DE60007304T2

DE60007304T2 - Verfahren zur kryopräservierung von blutgefässen durch glasbildung

Info

Publication number: DE60007304T2
Application number: DE60007304T
Authority: DE
Inventors: S. Bijan KHIRABADI; C. Ying SONG; G. Kelvin BROCKBANK
Original assignee: Organ Recovery Systems Inc
Current assignee: Organ Recovery Systems Inc
Priority date: 1999-04-13
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2004-09-16
Anticipated expiration: 2020-04-13
Also published as: AU4230200A; CA2368884A1; EP1182926B1; DE60007304D1; EP1182926A1; JP2002541160A; US7157222B2; WO2000060935A1; US6740484B1; US20050100876A1; US6194137B1

Description

Diese Erfindung wurde mit Unterstützung der Regierung der Vereinigten Staaten gemacht, die von der NIST gewährt wurde. Die Regierung der Vereinigten Staaten hat gewisse Rechte an dieser Erfindung.
In der heutigen Zeit des Arterienersatzes werden pro Jahr zumindest 345.000 bis 485.000 autologe Koronartransplantate (entweder Arterien oder Venen) und über 200.000 autogene Venentransplantate in die periphären Arterien durchgeführt. Siehe den Bericht einer Arbeitsgruppe der British Cardiac Society: Coronary Angioplasty in the United Kingdom. Br Heart J. 66:325-331, 1991; Heart and Stroke Facts: Statistical Supplement, American Heart Association, 1996; and Callow AD. "Historical overview of experimental and clinical development of vascular grafts," in: Biologic and Synthetic Vascular Prosthesis, Stanley J (Ed), Grune and Stratton, New York, 11, 1983. Ein kürzlich durchgeführter Marketingbericht hat gezeigt, dass in den Vereinigten Staaten pro Jahr zumindest 300.000 Koronararterien Bypassoperationen durchgeführt werden, die über 1 Million Gefäßtransplantate einschließen. Siehe World Cell Therapy Markets, Frost & Sullivan, 5413–43 Revision #1, ISBN 0–7889–0693-3, 1997.
Viele dieser Patienten verfügen auf Grund von vorexistierenden Gefäßerkrankungen, Venenstripping oder Verwendung in vorangegangenen Gefäßoperationen über keine für Transplantate geeigneten autologen Venen. Es wird geschätzt, dass bis zu 30 % der Patienten, die arterielle Bypassoperationen benötigen, Venae saphenae aufweisen, die für die Verwendung in der Gefäßrekonstruktion ungeeignet sind. Siehe Edwards WS, Holdefer WF, Motashemi, M, „The importance of proper caliber of lumen in femoral popliteal artery reconstruction," Surg Gynecol Obstet. 122:37, 166. Vor kurzem wurde gezeigt, dass 2 bis 5 % der für Bypassoperationen in Betracht gezogenen Venae saphenae auf Grund von makroskopischen pathologischen Befunden unbrauchbar waren und dass bis zu 12 % später als erkrankt klassifiziert wurden. Diese „erkrankten" Venen hatten eine Durchgängigkeitsrate von weniger als der Hälfte der nicht erkrankten Venen. Siehe Panetta TF, Marin ML, Veith FJ, et al., "Unsuspected preexisting saphenous vein disease: an unrecognized cause of vein bypass failure," J Vasc Surg. 15:102–112, 1992. Wir schätzen jedoch, dass wenn alle arteriellen Transplantate und alternativen Venen gemäß der heutigen operativen Praxis verwendet werden, die maximale Anzahl von möglichen Empfängern von Allotransplantaten wahrscheinlich näher bei 10 % liegt.
Vitrifizierte arterielle Transplantate können außerdem einen Markt als Gerüst zum Säen und Anhaften von autologen endothelialen Zellen oder von genetisch modifizierten endothelialen Zellen haben.
Zur Zeit werden prosthetische Transplantate für Nicht-Koronaranwendungen mit großem Durchmesser (größer als 6 mm innerer Durchmesser) verwendet. Zwischen 1985 und 1990 wurden etwa 1.200 allogene Venensegmente für arterielle Bypässe verwendet. Siehe Brockbank KGM, McNally RT, Walsh KA, „Cryopreserved vein transplantation," J Cardiac Surg. 7:170–176, 1992. Die Nachfrage nach allogenen Venen steigt trotz der gut dokumen tierten Immunreaktion auf diese Transplantate und der niedrigen klinischen Durchgängigkeitsraten. Allein 1991 wurden mindestens 1.400 Allotransplantatsegmente der Vena saphena transplantiert. Siehe McNally RT, Walsh K, Richardson W, „Early clinical evaluation of cryopreserved allograft vein," Proceedings of the 29^th meeting of the Society for Cryobiology, Cryobio., Abstract #4, 1992. Konservativ geschätzt beträgt das Marktpotenzial für vitrifizierte Gefäßtransplantate 50.000 Einheiten pro Jahr oder 10 % aller Gefäßtransplantationsprozeduren in den Vereinigten Staaten.
Blutgefäße sind außerdem ein allgegenwärtiger Bestandteil von vaskularisierten Geweben und Organen sowohl im Menschen als auch im Tier, die eines Tages erfolgreich durch Vitrifikation für die Transplantation gelagert werden könnten. Vorausgesetzt, dass signifikante immunologische Probleme gelöst werden können, können aus Tieren gewonnene Transplantate eines Tages einen unbegrenzten Vorrat an Blutgefäßen und vaskularisierten Geweben und Organen zur Verfügung stellen, die vor der Transplantation in einem vitrifizierten Zustand gelagert werden könnten.
Die Aufbewahrung von biologischen Geweben und Organen bei niederen Temperaturen, d.h. die Kältekonservierung war das Objekt großer Forschungsanstrengungen. Kältekonservierung kann durch Einfrieren oder durch Vitrifizieren erreicht werden. Wenn das Organ oder das Gewebe eingefroren wird, können sich Eiskristalle in dem Organ oder Gewebe bilden, die dessen Struktur mechanisch zerstören können und somit dessen Fähigkeit schädigen, korrekt zu funktionieren, wenn es in einen Empfänger transplantiert worden ist.
Organisierte Gewebe und Organe sind besonders anfällig gegenüber mechanischer Beschädigung durch Eiskristalle, die sich während des Einfrierens bilden.
Im Gegensatz dazu bedeutet Vitrifikation Verfestigung wie in einem Glas, ohne die Bildung von Eiskristallen. Die Prinzipien der Vitrifikation sind bekannt. Im Allgemeinen ist die niedrigste Temperatur, auf die eine Lösung unterkühlt werden kann, ohne dabei einzufrieren, die homogene Keimbildungstemperatur T_h, bei der Eiskristalle sich bilden und wachsen und bei der aus der Lösung ein kristalliner Feststoff gebildet wird. Vitrifikationslösungen weisen eine Glasübergangstemperatur T_g auf, bei der der gelöste Stoff vitrifiziert oder ein nicht kristalliner Feststoff wird. Auf Grund der Kinetik der Keimbildung und des Kristallwachstums ist es für Wassermoleküle effektiv unmöglich, sich bei Temperaturen, die weit unter T_g liegen, für die Kristallbildung auszurichten. Außerdem dazu wird beim Abkühlen der meisten verdünnten wässrigen Lösungen auf die Glasübergangstemperatur T_h vor T_g erreicht und eine Eiskeimbildung findet statt, was es unmöglich macht, die Lösung zu vitrifizieren. Um solche Lösungen zur Aufbewahrung von biologischen Materialien durch Vitrifikation nutzbar zu machen, ist es daher notwendig, die Eigenschaften der Lösung so zu verändern, dass Vitrifikation anstatt von Eiskristallkeimbildung und -wachstum stattfindet. Es ist außerdem wichtig, dass jegliche Lebensfähigkeit und Gewebefunktion durch das gesamte Vitrifikationsverfahren beibehalten wird.
Obwohl es allgemein bekannt ist, dass hohe hydrostatische Drücke T_g erhöhen und T_h erniedrigen, ist die Vitrifikation der meisten verdünnten Lösungen durch das Anwenden von Drücken meist unmöglich oder unpraktisch. Insbesondere verursachten bei vielen Lösungen, die durch das Anwenden von Druck vitrifizierbar sind, die benötigten Drücke unannehmbar schwere Verletzungen an ungeschützten Biomaterialien während deren Vitrifikation. Obwohl es allgemein bekannt ist, dass zahlreiche gelöste Stoffe, wie die normalerweise eingesetzten Kälteschutzmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO), T_g anheben und T_h absenken, nähern sich die Konzentrationen in Lösung an DMSO oder ähnlichen gelösten Stoffen, die hoch genug sind, um die Vitrifikation zu ermöglichen typischerweise der eutektischen Konzentration und sind im Allgemeinen für biologische Materialien toxisch.
Eine Art von Schädigung, der durch Kälteschutzmittel verursacht wird, ist osmotische Beschädigung. Cryobiologen haben in den 1950ern aus den osmotischen Effekten der Kälteschutzmittel und der Notwendigkeit gelernt, diese Effekte zu steuern, um eine Beschädigung während des Zugebens und des Entfernens von Kälteschutzmittel zu isolierten Zellen und Geweben zu verhindern. Ähnliche Lektionen wurden gelernt, als die Cryobiologen zu Studien über das Durchspülen von ganzen Organen mit Kälteschutzmitteln übergingen. Ein Beachten der Prinzipien der Osmose war essentiell, um in den Organen eine Toleranz gegenüber der Zugabe von Kälteschutzmitteln zu induzieren.
Trotz der Anstrengungen, die schädlichen osmotischen Effekte von Kälteschutzmitteln zu steuern, werden noch immer Grenzen der Toleranz gegenüber Kälteschutzmitteln beobachtet. Es scheinen echte, inhärente, toxische Effekte von Kälteschutzmittel zu existieren, die von den vorübergehenden, osmotischen Effekten dieser chemischen Mittel unabhängig sind.
Studien der Erfinder und anderer haben Verfahren untersucht, um die nicht osmotische, inhärente Toxizität von Kälteschutzmitteln zu steuern. Die Resultate zeigen, dass verschiedene Techniken allein oder in Kombination wirksam sein können. Diese schließen Folgendes ein, nämlich (a) die Verwendung von spezifischen Kombinationen von Kälteschutzmitteln, deren Effekte die Toxizitäten untereinander aufheben; (b) das Aussetzen an Kälteschutzmittel in Trägerlösungen, die für diese speziellen Kälteschutzmittel optimiert sind; (c) die Verwendung von nicht durchdringenden Mitteln, die einen Teil der ansonsten benötigten durchdringenden Mittel ersetzen können und somit das Innere der Zelle vor einem Aussetzen an zusätzlichen intrazellulären Mitteln schützen; und (d) Minimieren der Zeit, die innerhalb des Konzentrationsbereichs der schnellen zeitabhängigen Toxizität verbracht wird.
Einige dieser Techniken stehen möglicherweise in Konflikt mit der Notwendigkeit, die osmotischen Kräfte zu regeln. So reduziert z.B. ein Erniedrigen der Temperaturen auch die Einfluss- und Ausflussgeschwindigkeit von Kälteschutzmitteln, wodurch deren osmotische Effekte verlängert und intensiviert werden. In ähnlicher Weise maximiert ein Minimieren der Zeit des Aussetzens an Kälteschutzmittel deren mögliche osmotische Effekte. Es muss daher ein Gleichgewicht zwischen dem Steuern der osmotischen Beschädigung und dem Steuern der Toxizität gefunden werden. Mittel zum Erreichen dieses Gleichgewichts sind im US-Patent Nr. 5,723,282 für Fahy et al. beschrieben. Dieses Patent beschreibt jedoch kein spezielles Verfahren, das für Blutgefäße zu verwenden ist. Zusätzlich dazu beschreibt das Patent auch keine Protokolle zum Abkühlen oder Erwärmen des Organs oder des Gewebes.
ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Vitrifizieren eines Blutgefäßes gerichtet. Das Verfahren weist Folgendes auf, nämlich Eintauchen des Blutgefäßes in ansteigende Konzentrationen einer Kälteschutzmittellösung bei einer Temperatur größer als –5°C bis zu einer für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration; schnelles Abkühlen des Blutgefäßes auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur (T_g); und weiteres Abkühlen des Blutgefäßes von einer Temperatur über der Glasübergangstemperatur auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur, um das Blutgefäß zu vitrifizieren.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zum Entnehmen eines Blutgefäßes aus dem Zustand der Vitrifikation in einer Kälteschutzmittellösung gerichtet. Das Verfahren weist Folgendes auf, nämlich langsames Erwärmen eines vitrifizierten Blutgefäßes in der Kälteschutzmittellösung auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur; schnelles Erwärmen des Blutgefäßes in der Kälteschutzmittellösung auf eine Temperatur über –75°C; und Reduzieren der Konzentration des Kälteschutzmittels durch Eintauchen des Blutgefäßes in abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zum Behandeln von Blutgefäßen gerichtet, so dass im Vergleich mit frischen unbehandelten Kontrollmustern die Funktionen der glatten Muskeln und die Implantatsdurchgängigkeitsrate beibehalten werden und die intimale Hyperplasie reduziert wird. Insbesondere ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, bei dem im Vergleich zu frischen unbehandelten Kontrollmustern zumindest 70 %, vorzugsweise zumindest 80 % der Funktion der glatten Muskeln und der Implantatsdurchgängigkeitsrate beibehalten werden.
Die vorliegende Erfindung basiert somit auf einem Verfahren zum Vitrifizieren eines Blutgefäßes, das Folgendes aufweist, nämlich Eintauchen des Blutgefäßes in eine Reihe von Lösungen, die schrittweise ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration zu erreichen, wobei jede Lösung der Reihe von Lösungen eine Temperatur von über –15°C aufweist; Abkühlen des Blutgefäßes unter physiologischem Druck von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen 80°C und T_g in einer Lösung, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel aufweist mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 30 bis 60°C pro Minute; weiteres Abkühlen des Blutgefäßes von einer Temperatur über T_g auf eine Temperatur unter T_g mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 10°C pro Minute, um das Blutgefäß zu vitrifizieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt ein Beispiel einer Vorrichtung zum Durchspülen, das in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
2 zeigt eine Vorrichtung, die zum schnellen Abkühlen der Blutgefäße verwendet werden kann.
3 zeigt das Abkühlprofil, das durch ein Verbringen eine Glasscintillationsviole 30 mm tief in vorgekühltes 2-Methylbutan und dann in kalte Luft erzeugt wurde, wobei die Vorrichtung von 2 verwendet wurde.
4 zeigt das Aufwärmprofil, das durch ein Verbringen der Glasscintillationsviole in kalte Luft und dann in eine Mischung von 30 % DMSO/H₂O bei Raumtemperatur erzeugt wurde.
5 zeigt die strukturelle Integrität von Venensegmenten im Anschluss an die Konservierung durch Vitrifikation.
6A–F zeigen frische und vitrifizierte Transplantate bei der Implantation, nach dem Durchspülen, Fixieren und Entfernen und nach der Sektion des Transplantats.
7A-F zeigen die Morphologie von nicht operierten Venen, Frischvenentransplantaten und vitrifizierten Venentransplantaten mit Mikat oder H&E-Anfärbung.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG VON BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zum Vitrifizieren eines Blutgefäßes in einer Kälteschutzmittellösung und zum anschließenden Entnehmen des Blutgefäßes aus dem Zustand der Vitrifikation gerichtet. „Blutgefäß" wie hierin verwendet bedeutet jegliche biologische Leitung, die Blut transportiert. Somit bedeutet der Ausdruck eine Arterie, eine Kapillare, eine Vene, einen Sinus oder ein künstlich hergestelltes Konstrukt.
Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Ausdruck „Vitrifikation" das Verfestigen ohne Bildung von Eiskristallen. Wie hierin verwendet, ist ein Gewebe vitrifiziert, wenn es die Glasübergangstemperatur (T_g) erreicht hat.
Wie hierin verwendet, bedeutet „Glasübergangstemperatur" die Glasübergangstemperatur einer Lösung unter den Bedingungen, bei denen das Verfahren durchgeführt wird. Im Allgemeinen wird das erfindungsgemäße Verfahren bei physiologischen Drücken durchgeführt. Es können jedoch höhere Drücke verwendet werden, solange das Blutgefäß dadurch nicht signifikant beschädigt wird.
Wie hierin verwendet, bedeutet „physiologische Drücke" Drücke, denen Blutgefäße während ihrer normalen Funktion ausgesetzt sind. Der Ausdruck „physiologische Drücke" schließt somit sowohl normale atmosphärische Bedingungen als auch die höheren Drücke ein, denen Blutgefäße unter diastolischen und systolischen Bedingungen ausgesetzt sind.
Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Ausdruck „Durchspülen" das Fließen einer Flüssigkeit durch das Blutgefäß. Techniken zum Durchspülen von Organen und Geweben sind z.B. im US-Patent Nr. 5,723,282 für Fahy et al. beschrieben.
Wie er hierin verwendet wird, bedeutet der Ausdruck „Kälteschutzmittel" eine Chemikalie, die die Bildung von Eiskristallen in einem Gewebe oder einem Organ verhindert, wenn das Organ auf Temperaturen unter Null abgekühlt wird und die im Vergleich zu den Auswirkungen des Abkühlens ohne Kälteschutz mittel zu einem Anstieg der Lebensfähigkeit nach dem Erwärmen führt.
Wie hierin verwendet, bedeutet „etwa ein osmotisches Gleichgewicht", dass zwischen den intrazellulären und extrazellulären Konzentrationen eines gelösten Stoffes nicht mehr als 10 % Unterschied besteht. Ein Unterschied von nicht mehr als 10 % bedeutet z.B., dass wenn die extrazelluläre Konzentration 4 M beträgt, die intrazelluläre Konzentration eines gelösten Stoffs zwischen 3,6 und 4,4 M liegt. Vorzugsweise besteht nicht mehr als 5 % Unterschied zwischen den intrazellulären und extrazellulären Konzentrationen.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird das Blutgefäß bei einer Temperatur größer als –5°C in ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittellösung eingetaucht. Die Temperatur liegt vorzugsweise zwischen 0°C und 15°C, bevorzugter zwischen 0°C und 10°C. Vorzugsweise wird das Blutgefäß außerdem mit den ansteigenden Konzentrationen des Kälteschutzmittels durchspült.
Der Anstieg der Konzentration wird vorzugsweise schrittweise durchgeführt. Das bedeutet, das Kälteschutzmittel wird zu der extrazellulären Lösung zugegeben, um eine gewisse Konzentration an Kälteschutzmittel zu erreichen. Nachdem dieser Konzentrationslevel erreicht ist, wird die Konzentration der Lösung für eine Zeitspanne im Wesentlichen beibehalten. Insbesondere wird der Konzentrationslevel für eine ausreichende Zeit beibehalten, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht des Blutgefäßes in der Lösung zu erreichen. Um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, wird der Konzentrationslevel im Allgemeinen für zumindest 10 Minuten beibehalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Konzentrationslevel für zumindest 15 Minuten beibehalten. Dieser Vorgang wird so häufig wie nötig wiederholt, wobei die Endkonzentration für die Vitrifikation bei physiologischen Drücken, insbesondere unter normalen atmosphärischen Bedingungen, ausreichend ist. Zusätzlich dazu wird das Blutgefäß im Allgemeinen für nicht mehr als eine Stunde, vorzugsweise für nicht mehr als 30 Minuten auf jedem Konzentrationslevel gehalten.
Im Allgemeinen wird das Blutgefäß zuerst in eine kälteschutzmittelfreie Lösung eingetaucht. Das Blutgefäß kann auch mit der kälteschutzmittelfreien Lösung durchspült werden. Diese kälteschutzmittelfreie Lösung kann jede Art von Lösung sein, die die zelluläre Integrität unter in-vitro-Bedingungen erhält, wie sie durch synthetische physikalische Puffer bei Normaltemperaturen und Organkonservierungslösungen bei hypothermischen Temperaturen exemplarisch dargestellt werden. In den meisten Fällen wird die anfängliche lösemittelfreie Lösung die gleiche sein wie die Trägerlösung, die verwendet wird, um Kälteschutzmittel in dem Blutgefäß zuzugeben und zu entfernen. Die kälteschutzmittelfreie Lösung kann z.B. eine Euro-Collins-Lösung sein, die eine nachfolgend in Tabelle 1 beschriebene wässrige Lösung ist.
TABELLE 1
Andere geeignete wässrige Lösungen sind in den nachfolgenden Tabellen 2 und 3 beschrieben.
TABELLE 2
(Anmerkung: RPS-2^TM-Lösung ist eine modifizierte RPS-2-Lösung ohne CaCl₂ und ohne MgCl₂ )
TABELLE 3
(Bemerkung: Die modifizierte UW-Lösung #2 enthält kein HES, enthält aber mehr Glucose als die modifizierte UW-Lösung #1) Das Blutgefäß wird, nachdem es in eine kälteschutzmittelfreie Lösung eingetaucht wurde, in eine Lösung eingetaucht, die Kälteschutzmittel aufweist. Eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration liegt im Wesentlichen bei 6,0 bis 9,5 M Kälteschutzmittel, vorzugsweise von 7 bis 9 M Kälteschutzmittel, bevorzugter bei 8 bis 9 M Kälteschutzmittel. Die Kälteschutzmittellösung kann jede für die Vitrifikation ausreichende Kombination von Kälteschutzmitteln enthalten. Kälteschutzmittel schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Dimethylsulfoxid, Formamid, 1,2-Propandiol, 2,3-Butandiol, Glycerin, Ethylenglycol, N,N-Dimethylformamid und 1,3-Propandiol.
Impermeable Kälteschutzmittel wie Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxyethylstärke können wirksamer sein, biologische Systeme, die mit solch hohen Geschwindigkeiten abgekühlt werden, zu schützen. Solche Mittel sind häufig große Makromoleküle, die die Eigenschaften der Lösung in einem größeren Ausmaß beeinflussen als von ihrem osmotischen Druck zu erwarten wäre. Einige dieser nicht durchdringenden Kälteschutzmittel haben direkte schützende Wirkungen auf die Zellmembran. Der primäre Wirkungsmechanismus scheint jedoch das Induzieren von extrazellulärer Glasbildung zu sein. Wenn solche Kälteschutzmittel in sehr hohen Konzentrationen verwendet werden, kann die Eisbildung während des Abkühlens auf und des Erwärmens von den cryogenischen Temperaturen vollständig eliminiert werden. Impermeable Chemikalien mit nachgewiesenen Kälteschutzaktivitäten schließen Folgendes ein, nämlich Agarose, Dextrane, Glucose, Hydroxyethylstärke, Inositol, Lactose, Methylglucose, Polyvinylpyrrolidon, Sorbit, Saccharose und Harnstoff.
In einer speziellen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die Kälteschutzmittellösung Dimethylsulfoxid, Formamid und 1,2-Propandiol. Die Kälteschutzmittellösung kann z.B. eine Lösung sein, die als VS55 bezeichnet wird. VS55 ist eine Lösung, die 24,2 % w/v (3,1 M) Dimethylsulfoxid, 16,8 % w/v (2, 2 M) 1, 2-Propandiol und 14 % w/v (3, 1 M) Formamid enthält. Die Lösung enthält somit etwa 55 % w/v oder 8,4 M Kälteschutzmittel. Die Menge an Dimethylsulfoxid kann von 20 bis 30 % w/v variiert werden. In ähnlicher Weise kann die Menge an 1,2-Propandiol und Formamid jeweils von etwa 10 bis 20 % w/v variiert werden. Die Gesamtmenge an Kälteschutzmittel in der unverdünnten Lösung sollte jedoch zwischen 45 % w/v und 60 Gew.-% w/v, vorzugsweise bei etwa 50 % w/v bis 55 % w/v liegen.
Zusätzlich dazu kann in weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung 1,2-Propandiol durch ähnliche Konzentrationen an 2,3-Butandiol ersetzt werden. In ähnlicher Weise kann Dimethylsulfoxid durch ähnliche Konzentrationen an Glycerin oder Ethylenglycol oder Kombinationen davon ersetzt werden.
Der Träger für die Lösemittellösung kann jede Art von Lösung sein, die die zelluläre Integrität unter in-vitro-Bedingungen erhält. Insbesondere weist der Träger im Allgemeinen langsam durchdringende gelöste Stoffe auf. In VS55 ist die Trägerlösung eine Euro-Collins-Lösung, die 10 mM HEPES enthält. HEPES ist als Puffer enthalten und kann in jeder wirksamen Menge enthalten sein. Zusätzlich dazu können sowohl andere Puffer als auch kein Puffer verwendet werden. Alternative Träger schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf die in den zuvor genannten Tabellen 2 und 3 diskutierten Lösungen.
Die Endkonzentration der Spüllösung ist ausreichend, das Blutgefäß zu vitrifizieren. Die Konzentration der Lösung wird jedoch wie zuvor diskutiert nach und nach angehoben, um diesen Level zu erreichen, vorzugsweise schrittweise. Genauer gesagt, wird das Kälteschutzmittel zugegeben, um ein gewisses Plateau zu erreichen, was für eine ausreichende Zeit beibehalten wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, insbesondere für zumindest 10 Minuten und vorzugsweise für etwa 15 Minuten. Danach wird weiteres Kälteschutzmittel zugegeben, um die Kälteschutzmittelkonzentration zu erhöhen, die dabei einen für die Vitrifikation ausreichenden Level erreichen kann, aber nicht muss. Wenn es nicht der Fall ist, wird nach dem Beibehalten der Konzentration für eine ausreichende Zeit, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, weiteres Kälteschutzmittel in einem oder mehreren Schritten zugegeben, um eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration zu erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform gibt es vier Kälteschutzmittelkonzentrationsplateaus, bevor die für die Vitrifikation ausreichende Konzentration erreicht wird. In dieser bevorzugten Ausführungsform gibt es somit sechs Schritte, wobei der erste Schritt eine kälteschutzmittelfreie Lösung verwendet, und diesem vier ansteigende Kälteschutzmittelkonzentrationsplateaus und dann eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration folgen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform mit sechs Schritten wird in Schritt 1 kein Kälteschutzmittel verwendet; in Schritt 2 werden 5 bis 20 %, vorzugsweise 10 bis 15 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet, in Schritt 3 werden 15 bis 35 %, vorzugsweise 20 bis 30 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet; in Schritt 4 werden 40 bis 60 %, vorzugsweise 45 bis 55 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet; in Schritt 5 werden 65 bis 85 %, vorzugsweise 70 bis 80 % der Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet und in Schritt 6 wird diejenige Kälteschutzmittelendkonzentration verwendet, die für die Vitrifikation ausreichend ist. Jeder Kälteschutzmittelkonzentrationsschritt wird für eine ausreichende Zeit beibehalten, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erhalten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Blutgefäß bei jedem Schritt mit der Lösung durchspült.
Nachdem das Blutgefäß in eine Lösung eingetaucht wurde, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel enthält, wird das Blutgefäß, das in einer Lösung gehalten wird, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel enthält, schnell auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur abgekühlt. Die schnelle Abkühlgeschwindigkeit beträgt im Allgemeinen zumindest 25°C pro Minute. Die durchschnittliche Abkühlgeschwindigkeit während dieses Schrittes liegt vorzugsweise bei 30°C bis 60°C pro Minute, bevorzugter bei 35°C bis 50°C pro Minute und besonders bevorzugt bei 40°C bis 45°C pro Minute. Die Temperatur, auf die das Blutgefäß während dieses schnellen Abkühlvorgangs abgekühlt wird, liegt vorzugsweise zwischen –90°C und –110°C, bevorzugter zwischen –95°C und –105°C.
Nachdem das Blutgefäß diesen schnellen Abkühlvorgang erfahren hat, erfährt das Blutgefäß einen langsamen Abkühlvorgang, bei dem das Blutgefäß mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 10°C pro Minute von einer Temperatur über der Glasübergangstemperatur auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur abgekühlt wird, um das Blutgefäß zu vitrifizieren. Der Abkühlvorgang wird vorzugsweise mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 5°C pro Minute durchgeführt. Vorzugsweise steigt die Abkühlgeschwindigkeit während des gesamten Schritts nicht über 10°C pro Minute und bevorzugter steigt die Abkühlgeschwindigkeit nicht über 5°C pro Minute. Die Glasübergangstemperatur liegt im All– gemeinen bei etwa –120°C bis –135°C unter normalen atmosphäri schen Bedingungen. Das Blutgefäß kann dann für einen langen Zeitraum bei einer Temperatur unter der Glasübergangstemperatur gelagert werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die langsame Abkühlgeschwindigkeit durch ein Verändern der Umgebung, in die der die Lösung enthaltende Behälter verbracht wird, erreicht. In einer besonderen Ausführungsform wird die schnelle Abkühlgeschwindigkeit durch ein Verbringen des Behälters in eine Flüssigkeit wie 2-Methylbutan erreicht, die auf eine Temperatur unter –100°C, vorzugsweise nahe oder unter der Glasübergangstemperatur der zu kühlenden Lösung vorgekühlt wurde. Der Behälter wird dann, um die langsame Abkühlgeschwindigkeit zu erreichen, aus der Flüssigkeit entnommen und in einer gasförmigen Umgebung auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur abgekühlt.
Die vorliegende Erfindung ist außerdem auf ein Verfahren zum Entnehmen eines Blutgefäßes aus dem Zustand der Vitrifikation in einer Kälteschutzmittellösung gerichtet. Das Verfahren weist das langsame Erwärmen eines vitrifizierten Blutgefäßes in der Kälteschutzmittellösung auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur auf. Die langsame Erwärmungsgeschwindigkeit liegt im Allgemeinen unter 50°C pro Minute. Zusätzlich dazu liegt die durchschnittliche Erwärmungsgeschwindigkeit während dieser Stufe im Allgemeinen bei etwa 20°C bis 40°C pro Minute, vorzugsweise bei 25°C bis 35°C pro Minute. Zusätzlich dazu liegt die Temperatur, auf die das vitrifizierte Blutgefäß langsam erwärmt wird, liegt vorzugsweise zwischen –90°C und –110°C, bevorzugter zwischen –95°C und –105°C.
Nachdem das Blutgefäß diesen langsamen Erwärmungsvorgang erfahren hat, wird das Blutgefäß schnell auf eine Temperatur über –75°C erwärmt. Die Temperatur sollte ausreichend hoch sein, so dass die Lösung ausreichend flüssig ist, dass das Blutgefäß daraus entnommen werden kann. Der schnelle Erwärmungsvorgang wird im Allgemeinen mit einer Geschwindigkeit über 80°C pro Minute, vorzugsweise über 100°C pro Minute durchgeführt. Die durchschnittliche Erwärmungsgeschwindigkeit während dieses Schrittes liegt vorzugsweise bei 200°C bis 300°C pro Minute, bevorzugter bei 215°C bis 250°C pro Minute. Das Blutgefäß wird bei diesem Vorgang vorzugsweise auf eine Temperatur zwischen –75°C und –55°C erwärmt. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Blutgefäß jedoch in diesem Schritt auf eine Temperatur über –5°C, vorzugsweise zwischen –5°C und +5°C erwärmt.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird die schnelle Erwärmungsgeschwindigkeit durch ein Verändern der Umgebung, in die der die Lösung enthaltende Behälter verbracht wird, erreicht. In einer besonderen Ausführungsform wird die langsame Erwärmungsgeschwindigkeit durch ein Verbringen des Behälters in eine gasförmige Umgebung mit einer Temperatur über der Temperatur, bei der das Blutgefäß gelagert wurde, erreicht. Danach wird der Behälter, um die schnelle Erwärmungsgeschwindigkeit zu erreichen, in eine Flüssigkeit, wie eine wässrige Lösung aus z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), mit einer Temperatur über –75°C, vorzugsweise über 0°C, und besonders bevorzugt mit normalen atmosphärischen Temperaturen verbracht.
Nachdem das Blutgefäß auf eine Temperatur über –65°C erwärmt wurde, wird die Konzentration des Kälteschutzmittels in der Lösung nach und nach reduziert. Vorzugsweise wird die Käl-teschutzmittelkonzentration schrittweise reduziert. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die abnehmenden Kälteschutzmittellösungen durch ein Eintauchen des Blutgefäßes in eine Reihe von Lösungen mit abnehmender Kälteschutzmittelkonzentration erreicht, um die Elution des Kälteschutzmittels aus dem Blutgefäß zu erleichtern. Das Blutgefäß kann außerdem mit den Lösungen durchspült werden. Die Lösungen weisen im Allgemeinen Temperaturen über –15°C, vorzugsweise zwischen –15°C und +15°C oder noch bevorzugter zwischen 0°C und 10°C auf.
Die Kälteschutzmittelkonzentration wird vorzugsweise reduziert, um ein gewisses Plateau zu erreichen, das für eine ausreichende Zeit beibehalten wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, insbesondere für zumindest 10 Minuten und bevorzugt für etwa 15 Minuten. Die Kälteschutzmittelkonzentration wird dann weiter reduziert, was zu einer kälteschutzmittelfreien Lösung führen kann, aber nicht muss. Ist dies nicht der Fall, wird die Kälteschutzmittelkonzentration nach dem Beibehalten der Konzentration für eine ausreichende Zeit, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen, wieder in einem oder mehreren Schritten weiter reduziert, um schließlich eine kälteschutzmittelfreie Lösung zu schaffen. Zusätzlich dazu wird das Blutgefäß für nicht länger als eine Stunde, vorzugsweise nicht länger als 30 Minuten, in jede Lösung eingetaucht.
Um die Kälteschutzmittelkonzentration zu erniedrigen, kann die Kälteschutzmittellösung mit einer Lösung vermischt werden, der Art ähnlich der kälteschutzmittelfreien Lösung die verwen det wird, um dem Blutgefäß Kälteschutzmittel zuzugeben. Die Lösung enthält vorzugsweise zumindest einen osmotischen Puffer.
Wie hierin verwendet bezeichnet „osmotischer Puffer" einen nicht durchdringenden extrazellulären gelösten Stoff mit hohem oder niedrigem Molekulargewicht, der den osmotischen Auswirkungen der größeren intrazellulären Konzentrationen gegenüber den extrazellulären Konzentrationen des Kälteschutzmittels während des Kälteschutzmittelausflussvorgangs entgegenwirkt.
Wie hierin verwendet, bedeutet „nicht durchdringend", dass die große Mehrheit der Moleküle der Chemikalie nicht in die Zellen des Blutgefäßes eindringt, sondern in der extrazellulären Flüssigkeit des Gewebes verbleibt.
Wie hierin verwendet, weisen „osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht" ein relatives Molekulargewicht von 1000 Dalton oder weniger auf. Osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Maltose, Kalium- und Natriumfructose-1,6-diphosphat, Kalium- und Natriumlactobionat, Kalium- und Natriumglycerophosphat, Maltpentose, Stachyose, Mannitol, Saccharose, Glucose, Maltotriose, Natrium- und Kaliumgluconat, Natrium- und Kaliumglucose-6-phosphat und Raffinose. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht zumindest einer ausgewählt aus Mannitol, Saccharose und Raffinose.
Wie hierin verwendet, weisen „osmotische Puffer mit hohem Molekulargewicht" im Allgemeinen ein relatives Molekulargewicht von mehr als 1.000 bis 500.000 Dalton auf. Osmotische Puffer mit hohem Molekulargewicht schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Hydroxyethylstärke (HES), Polyvinylpyrrolidon (PVP), Kaliumraffinoseundecaacetat (> 1.000 Dalton) und Ficoll (mehr als 1.000 bis 100.000 Dalton). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der osmotische Puffer mit hohem Molekulargewicht HES, bevorzugter eine, mit einem Molekulargewicht von etwa 450.000.
Die kälteschutzmittelfreie Lösung enthält vorzugsweise weniger als etwa 500 mM eines osmotischen Puffers, bevorzugter etwa 200 bis 400 mM osmotischen Puffer. Bevorzugterweise wird ein osmotischer Puffer mit niedrigem Molekulargewicht als osmotischer Puffer verwendet. Besonders bevorzugterweise ist der osmotische Puffer mit niedrigem Molekulargewicht Mannitol.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Kälteschutzmittel in sieben Schritten entfernt. In der bevorzugten Ausführungsform liegt in Schritt 1 die Kälteschutzmittelkonzentration bei 40 bis 60 %, vorzugsweise bei 45 bis 55 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration; in Schritt 2 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 30 bis 45 %, vorzugsweise bei 35 bis 40 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration; in Schritt 3 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 15 bis 35 %, vorzugsweise bei 20 bis 30 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration; in Schritt 4 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 5 bis 20 %, vorzugsweise 10 bis 15 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzentration; und in Schritt 5 liegt die Kälteschutzmittelkonzentration bei 2,5 bis 10 %, vorzugsweise bei 5 bis 7,5 % der für die Vitrifikation verwendeten Kälteschutzmittelkonzent ration. In diesen Schritten ist der Rest der Lösung eine kälteschutzmittelfreie Lösung, die einen osmotischen Puffer enthält. In Schritt 6 wird im Wesentlichen das gesamte Kälteschutzmittel entfernt. Der osmotische Puffer wird jedoch beibehalten. In Schritt 7 wird der osmotische Puffer entfernt. Als Alternative können die Schritte 6 und 7 in einem einzigen Schritt kombiniert werden. Das bedeutet, der osmotische Puffer kann zur gleichen Zeit wie der Rest des Kälteschutzmittels entfernt werden. Zusätzlich dazu kann, wenn kein osmotischer Puffer verwendet wird oder dieser nicht entfernt wird, Schritt 7 eliminiert werden. Jeder dieser Konzentrationsschritte wird für eine ausreichende Zeit beibehalten, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Die Temperatur der Reihe von Lösungen liegt im Allgemeinen über –15°C, vorzugsweise zwischen –15°C und +15°C und bevorzugter zwischen 0 und +10°C. Wenn Schritt 1 begonnen wird, weist das Blutgefäß eine Temperatur über –75°C, vorzugsweise über – 65°C auf. Somit wird das Blutgefäß, wenn die Temperatur des Blutgefäßes unter der Temperatur der Lösung liegt, in die es in Schritt 1 eingetaucht wird, im Schritt 1 des Entfernens des Kälteschutzmittels weiter auf eine Temperatur über –15°C erwärmt.
BEISPIELE
Es wurde die äußere Jugularvene aus weißen Neuseelandkaninchen gewonnen. Die distale Seite jedes Venensegments über der Gabelung wurde in situ mit einer Silikonröhre kanuliert. Das proximale Ende wurde zum Ausfließen von Flüssigkeit offen gelassen. Die Venensegmente, die etwa 40 bis 60 mm lang waren, wurden bei 0 bis 4°C durchspült.
Um die Venen zu durchspülen, wurde die Vorrichtung zum Durchspülen von 1 verwendet. Die Vorrichtung zum Durchspülen weist ein Reservoir 1 (eine 60 cm³-Spritze) auf, die eine Spüllösung 5 enthält und die mit einem 3-Wege-Hahn mit der Kanüle 2 verbunden ist. Das Reservoir 1 wurde auf einen physiologischen Druck eingestellt. Die Vene 3 wurde in eine Petrischale 4 (Durchmesser × Höhe 50 × 15 mm) verbracht, die die Spüllösung 5 enthielt. Die Spüllösung 5 im Reservoir 1 und in der Petrischale 4 war die gleiche und war vorgekühlt (0°C bis 4°C), und die Petrischale 4 wurde während des Spülvorgangs in Eis (0°C bis 4°C) verbracht.
Die verwendete Vitrifikationslösung war VS55. Die unverdünnte VS55-Lösung wurde in sechs aufeinanderfolgenden Schritten eingeführt. In dem ersten Schritt wurden die Blutgefäße mit Euro-Collins-Lösung, die den Träger von VS55 bildet, durchspült. In den Schritten 2 bis 5 war die Menge an unverdünntem VS55 in der Lösung wie folgt: 1/8 VS55, 2/8 VS55, 4/8 VS55 bzw. 6/8 VS55. In jedem Fall bestand der Rest der Lösung aus Euro-Collins-Lösung. Im sechsten Schritt war die Spüllösung unverdünntes VS55. Die Einwirkzeit für jeden Schritt lag bei 15 Minuten.
Nach dem Zugeben der Vitrifikationslösung wurden die Venensegmente schnell unter Verwendung der in 2 dargestellten Vorrichtung abgekühlt. Die Venensegmente 3, zusammen mit der Silikonröhre, wurden in eine Glasscintillationsviole 6 (Durchmesser × Höhe 25 × 60 mm) verbracht, die 1 ml einer vor gekühlten unverdünnten VS55-Lösung 7 enthielt, um die Probe 8 zu bilden. Die Oberfläche der Vitrifikationslösung 7 wurde mit 0,7 ml 2-Methylbutan 9 (Isopentan, Schmelzpunkt –160°C, Dichte 0,62) bei 0°C bis 4°C bedeckt, um eine direkte Berührung mit Luft zu vermeiden. Ein Thermoelement 10 wurde in eine Dummyprobe 11 einer Vitrifikationslösung 7 eingeführt und dessen Output wurde mit einem Digitalthermometer 12 überwacht. Die Temperatur während des Abkühlungsprozesses wurde aufgezeichnet.
Die Vorrichtung zum Abkühlen wurde in einem –135°C-Gefrierschrank aufgebaut. Die Abkühlgeschwindigkeiten wurden durch ein Verbringen der Probe in einen Behälter 13, der vorgekühltes 2-Methylbutan 14 enthielt, eingestellt. Die Abkühlgeschwindigkeiten konnten abhängig von der Tiefe, mit der die Phiole in das 2-Methylbutan verbracht wurde, verändert werden (30 mm erzeugen eine Abkühlgeschwindigkeit von 43°C pro Minute; 60 mm erzeugen eine Abkühlgeschwindigkeit von 71°C pro Minute). Mit dieser Technik wurden die Proben schnell (durchschnittliche Geschwindigkeit 43 ± 2°C pro Minute) auf –100°C abgekühlt. Die Proben wurden dann langsam (durchschnittliche Geschwindigkeit = 3 ± 0,2°C pro Minute) auf –135°C abgekühlt und zwar durch Entnehmen der Probe aus dem Behälter 13 mit 2-Methylbutan 14 und Abschließen des Abkühlvorgangs durch die Luft in dem –135°C-Gefrierschrank. 3 zeigt das Abkühlprofil unter Verwendung der Technik des Verbringens der Glasscintillationsviole 30 mm tief in vorgekühltes (–135°C) 2-Methylbutan. Die Probe wurde danach für zumindest 24 Stunden in dem –135°C-Gefrierschrank gelagert.
Nachdem sie für 24 Stunden gelagert wurden, wurden die Venen in zwei Stufen wieder erwärmt, und zwar langsames Erwär men auf –100°C (durchschnittliche Geschwindigkeit = 30 ± 2°C pro Minute) und schnelles Erwärmen auf –65°C (durchschnittliche Geschwindigkeit = 225 ± 15°C pro Minute). Die langsame Erwärmgeschwindigkeit wurde durch ein Verbringen der Probe auf das oberste Fach des –135°C-Gefrierschranks geschaffen und die schnelle Erwärmgeschwindigkeit wurde durch ein Verbringen der Glasphiole in eine Mischung aus 30 % DMSO/H₂O bei Raumtemperatur geschaffen. 4 zeigt das Erwärmprofil unter Verwendung dieser Technik.
Die VS55-Vitrifikationslösung wurde dann in sieben Schritten entfernt, wobei die Vorrichtung zum Durchspülen von 1 verwendet wurde. Die Spüllösung 5 im Reservoir 1 und in der Petrischale 4 war die gleiche und war vorgekühlt (0°C bis 4°C) und die Petrischale 4 wurde während des Spülvorgangs in Eis (0°C bis 4°C) verbracht. Während des ersten Schrittes wurde somit das Blutgefäß weiter auf eine Temperatur zwischen 0°C und 4°C erwärmt.
In allen Schritten außer dem letzten enthielt die Lösung zusätzlich zur Kälteschutzmittellösung 400 bis 200 mM Mannitol. In den Schritten 1 bis 5 war die Menge des unverdünnten VS55 in der Lösung wie folgt: 4/8 VS55; 3/8 VS55; 2/8 VS55; 1/8 VS55; und 0,5/8 VS55, wobei der Rest der Lösung Mannitol enthaltende Euro-Collins-Lösung war (Die 4/8-Stärke VS55-Lösung enthielt 400 mM Mannitol und die kälteschutzmittelfreie Euro-Collins-Lösung, die damit vermischt wurde, um die Lösungen mit niedrigerer Kälteschutzmittelkonzentration zu bilden, enthielt 200 mM Mannitol. Somit wurde die Menge an Mannitol, wenn die Menge an VS55 erniedrigt wurde, auf zwischen 400 und 200 mM erniedrigt.) In Schritt 6 wurde eine Euro-Collins-Lösung, die 200 mM Manni tol enthielt, verwendet. In Schritt 7 wurde eine Euro-Collins-Lösung verwendet, die kein Mannitol enthielt. Die Einwirkzeit für jeden Schritt lag bei 15 Minuten.
Die Morphologiestudien zeigten, dass die strukturelle Integrität von Venensegmenten im Anschluss an die Vitrifikation erhalten blieb. 5 zeigt eine histologische Sektion einer vitrifizierten Kaninchenjugularvene, die intakte morphologische Eigenschaften einschließlich endothelialer Zellen, glatter Muskeln und Bindegewebe der Adventitia aufweist.
Venentransplantatimplantationsexperimente zeigen die Lebensfähigkeit der Venensegmente nach der Vitrifikation im Vergleich zu frischen autologen Venen in der Karotidposition als Kontrollverfahren. Weiße Neuseelandkaninchen (durchschnittliches Gewicht 2,0 bis 2,5 kg) wurden einem rechtseitigen allgemeinen Interpositionskarotidtransplantbypass unterzogen. Die frischen oder vitrifizierten umgekehrten ipsilateralen äußeren Jugularvenen wurden als syngene Transplantate verwendet. Die Tiere wurden entweder zwei oder vier Wochen nach der Implantation getötet. Die Venentransplantate wurden für histologische Studien entnommen.
Operatives Verfahren:
In weißen Neuseelandkaninchen wurde durch eine Injektion einer Mischung aus Ketaminhydrochlorid (60 mg/kg) und Xylazin (6 mg/kg) eine Anästhesie induziert und diese wurde in den intubierten Tieren unter Verwendung von Isofluran in Sauerstoff aufrecht erhalten. Zum Zeitpunkt der Induktion wurde eine Einzeldosis antibiotischer Prophylaxe in Form von Enrofloxacin (5 mg/kg) intramuskulär gegeben. Die Operation wurde mit einem Operationsmikroskop unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Nach dem Freilegen durch einen rechten Nackeneinschnitt in Längsrichtung wurde die rechte externe Jugularvene identifiziert; ihre Abzweigungen wurden kauterisiert und entfernt. Frische Venen wurden sofort implantiert. Vitrifizierte Venen wurden im Labor wieder erwärmt und in DMEM-Medium auf Eis zum Operationsraum transportiert.
Zum Zeitpunkt der Implantation wurde die rechte gemeinsame Karotidarterie identifiziert und seziert. Heparin (200 IU/kg) wurde intravenös gegeben. Eine proximale Längsarteriotomie wurde durchgeführt und ein Ende der umgekehrten Jugularvene wurde mit einer kontinuierlichen 8-0-mikrovaskularen Prolennaht End-zu-Seite an die Arterie anastomisiert. Die distale Anastomosie wurde in ähnlicher Weise durchgeführt (6, A–B). Während der gesamten Prozedur wurde darauf geachtet, unnötiges Instrumentieren des Venentransplantats zu vermeiden. Die rechte gemeinsame Karotis wurde zwischen den zwei Anastomosen mit 4–0 Seidenligationen ligiert und aufgeteilt. Es wurde Hämostasis erreicht und die Wunde anschließend in Schichten geschlossen.
Während der Erholungsphase wurde ein Schmerzmittel (Buprenorphin 0,05 mg/kg, S.C.) wenn notwendig bereitgestellt. Die Tiere wurden täglich auf Zeichen von Infektion, Krankheit, Verletzung oder abnormalem Verhalten hin beobachtet. Kranke oder verletzte Tiere wurden sofort in tierärztliche Behandlung gegeben oder eingeschläfert. Zum Zeitpunkt des Entnehmens der Transplantate wurden unter den gleichen zuvor beschriebenen Anästhesiebedingungen die originalen Einschnitte wieder geöffnet und die beiden Venentransplantate und die nicht operierte contralaterale Venen isoliert. Im Anschluss an die Heparinisation wurden die Venentransplantate und die contralateralen Kontrollen in situ mit einem Druck von 8 mm Quecksilber (6, C–D) perfusionsfixiert. Die Transplantate wurden anfänglich mit einer standardisierten Infusion von Ringers Laktatlösung gefolgt von 2 % Glutaraldehyd in 0,1 molarem Kakodylatpuffer durchspült, wobei dieser mit 0,1 M Saccharose ergänzt war, um eine Osmolalität von etwa 300 mOsm/kg zu erhalten. Nach dem Eintauchen in das Fixiermittel für 24 bis 48 Stunden wurde das Transplantat in proximale, mittlere und distale Stücke (6, E–F) aufgeteilt. Querschnitte vom zentralen Bereich und Längssektionen der proximalen und distalen Anastomosiebereiche wurden für histologische Studien genommen.
Implantatsdurchgängigkeit:
Unter Verwendung dieser Techniken wurden zehn frische Transplantate entnommen, wobei neun Implantate zwei oder vier Wochen nach der Operation durchgängig waren. Ein Vier-Wochen-Transplantat, das nicht durchgängig war, konnte nicht auf technische Komplikationen zurückgeführt werden. In dieser Studie wurden ähnliche Durchgängigkeitsergebnisse erreicht wie die, die von anderen Forschern unter Verwendung der gleichen operativen Verfahren erhalten wurden. Zusätzlich dazu wurden zwölf vitrifizierte Transplantate entnommen und elf Transplantate verblieben durchgängig. Das fehlgeschlagene Implantat wurde zum Zeitpunkt der Entnahme entdeckt. Dies ging auf einen Operationsfehler zurück, der in der proximalen Anastomosie gemacht wurde, und der den Blutfluss blockierte. Diese Studie zeigte ähnliche Durchgängigkeitsraten in frischen und vitrifizierten autologen Venentransplantaten. Die Studie schloss außerdem ein Allotransplantatvenensegment ein, das zwei Wochen nach der Explantation durchgängig war.
Histologische Studie:
7 zeigt die Morphologie von nicht operierten Venen, frischen Venentransplantaten und vitrifizierten Venentransplantaten unter Mikat- oder H&E-Färbung. Nicht operierte Kontrollvenen zeigten unveränderte endotheliale Zellen auf der Intimaoberfläche und ihre Wände bestanden aus einem Paar Schichten von glatten Muskelzellen (7, A–B). Zwei Wochen nach der Transplantation erschien in den frischen Venentransplantaten (7, C–D) eine wuchernde Läsion-intimale Hyperplasie in den glatten Muskelzellen und ein verdicktes Medium. In ähnlicher Weise entwickelten die vitrifizierten Venen eine intimale Hyperplasieschicht, die jedoch viel dünner war als in den frischen Venentransplantaten (7, E–F). Diese Studie zeigt, dass die intimale Hyperplasie in Venentransplantaten, die durch Vitrifikation vorbehandelt wurden, vermindert war. Diese verminderte intimale Hyperplasie war eine besonders unerwartete Feststellung.
Physiologische Studie:
Venenringe, die aus etwa 4 mm langen Segmenten von externen Kaninchenjugularvenen bestanden, wurden in VS55 mit der zuvor für längere externe Jugularvenensegmente beschriebenen Methode vitrifiziert, mit dem Unterschied, dass kein Durchspülen verwendet wurde. Nachdem sie wieder erwärmt wurden, wurden die Venenringe zwischen zwei rostfreien Stahldrahthaken befestigt und in einem Bad für glatte Gefäßmuskeln aufgehängt, das 5 ml Krebs-Henseleit-(KH)-Lösung aufwies, die kontinuierlich mit 95 % O₂ und 5 % CO₂ bei 37°C begast wurde. Die Basisspannung aller Venenringe wurde auf 0,25 bis 0,75 g eingestellt. Die Veränderungen in der Spannung wurden mit Kraftaufnehmern aufgezeichnet. Nach 1 Stunde Äquilibrationszeit wurden die Venenringe mit Kaliumchlorid auf Kontraktion vorgetestet. Nach Spülen mit KH-Lösung wurden die Venenringe vor dem Start des Experiments für weitere 30 Minuten äquilibriert. Während des Relaxationsexperiments wurde die Kontraktion der Venenringe durch 10^–6 M Norepinephrin ausgelöst und nach den kontraktilen Antwortplateaus wurden kumultative Konzentrationen von Acetylcholin (10^–10°M bis 10^–4 M) zu dem Badmedium hinzugegeben, um die vom Endothelium abhängige Relaxationsantwort zu induzieren.
In der vorliegenden Studie wurden Histamin, Bradykinin, Angiotensin II und Norepinephrin mit Kaninchenjugularvenenringsegmenten, die mit VS55 vitrifiziert wurden und mit frischen Venenringen getestet. Sowohl Histamin als auch Bradykinin erzeugten eine Kontraktion in der Vene und zwar über deren lokaler Rezeptoren. Norepinephrin wirkt direkt auf den Adrenorezeptor, während Angiotensin II an den AT-Rezeptor bindet und dadurch auf die lokalen Renin-Angiotensinsysteme wirkt.
Die nachfolgende Tabelle 4 zeigt, dass die vitrifizierten Ringe im Vergleich zu den frischen Venenringen ähnliche kontraktile Funktionen erzeugen.
TABELLE 4
Vitrifizierte Venenringe vitrifiziert mit Vitrifikationslösung VS55 (n = 26)
Kontrolle = frische Venenringe (n = 15).
% = Prozent der entsprechenden frischen Kontrollen.
Arterienringe wurden mit der gleichen Methode, die zuvor für Venenringe beschrieben wurde, in VS55 vitrifiziert. Nachdem diese wieder erwärmt wurden, wurden Norepinephrin und Phenylephrin in Arterienringsegmenten, die mit VS55 vitrifiziert wurden, und frischen Arterienringen getestet.
Die nachfolgende Tabelle 5 zeigt, dass die vitrifizierten Arterienringe im Vergleich zu frischen Arterienringen ähnliche kontraktile Funktionen erzeugen.
TABELLE 5
Vitrifizierte Arterienringe vitrifiziert mit Vitrifikationslösung VS55 (Norepinephrin n = 37, Phenylephrin n = 23).
Kontrolle = frische Venenringe (Norepinephrin n = 16, Phenylephrin n = 12).
% = Prozent der entsprechenden frischen Kontrollen.

Claims

Verfahren zur Vitrifikation eines Blutgefäßes, das Folgendes aufweist, nämlich: Eintauchen des Blutgefäßes in eine Reihe von Lösungen, die schrittweise ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um eine für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration zu erreichen, wobei jede Lösung der Reihe von Lösungen eine Temperatur über –15°C aufweist; Abkühlen des Blutgefäßes unter physiologischem Druck von einer Temperatur über –15°C auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur in einer Lösung, die eine für die Vitrifikation ausreichende Konzentration an Kälteschutzmittel aufweist, mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 30 bis 60°C pro Minute; und weiteres Abkühlen des Blutgefäßes von einer Temperatur über der Glasübergangstemperatur auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von weniger als 10°C pro Minute, um das Blutgefäß zu vitrifizieren.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Schritt des Eintauchens Folgendes aufweist, nämlich: (a) Eintauchen des Blutgefäßes in eine kälteschutzmittelfreie Lösung; (b) Eintauchen des Blutgefäßes in zumindest eine Lösung, die Kälteschutzmittel in einer Konzentration aufweist, die geringer ist als die für die Vitrifikation ausreichende Konzentration; und (c) Eintauchen des Blutgefäßes in eine Lösung, die Kälteschutzmittel in der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Blutgefäß in jedem der Schritte (a) bis (c) auch mit der Lösung durchspült wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei in jedem der Schritte (a) bis (c) das Blutgefäß für eine ausreichende Zeit in die Lösung eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei in jedem der Schritte (a) bis (c) das Blutgefäß für zumindest 10 Minuten in die Lösung eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei Schritt (b) Folgendes aufweist, nämlich Eintauchen des Blutgefäßes in eine Reihe von vier Lösungen, die ansteigende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, wobei jede von diesen eine Kälteschutzmittelkonzentration aufweist, die geringer ist als die für die Vitrifikation ausreichende Konzentration.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Blutgefäß für eine ausreichende Zeit in jede Lösung der Reihe von vier Lösungen eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das Blutgefäß für zumindest 10 Minuten in jede Lösung der Reihe von vier Lösungen eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die vier ansteigenden Konzentrationen wie folgt sind, nämlich 5 bis 20 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration; 15 bis 35 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration; 40 bis 60 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration und 65 bis 85 % der für die Vitrifikation ausreichenden Kälteschutzmittelkonzentration.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kälteschutzmittellösung Dimethylsulfoxid, Formamid, und 1,2-Propandiol aufweist
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Kälteschutzmittellösung 20 bis 30 % w/v Dimethylsulfoxid, 10 bis 20 % w/v Formamid und 10 bis 20 % w/v 1,2-Propandiol aufweist.
Verfahren zum Entnehmen eines Blutgefäßes aus dem Zustand der Vitrifikation in einer Lösung, die Kälteschutzmittel aufweist, das Folgendes aufweist, nämlich: Erwärmen des vitrifizierten Blutgefäßes in der Kälteschutzmittel enthaltenden Lösung auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 20 bis 40°C pro Minute; weiteres Erwärmen des Blutgefäßes in der Lösung auf eine Temperatur über –75°C mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 200 bis 300°C pro Minute, wobei bei dieser Temperatur die Lösung ausreichend flüssig ist, so dass die Blutgefäße daraus entnommen werden können; und Eintauchen des Blutgefäßes in eine Reihe von Lösungen, die schrittweise abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um ein Blutgefäß in einer kälteschutzmittelfreien Lösung zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei jede Lösung der Reihe von Lösungen eine Temperatur von über –15°C aufweist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei in jedem Schritt des Eintauchens das Blutgefäß auch mit der Lösung durchspült wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Blutgefäß für eine ausreichende Zeit in jede Lösung der Reihe von Lösungen eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Blutgefäß für zumindest 10 Minuten in jede Lösung der Reihe von Lösungen eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Blutgefäß in eine Reine von sechs Lösungen eingetaucht wird, die abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, wobei die sechste Lösung kälteschutzmittelfrei ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Blutgefäß für eine ausreichende Zeit in jede Lösung der Reihe von sechs Lö sungen eingetaucht wird, um in etwa ein osmotisches Gleichgewicht zu erreichen.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das Blutgefäß für zumindest 10 Minuten in jede Lösung der Reihe von sechs Lösungen eingetaucht wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Kälteschutzmittelkonzentration der sechs Lösungen wie folgt ist, nämlich 40 bis 60 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration; 30 bis 45 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration; 15 bis 35 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration, 5 bis 20 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration, 2,5 bis 10 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration und 0 % der für die Vitrifikation ausreichenden Konzentration.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei jede der sechs Lösungen einen osmotischen Puffer aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei der osmotische Puffer ein osmotischer Puffer mit niedrigem Molekulargewicht ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der osmotische Puffer Mannitol ist.
Verfahren nach Anspruch 21, das weiterhin Folgendes aufweist, nämlich Eintauchen des Blutgefäßes in eine zweite kälteschutzmittelfreie Lösung, die keinen osmotischen Puffer, nach dem Eintauchen in die kälteschutzmittelfreie Lösung, die einen osmotischen Puffer aufweist.
Verfahren zur Vitrifikation eines Blutgefäßes und anschließend Entnehmen aus dem Zustand der Vitrifikation, das Folgendes aufweist, nämlich eine Vitrifikation des Blutgefäßes nach Anspruch 1; Erwärmen des vitrifizierten Blutgefäßes auf eine Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 20 bis 40°C pro Minute; weiteres Erwärmen des Blutgefäßes auf eine Temperatur über –75°C mit einer durchschnittlichen Geschwindigkeit von 200 bis 300°C pro Minute; und Eintauchen des Blutgefäßes in eine Reihe von Lösungen, die schrittweise abnehmende Konzentrationen an Kälteschutzmittel aufweisen, um ein Blutgefäß in einer kälteschutzmittelfreien Lösung zu erhalten.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei im Vergleich zu frischen Blutgefäßen zumindest 70 % der Funktion der glatten Muskeln und der Implantatsdurchgängigkeitsrate der Blutgefäße beibehalten werden.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Verfahren im Vergleich zu frischen Blutgefäßen eine verminderte intimale Hyperplasie in dem Blutgefäß schafft.
[gestrichen]
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und 25 bis 27, wobei das Blutgefäß unter physiologischen Drücken von einer Temperatur über der Glasübergangstemperatur auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur abgekühlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und 25 bis 27, wobei das Blutgefäß mit einer Geschwindigkeit von weniger als 5°C pro Minute von einer Temperatur über der Glasübergangstemperatur auf eine Temperatur unter der Glasübergangstemperatur abgekühlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 24, wobei die Temperatur zwischen –80°C und der Glasübergangstemperatur zwischen –90°C und –110°C liegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 24, wobei das Verfahren unter physiologischen Drücken durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und 25 bis 27, wobei die für die Vitrifikation ausreichende Kälteschutzmittelkonzentration zwischen 6 und 9,5 M liegt.