und Gewebefunktionen beibehalten werden. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, bei dem im Vergleich zu frischen unbehandelten Kontrollmustern zumindest 50 %, vorzugsweise zumindest 70 %, und besonders bevorzugt mehr als 80 % der Zell- und Gewebefunktionen beibehalten werden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Beispiel einer Vorrichtung zum Durchspülen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
2 zeigt eine Vorrichtung, die zum schnellen Abkühlen von Geweben oder Organen verwendet werden kann.
3 zeigt ein beispielhaftes Abkühlprofil, das durch ein Verbringen einer Glasscintillationsviole 30 mm tief in vorgekühltes 2-Methylbutan und dann in kalte Luft erzeugt wurde, wobei die Vorrichtung von 2 verwendet wurde.
4 zeigt ein beispielhaftes Aufwärmprofil, das durch Verbringen der Glasscintillationsviole in kalte Luft und dann in eine Mischung von 30 % DMSO/H₂O bei Raumtemperatur erzeugt wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Vitrifizieren eines Gewebes oder eines Organs in einer Kälteschutzmittellösung und zum anschließenden Entnehmen des Gewebes oder des Organs aus dem Zustand der Vitrifikation gerichtet. "Gewebe oder Organ", wie hierin verwendet, bedeutet jedes natürliche oder künstlich hergestellte biologische Gewebe oder Organ einschließlich, aber nicht beschränkt auf, vaskularisierte Gewebe und avaskuläre Gewebe, einschließlich vom Muskel- und Knochenskelettgewebe, wie Knorpelgewebe, Meniskii, Muskeln, Bändern und Sehnen, Haut, cardiovaskulärem Gewebe, wie Herzklappen und Myocardium, Neuronalgewebe, Peridontalgewebe, Drüsengewebe, Organgewebe, Langerhans'sche Inseln, Hornhaut, Harnleiter, Harnröhre, Brustgewebe und Organen wie Pankreas, Blase, Niere, Brust, Leber, Darm, Herz und Abschnitte oder Teile davon.
Der Ausdruck "Transplantation", wie er hierin verwendet wird, bedeutet jeden Typ von Transplantation oder Implantation, ob nun autolog, homolog oder heterolog, und ob diese nun direkt oder im Anschluss an ein weiteres Verarbeiten des Gewebes oder des Organs durchgeführt wird.
Der Ausdruck "Vitrifikation", wie er hierin verwendet wird, bedeutet das Verfestigen ohne Bildung von Eiskristallen. Wie hierin verwendet, ist ein Gewebe vitrifiziert, wenn es die Glasübergangstemperatur (T_g) erreicht hat. Der Vorgang der Vitrifikation schließt eine merkliche Erhöhung der Viskosität der Kälteschutzmittellösung ein, wenn die Temperatur erniedrigt wird, so dass Eiskristallbildung und Eiswachstum ge hemmt werden. In der Praxis kann die Vitrifikation oder die glasartige Kryokonservierung selbst in Gegenwart einer kleinen oder begrenzten Menge an Eis erreicht werden, die niedriger ist als die Menge, die Verletzungen am Gewebe verursacht.
"Glasübergangstemperatur", wie hierin verwendet, bedeutet die Glasübergangstemperatur einer Lösung unter den Bedingungen, unter denen das Verfahren durchgeführt wird. Im Allgemeinen wird das erfindungsgemäße Verfahren bei physiologischen Drücken durchgeführt. Es können jedoch höhere Drücke verwendet werden, solange das Gewebe oder das Organ dadurch nicht signifikant beschädigt wird.
"Physiologische Drücke", wie hierin verwendet, bedeutet Drücke, denen Gewebe oder Organe während ihrer normalen Funktion ausgesetzt sind. Der Ausdruck "physiologische Drücke" schließt somit sowohl normale atmosphärische Bedingungen als auch die höheren Drücke ein, denen verschiedene Gewebe wie vaskularisierte Gewebe unter diastolischen und systolischen Bedingungen ausgesetzt sind.
Der Ausdruck "Durchspülen", wie er hierin verwendet wird, bedeutet das Fließen einer Flüssigkeit durch das Gewebe oder das Organ. Techniken zum Durchspülen von Organen und von Geweben sind z.B. im US-Patent Nr. 5,723,282 für Fahy et al. beschrieben.
Der Ausdruck "Kälteschutzmittel", wie er hierin verwendet wird, bedeutet eine Chemikalie, die Bildung von Eiskristallen in einem Gewebe oder in einem Organ minimiert, wenn das Gewebe oder das Organ auf Temperaturen unter 0°C abgekühlt wird und die im Vergleich zu den Auswirkungen des Abkühlens ohne Kälteschutzmittel zu einem Anstieg der Lebensfähigkeit nach dem Erwärmen führt.
"Ein etwa osmotisches Gleichgewicht", wie hierin verwendet, bedeutet, dass zwischen den intrazellulären und den extrazellulären Konzentrationen eines gelösten Stoffs nicht mehr als 10 % Unterschied besteht. Ein Unterschied von nicht mehr als 10 % bedeutet z.B., dass, wenn die extrazelluläre Konzentration 4 M beträgt, die intrazelluläre Konzentration eines gelösten Stoffes zwischen 3,6 und 4,4 M liegt. Vorzugsweise besteht nicht mehr als 5 % Unterschied zwischen den intrazellulären und extrazellulären Konzentrationen.
Die Vitrifikation kann unter Verwendung einer Vielzahl von Kälteschutzmittelmischungen und/oder Bedingungen für das Abkühlen/Erwärmen erreicht werden. Die Schlüsselvariablen sollten für jeden speziellen Zell- oder Gewebetyp und jede Probengröße optimiert werden. Die Auswahl der Kälteschutzmittelmischung und die Equilibrationsschritte, die für die Zugabe und das Entfernen von Kälteschutzmittel ohne unzumutbaren osmotischen Schock notwendig sind, sollten basierend auf den gemessenen Kinetiken der Kälteschutzmittelpermeation in Gewebeproben optimiert werden. Außerdem kann Kryosubstitution eingesetzt werden, um zu verifizieren, dass mit einem gegebenen Protokoll eine eisfreie Konservierung erreicht wurde.
In Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das Gewebe oder das Organ bei einer Temperatur höher als –5°C in ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittellösung eingetaucht. Organe oder Gewebe, die Blutgefäße enthalten, sollten anstatt von oder zusammen mit einem Eintauchen durchspült werden. Die Temperatur liegt vorzugsweise von 0°C bis 15°C, bevorzugter von 0°C bis 10°C. Vorzugsweise wird das Gewebe oder das Organ außerdem mit den ansteigenden Konzentrationen an Kälteschutzmittel durchspült.
Der Anstieg der Konzentration wird vorzugsweise schrittweise durchgeführt. Das bedeutet, das Kälteschutzmittel wird zu der extrazellulären Lösung zugegeben, um eine gewisse Konzentration an Kälteschutzmittel zu erreichen. Nachdem dieser Konzentrationslevel erreicht ist, wird die Konzentration der Lösung für eine Zeitspanne im Wesentlichen beibehalten. Insbesondere wird der Konzentrationslevel im Allgemeinen für eine ausreichende Zeit beibehalten, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht des Gewebes oder des Organs in der Lösung zu erreichen. Um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, wird der Konzentrationslevel im Allgemeinen für zumindest 10 Minuten beibehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Konzentrationslevel für zumindest 15 Minuten beibehalten. Dieser Vorgang wird so häufig wie nötig wiederholt, wobei die Endkonzentration für die Vitrifikation bei physiologischen Drücken, insbesondere unter normalen atmosphärischen Bedingungen, ausreichend ist. Zusätzlich dazu wird das Gewebe oder das Organ im Allgemeinen für nicht mehr als eine Stunde, vorzugsweise für nicht mehr als 30 Minuten auf jedem Konzentrationslevel gehalten.
Im Allgemeinen wird das Gewebe oder das Organ zuerst in eine kälteschutzmittelfreie Lösung eingetaucht. Das Gewebe oder das Organ kann außerdem mit der kälteschutzmittelfreien Lösung durchspült werden. Diese kälteschutzmittelfreie Lösung kann jede Art von Lösung sein, die die zelluläre Integrität unter in vitro-Bedingungen erhält, wie dies durch synthetische physikalische Puffer bei Normaltemperaturen und Organkonservierungslösung bei hypothermischen Temperaturen exemplarisch dargestellt wird. In den meisten Fällen wird die anfängliche kälteschutzmittelfreie Lösung die gleiche sein wie die Trägerlösung, die verwendet wird, um Kälteschutzmittel zu dem Gewebe oder dem Organ zuzugeben und es davon zu entfernen. Die kälteschutzmittelfreie Lösung kann z.B. eine Euro-Collins-Lösung sein, die eine nachfolgend in Tabelle 1 beschriebene wässrige Lösung ist.
Tabelle 1
Andere Beispiele für geeignete wässrigen Lösungen sind in den nachfolgenden Tabellen 2 und 3 beschrieben.
Tabelle 2
Tabelle 3
Das Gewebe oder das Organ wird, nachdem es in eine kälteschutzmittelfreie Lösung eingetaucht wurde, mit oder ohne Durchspülen in eine Lösung eingetaucht, die Kälteschutzmittel enthält. (Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass ein Durchspülen nicht unbedingt benötigt ist.) Eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration liegt im Allgemeinen bei 6,0 bis 9,5 M Kälteschutzmittel, vorzugsweise bei 7 bis 9 M Kälteschutzmittel, bevorzugter bei 8 bis 9 M Kälteschutzmittel. Die Kälteschutzmittellösung kann jede für die Vitrifikation ausreichende Kombination von Kälteschutzmitteln enthalten. Kälteschutzmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Dimethylsulfoxid, Formamid, 1,2-Propandiol, 2,3-Butandiol, Glycerin, Ethylenglykol, N,N-Dimethylformamid und 1,3-Propandiol.
Impermeable Kälteschutzmittel wie Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxyethylstärke können wirksamer sein, biologische Systeme, die mit hohen Geschwindigkeiten abgekühlt werden, zu schützen. Solche Mittel sind häufig große Makromoleküle, die die Eigenschaften der Lösung in einem größeren Ausmaß beeinflussen als von ihrem osmotischen Druck zu erwarten wäre. Einige dieser nicht durchdringenden Kälteschutzmittel haben direkte schützende Wirkungen auf die Zellmembran. Der primäre Wirkungsmechanismus scheint jedoch das Induzieren von extrazellulärer Glasbildung zu sein. Wenn solche Kälteschutzmittel in sehr hohen Konzentrationen verwendet werden, kann die Eisbildung während des Abkühlens auf und des Erwärmens von kryogenischen Temperaturen vollständig eliminiert werden. Impermeable Chemikalien mit nachgewiesener Kälteschutzmittelaktivität schließen Folgendes ein, nämlich Agarose, Dextrane, Glucose, Hydroxyethylstärke, Inositol, Lactose, Methylglucose, Polyvinylpyrrolidon, Sorbit, Saccharose und Harnstoff.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Kälteschutzmittellösung Dimethylsulfoxid, Formamid und 1,2-Propandiol. Die Kälteschutzmittellösung kann z.B. eine Lösung sein, die als VS55 bezeichnet wird. VS55 ist eine Lösung, die 24,2 % w/v (3,1 M) Dimethylsulfoxid, 16,8 % w/v (2,2 M) 1,2-Propandiol und 14,0 % w/v (3,1 M) Formamid in einer Vehikellösung wie Euro-Collins-Lösung enthält. Die Lösung enthält somit etwa 55 % w/v oder 8,4 M Kälteschutzmittel. Die Menge an Dimethylsulfoxid kann von 20 bis 30 % w/v variiert werden. In ähnlicher Weise kann die Menge an 1,2-Propandiol und Formamid jeweils von etwa 10 bis 20 % w/v variiert werden. Die Gesamtmenge an Kälteschutzmittel in der unverdünnten Lösung sollte jedoch bei 45 % w/v bis 60 % w/v, vorzugsweise bei etwa 50 % w/v bis 55 % w/v liegen.
VS55 kann außerdem mit konventionellen Kälteschutzmitteln und/oder natürlichen oder synthetischen Eisblockermolekülen modifiziert werden, wie z.B. Acetamid, Agarose, Alginat, Alanin, Albumin, Ammoniumacetat, Frostschutzproteinen, Butandiol, Chondroitinsulfat, Chloroform, Cholin, Cyclohexandiolen, Cyclohexandionen, Cyclohexantriolen, Dextranen, Diethylenglykol, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Erythrol, Ethanol, Ethylenglykol, Ethylenglykolmonomethylether, Glucose, Glycerin, Glycerinphosphat, Glycerinmonoacetat, Glycin, Glykoproteinen, Hydroxyethylstärke, Inositol, Lactose, Magnesium chlorid, Magnesiumsulfat, Maltose, Mannitol, Mannose, Methanol, Methoxypropandiol, Methylacetamid, Methylformamid, Methylharnstoffen, Methylglucose, Methylglycerin, Phenol, pluronischen Polyolen, Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Prolin, Pyridin-N-Oxid, Raffinose, Ribose, Serin, Natriumbromid, Natriumchlorid, Natriumiodid, Natriumnitrat, Natriumnitrit, Natriumsulfat, Sorbit, Saccharose, Trehalose, Triethylenglykol, Trimethylaminacetat, Harnstoff, Valin und/oder Xylose.
Zusätzlich dazu kann in weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung 1,2-Propandiol durch ähnliche Konzentrationen an 2,3-Butandiol ersetzt werden. In ähnlicher Weise kann Dimethylsulfoxid durch ähnliche Konzentrationen an Glycerin oder Ethylenglykol oder Kombinationen davon ersetzt werden.
Der Träger für die Kälteschutzmittellösung kann jede Art von Lösung sein, die die zelluläre Integrität unter in vitro-Bedingungen erhält. Insbesondere weist der Träger im Allgemeinen langsam durchdringende gelöste Stoffe auf. In VS55 ist die Trägerlösung eine Euro-Collins-Lösung, die 10 mM HEPES enthält. HEPES ist als Puffer enthalten und kann in jeder wirksamen Menge enthalten sein. Zusätzlich dazu können sowohl andere Puffer als auch kein Puffer verwendet werden. Alternative Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die in den zuvor genannten Tabellen 2 und 3 diskutierten Lösungen.
Die Endkonzentration der Spüllösung ist ausreichend, das Gewebe oder das Organ zu vitrifizieren. Die Konzentration der Lösung wird jedoch wie zuvor diskutiert nach und nach angehoben, um diesen Level zu erreichen, vorzugsweise schrittweise. Genauer gesagt wird das Kältemittel zugegeben, um ein gewisses Plateau zu erreichen, was für eine ausreichende Zeit beibehalten wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, insbesondere für zumindest 10 Minuten und vorzugsweise für etwa 15 Minuten. Danach wird weiteres Kälteschutzmittel zugegeben, um die Kälteschutzmittelkonzentration zu erhöhen, die dabei einen für die Vitrifikation ausreichenden Level erreichen kann, aber nicht muss. Wenn dies nicht der Fall ist, wird nach dem Beibehalten der Konzentration für eine ausreichende Zeit, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, weiteres Kälteschutzmittel in einem oder mehreren Schritten zugegeben, um eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration zu erreichen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung gibt es vier Kälteschutzmittelkonzentrationsplateaus, bevor die für die Vitrifikation ausreichende Konzentration erreicht wird. In dieser bevorzugten Ausführungsform gibt es somit sechs Schritte, wobei der erste Schritt eine kälteschutzmittelfreie Lösung verwendet und diesem vier ansteigende Kälteschutzmittelkonzentrationsplateaus und dann eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration folgen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform mit sechs Schritten wird in Schritt 1 kein Kälteschutzmittel verwendet; in Schritt 2 werden 5 bis 20 %, vorzugsweise 10 bis 15 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet; in Schritt 3 werden 15 bis 35 %, vorzugsweise 20 bis 30 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet; in Schritt 4 werden 40 bis 60 %, vorzugsweise 45 bis 55 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet; in Schritt 5 werden 65 bis 85 %, vorzugsweise 70 bis 80 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet und in Schritt 6 wird die Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet, die für die Vitrifikation ausreichend ist. Jeder Kälteschutzmittelkonzentrationsschritt wird für eine ausreichende Zeit beibehalten, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Gewebe oder das Organ bei jedem Schritt mit der Lösung durchspült.
Nachdem das Gewebe oder das Organ in eine Lösung eingetaucht wurde, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel enthält, wird das Gewebe oder das Organ, das in einer Lösung gehalten wird, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel enthält, schnell auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur abgekühlt. Die schnelle Abkühlgeschwindigkeit kann 2,5 bis 100°C pro Minute betragen. Die schnelle Abkühlgeschwindigkeit beträgt im Allgemeinen zumindest 15, 20, 25 oder 30°C pro Minute. Die durchschnittliche Abkühlgeschwindigkeit in diesem Schritt liegt vorzugsweise bei 10 bis 80°C, bevorzugter bei 30 bis 60°C pro Minute, noch bevorzugter bei 35 bis 50°C pro Minute und noch bevorzugter bei 40 bis 45°C pro Minute. Die Temperatur, auf die das Gewebe oder Organ während dieses schnellen Abkühlvorgangs abgekühlt wird, liegt vorzugsweise bei –90 bis –110°C, bevorzugter bei –95° bis –105°C.
Nachdem das Gewebe oder das Organ diesen schnellen Abkühlvorgang erfahren hat, erfährt das Gewebe oder das Organ einen langsamen Abkühlvorgang, bei dem das Gewebe oder das Organ mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 30°C pro Minute, vorzugsweise mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 10°C pro Minute von einer Temperatur über der Glasübergangstemperatur auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur abgekühlt wird, um das Gewebe oder das Organ zu vitrifizieren. Der Abkühlvorgang wird vorzugsweise mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 5°C pro Minute durchgeführt. Vorzugsweise steigt die Abkühlgeschwindigkeit während des gesamten Schritts nicht über 30°C pro Minute, bevorzugter steigt die Abkühlgeschwindigkeit nicht über 10°C pro Minute und noch bevorzugter steigt die Abkühlgeschwindigkeit nicht über 5°C pro Minute. Die Glasübergangstemperatur liegt im Allgemeinen bei etwa –120°C bis –135°C unter normalen atmosphärischen Bedingungen. Das Gewebe oder das Organ kann dann für einen langen Zeitraum bei einer Temperatur unter der Glasübergangstemperatur gelagert werden.
Die erste Abkühlgeschwindigkeit ist im Allgemeinen höher als die zweite Abkühlgeschwindigkeit; die beiden Abkühlgeschwindigkeiten können jedoch in Ausführungsformen gleich sein.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die langsame Abkühlgeschwindigkeit durch ein Verändern der Umgebung, in die der die Lösung enthaltene Behälter verbracht wird, erreicht. In einer besonderen Ausführungsform wird die schnelle Abkühlgeschwindigkeit durch ein Verbringen des Behälters in eine Flüssigkeit wie 2-Methylbutan erreicht, die auf eine Temperatur unter –100°C, vorzugsweise nahe oder unter der Glasübergangstemperatur der zu kühlenden Lösung vorgekühlt wurde. Der Behälter wird dann, um die langsame Abkühlgeschwindigkeit zu erreichen, aus der Flüssigkeit entnommen und in einer gasförmigen Umgebung auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur abgekühlt.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zum Entnehmen eines Gewebes oder eines Organs aus dem Zustand der Vitrifikation in einer Kälteschutzmittellösung gerichtet, und zwar mit oder ohne Durchspülen. Das Verfahren weist das langsame Erwärmen eines vitrifizierten Gewebes oder Organs in der Kälteschutzmittellösung auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur auf. Die langsame Erwärmungsgeschwindigkeit liegt im Allgemeinen unter 50°C pro Minute. Zusätzlich dazu liegt die durchschnittliche Erwärmungsgeschwindigkeit während dieser Stufe im Allgemeinen bei 20 bis 40°C pro Minute, vorzugsweise bei 25 bis 35°C pro Minute. Zusätzlich dazu liegt die Temperatur, auf die das vitrifizierte Gewebe oder Organ langsam erwärmt wird, vorzugsweise bei –90 bis –110°C, besonders bevorzugt bei –95 bis –105°C.
Nachdem das Gewebe oder das Organ diesen langsamen Erwärmungsvorgang erfahren hat, wird das Gewebe oder das Organ schnell auf eine Temperatur über –75°C erwärmt. Die Temperatur sollte ausreichend hoch sein, so dass die Lösung ausreichend flüssig ist, dass das Gewebe oder das Organ daraus entnommen werden kann. Der schnelle Erwärmungsvorgang wird im Allgemeinen mit einer Geschwindigkeit über 80°C pro Minute, vorzugsweise über 100°C pro Minute durchgeführt. Die durchschnittliche Erwärmungsgeschwindigkeit während dieses Schrittes liegt vorzugsweise bei 200 bis 300°C pro Minute, bevorzugter bei 215 bis 250°C pro Minute. Das Gewebe oder das Organ wird bei diesem Vorgang vorzugsweise auf eine Temperatur über –75°C wie über –35°C erwärmt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Gewebe oder das Organ jedoch in diesem Schritt auf eine Temperatur über –5°C, vorzugsweise von –5°C bis +5°C erwärmt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die schnelle Erwärmungsgeschwindigkeit durch ein Verändern der Umgebung, in die der die Lösung enthaltene Behälter verbracht wird, erreicht. In einer besonderen Ausführungsform wird die langsame Erwärmungsgeschwindigkeit durch ein Verbringen des Behälters in eine gasförmige Umgebung mit einer Temperatur über der Temperatur, bei der das Gewebe oder das Organ gelagert wurde, erreicht. Danach wird der Behälter, um die schnelle Erwärmungsgeschwindigkeit zu erreichen, in eine Flüssigkeit wie eine wässrige Lösung von z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO) mit einer Temperatur über –75°C, vorzugsweise über 0°C und besonders bevorzugt mit normalen atmosphärischen Temperaturen verbracht.
Nachdem das Gewebe oder das Organ auf eine Temperatur über –65°C erwärmt wurde, wird die Konzentration des Kälteschutzmittels in der Lösung nach und nach reduziert. Vorzugsweise wird die Kälteschutzmittelkonzentration schrittweise reduziert. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die abnehmenden Kälteschutzmittellösungen durch Eintauchen des Gewebes oder des Organs in eine Reihe von Lösungen mit abnehmender Kälteschutzmittelkonzentration erreicht, um die Elution des Kälteschutzmittels aus dem Gewebe oder dem Organ zu erleichtern. Das Gewebe oder das Organ kann außerdem mit den Lösungen durchspült werden. Die Lösungen weisen im Allgemeinen Temperaturen über –15°C, vorzugsweise von –15 bis +15°C und noch bevorzugter von 0 bis 10°C auf.
Die Kälteschutzmittelkonzentration wird vorzugsweise reduziert, um ein gewisses Plateau zu erreichen, das für eine ausreichende Zeit beibehalten wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, insbesondere für zumindest 10 Minuten und bevorzugt für etwa 15 Minuten. Die Kälteschutzmittelkonzentration wird dann weiter reduziert, was zu einer kälteschutzmittelfreien Lösung führen kann, aber nicht muss. Ist dies nicht der Fall, wird die Kälteschutzmittelkonzentration nach dem Beibehalten der Konzentration für eine ausreichende Zeit, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, wieder in einem oder mehreren Schritten weiter reduziert, um schließlich eine kälteschutzmittelfreie Lösung zu schaffen. Zusätzlich dazu wird das Gewebe oder das Organ im Allgemeinen nicht länger als eine Stunde, vorzugsweise nicht länger als 30 Minuten in jede Lösung eingetaucht.
Um die Kälteschutzmittelkonzentration zu erniedrigen, kann die Kälteschutzmittellösung mit einer Lösung vermischt werden, ähnlich der kälteschutzmittelfreien Lösung, die verwendet wird, um Kälteschutzmittel zu dem Gewebe oder dem Organ zuzugeben. Die Lösung enthält vorzugsweise zumindest einen osmotischen Puffer.
Die Vitrifikationsverfahren der vorliegenden Erfindung resultieren typischerweise im Vergleich zu konventionellen Kryokonservierungstechniken, die Einfrieren einschließen, in einer größeren Anzahl oder einem größeren Prozentsatz von lebensfähigen Zellen in einer Gewebe- oder einem Organprobe. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung ergeben im Allgemeinen Gewebe- oder Organproben mit zumindest 50 % lebensfähigen Zellen. In Ausführungsformen ergeben die Verfahren der vorliegenden Erfindung Gewebe- oder Organproben mit zumindest 60 % lebensfähigen Zellen, z.B. zumindest 80 % Lebensfähigkeit wie z.B. zumindest 90 % Lebensfähigkeit. Die vorliegende Erfindung kann außerdem bezogen auf frische nicht behandelte Kon trollmuster das Beibehalten von zumindest 70 %, vorzugsweise zumindest 80 % der Zellfunktionen und der Transplantatfunktionen ergeben.
"Osmotischer Puffer", wie hierin verwendet, bezeichnet einen nicht durchdringenden extrazellulären gelösten Stoff mit hohem oder niedrigem Molekulargewicht, der den osmotischen Auswirkungen der größeren intrazellulären Konzentration gegenüber den extrazellulären Konzentrationen des Kälteschutzmittels während des Kälteschutzmittelausflussvorgangs entgegenwirkt.
"Nicht durchdringend", wie hierin verwendet, bedeutet, dass die große Mehrheit der Moleküle der Chemikalie nicht in die Zellen des Gewebes oder des Organs eindringt, sondern in der extrazellulären Flüssigkeit des Gewebes verbleibt.
"Osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht", wie hierin verwendet, weisen ein relatives Molekulargewicht von 1.000 Dalton oder weniger auf. Osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Maltose, Kalium- und Natriumfructose-1,6-diphosphat, Kalium- und Natriumlactobionat, Kalium- und Natriumglycerinphosphat, Maltopentose, Stachyose, Mannitol, Saccharose, Glucose, Maltotriose, Natrium- und Kaliumgluconat, Natrium- und Kaliumglucose-6-phosphat und Raffinose. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht zumindest einer ausgewählt aus Mannitol, Saccharose und Raffinose.
"Kälteschutzmittel und osmotische Puffer mit hohem Molekulargewicht", wie hierin verwendet, weisen im Allgemeinen ein relatives Molekulargewicht von mehr als 1.000 bis 500.000 Dalton auf. Osmotische Puffer mit hohem Molekulargewicht schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Hydroxyethylstärke (HES), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Kaliumraffinoseundecaacetat (> 1.000 Dalton) und Ficoll (mehr als 1.000 bis 100.000 Dalton). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der osmotische Puffer mit hohem Molekulargewicht HES, besonders bevorzugt eine mit einem Molekulargewicht von mehr als 450.000.
Die kälteschutzmittelfreie Lösung enthält vorzugsweise weniger als etwa 500 mM eines osmotischen Puffers, bevorzugter von etwa 200 bis 400 mM osmotischen Puffer. Als osmotischer Puffer wird vorzugsweise ein osmotischer Puffer mit niedrigem Molekulargewicht verwendet. Besonders bevorzugterweise ist der osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht Mannitol.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Kälteschutzmittel in sieben Schritten entfernt. In der bevorzugten Ausführungsform liegt in Schritt 1 die Kälteschutzmittelkonzentration bei 40 bis 60 %, vorzugsweise bei 45 bis 55 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration; in Schritt 2 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 30 bis 45 %, vorzugsweise bei 35 bis 40 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration; in Schritt 3 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 15 bis 35 %, vorzugsweise bei 20 bis 30 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration; in Schritt 4 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 5 bis 20 %, vor zugsweise bei 10 bis 15 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration und in Schritt 5 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 2,5 bis 10 %, vorzugsweise bei 5 bis 7,5 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration. In diesen Schritten ist der Rest der Lösung eine kälteschutzmittelfreie Lösung, die einen osmotischen Puffer enthält. In Schritt 6 wird im Wesentlichen das gesamte Kälteschutzmittel entfernt. Der osmotische Puffer wird jedoch beibehalten. In Schritt 7 wird der osmotische Puffer entfernt. Als Alternative können die Schritte 6 und 7 in einem einzigen Schritt kombiniert werden. Das bedeutet, der osmotische Puffer kann zur gleichen Zeit wie der Rest des Kälteschutzmittels entfernt werden. Zusätzlich dazu kann, wenn kein osmotischer Puffer verwendet wird, oder dieser nicht entfernt wird, Schritt 7 eliminiert werden. Jede dieser Konzentrationen wird für eine ausreichende Zeit beibehalten, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Die Temperatur der Reihe von Lösungen liegt im Allgemeinen über –15°C, vorzugsweise bei –15 bis +15°C und bevorzugter bei 0°C bis +10°C. Wenn Schritt 1 begonnen wird, weist das Gewebe oder das Organ eine Temperatur über –75°C, bevorzugt über –65°C auf. Somit wird das Gewebe oder das Organ, wenn die Temperatur des Gewebes oder des Organs unter der Temperatur der Lösung liegt, in die es in Schritt 1 eingetaucht wird, im Schritt 1 des Entfernens des Kälteschutzmittels auf eine Temperatur über –15°C erwärmt.
Das Gewebe oder das Organ kann vor oder nach der Vitrifikation und/oder Devitrifikation weiter verarbeitet werden. So kann das Gewebe oder das Organ z.B. vor und/oder nach der Vitrifikation und Devitrifikation durch Spülverfahren wie die in der US-Patentanmeldung Nr. 09/645525 beschriebenen revitalisiert werden. Die Gewebe oder die Organe können vor der Vitrifikation genetisch behandelt werden und/oder nach der Devitrifikation wiederbehandelt werden, z.B. durch die in Binette F, McQuaid DP, Haudenschild DR, Yaeger PC, McPherson JM, Tubo R, "Expression of a Stable Articular Cartilage Phenotype without Evidence of Hypertrophy by Adult Human Articular Chondrocytes in Vitro", J Orthop Res, Vol. 16, Nr. 2, 1998 und Stone BB, DeFranzo BE, DiCesare C, Rapko SM, Brockbank KGM, Wolfrum JM, Wrenn CA, Grosman JD, "Cryopreservation of Human Articular Cartilage for Autologus Chondrocyte Implantation" präsentiert auf dem 35^th Annual Meeting of Society for Cryobiology, Juli 1998, beschriebenen Verfahren zur Knorpelgewebeverdauung und zellulären Proliferation. Als Alternative dazu können die Gewebe oder die Organe im Wesentlichen direkt nach der Entnahme vitrifiziert werden und/oder im Wesentlichen direkt nach der Devitrifikation transplantiert werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Vaskularisiertes Gewebe
Um das Gewebe zu durchspülen, kann die Vorrichtung zum Durchspülen von 1 verwendet werden. Die Vorrichtung zum Durchspülen weist ein Reservoir 1 (eine 60 cm³-Spritze) auf, die eine Spüllösung 5 enthält und die mit einem Dreiwegehahn mit der Kanüle 2 verbunden ist. Das Reservoir 1 wird auf physiologischen Druck eingestellt. Das Gewebe 3 wird in eine Petrischale 4 (Durchmesser × Höhe, 50 × 15 mm) verbracht, die die Spüllösung 5 enthält. Die Spüllösung 5 im Reservoir 1 und in der Petrischale 4 ist die gleiche und ist vorgekühlt (0°C bis 4°C), und die Petrischale 4 wird während des Spülvorgangs in Eis (0°C bis 4°C) verbracht.
Die verwendete Vitrifikationslösung ist VS55. Die unverdünnte VS55-Lösung wird in sechs aufeinanderfolgenden Schritten eingeführt. Im ersten Schritt wird das Gewebe mit Euro-Collins-Lösung, die den Träger von VS55 bildet, durchspült. In den Schritten 2 bis 5 ist die Menge an unverdünntem VS55 in der Lösung wie folgt: 1/8 VS55, 2/8 VS55, 4/8 VS55 und 6/8 VS55. In jedem Fall besteht der Rest der Lösung aus Euro-Collins-Lösung. Im sechsten Schritt ist die Spüllösung unverdünntes VS55. Die Einwirkzeit für jeden Schritt liegt bei 15 Minuten.
Nach dem Zugeben der Vitrifikationslösung wird das Gewebe schnell unter Verwendung der in 2 dargestellten Vorrichtung abgekühlt. Das Gewebe 3, zusammen mit der Siliconröhre wird in eine Glasscintillationsviole 6 (Durchmesser × Höhe, 25 × 60 mm) verbracht, die 1 ml einer vorgekühlten unverdünnten VS55-Lösung 7 enthält, um die Probe 8 zu bilden. Die Oberfläche der Vitrifikationslösung 7 wird mit 0,7 ml 2-Methylbutan 9 (Isopentan, Schmelzpunkt: –160°C, Dichte: 0,62) bei 0 bis 4°C bedeckt, um eine direkte Berührung mit der Luft zu vermeiden. Ein Thermoelement 10 wird in eine Dummyprobe 11 der Vitrifikationslösung 7 eingerührt und dessen Output wird mit einem Digitalthermometer 12 überwacht. Die Temperatur wird während des gesamten Abkühlvorgangs aufgezeichnet.
Die Vorrichtung zum Abkühlen wird in einem –135°C-Kühlgefrierschrank aufgebaut. Die Abkühlgeschwindigkeiten wer den durch Verbringen der Probe in einen Behälter 13, der vorgekühltes 2-Methylbutan 14 enthält, eingestellt. Die Abkühlgeschwindigkeiten können abhängig von der Tiefe, mit der die Viole in das 2-Methylbutan verbracht wurde, verändert werden (30 mm erzeugen eine Abkühlgeschwindigkeit von 43°C/min; 60 mm erzeugen eine Abkühlgeschwindigkeit von 71°C/min). Durch diese Technik werden die Proben schnell (durchschnittliche Geschwindigkeit = 43 ± 2°C/min) auf –100°C abgekühlt. Die Proben werden dann langsam (durchschnittliche Geschwindigkeit = 3 ± 0,2°C/min) auf –135°C abgekühlt, und zwar durch Entnehmen der Probe aus dem Behälter 13 mit 2-Methylbutan 14 und Abschließen des Abkühlvorgangs durch die Luft in den –135°C-Gefrierschrank. 3 zeigt ein beispielhaftes Abkühlprofil unter Verwendung der Technik des Verbringens der Glasscintillationsviole 30 mm tief in vorgekühltes (–135°C) 2-Methylbutan. Die Probe wird danach für zumindest 24 Stunden in dem –135°C-Gefrierschrank gelagert.
Nachdem sie für 24 Stunden gelagert wurde, wird das Gewebe in zwei Stufen wieder erwärmt, und zwar langsames Erwärmen auf –100°C (durchschnittliche Geschwindigkeit = 30 ± 2°C/min) und schnelles Erwärmen auf –65°C (durchschnittliche Geschwindigkeit = 225 ± 15°C/min). Die langsame Erwärmungsgeschwindigkeit wurde durch ein Verbringen der Probe auf das oberste Fach des –135°C-Gefrierschranks geschaffen und die schnelle Erwärmungsgeschwindigkeit wurde durch ein Verbringen der Glasviole in eine Mischung aus 30 % DMSO/H₂O bei Raumtemperatur geschaffen. 4 zeigt ein beispielhaftes Aufwärmprofil unter Verwendung dieser Technik.
Die VS55-Vitrifikationslösung wird dann in sieben Schritten entfernt, wobei die Vorrichtung zum Durchspülen von 1 verwendet wird. Die Perfusionslösung 5 sowohl im Reservoir 1 als auch in der Petrischale 4 ist die gleiche und ist vorgekühlt (0°C bis 4°C), und die Petrischale 4 wird während des Spülvorgangs in Eis (0°C bis 4°C) verbracht. Somit wird während des ersten Schritts das Gewebe somit weiter auf eine Temperatur zwischen 0°C und 4°C erwärmt.
In allen Schritten außer dem letzten Schritt enthält die Lösung zusätzlich zur Kälteschutzmittellösung 400 bis 200 mM Mannitol. In den Schritten 1 bis 5 ist die Menge an unverdünntem VS55 in der Lösung wie folgt: 4/8 VS55; 3/8 VS55; 2/8 VS55; 1/8 VS55; und 0,5/8 VS55, wobei der Rest der Lösung eine Mannitol-enthaltende Euro-Collins-Lösung ist. (Die 4/8 Stärke VS55-Lösung enthält 400 mM Mannitol und die kälteschutzmittelfreie Euro-Collins-Lösung, die damit vermischt wird, um die Lösungen mit niedrigerer Kälteschutzmittelkonzentration zu bilden, enthält 200 mM Mannitol. Somit wird die Menge an Mannitol, wenn die Menge an VS55 erniedrigt wird, auf 400 bis 200 mM erniedrigt.) In Schritt 6 wird eine Euro-Collins-Lösung verwendet, die 200 mM Mannitol enthält. In Schritt 7 wird eine Euro-Collins-Lösung verwendet, die kein Mannitol enthält. Die Einwirkzeit bei jedem Schritt liegt bei 15 Minuten.
Beispiel 2: Knorpelgewebe
Schweineknorpelgewebe wurde in dieser Studie verwendet. Die Größe der Proben wurde von 100 bis 300 mg und > 300 mg variiert. Die Experimente schlossen frische Kontrollgruppen und Vitrifikationsgruppen ein. Die Gewebelebensfähigkeit wurde unter Verwendung des Alamar Blue-Assays getestet.
Nicht zuchtverwandte Schweine beiderlei Geschlechts, die 30 bis 60 kg wogen, wurden in dieser Pilotstudie ausgewählt. Das Tier wurde gewogen, und dann wurde mit 33 mg/kg Ketamin und 1,1 mg/kg Acepromazin eine Anästhesie induziert und Isofluran in Sauerstoff wurde via einer Gesichtsmaske zugeführt. Nach der Intubation wurde die Anästhesie unter Verwendung von Isofluran in Sauerstoff aufrecht erhalten. Schweineknieknorpelgewebe wurden für die folgenden Studien entnommen.
Vor dem Abkühlen auf eine Temperatur unter 0°C wurden die Knorpelgewebeproben durch Zugeben der Vitrifikationslösung VS55 in sechs Schritten für je 15 Minuten auf Eis (4°C) der Kälteschutzmittelmischung ausgesetzt. Dies wurde in einer Glasscintillationsviole (Durchmesser × Höhe, 25 mm × 60 mm), die Euro- Collins-Lösung enthielt, in aufeinanderfolgenden Schritten erreicht, wobei die Konzentration an Kälteschutzmittel in der Lösung erhöht wurde, bis die Knorpelgewebeproben in unverdünntes VS55 bei 4°C eingetaucht waren. Die Oberfläche der Vitrifikationslösung wurde bei 4°C mit 0,7 ml 2-Methylbutan bedeckt, um eine direkte Berührung mit der Luft zu vermeiden. Die Proben wurden schnell (31°C/min) auf –100°C abgekühlt, gefolgt von einem langsamen Abkühlen (2°C/min) auf –135°C und letztendlich für zumindest 24 Stunden in einen Gefrierschrank bei –135°C gelagert. Jede vitrifizierte Knorpelgewebeprobe wurde in zwei Stufen wieder erwärmt, und zwar langsames Erwärmen auf –100°C (27°C/min) und schnelles Erwärmen auf etwa –35°C (169°C/min). Nachdem die Proben wieder erwärmt waren, wurde das VS55 schrittweise entfernt (sieben Schritte, je 15 Minuten, auf Eis, ausgehend von unverdünntem VS55 und Vermindern der Kälteschutzmittelkonzentration in der Lösung in aufeinanderfolgenden Schritten), um den osmotischen Schock für die Zellen zu minimieren.
Der Alamar Blue-Assay wurde als nicht zellspezifischer Lebensfähigkeitsassay verwendet. Der Assay wurde verwendet, um das Zellüberleben im Anschluss an die Gewinnung (frisch) und die Vitrifikationsbehandlung zu bestimmen. Er weist einen wasserlöslichen fluormetrischen Lebensfähigkeitsindikator basierend auf der Detektion von metabolischer Aktivität auf, genauer gesagt einen Reduktions-Oxidations(REDOX)-Indikator, der als Antwort auf die durch den Zellmetabolismus erzeugte chemische Reduktion des Wachstumsmediums sowohl fluoresziert als auch seine Farbe ändert. Der REDOX-Indikator hat den zusätzlichen Vorteil, dass er für Zellen minimal toxisch ist, und dies ermöglicht es, mit dem gleichen Probenmuster mehrfache Tests durchzuführen. Aliquots des Mediums von Gewebeproben, die, bevor sie in Wells von Mikrotiterplatten verbracht wurden, 3 bis 6 Stunden mit Alamar Blue-Arbeitslösung inkubiert wurden, wurden auf einem Mikrotiterplattenspektrofluorometer bei 590 nm ausgelesen. Die Daten wurden auf das Gewicht der Gewebeproben normalisiert und sind in Prozent als Durchschnitt ± 1 se Alamar Blue-Fluoreszenzintensität für 11 oder mehr Wiederholungsproben von unbehandelten Kontrollmustern angegeben.
Die Resultate dieser Pilotstudie sind in der nachstehenden Tabelle 4 zusammengefasst. Die Lebensfähigkeit ist in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) bezogen auf die Feuchtgutmasse des Knorpelgewebes (Durchschnitt ± SEM) ausgedrückt. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Fmax-Mikro plattenlesegeräts mit einer Anregungswellenlänge von 544 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm ausgelesen. N = 15, frische Kontrollmuster; n = 11, vitrifiziert. Es ist zu sehen, dass das durchschnittliche Zellüberleben von vitrifiziertem Knorpelgewebe, im Vergleich mit frischen Kontrollmustern (29,65 ± 3,04) bei etwa 91,5 % (27,13 ± 6,64) lag. Diese Studie zeigte, dass die verbesserte Zellerholung in dem vitrifizierten Knorpelgewebe zeigt, dass dieser Ansatz für die Cryokonservierung eine ermutigende Lösung für die Langzeitlagerung von Knorpelgeweben bietet.
Tabelle 4
Dieses Beispiel unter Verwendung eines neuartigen Vitrifikationsansatzes zeigt, dass durch Verwenden von glasartiger Cryokonservierung von Knorpelgewebe ein dramatisch verbessertes Zellüberleben erreicht wurde. Im Gegensatz dazu wurde von anderen Forschern berichtet, dass konventionelle Cryokonservierung von Knorpelgewebe die Anzahl von lebensfähigen Zellen, die durch Collagenase-/Trypsinverdauung aus dem Gewebe herausgelöst wurden, auf weniger als 20 % des frischen Kontrollmustergewebes (Bereich 0 bis 20 %) reduzierte. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass vitrifiziertes Knorpelgewebe konventionell cryokonserviertem Knorpelgewebe merklich überlegen ist. Dieses Beispiel deutet an, dass die höhere Zellerholung in intaktem Gelenkflächenknorpelgewebe ein direktes Ergebnis des Vermeidens von Eisbildung ist und bestätigt die bekannten Mechanismen von Cryoverletzung in multizellulären Geweben.
Beispiel 3: Weitere Gewebe
Schweine wurden als Tiermodell als Quelle für verschiedene Gewebe ausgewählt, um die Eignung der Vitrifikation für die Langzeitlagerung von Geweben zu testen. Die Probengrößen wurden von < 100 mg und 100 bis 300 mg variiert. Diese Pilotexperimente schlossen frische Kontroll- und Vitrifikationsgruppen ein. Die Gewebelebensfähigkeit wurde unter Verwendung des Alamar Blue-Assays getestet.
Nicht zuchtverwandte Schweine von beiderlei Geschlechts, die 30 bis 60 kg wogen, wurden in diesem Experiment ausgewählt. Das Tier wurde gewogen, und danach wurde mit 33 mg/kg Ketamin und 1,1 mg/kg Acepromazin eine Anästhesie induziert, und Isofluran in Sauerstoff wurde via einer Gesichtsmaske zugeführt. Nach der Intubation wurde die Anästhesie unter Verwendung von Isofluran in Sauerstoff aufrecht erhalten. Schweineherzklappen, Myocardium, Haut und Hornhäute wurden für die anschließenden Studien entnommen.
Vor dem Abkühlen auf Temperaturen unter 0°C wurden die Gewebeproben durch Zugeben der Vitrifikationslösung VS55 in sechs Schritten für je 15 Minuten auf Eis (4°C) der Kälteschutzmittelmischung ausgesetzt. Dies wurde in einer Glasscintillationsviole (Durchmesser × Höhe, 25 × 60 mm), die Euro-Collins-Lösung enthielt, in aufeinanderfolgenden Schritten erreicht, wobei die Konzentration an Kälteschutzmittel in der Lösung erhöht wurde, bis die Proben in unverdünntem VS55 bei 4°C eingetaucht waren. Die Oberfläche der Vitrifikationslösung wurde bei 4°C mit 0,7 ml 2-Methylbutan bedeckt, um eine direkte Berührung mit der Luft zu vermeiden. Die Proben wurden schnell (20°C/min) auf –100°C abgekühlt, gefolgt von einem langsamen Abkühlen (2°C/min) auf –135°C und letztendgültig für zumindest 24 Stunden in einem Gefrierschrank bei –135°C gelagert. Jede vitrifizierte Probe wurde in zwei Stufen wieder erwärmt, und zwar langsames Erwärmen auf –100°C (26°C/min) und schnelles Erwärmen auf etwa –35°C (216°C/min). Nachdem die Proben wieder erwärmt waren, wurde das VS55 schrittweise entfernt (sieben Schritte, je 15 Minuten, auf Eis, ausgehend von unverdünntem VS55 und Vermindern der Kälteschutzmittelkonzentration in der Lösung in aufeinanderfolgenden Schritten), um den osmotischen Schock für die Zellen zu minimieren.
Der Alamar Blue-Assay wurde als nicht zellspezifischer Lebensfähigkeitsassay eingesetzt. Dieser Assay wurde dazu verwendet, um das Zellüberleben im Anschluss an die Gewinnung (frisch) und die Vitrifikationsbehandlung zu bestimmen. Aliquots des Mediums von Gewebeproben, die, bevor sie in Wells von Mikrotiterplatten verbracht wurden, 2 bis 24 Stunden mit Alamar Blue-Arbeitslösung inkubiert wurden, wurden auf einem Mikrotiterplattenspektrofluorometer bei 590 nm ausgelesen. Die Daten wurden auf das Gewicht der Gewebeproben normalisiert und sind in Prozent als Durchschnitt ± 1 se Alamar Blue-Fluoreszenzintensität für 6 oder mehr Wiederholungsproben von unbehandelten Kontrollmustern angegeben.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Die Lebensfähigkeit ist in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) bezogen auf die Feuchtgutmasse der Gewebe (Durchschnitt ± SEM) ausgedrückt. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines Fmax-Miktroplattenlesegerätes mit einer Anregungswellenlänge von 544 nm und einer Emissionswellenlänge von 590 nm ausgelesen. Es ist zu sehen, dass die durchschnittliche Lebensfähigkeit von vitrifizierten Geweben im Vergleich mit frischen Kontrollmustern bei etwa 73 % (Bereich von 61 % bis 88 %) lag. Diese Beispiele zeigen, dass die verbesserte Zellerholung in den vitrifizierten Geweben zeigt, dass dieser Ansatz für die Cryokonservierung eine ermutigende Lösung für die Langzeitlagerung von Geweben bietet.
Tabelle 5

Claims

Verfahren zur Vitrifikation eines natürlichen oder eines künstlich hergestellten Gewebes oder Organs, das kein Blutgefäß ist, das Folgendes aufweist, nämlich (i) Eintauchen des Gewebes oder des Organs, das kein Blutgefäß ist, in eine Reihe von Lösungen, die ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration zu erreichen, wobei jede Lösung der Reihe von Lösungen eine Temperatur über –15°C aufweist; (ii) Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur in einer Lösung, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel aufweist, mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 2,5 bis 100°C pro Minute und (iii) weiteres Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur, die zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur liegt, auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 30°C pro Minute, um das Gewebe oder Organ zu vitrifizieren.
Verfahren zum Entnehmen eines Gewebes oder eines Organs, das kein Blutgefäß ist, aus dem Zustand der Vitrifikation in einer Lösung, die Kälteschutzmittel aufweist, das Folgendes aufweist, nämlich (a) Erwärmen des vitrifizierten Gewebes oder des Organs, das kein Blutgefäß ist, in der Kälteschutzmittel enthaltenden Lösung auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 20 bis 40°C pro Minute; (b) weiteres Erwärmen des Gewebes oder des Organs in der Lösung auf eine Temperatur über –75°C mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 200 bis 300°C pro Minute, wobei bei dieser Temperatur die Lösung ausreichend flüssig ist, so dass das Gewebe oder Organ daraus entnommen werden kann; und (c) Eintauchen des Gewebes oder Organs in eine Reihe von Lösungen, die abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um ein Gewebe oder ein Organ in einer kälteschutzmittelfreien Lösung zu erhalten.
Verfahren zur Vitrifikation eines Gewebes oder eines Organs, das kein Blutgefäß ist, und anschließend Entnehmen aus dem Zustand der Vitrifikation, das Folgendes aufweist, nämlich (i) Eintauchen des Gewebes oder des Organs, das kein Blutgefäß ist, in eine Reihe von Lösungen, die ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration zu erreichen, wobei jede Lösung der Reihe von Lösungen eine Temperatur über –15°C aufweist, (ii) Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur in einer Lösung, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel aufweist mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 2,5 bis 100°C pro Minute; (iii) weiteres Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur, die zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur liegt, auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 30°C pro Minute um das Gewebe oder Organ zu vitrifizieren; (a) Erwärmen des vitrifizierten Gewebes oder Organs auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 20 bis 40°C pro Minute; (b) weiteres Erwärmen des Gewebes oder Organs auf eine Temperatur über –75°C mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 200 bis 300°C pro Minute; und (c) Eintauchen des Gewebes oder Organs in eine Reihe von Lösungen, die abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um ein Gewebe oder Organ in einer kälteschutzmittelfreien Lösung zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von zumindest 10°C pro Minute durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von zumindest 15°C pro Minute durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von zumindest 20°C pro Minute durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 10 bis 80°C pro Minute durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 30 bis 60°C pro Minute durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur, die zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur liegt, auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 10°C pro Minute durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur, die zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur liegt, auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur mit einer niedrigeren Geschwindigkeit durchgeführt wird als die Geschwindigkeit des Abkühlens des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei das Abkühlen des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur, die zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur liegt, auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur mit der gleichen Geschwindigkeit durchgeführt wird wie die Geschwindigkeit des Abkühlens des Gewebes oder des Organs von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei der Schritt (i) des Eintauchens Folgendes aufweist, nämlich Eintauchen des Gewebes oder des Organs in eine kälteschutzmittelfreie Lösung; Eintauchen des Gewebes oder des Organs in zumindest eine Lösung, die Kälteschutzmittel in einer Konzentration aufweist, die geringer ist als die für die Vitrifikation ausreichende Konzentration; und Eintauchen des Gewebes oder des Organs in eine Lösung, die Kälteschutzmittel in der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in jedem der Schritte des Schritts (i) des Eintauchens das Gewebe oder das Organ für eine ausreichende Zeit in die Lösung eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in jedem der Schritte des Schritts (i) des Eintauchens das Gewebe oder das Organ für zumindest 10 Minuten in die Lösung eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der zweite Schritt des Schritts (i) des Eintauchens Folgendes aufweist, nämlich Eintauchen des Gewebes oder des Organs in eine Reihe von vier Lösungen, die ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, wobei jede von diesen eine Kälteschutzmittelkonzentration aufweist, die geringer ist als die für die Vitrifikation ausreichende Konzentration.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Gewebe oder das Organ für eine ausreichende Zeit in jede Lösung der Reihe von vier Lösungen eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Gewebe oder das Organ für zumindest 10 Minuten in jede Lösung der Reihe von vier Lösungen eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die vier ansteigenden Konzentrationen wie folgt sind, nämlich 5 bis 20 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration; 15 bis 35 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration; 40 bis 60 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration; und 65 bis 85 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, wobei die für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration zwischen 6 und 9,5 M liegt.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Gewebe oder das Organ mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 200 bis 300°C pro Minute auf eine Temperatur über –35°C erwärmt wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei jede Lösung der Reihe von Lösungen in Schritt (c) eine Temperatur von über –15°C aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei bei jedem Eintauchen in Schritt (c) das Gewebe oder das Organ auch mit der Lösung durchspült wird.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Gewebe oder das Organ in Schritt (c) für eine ausreichende Zeit in jede Lösung der Reihe von Lösungen eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Gewebe oder das Organ in Schritt (c) in eine Reihe von sechs Lösungen eingetaucht wird, die abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, wobei die sechste Lösung kälteschutzmittelfrei ist.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Gewebe oder das Organ für eine ausreichende Zeit in jede Lösung der Reihe von sechs Lösungen eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 24, wobei das Gewebe oder das Organ für zumindest 10 Minuten in jede Lösung der Reihe von Lösungen eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei die Kälteschutzmittelkonzentrationen der sechs Lösungen wie folgt sind, nämlich 40 bis 60 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration; 30 bis 45 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration; 15 bis 35 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration; 5 bis 20 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration; 2,5 bis 10 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration; und 0 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei jede der sechs Lösungen einen osmotischen Puffer aufweist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei der osmotische Puffer ein osmotischer Puffer mit niedrigem Molekulargewicht ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der osmotische Puffer Manitol ist.
Verfahren nach Anspruch 28, das weiterhin Folgendes aufweist, nämlich Eintauchen des Gewebes oder des Organs in eine zweite kälteschutzmittelfreie Lösung, die keinen osmotischen Puffer aufweist, und zwar nach dem Eintauchen in die kälteschutzmittelfreie Lösung, die einen osmotischen Puffer aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei im Vergleich mit frischen Geweben oder Organen zumindest 50 % einer gemessenen Funktion des Gewebes oder des Organs beibehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Kälteschutzmittellösung zumindest ein natürliches oder ein synthetisches Eisblockermolekül aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Kälteschutzmittellösung zumindest ein Mitglied aufweist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Acetamid, Agarose, Alginat, Alanin, Albumin, Ammoniumacetat, Frostschutzproteinen, Butandiol, Chondroitinsulfat, Chloroform, Cholin, Cyclohexandiolen, Dextranen, Diethylenglykol, Dimethylacetamid, Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Erythritol, Ethanol, Ethylenglykol, Ethylenglykolmonomethylether, Formamid, Glucose, Glycerin, Glycerinphosphat, Glycerinmonoacetat, Glycin, Glycoproteinen, Hydroxyethylstärke, Inositol, Lactose, Magnesiumchlorid, Magnesiumsulfat, Maltose, Manitol, Mannose, Methanol, Methoxypropandiol, Methylacetamid, Methylformamid, Methylharnstoffen, Methylglucose, Methylglycerin, Phenol, pluronischen Polyolen, Polyethylenglykol, Polyvinylpyrrolidon, Prolin, 1,2-Propandiol, Pyridin-N-oxid, Raffinose, Ribose, Serin, Natriumbromid, Natriumchlorid, Natriumjodid, Natriumnitrat, Natriumnitrit, Natriumsulfat, Sorbit, Saccharose, Trehalose, Triethylenglykol, Trimethylaminacetat, Harnstoff, Valin und Xylose.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Kälteschutzmittellösung Dimethylsulfoxid, Formamid und 1,2-Propandiol aufweist.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Kälteschutzmittellösung 20 bis 30 % w/v Dimethylsulfoxid, 10 bis 20 % w/v Formamid und 10 bis 20 % w/v 1,2-Propandiol in einer Trägerlösung aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei das Gewebe oder das Organ zumindest ein natürliches oder künstlich hergestelltes, vaskularisiertes oder avaskuläres Gewebe oder Organ ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Muskel- und Knochenskelettgewebe, Knorpelgewebe, Meniskii, Muskeln, Bändern, Sehnen, Haut, cardiovaskulärem Gewebe, Herzklappen, Myocardium, Peridontalgewebe, Drüsengewebe, Langerhans'schen Inseln, Hornhaut, Harnleiter, Harnröhre, Pankreas, Blase, Niere, Brust, Leber, Darm und Herz.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Gewebe oder das Organ Herzklappengewebe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Gewebe oder das Organ Knorpelgewebe ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Verfahren ohne Durchspülen des Gewebes oder des Organs durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, das nach dem Abkühlen und vor dem Erwärmen weiterhin das Aufbewahren des vitrifizierten Gewebes oder des Organs aufweist.