JPH0834701A - 生物組織保存方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 生物の器官を構成する組織を、その特性や機
能が細胞レベルで維持されるように保存する方法の提
供。 【構成】 器官内の血液を、溶血を生じない第一糖質液
で置換し、さらに有機溶媒を含む第二糖質液で置換する
ことにより、組織中での氷や溶質の結晶の発生を防止し
て、液体窒素温度まで冷却し、組織を保存する。組織試
料を金属針集合体に刺し通すことにより、冷却が均一
に、解凍が均一かつ速やかに行なわれる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は生物組織保存方法、特に
組織を構成する細胞の特性および機能を維持することの
できる生物組織の低温保存方法および保存再生方法に関
するものである。

【０００２】

【従来の技術】バクテリア等の微生物や、卵子、精子、
培養細胞等の細胞を、活性が５０％以上維持されるよう
に保存するため、細胞を毎分１℃前後の速さで徐々に冷
却し、−２００℃前後で保存し、保存終了時には急速に
融解（解凍）する方法が知られている。この際細胞の凍
結による破壊を防ぐために、細胞を１０％グリセリンま
たは５〜１０％ジメチルスルホキシド水溶液中に置く。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】微生物、卵子、精子等
の個別の細胞は上記の方法により比較的長期間保存する
ことができる。しかし動物の器官、例えば肝臓、腎臓等
の器官にこのような液を注入すると、保存された組織の
細胞の特性や機能の損失が著しかった。

【０００４】本発明の目的は、生物の器官を構成する組
織を、その特性や機能が細胞レベルで維持されるように
保存する方法を提供することである。また本発明の目的
は、生物の器官を構成する組織を、その特性や機能が細
胞レベルで維持されるように保存した後、生物活性を回
復させる方法を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明の生物組織保存方
法は、この目的を達成するために、動物の所定の器官に
通ずる血管に実質的に溶血を生じない第一の糖質液を注
入して、器官中の血液を第一の糖質液で置換し、水溶液
が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結晶を
生じない糖質と、水との混合液が液体窒素温度において
相分離せずかつ実質的に結晶を生じない有機溶媒とを含
む第二の糖質液を血管に注入して、血管内にある第一の
糖質液を第二の糖質液で置換し、器官の全部または所定
の部分を切除し、平行に固定された多数の金属針から成
る針集合体にこの切除された器官の試料を刺し通し、所
定の速度で徐々に冷却し、さらに液体窒素温度まで温度
を低下させて、針集合体に刺し通した試料を液体窒素温
度で保存し、保存を終了する際には針集合体の少なくと
も一部の温度を急速に２０℃以上にして、試料の温度を
第二の糖質液の氷点以上まで速やかに上昇させ、試料を
針集合体から引き抜くことから成る。この発明は動物の
臓器等の器官のみならず、筋肉等の結合組織にも適用で
きる。

【０００６】血液の第一および第二の糖質液による置換
（以下、潅流と言う）後に組織試料を切除する代わり
に、潅流前あるいは潅流の間に動物から器官の全部又は
所定の部分を切除してもよい。所定の部分とは、例えば
肝臓における肝葉の一つ又は二つである。潅流又は切除
を行なうには、動物の手術を行なう必要がある。切除後
潅流を行なう場合、潅流後にさらに組織の一部を試料と
して切除してもよい。

【０００７】手術を施す前に動物の、特に対象となる器
官付近の、末梢神経を遮断しておくことが組織機能の保
持のために好ましい。対象器官付近の末梢神経の遮断
は、モノアミンオキシダーゼ（以下、ＭＡＯと略記）阻
害作用を有する物質を血管内または腹腔内に注入するこ
とにより達成できる。本発明に適用できるＭＡＯ阻害物
質には、例えばN-アミノアルキルフェノチアジン系化合
物、N-アミノアルキルジベンゾアザシクロヘプタジエン
系化合物、イソニコチン酸ヒドラジド系化合物、プロパ
ルギルアミン誘導体がある。例えば、クロルプロマジ
ン、プロメタジン、イミプラミン、イプロニアジド、パ
ルジリン等である。潅流液中にもＭＡＯ阻害物質を添加
してもよい。

【０００８】潅流は、通常、器官に通ずる血管に留置針
（中空）を刺し込んで行なう。流量は、器官の種類、血
管の種類、太さに応じて選ばれる。第一および第二の糖
質液による置換は、それぞれ血液及び第一の糖質液が実
質的に残らないように、十分行なう。

【０００９】第二の糖質液に含まれる糖質は、例えばマ
ンニット(mannitol)やイヌリンのように、液体窒素温度
において相分離せずかつ実質的に結晶を生じないような
糖質でなければならない。実質的に結晶を生じないと
は、保存後の組織の構造および生物活性に損傷を与える
程度の結晶を生じないことを意味する。この糖質は、細
胞内に浸透する必要はなく、むしろ細胞内に浸透しにく
いものが好ましい。

【００１０】第一の糖質液は、組織の生物活性の維持に
役立つような糖質、例えばグルコースを含むことが好ま
しい。グルコースの濃度は、組織中のグルコース濃度と
等しい、又はできるだけ近い濃度とすることが好まし
い。第一の糖質液は、組織中への血球成分の残留の原因
となる溶血を起こさない組成とすることが必要である。
実質的に溶血を生じないとは、溶血による組織の構造お
よび生物活性の損傷がないことを意味する。

【００１１】第一及び第二の糖質液は実質的に組織に対
し等張(isotonic)であることが好ましいが、血液やリン
パ液の１／２ないし２倍の範囲の浸透圧であればよい。
第一および第二の糖質液はそれぞれ、糖のほか塩類、
酸、塩基、緩衝剤、界面活性剤、増粘剤等を含んでもよ
い。潅流に用いる第一及び第二の糖質液の温度は、組織
の変化を防ぐため、液の氷点以上のなるべく低い温度
（通常、−１０℃ないし＋５℃）に保つことが好まし
い。

【００１２】第二の糖質液に用いる有機溶媒は、水との
混合液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に
結晶を生じないものでなければならない。実質的に結晶
を生じないとは、保存後の組織の構造および生物活性に
損傷を与える程度の結晶を生じないことを意味する。こ
のような性質を具える有機溶媒は、例えば、グリセリ
ン、ジメチルスルホキシドである。第二の糖質液中の有
機溶媒の濃度は５〜１０％が適当であるが、これより若
干低く（例えば３％）あるいは若干高く（例えば１５
％）てもよい。

【００１３】針集合体に用いる金属針および金属台座
は、少なくとも表面が、組織、糖液に影響を与えず、ま
たそれらによって錆や腐蝕を生じない金属から成るもの
が好ましい。例えば、ステンレス鋼、金、白金、金めっ
き、クロムめっき（鉄、黄銅など）等を用いる。

【００１４】金属針の太さは、組織試料を刺し通すのに
十分な機械的強度を与える太さとする必要がある。金属
針が太いほど、また間隔がせまいほど、熱伝導が速やか
で、低温での保存を終了する際に組織試料の温度を速く
上昇させることができるが、組織試料全体の機械的損傷
は大きくなる。金属針の太さは0.2 ないし1.6 ｍｍ、間
隔（中心間）は0.5 ないし４ｍｍが適当である。

【００１５】金属針に刺し通した組織試料の冷却は、少
なくとも−８０℃までを徐々に行なうことが望ましく、
例えば温度低下を−８０℃まで平均毎分１.3℃以内とす
るのが望ましい。このような温度低下は、例えば試料を
適当な大きさの保冷箱に収めて、−８０℃の冷凍庫中に
置けば実現できる。プログラム制御された冷凍庫を用い
てもよい。

【００１６】保存を終了する際には、針集合体の少なく
とも一部の温度を急速に（例えば２分以内で）20℃以上
にすることにより、試料の温度を第二の糖質液の融点以
上の温度（通常−５℃ないし＋５℃、例えば４℃）まで
急速に上昇させ、解凍する。具体的には例えば、金属台
座の周りに適当量の20℃ないし40℃の微温水（水以外の
液体でもよい）を流す。あるいは金属針集合体に刺し通
された試料の回りに適当な温度の潅流液（糖質液）を流
す。このような方法で、組織試料の温度を、好ましくは
４分以内に、第二の糖質液の氷点以上に上昇させ、解凍
する。

【００１７】試料が融解した後、適当な手段で、例えば
金属針の基部に刺し通した布や合成紙を引き抜くことに
より、組織試料を針集合体から引き抜く。引き抜いた組
織試料は適当な温度、例えば４℃の生理食塩水、糖質
液、組織培養液、その他で潅流し、少なくとも必要とす
る生物活性を回復させて、それ以後の用に供される。

【００１８】生物活性を回復させるためには、適当な組
成の液（例えば、第一の糖質液と同じ液）で潅流しなが
ら、組織の解凍に必要な温度から約２５℃まで最小限度
以上の時間をかけて温度を上昇させ、さらに３７℃付近
まで上昇させる。最小限度の時間は５分であり、１０分
以上かけて２５℃まで温度を上げることが好ましい。温
度２５℃から３７℃付近への上昇には特に時間の制限は
ない。この段階で用いる潅流液には、dibutyryl cyclic
ＡＭＰを含んでもよく、低酸素濃度下での細胞膜損傷の
防止に有用である。潅流液にはまたhydrocortizoneを含
んでもよい。

【００１９】本発明は、特に哺乳動物の、肝臓、腎臓、
すい臓、脾臓、精巣、卵巣、副腎、脳、甲状腺等の低温
保存に有用である。肝臓の低温保存に特に効果的であ
る。

【００２０】

【作用】動物の器官に通ずる血管に第一の糖質液を注入
して、血液を第一の糖質液で置換することにより、器官
中の血液は排除される。さらに第二の糖質液を血管に注
入して、第一の糖質液を第二の糖質液で置換することに
より、第一の糖質液は排除され、血管内は第二の糖質液
で満たされる。このとき、洞様血管、細胞間隙も第二の
糖質液で満たされる。

【００２１】切除（潅流前又は潅流中に切除してもよ
い）された組織試料を、金属台座に平行に固定された多
数の金属針から成る針集合体に刺し通し、徐々に冷却す
ると、刺し通された金属針を介する熱伝導により、組織
試料全体の温度は比較的均一に保たれる。液体窒素温度
までさらに温度を低下させ、この温度に保つことによ
り、針集合体に刺し通された組織試料は液体窒素温度で
保存される。

【００２２】血管から組織に導入された第二の糖質液
は、水溶液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質
的に結晶を生じない糖質を含むので、液体窒素温度でも
糖質自体及び氷の結晶が、少なくとも組織の細胞の外
（血管内、洞様血管、細胞間隙を含む）には生じない。
また第二の糖質液は、水とよく混和し、水との混合液が
液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結晶を生
じない有機溶媒を含む。この有機溶媒は細胞内にも浸透
する。細胞内外ともにこの有機溶媒が存在するために、
液体窒素温度において組織中に氷も溶媒（あるいは共融
体）結晶も生じない。それ故、氷および溶媒結晶の生成
による細胞の破壊が防がれる。

【００２３】保存を終了する際に、針集合体の少なくと
も一部の温度を急速に２０℃以上にすると、組織試料の
温度が第二の糖質液の融点以上まで上昇し、金属針と接
する部分が融解すると、試料は針集合体から引き抜くこ
とができる。さらに組織の温度を２５℃以上に上昇させ
ると、組織はその生物活性を回復する。刺し通された金
属針集合体を介した熱伝導により、金属針集合体を用い
ない場合に比べて、組織試料全体の温度が速やかにかつ
比較的均一に上昇する。試料全体のこの急速かつ均一な
温度上昇のために、組織細胞の特性および機能は損なわ
れることがなく、その後の環境（温度等）の調整により
回復することができる。

【００２４】

【実施例】以下に実施例を示し、本発明のさらに具体的
な説明とする。 ［実施例１］ (1) 金属針集合体の製作 外径０．３ｍｍ長さ１５ｍｍのステンレス鋼注射針（注
射筒への連結部を省いたもの）を、低融点合金の台座に
１ｍｍ間隔で縦１０列、横１２列直立（先端を上向き
に）させた。挿入した組織試料を取り出すため、太さ
０．６ｍｍのガラス棒を台座に沿って針の間に格子状に
挿入した。

【００２５】(2) 肝臓潅流 健康なラットに開腹手術を施し、肝門脈に留置針を挿入
した。肝潅流の常法に従い、留置針に連結したポリエチ
レン細管から、温度４℃とした下記組成の第一潅流液を
毎分４ミリリットルの流量で肝門脈に注入し、５分間潅流し
た。 Ｄ−マンニット １ｇ Krebs-Ringer緩衝液 ２０ミリリットル 次いで、温度４℃とした下記組成の第二潅流液を毎分４
ミリリットルの流量で肝門脈に注入し、５分間潅流した。 ジメチルスルホキシド ２ｇ Ｄ−マンニット １ｇ Krebs-Ringer緩衝液 ２０ミリリットル

【００２６】(3) 低温保存 潅流直後、肝臓を摘出し、金属針集合体に刺し通した。
これを発泡ポリスチレン保冷箱に収めた上で、−８０℃
の冷凍庫中に収めた（毎分１℃以内でゆっくり冷却され
る）。３時間以上経過後、保冷箱に適量の液体窒素を注
いで、更に冷却した。液体窒素を補充しながら、肝臓試
料を３週間保存した。

【００２７】(4) 組織の解凍 温度２５℃の恒温水槽の深さ２ミリメートルの位置に網板を固
定した。金属針に通した肝臓試料をそのまま保冷箱から
取り出し、この網板の上にのせた。金属台座が周りに流
れる２５℃の恒温水で加熱される。２分後に取り出し、
金属針の台座側に挿入されたガラス棒の格子を用いて、
肝臓試料を押し出して、針から取り外した。取り外した
肝臓に門脈から温度４℃の第一潅流液を毎分４ミリリットルの
流量で注入して、５分間潅流し、肝臓中の第二潅流液を
第一潅流液で置換した。

【００２８】(5) 組織保存の確認 肝臓試料をホルマリン固定した後、厚さ５ミクロンの切片に
して染色した。顕微鏡観察の結果、肝臓の細胞がよく保
存されており、特にグリコーゲン顆粒が明瞭に認められ
た。

【００２９】［実施例２］ (1) 組織採取および潅流 健康なラットの腹腔にクロロブロマジン１％水溶液０．
１ml／体重100gを注射して腹部の末梢神経を遮断し、体
重100g当たり0.04mgのソムノペンチルを注射して麻酔し
た後、開腹手術を施し、ポリエチレン細管と連結された
留置針を肝門脈に挿入した。肝潅流の常法に従い、留置
針に連結したポリエチレン細管から、温度を−５℃とし
た下記組成の第一潅流液を毎分 0.9ミリリットルの流量で肝門
脈に注入し、４分間潅流した。潅流しつつ肝臓をラット
から定法により切除した。 Ｄ−グルコース 2 ｇ ＢＳＡ 4.5 ｇ 酵素阻害剤Pefabloc(Merck) 1 mM相当 p-APMSF 0.1 mM相当 (p-amidinophenylmethanesulfonylfluoride hydrochlor
ide) Krebs-Henseleit 緩衝液 100 ミリリットル (pH 7.4) クロロブロマジン 1 ｇ ヘパリン 0.5 ミリリットル

【００３０】摘出した肝臓を直ちに、温度−５℃とした
下記組成の液（第二潅流液）中に浸漬するとともに、第
二潅流液を毎分 0.9ミリリットルの流量で肝門脈に注入し、４
分間潅流した。 ジメチルスルホキシド 10ｇ Ｄ−マンニット 5ｇ Ｄ−グルコース 2 ｇ ＢＳＡ 4.5ｇ 酵素阻害剤Pefabloc(Merck) 1 mM相当 p-APMSF 0.1mM相当 Krebs-Henseleit 緩衝液 100 ミリリットル (pH 7.4)

【００３１】(2) 低温保存 潅流直後、肝臓を金属針集合体（金めっき黄銅針、針の
直径 0.8mm、中心間隔３mm、針の高さ20mm、金属台座の
厚さ５mm）に刺し通した。予め金属針の基部には合成紙
を刺しておく。これを耐寒ポリエチレン袋に封入し、毎
分−１℃に設定したプログラム制御冷凍庫中で−８０℃
まで冷却した。３時間以上経過後、保冷箱中で適量の液
体窒素を注いで更に冷却した。液体窒素を補充しなが
ら、肝臓試料を３週間保存した。

【００３２】(3) 組織の解凍 液体窒素中から試料の容器を取り出し、−８０℃の冷凍
庫中にしばらく置いた後、第一潅流液と同じ組成の解凍
液中で、液を循環させることにより組織重量50ク゛ラムの場
合に２分未満の短時間で試料全体の温度を−４℃まで上
昇させた。

【００３３】解凍液中で試料を金属針集合体から抜き取
り、留置針から門脈へ温度−４℃の第一潅流液を毎分１
ミリリットルの流量で注入して、４分間潅流し、肝臓中の第二
潅流液を第一潅流液で置換した。

【００３４】組織の一部を常法により固定、染色し、光
学顕微鏡観察したところ、切除直後（第一潅流液による
潅流のみ）の組織と比較して、組織の変化はほとんど見
られなかった。

【００３５】［実施例３］ (1) 潅流の準備 健康なラットの腹腔に体重100g当たり０．１mlのクロル
プロマジン１％水溶液を注射して腹部の末梢神経を遮断
し、１ml当たり1000ＩＵのヘパリン液を、体重100g当た
り50マイクロリットル注射した後、常法によりハロセン麻酔し
て、開腹手術を行ない、ポリエチレン細管と連結された
留置針を肝門脈に挿入した（門脈カニュレーション）。
同様な方法で下大動脈にもカニュレーションを施し（下
大動脈カニュレーション）、下大動脈と下大静脈をまと
めて結紮した。大動脈をクレンメルで止めておき、胸郭
を開いて大動脈および大静脈を切断した。

【００３６】(2) 潅流 下大静脈の結紮部を切断し、温度を−５℃とした下記組
成の第一潅流液を、下大動脈カニュレーションを通じて
毎分 1.5ミリリットルの流量で下大動脈に、門脈カニュレーシ
ョンを通じて毎分 1.0ミリリットルの流量で肝門脈に、それぞ
れ注入し、１０分間潅流した。肝臓から血液が充分排除
されたことを確認した上で、肝臓をラットから摘出し
た。このとき門脈および下大動脈は、肝臓側に各カニュ
レーションを確保して切断される。 第一潅流液： Ｄ−グルコース 2 ｇ ＢＳＡ 3 ｇ Krebs-Henseleit 緩衝液 100 ミリリットル (pH 7.4) クロルプロマジン 0.01ｇ

【００３７】摘出した肝臓を直ちに、温度−５℃とした
下記組成の液（第二潅流液）中に浸漬するとともに、こ
の第二潅流液を下大動脈カニュレーションを通じて毎分
1.5ミリリットルの流量で下大動脈に、門脈カニュレーション
を通じて毎分 1.0ミリリットルの流量で肝門脈に、それぞれ注
入し、１０分間潅流した。 ジメチルスルホキシド 10 ｇ Ｄ−マンニット 5 ｇ ＢＳＡ 3 ｇ Krebs-Henseleit 緩衝液 100 ミリリットル (pH 7.4)

【００３８】(2) 低温保存 潅流直後、肝臓を金属針集合体（金めっき黄銅針、針の
直径 0.8mm、中心間隔３mm、針の高さ20mm、金属台座の
厚さ５mm）に刺し通した。予め金属針の基部には合成紙
を刺しておく。これを耐寒ポリエチレン袋に封入し、毎
分−１℃に設定したプログラム制御冷凍庫中で−８０℃
まで冷却した。３時間以上経過後、保冷箱中で適量の液
体窒素を注いで更に冷却した。液体窒素を補充しなが
ら、肝臓試料を３週間保存した。

【００３９】(3) 組織の解凍 液体窒素中から試料の容器を取り出し、−８０℃の冷凍
庫中にしばらく置いた後、組織試料を第一潅流液と同じ
組成の解凍液（温度約３０℃）に浸し、液を循環させる
ことにより組織重量50ク゛ラムの場合に２分未満の短時間で
試料全体の温度を４℃まで上昇させた。

【００３３】解凍液中で試料を金属針集合体から抜き取
り、下記組成の第三潅流液を、下大動脈カニュレーショ
ンを通じて毎分 1.5ミリリットルの流量で下大動脈に、門脈カ
ニュレーションを通じて毎分 1.0ミリリットルの流量で肝門脈
に、それぞれ注入し、１０分間潅流し、肝臓中の第二潅
流液を第三潅流液で置換した。第三潅流液の温度は最初
４℃とし、潅流中に１分当たり約２．５℃の割合で温度
を２５℃まで上昇させた。 第三潅流液： Ｄ−マンニット 1 ｇ Ｄ−グルコース 1 ｇ ラクトビオン酸 50 ｍＭ ＢＳＡ 3 ｇ アスコルビン酸 0.1ｇ Krebs-Henseleit 緩衝液 100 ミリリットル (pH 7.4)

【００４０】組織の一部を常法により固定、染色し、光
学顕微鏡観察したところ、切除直後（第一潅流液による
潅流のみ）の組織と比較して、組織の変化はほとんど見
られなかった。

【００４１】実施例３において第三潅流液で潅流を終え
た肝臓を温度37℃、相対湿度 100％の箱の中に収め、18
5kＢｑの[2−¹⁴Ｃ] Diazepamを門脈カニュレーションか
ら注入し、その直後定量ポンプを用いて下記組成の代謝
実験用潅流液を１ml/minの流量で供給した。同時に動脈
カニュレーションを通じて同液を１.5ml/minの流量で供
給した。２０分間潅流を続け、このとき肝臓より流出す
る潅流液をロウトに受け、２分毎に試験管に採取した。

【００４２】採取した潅流液は３０００回転で１０分間
遠心分離し、その上清中の放射性代謝物を、薄層クロマ
トグラフィにより分離し、ラジオルミノグラフィにより
検出解析を行なった。その結果、流出液中には、親化合
物であるDiazepamのほかにその代謝物である4'-hydroxy
diazepam，Nordazepam, Temazepam, Oxazepam が検出さ
れた。これらは、凍結保存しない肝臓を用いて同じ実験
を行なった場合に認められる代謝物であり、本方法によ
り保存された肝臓組織が代謝活性を有することを示して
いる。

【００４３】また、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量し
たところ、いずれの流出液も約 100IU／リットルであり、２
０分間の潅流を通じて正常値を示した。これは、凍結、
解凍の過程を経ても肝臓組織が損傷を受けていないこと
を示す。

【００４４】

【発明の効果】本発明によって保存された器官、筋肉等
の生物組織は、その細胞の特性及び機能がよく維持され
る。本発明の方法は特に肝臓及び腎臓の組織の保存に有
効である。

Claims (66)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 動物の器官に通ずる血管に潅流液を注入
   して、前記器官中の血液を前記潅流液で置換し、前記動
   物から切除された前記器官の少なくとも一部を冷却し、
   液体窒素温度まで温度を低下させて前記器官の組織を保
   存する生物組織保存方法において、 前記血管に第一の潅流液として実質的に溶血を生じない
   第一の糖質液を注入して、前記器官中の血管内の血液を
   この第一の糖質液で置換し、 ついで前記器官に通ずる血管に第二の潅流液として、水
   溶液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結
   晶を生じない糖質と、水との混合液が液体窒素温度にお
   いて相分離せずかつ実質的に結晶を生じない有機溶媒と
   を含む第二の糖質液を注入して、前記器官中の前記第一
   の糖質液を前記第二の糖質液で置換し、その後液体窒素
   温度まで冷却することを特徴とする、生物組織保存方
   法。
2. 【請求項２】 前記第二の糖質液が前記糖質としてマン
   ニットを含む、請求項１の生物組織保存方法。
3. 【請求項３】 前記第二の糖質液が前記糖質としてイヌ
   リンを含む、請求項１の生物組織保存方法。
4. 【請求項４】 前記有機溶媒がジメチルスルホキシド又
   はグリセリンである、請求項１、２または３の生物組織
   保存方法。
5. 【請求項５】 前記第二の糖質液の温度が０℃以下であ
   る、請求項１ないし４いずれかの生物組織保存方法。
6. 【請求項６】 前記第一の糖質液による前記血液置換よ
   り後に前記器官の全部または所定の部分を前記動物から
   切除する、請求項１ないし５いずれかの生物組織保存方
   法。
7. 【請求項７】 前記第一の糖質液がグルコースを含む、
   請求項１ないし６いずれかの生物組織保存方法。
8. 【請求項８】 前記第一の糖質液がモノアミンオキシダ
   ーゼ阻害作用を有する物質を含む、請求項１ないし７い
   ずれかの生物組織保存方法。
9. 【請求項９】 前記動物が哺乳動物である、請求項１な
   いし８いずれかの生物組織保存方法。
10. 【請求項１０】 動物の器官に通ずる血管に潅流液を注
    入して、前記器官中の血液を前記潅流液で置換し、前記
    動物から切除された前記器官の少なくとも一部を冷却
    し、液体窒素温度まで温度を低下させて前記器官の組織
    を保存する生物組織保存方法において、 前記器官を含む領域の末梢神経を遮断し、 前記血管に第一の潅流液として実質的に溶血を生じない
    第一の等張糖質液を注入して、前記器官中の血管内の血
    液をこの第一の糖質液で置換し、 ついで前記器官に通ずる血管に第二の潅流液として、水
    溶液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結
    晶を生じない糖質と、水との混合液が液体窒素温度にお
    いて相分離せずかつ実質的に結晶を生じない有機溶媒と
    を含む第二の糖質液を注入して、前記器官中の前記第一
    の糖質液を前記第二の糖質液で置換し、その後液体窒素
    温度まで冷却することを特徴とする、生物組織保存方
    法。
11. 【請求項１１】 前記第二の糖質液が前記糖質としてマ
    ンニットを含む、請求項１０の生物組織保存方法。
12. 【請求項１２】 前記有機溶媒がジメチルスルホキシド
    又はグリセリンである、請求項１０または１１の生物組
    織保存方法。
13. 【請求項１３】 前記第二の糖質液の温度が０℃以下で
    ある、請求項１０ないし１２いずれかの生物組織保存方
    法。
14. 【請求項１４】 前記第一の糖質液による前記血液置換
    より後に前記器官の全部または所定の部分を前記動物か
    ら切除する、請求項１０ないし１３いずれかの生物組織
    保存方法。
15. 【請求項１５】 前記第一の糖質液がグルコースを含
    む、請求項１０ないし１４いずれかの生物組織保存方
    法。
16. 【請求項１６】 前記動物の血管内または腹腔内に末梢
    神経遮断剤を導入することにより末梢神経を遮断する、
    請求項１０ないし１５いずれかの生物組織保存方法。
17. 【請求項１７】 前記末梢神経遮断剤がモノアミンオキ
    シダーゼ阻害作用を有する物質である、請求項１０ない
    し１６いずれかの生物組織保存方法。
18. 【請求項１８】 前記動物が哺乳動物である、請求項１
    ０ないし１７いずれかの生物組織保存方法。
19. 【請求項１９】 動物から切除された器官の少なくとも
    一部を冷却し、液体窒素温度まで温度を低下させて保存
    する生物組織保存方法において、 前記切除された器官の少なくとも一部を、組織試料とし
    て、金属台座に平行に固定された多数の金属針から成る
    針集合体に刺し通し、 この針集合体に刺し通した前記試料を所定の速度で徐々
    に冷却し、さらに液体窒素温度まで温度を低下させ、液
    体窒素温度で保存することを特徴とする、生物組織保存
    方法。
20. 【請求項２０】 前記所定の速度は−80℃まで平均毎分
    １．３℃以内である、請求項１９の生物組織保存方法。
21. 【請求項２１】 動物から切除された器官の少なくとも
    一部を冷却し、液体窒素温度まで温度を低下させて保存
    する生物組織保存方法において、 前記切除された器官の少なくとも一部を、組織試料とし
    て、金属台座に平行に固定された多数の金属針から成る
    針集合体に刺し通し、 この針集合体に刺し通した前記試料を所定の速度で徐々
    に冷却し、さらに液体窒素温度まで温度を低下させて、
    液体窒素温度で保存し、 保存を終了する際に、前記組織試料の生物活性を復活さ
    せるため、前記針集合体の台座の温度を４分を超えない
    時間内に２０℃以上とすることを特徴とする、生物組織
    保存方法。
22. 【請求項２２】 保存を終了する際に前記台座の温度を
    ３分以内に２０℃以上とする、請求項２１の生物組織保
    存方法。
23. 【請求項２３】 動物の器官に通ずる血管に潅流液を注
    入して、前記器官中の血液を前記潅流液で置換し、前記
    動物から切除された前記器官の少なくとも一部を冷却
    し、液体窒素温度まで温度を低下させて保存する生物組
    織保存方法において、 前記血管に第一の潅流液として実質的に溶血を生じない
    第一の糖質液を注入して、前記器官中の血管内の血液を
    この第一の糖質液で置換し、 ついで前記器官に通ずる血管に第二の潅流液として、水
    溶液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結
    晶を生じない糖質と、水との混合液が液体窒素温度にお
    いて相分離せずかつ実質的に結晶を生じない有機溶媒と
    を含む第二の糖質液を注入して、前記器官中の前記第一
    の糖質液を前記第二の糖質液で置換し、 前記動物から切除された前記器官の少なくとも一部を組
    織試料として、金属台座に平行に固定された多数の金属
    針から成る針集合体に刺し通し、 この針集合体に刺し通した組織試料を、所定の速度で徐
    々に冷却し、さらに液体窒素温度まで温度を低下させ、
    液体窒素温度で保存することを特徴とする、生物組織保
    存方法。
24. 【請求項２４】 前記有機溶媒がジメチルスルホキシド
    またはグリセリンである、請求項２３の生物組織保存方
    法。
25. 【請求項２５】 前記第二の糖質液が前記糖質としてマ
    ンニットを含む、請求項２３または２４の生物組織保存
    方法。
26. 【請求項２６】 前記第二の糖質液が前記糖質としてイ
    ヌリンを含む、請求項２３または２４の生物組織保存方
    法。
27. 【請求項２７】 前記第一の糖質液が主たる糖質として
    マンニットを含む請求項２３ないし２６いずれかの生物
    組織保存方法。
28. 【請求項２８】 前記第一の糖質液がグルコースを含む
    請求項２３ないし２６いずれかの生物組織保存方法。
29. 【請求項２９】 前記所定の速度が−８０℃まで平均毎
    分１．３℃以内である請求項２３ないし２８いずれかの
    生物組織保存方法。
30. 【請求項３０】 前記第一の糖質液による前記血液置換
    より後に前記器官の全部または所定の部分を前記動物か
    ら切除する、請求項２３ないし２９いずれかの生物組織
    保存方法。
31. 【請求項３１】 動物の器官に通ずる血管に実質的に溶
    血を生じない第一の糖質液を注入して、前記器官中の血
    液を前記第一の糖質液で置換し、 この置換の間または置換の後に前記器官の全部または所
    定の部分を切除し、 次いで前記血管に、水溶液が液体窒素温度において相分
    離せずかつ実質的に結晶を生じない糖質と、水との混合
    液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結晶
    を生じない有機溶媒とを含む第二の糖質液を注入して、
    前記器官中の前記第一の糖質液を前記第二の糖質液で置
    換し、 この第二の糖質液で置換された前記器官の少なくとも一
    部を、組織試料として、金属台座に平行に固定された多
    数の金属針から成る針集合体に刺し通し、 前記針集合
    体に刺し通した前記試料を、所定の速度で徐々に冷却
    し、さらに液体窒素温度まで温度を低下させ、液体窒素
    温度で保存し、 保存を終了する際には前記針集合体の少なくとも一部の
    温度を４分を超えない時間内に２０℃以上として、前記
    試料の温度を前記第二の糖質液の氷点以上に上昇させ、 前記試料を前記針集合体から引き抜くことから成る、生
    物組織保存方法。
32. 【請求項３２】 前記有機溶媒がジメチルスルホキシド
    またはグリセリンである、請求項３１の生物組織保存方
    法。
33. 【請求項３３】 前記第二の糖質液が前記糖質としてマ
    ンニットを含む、請求項３１または３２の生物組織保存
    方法。
34. 【請求項３４】 前記第二の糖質液が前記糖質としてイ
    ヌリンを含む、請求項３１または３２の生物組織保存方
    法。
35. 【請求項３５】 前記冷却の所定の速度が−８０℃まで
    平均毎分１．３℃以内である、請求項３１ないし３４い
    ずれかの生物組織保存方法。
36. 【請求項３６】 前記第一の糖質液が主たる糖質として
    マンニットを含む請求項３１ないし３５いずれかの生物
    組織保存方法。
37. 【請求項３７】 前記第一の糖質液がグルコースを含む
    請求項３１ないし３５いずれかの生物組織保存方法。
38. 【請求項３８】 前記４分を超えない時間が３分以内で
    ある、請求項３１ないし３７いずれかの生物組織保存方
    法。
39. 【請求項３９】 保存を終了する際に前記針集合体の台
    座の温度を３分以内に２０℃以上とする、請求項３８の
    生物組織保存方法。
40. 【請求項４０】 動物の器官に通ずる血管に実質的に溶
    血を生じない第一の糖質液を注入して、前記器官中の血
    液を前記第一の糖質液で置換し、 次いで前記血管に、水溶液が液体窒素温度において相分
    離せずかつ実質的に結晶を生じない糖質と、水との混合
    液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結晶
    を生じない有機溶媒とを含む第二の糖質液を注入して、
    前記器官中の前記第一の糖質液を前記第二の糖質液で置
    換し、 この第二の糖質液で置換された前記器官の全部または所
    定の部分を前記動物から切除し、 これを組織試料として、金属台座に平行に固定された多
    数の金属針から成る針集合体に刺し通し、 前記針集合体に刺し通した前記試料を、所定の速度で徐
    々に冷却し、さらに液体窒素温度まで温度を低下させ、
    液体窒素温度で保存し、 保存を終了する際には前記針集合体の少なくとも一部の
    温度を所定の時間内に２０℃以上として、前記試料の温
    度を前記第二の糖質液の氷点以上に上昇させ、 前記試料を前記針集合体から引き抜くことから成る、生
    物組織保存方法。
41. 【請求項４１】 前記有機溶媒がジメチルスルホキシド
    またはグリセリンである、請求項４０の生物組織保存方
    法。
42. 【請求項４２】 前記第二の糖質液が前記糖質としてマ
    ンニットを含む、請求項４０または４１の生物組織保存
    方法。
43. 【請求項４３】 前記第二の糖質液の温度を０℃以下と
    する、請求項４０または４１の生物組織保存方法。
44. 【請求項４４】 前記第一の糖質液が液体窒素温度にお
    いて実質的に結晶を生じないものである、請求項４０な
    いし４３いずれかの生物組織保存方法。
45. 【請求項４５】 前記第一の糖質液が主たる糖質として
    マンニットを含む請求項４４の生物組織保存方法。
46. 【請求項４６】 前記第一の糖質液がグルコースを含む
    請求項４４の生物組織保存方法。
47. 【請求項４７】 前記冷却の所定の速度は−８０℃まで
    平均毎分１．３℃以内である、請求項４０ないし４６の
    生物組織保存方法。
48. 【請求項４８】 保存を終了する際に前記針集合体の台
    座の温度を３分以内に２０℃以上とする、請求項４０な
    いし４７いずれかの生物組織保存方法。
49. 【請求項４９】 動物の器官に通ずる血管に、実質的に
    溶血を生じない第一の糖質液を注入して、前記器官中の
    血液を前記第一の糖質液で置換し、 次いで前記血管に、水溶液が液体窒素温度において相分
    離せずかつ実質的に結晶を生じない糖質と、水との混合
    液が液体窒素温度において相分離せずかつ実質的に結晶
    を生じない有機溶媒とを含む第二の糖質液を注入して、
    前記器官中の前記第一の糖質液を前記第二の糖質液で置
    換し、 この第二の糖質液で置換された前記器官の全部又は所定
    の部分を、組織試料として、金属台座に平行に固定され
    た多数の金属針から成る針集合体に刺し通し、 前記針集合体に刺し通した前記試料を、所定の速度で徐
    々に冷却し、さらに液体窒素温度まで温度を低下させ、
    液体窒素温度で保存し、 保存を終了する際には所定の時間内に前記試料の温度を
    前記第二の糖質液の氷点以上に上昇させ、 前記試料を前記針集合体から引き抜くことから成る、生
    物組織保存方法。
50. 【請求項５０】 前記有機溶媒がジメチルスルホキシド
    またはグリセリンである、請求項４９の生物組織保存方
    法。
51. 【請求項５１】 前記第二の糖質液が前記糖質としてマ
    ンニットを含む、請求項４９または５０の生物組織保存
    方法。
52. 【請求項５２】 前記冷却の所定の速度は−８０℃まで
    平均毎分１．３℃以内である、請求項４９ないし５１い
    ずれかの生物組織保存方法。
53. 【請求項５３】 前記第一の糖質液がグルコースを含む
    請求項４９ないし５２いずれかの生物組織保存方法。
54. 【請求項５４】 保存を終了する際に４分以内に前記試
    料の温度を−５℃以上５℃以下に上昇させる、請求項４
    ９ないし５３いずれかの生物組織保存方法。
55. 【請求項５５】 保存を終了する際に前記試料の温度
    を、４分以内に−５℃以上５℃以下に上昇させ、平均毎
    分４℃以下の割合で２５℃以上に上昇させる、請求項５
    ４の生物組織保存方法。
56. 【請求項５６】 動物の器官に通ずる血管に潅流液を注
    入して、前記器官中の血液を前記潅流液で置換し、前記
    動物から切除された前記器官の少なくとも一部を冷却
    し、液体窒素温度まで温度を低下させて前記器官の組織
    の少なくとも一部を保存する生物組織保存方法におい
    て、 前記潅流液を注入する前に、予め前記動物の前記器官を
    含む領域の末梢神経を遮断し、 前記器官に通ずる血管に実質的に溶血を生じない第一の
    糖質液を注入して、前記器官中の血液を前記第一の糖質
    液で置換し、この置換中またはその後に前記動物から前
    記器官を切除し、 次いで前記器官に通ずる血管に、水溶液が液体窒素温度
    において相分離せずかつ実質的に結晶を生じない糖質
    と、水との混合液が液体窒素温度において相分離せずか
    つ実質的に結晶を生じない有機溶媒とを含む第二の糖質
    液を注入して、前記器官中の前記第一の糖質液を前記第
    二の糖質液で置換し、 この第二の糖質液で置換された前記器官の少なくとも一
    部を、組織試料として、金属台座に平行に固定された多
    数の金属針から成る針集合体に刺し通し、 前記針集合
    体に刺し通した前記試料を、所定の速度で徐々に冷却
    し、さらに液体窒素温度まで温度を低下させ、液体窒素
    温度で保存し、 保存を終了する際には４分を超えない時間内に前記試料
    の温度を前記第二の糖質液の氷点以上に上昇させ、 前記試料を前記針集合体から引き抜くことから成る、生
    物組織保存方法。
57. 【請求項５７】 前記有機溶媒がジメチルスルホキシド
    またはグリセリンである、請求項５６の生物組織保存方
    法。
58. 【請求項５８】 前記第二の糖質液が前記糖質としてマ
    ンニットを含む、請求項５６または５７の生物組織保存
    方法。
59. 【請求項５９】 前記第一の糖質液がグルコースを含む
    請求項５６ないし５８いずれかの生物組織保存方法。
60. 【請求項６０】 前記冷却の所定の速度は−８０℃まで
    平均毎分１．３℃以内である、請求項５６ないし５９い
    ずれかの生物組織保存方法。
61. 【請求項６１】 保存を終了する際には４分以内に前記
    試料の温度を−５℃以上５℃以下に上昇させる、請求項
    ５６ないし６０いずれかの生物組織保存方法。
62. 【請求項６２】 保存を終了する際に前記試料の温度
    を、４分以内に−５℃以上５℃以下に上昇させ、平均毎
    分４℃以下の割合で２５℃以上に上昇させる、請求項６
    １の生物組織保存方法。
63. 【請求項６３】 動物から切除された器官の少なくとも
    一部を冷却し、液体窒素温度まで温度を低下させて保存
    した後、前記組織試料を解凍して生物活性を回復させる
    生物組織保存再生方法において、 前記切除された器官の全部または所定の部分を、金属台
    座に平行に固定された複数の金属針から成る針集合体に
    刺し通して冷却し、液体窒素温度で組織試料として保存
    し、 保存を終了する際に、前記組織試料の生物活性を復活さ
    せるため、前記金属針の少なくとも一端を加温して、４
    分以内に前記組織試料の温度を−５℃以上５℃以下とし
    て前記組織試料を解凍し、 前記針集合体から前記組織試料を抜き取り、 解凍後前記組織試料の温度を平均毎分４℃以下の割合で
    ２５℃以上に上昇させて、前記組織試料の生物活性を回
    復させることを特徴とする、生物組織保存再生方法。
64. 【請求項６４】 動物の器官に通ずる血管に潅流液を注
    入して、前記器官中の血液を前記潅流液で置換し、前記
    動物から切除された前記器官の少なくとも一部を冷却
    し、液体窒素温度まで温度を低下させて前記器官の組織
    を保存した後、前記組織試料を解凍して生物活性を回復
    させる生物組織保存再生方法において、 前記切除された器官の全部または所定の部分を、金属台
    座に平行に固定された複数の金属針から成る針集合体に
    刺し通して冷却し、液体窒素温度で組織試料として保存
    し、 保存を終了する際に、前記金属針の少なくとも一端を加
    温して、４分以内に前記組織試料の温度を−５℃以上５
    ℃以下として前記組織試料を解凍し、 前記針集合体から前記組織試料を抜き取り、 解凍後少なくとも５分経過した後に前記組織試料の温度
    を２５℃以上に上昇させて、前記組織試料の生物活性を
    回復させることを特徴とする、生物組織保存再生方法。
65. 【請求項６５】 解凍後温度を２５℃まで上昇させる間
    に、前記組織試料に通ずる血管に糖質および血清蛋白を
    含む緩衝液を潅流させることにより、前記組織試料の生
    物活性を回復させる、請求項６４の生物組織保存再生方
    法。
66. 【請求項６６】 前記緩衝液がジブチリルサイクリック
    ＡＭＰを含む、請求項６５の生物組織保存再生方法。