DE69333926T2

DE69333926T2 - Verfahren zur Verarbeitung und Konservierung von auf Kollagen basierten Gewebeteilen zur Transplantation

Info

Publication number: DE69333926T2
Application number: DE69333926T
Authority: DE
Inventors: Stephen A. Eltham Livesey; Anthony A. Houston Del Campo; Abhijit Houston Nag; Ken B. Houston Nichols; Edward S. Conroe Griffey; Christopher Houston Coleman
Original assignee: LifeCell Corp
Current assignee: LifeCell Corp
Priority date: 1992-02-12
Filing date: 1993-02-12
Publication date: 2006-08-10
Anticipated expiration: 2013-02-13
Also published as: EP0564786B1; EP0564786A3; EP0564786A2; EP1637037A2; US5336616A; AU668703B2; JP4001642B2; JPH06261933A; ATE311746T1; AU3293493A; ES2255048T3; DE69333926D1; EP1637037A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Verfahren zum Erzielen einer Zellentfernung und weiterem Bearbeiten und Trockenaufbewahren von von Menschen und Tieren abgeleiteten Geweben auf Kollagenbasis zur Transplantation in Menschen oder andere Tiere. Durch diese Verfahren wird ein Gewebeprodukt hergestellt, das aus einer selektiv konservierten extrazellulären Proteinmatrix besteht, die frei von bestimmten lebensfähigen Zellen ist, die gewöhnlich antigene Bestimmungsfaktoren des Haupthistokompabilitätskomplexes und andere Antigene, die von dem Empfänger als fremd erkannt werden würden, exprimieren. Diese exterzelluläre Proteinmatrix besteht aus Kollagen und anderen Proteinen und stellt ein strukturelles Templat bereit, das mit neuen lebensfähigen Zellen, die von dem Wirt nicht abgestoßen werden würden, erneut besiedelt werden kann. Diese lebensfähigen Zellen können vom Wirt (körpereigene Zellen) vor und nach der Transplantation oder von einer alternativen menschlichen Quelle, einschließlich Vorhaut-, Nabelschnur- oder Fehlgeburtsgeweben erhalten werden. Insbesondere betrifft diese Erfindung die derartige Beschaffung und die derartige Bearbeitung von Geweben auf Kollagenbasis, dass Komplikationen infolge einer Implantation (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Immunabstoßung, Kontraktur, Verkalkung, Verschluss und Infektion) in Bezug auf gegenwärtige Implantationsverfahren und -materialien deutlich reduziert sind.
Beschreibung des Stands der Technik
Bei der Gewebe- und Organtransplantation handelt es sich um ein sich zusehends entwickelndes therapeutisches Gebiet auf Grund von Verbesserungen in chirurgi schen Verfahren, Weiterentwicklungen von immunsuppressiven Arzneimitteln und dem gesteigerten Fachwissen über die Transplantat/Wirt-Wechselwirkung. Trotz der grundlegenden Weiterentwicklung auf diesem Gebiet bleibt die moderne Gewebetransplantation mit Komplikationen, einschließlich Entzündung, Abbau, Narbenbildung, Kontraktur, Verkalkung (Verhärtung), Verschluss und Abstoßung verbunden. Es finden fortlaufend zahlreiche die Gestaltung von verbesserten transplantierbaren Gewebetransplantaten betreffende Untersuchungen statt, jedoch wird in der Industrie allgemein angenommen, dass ideale Implantate bis jetzt noch nicht hergestellt wurden.
EP 0128 706 offenbart Körperimplantate aus extrazellulärer Matrix und Mittel und Verfahren zur Herstellung und Verwendung derartiger Implantate. EP 0267026 offenbart eine Apparatur zur Tiefkühlpräparation von biologischen Gewebeproben zur ultrastrukturellen Analyse. Die Verwendung der Apparatur umfasst das Sintern einer biologischen Gewebeprobe unter Tiefkühltemperatur- und Ultravakuumbedingungen. US 4,776,853 beschreibt ein Verfahren zur Präparation von biologischem Material zur Implantation in das kardiovaskuläre System, Atemwegsystem oder Weichgewebe, das einen Schritt des enzymatischen Verdaus in gepufferter Kochsalzlösung einschließt. Kreijci, N. C. et al. (1991) J. Invest. Dermatol. 97, 843 offenbaren ein Verfahren zur Neubildung in vitro von Haut, das das Bearbeiten mit Trypsin zum Abbau von Bestandteilen der Basalmembran einschließt. Sasamoto, J. et al. (1990) J. Burncare 11, 190 offenbaren Verfahren zur Bildung von neu gebildeter Haut unter Verwendung von gezüchteten allogenen Epithealschichten und gezüchteter allogener Dermis, dass das Bearbeiten mit Trypsin einschließt. Grillo, H. C. et al. (1964) Transplantation 1, 48, offenbaren homologe Transplantate von Mäusehaut, in welchen die Zerstörung der Zellpopulation durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen erzielt wurde. In einigen Versuchen wurde die Mäusehaut anschließend mit einer cyanidhaltigen Trypsinlösung behandelt. Fang, C. H. et al. (1990) J. Burn. Care Rehab. 11, 538 offenbaren gemischte Hauttransplantate der Xenodermis der Allodermis mit einer Auflage aus isogenem Spalthautlappentransplantat. Oliver, R. F. et al. (1972) Br. J. Exp. Path. 53, 540 offenbaren die Reinigung von Dermalkollagen durch Behandeln der gesamten Haut mit einer Lösung von kristallinem Trypsin bei Temperaturen unter 20°C. Oliver, R. F. et al. (1977) Br. J. Plast. Chir. 30, 88 offenbaren die Einbringung von unter Verwendung von kristallinen Trypsin gebildeten allogenen Transplantaten mit gespeichertem zellfreiem Dermalkollagen in Hautwunden. Griffiths, R. W. & Shakespeare, P. G. (1982) Br. J. Plast. Sur. 35, 519 offenbaren gemischte Hauttransplantate, die aus gezüchteten Keratinocyten und tiefkühlbewahrten Dermis bestehen, wobei die Dermis durch Trypsinierung hergestellt wurde. Ben-Bassat, H. et al. (1992) Plast. Reconstr. Sur. 89, 510, offenbaren das histologische Erscheinungsbild von mit Glutaraldehyd behandelten menschlichen faserartigen, allogenen Dermalkollagentransplantaten.
Körpereigenes oder selbst abgeleitetes menschliches Gewebe wird häufig für Transplantationsverfahren verwendet. Diese Verfahren schließen koronare und peripherale Gefäßbypassoperationen ein, wobei ein Blutgefäß, gewöhnlich eine Vene, von einem anderen Bereich des Körpers entnommen und zum Beheben von blockiertem Blutfluss durch eine oder mehrere kritische Arterien transplantiert wird. Eine andere Anwendung von körpereigenem Gewebe ist die Behandlung von Verbrennungen dritten Grades und anderen Hautverletzungen dritten Grades. Diese Behandlung beinhaltet das Transplantieren von gesunder Haut von unverletzten Körperstellen auf die Wundstelle, ein als Spalthautlappentransplantation bezeichnetes Verfahren. Zusätzliche Anwendungen einer Transplantation mit körpereigenem Gewebe schließen zu Neubildungsverfahren verwendete Knochen-, Knorpel- und Faszie-Transplantation ein.
Der Anlass zur Verwendung von körpereigenem Gewebe zur Transplantation basiert auf dem Konzept, dass Komplikationen der Immunabstoßung eliminiert werden, was zu verbesserten Bedingungen für das Überleben der Transplantation führen. Unglücklicherweise können jedoch andere Komplikationen mit körpereigenen Transplantaten auftreten. Zum Beispiel kann eine deutliche Schädigung einiger Gewebebestandteile der transplantierten Venen während der Entnahme und vor der Implantation auftreten. Diese Schädigung kann eine mechanische Kontraktion der Glattmuskelzellen in der Venenwand einschließen, was zu einem Verlust an Endothelium und Glattmuskelzellsauerstoffhypoxie und -tod führt. Eine hypoxische Schädigung kann zur Freisetzung von Zelllysomen, Enzymen, die eine deutliche Schädigung der extrazellulären Matrix verursachen können, führen. Infolge der Implantation kann eine derartige Schädigung zu einer erhöhten Plättchenanhaftung, Leukozyten- und Makrophageninfiltration und anschließend des Weiteren zu einer Schädigung der Gefäßwand führen. Das Endergebnis einer derartigen Schädigung ist Thrombose und Verschluss in der frühen Postimplantationsperiode. Sogar bei Abwesenheit einer derartigen Schädigung unterziehen sich transplantierte körpereigene Venen typischerweise einer Verdickung der Gefäßwand und fördern Arteriosklerose, was zu spätem Verschluss führt. Der genaue Grund für dieses Phänomen ist ungewiss, kann jedoch mit der Dehanbarkeitsfehlanpassung der Vene in einer Arterienstelle mit hohem Blutdruck und hoher Fließgeschwindigkeit verbunden sein. Dieses Phänomen kann durch jegliche während der Beschaffung stattfindende anfängliche Schädigung der Glattmuskelzellen und Matrix vergrößert und beschleunigt werden. Ein Verschluss von transplantierten Venen kann wiederholte Bypassverfahren erfordern, wobei die zusätzlichen körpereigenen Venen anschließend erneut entnommen oder mit synthetischen Röhren oder nicht körpereigenen Gefäßen ersetzt werden.
Ein anderes Beispiel für Komplikationen, die aus einer Transplantation mit körpereigenem Gewebe resultieren, ist die Narbenbildung und Kontraktion, die mit Spalthauttransplantaten für eine Wundenausbesserung dritten Grades vorkommen können. Spalthauttransplantate werden typischerweise durch die Verwendung eines ein Muster aus kleinen Schlitzen in die Haut einbringenden Mascheninstruments mechanisch erweitert. Das Spalthautlappentransplantat wird dann gedehnt, um einen größeren Wundbereich zu bedecken. Sich teilende Epidermalzellen wachsen schließlich in die Flächen der Schlitze und bedecken diese, wobei sich die darunterliegende Dermalträgermatrix jedoch nicht leicht in diese Flächen ausdehnt. Die Dermalmatrix, die primär aus Kollagen, anderen extrazellulären Prote inmatrixproteinen und Basalmembrankomplex zusammengesetzt sind, ist für die dehnbare, flexible Natur der Haut verantwortlich. Die Abwesenheit einer Dermalmatrix führt zur Narbenbildung und Kontraktur in den Bereichen der Schlitze. Diese Kontraktur kann schwer sein und im Falle von massiv verbrannten Patienten, die sich einer extensiven Spalthautlappentransplantation unterziehen, eine anschließende Auslösung von chirurgischen Verfahren zum Wiederherstellen von Nahtbewegung erfordern.
Ist die Versorgung von transplantierbaren körpereigenen Geweben erschöpft oder ist kein geeignetes körpereigenes Gewebe für eine Transplantation (z.B. Herzklappenersatz) verfügbar, können Vertreter, einschließlich künstlich hergestellter synthetischer Materialien, von Tieren abgeleitete Gewebe und Gewebeprodukte oder allogene menschliche Gewebe, die von einem anderen Individuum gespendet (gewöhnlich von Kadavern abgeleitet) werden, verwendet werden. Künstlich hergestellte Implantatmaterialien schließen synthetische Polymere (z.B. (PTFE) Polytetraflourethylen, Dacron und Goretex) ein, die manchmal in eine Röhrenform geformt und als Blutflussröhre für einige peripherale arterielle Bypassverfahren verwendet werden. Zudem können künstlich hergestellte synthetische Verbindungen (Polyurethene) und Hydrocolloide oder -gele als provisorische Wundverbände vor der Spalthautlappentransplantation verwendet werden.
Andere künstlich hergestellte Materialien schließen für Aortenherzklappenersatzverfahren verwendete Kunststoffe und carbonisierte Materialien ein, die zu einer prosthetischen Herzklappe gestaltet werden. Synthetische Materialien können mit geringer Immunogenität hergestellt werden, sind jedoch andere Beschränkungen unterworfen. Im Falle von mechanischen Herzklappen erfordern ihre hämodynamischen Eigenschaften eine lebenslange Antiblutgerinnungstherapie. Synthetische Gefäßröhren, die häufig in peripheralen Gefäßbypassverfahren im Oberschenkel verwendet werden, sind einem noch höheren Verschlussvorkommen als körpereigene Transplantate unterworfen. In vielen Fällen ist ein biologisches Implantat bevorzugt, bei welchem es sich um ein bearbeitetes tierisches Gewebe oder frisches oder tiefkühlbewahrtes allogenes menschliches Gewebe handeln kann.
Tierische Gewebe (vom Rind oder Schwein), die chemisch behandelt sind, werden üblicherweise als Ersatz für fehlerhafte menschliche Herzklappen und wurden in der Vergangenheit für Gefäßröhren verwendet. Das Konzept der chemischen Bearbeitung ist die Stabilisierung des Strukturproteins und der Kollagenmatrix durch Vernetzen mit Glutaraldehyd oder einem ähnlichen Vernetzungsmittel. Diese Behandlung maskiert auch die antigenen Bestimmungsfaktoren derart, dass der menschliche Wirt das Implantat nicht als fremd erkennt, und beugt einer Immunabstoßungsantwort vor. Mit Glutaraldehyd behandelte Gewebe erlauben jedoch keine Einwanderung von zum Umbilden nötigen Wirtszellen und verhärten allmählich infolge einer Verkalkung. Aus diesem Grund erfordern mit Glutaraldehyd behandelte Gewebe im Allgemeinen einen Ersatz innerhalb von 5–7 Jahren. Mit Glutaraldehyd behandelte Rindervenen wurden in der Vergangenheit für Gefäßbypassverfahren verwendet, jedoch wurde deren Verwendung auf Grund des unakzeptablen Vorkommens von Aneurismabildung und Verschluss abgebrochen.
Die Verwendung von allogenen Transplantatgeweben wurde für Herzklappenersatzverfahren, arterielle Bypassverfahren, Knochen-, Knorpel- und Wurzelhautersatzverfahren und Wundbehandlung dritten Grades als provisorischer Verband angewandt. Das allogene Gewebe wird frisch verwendet oder kann unter Verwendung von DMSO und/oder Glycerin tiefgekühlt aufbewahrt werden, um die Lebensfähigkeit der Zellbestendteile beizubehalten. Es wird angenommen, dass die Zellbestandteile Histokompatibilitätsantigene enthalten und eine Immunantwort vom Wirt auslösen können. In vielen Fällen unterzieht sich der das allogene Transplantat erhaltende Patient einer Immunosuppressionstherapie. Trotz dieser Therapie unterziehen sich viele allogene Transplantate, einschließlich Herzklappen und Blutgefäße einer entzündlichen Antwort und versagen innerhalb von 5–10 Jahren. Allogene Haut wird typischerweise innerhalb von 1–5 Wochen nach der Aufbringung abgestoßen, und es wurde auch dann, wenn immunsuppresive Arz neimittel verwendet wurden, nie demonstriert, dass sie vom Wirt dauerhaft akzeptiert wird.
Alternative Verarbeitungsverfahren wurden von Anderen entwickelt, die die Einschränkungen von Allogenen und vom Tier abgeleiteten Transplantatgeweben angehen wollten. Gefriertrocknen wird routinemäßig beim Bearbeiten von allogenen Knochen zur Transplantation verwendet. Es wurde gefunden, dass der Gefriertrocknungsprozess zu einem Transplantat führt, das verglichen mit frischem oder tiefkühlbewahrten allogenen Knochen keine merkliche Abstoßungsantwort auslöst. Der gefriergetrocknete Knochen wirkt nach der Implantation als Templat, das im Wesentlichen durch den Wirt neu gestaltet wird. Wurde der Gefriertrocknungsprozess auf mehrere komplexe Gewebe wie Herzklappen angewandt, waren die Ergebnisse gemischt, jedoch insgesamt unbefriedigend. Eine Studie wurde durchgeführt, in welchen 15 allogene Herzklappen vor der Transplantation durch Gefriertrocknung bearbeitet wurden. Die meisten der gefriergetrockneten Klappen versagten auf Grund von mechanischen Ursachen in der frühen Posttransplantationsperiode. Diejenigen gefriergetrockneten Klappen, die nicht versagten, zeigten jedoch eine längere Funktionsweise (bis zu 15 Jahren).
Enzyme und Detergensbearbeitung wurden ebenso zum Entfernen von allergenen Zellen von tranplantierbaren Geweben auf Kollagenbasis verwendet. Organische Lösungsmittel und Detergensbehandlungen wurden mit relativ einfachen Geweben wie der in chirurgischen Neubildungsverfahren verwendeten Dura mater erfolgreich verwendet. Eine chemische Bearbeitung von komplexeren Strukturen wie Herzklappen, Gefäßröhren und Haut waren jedoch in klinischen Anwendungen nur beschränkt erfolgreich.
Die Erfindung dieses Patents ist eine umfassende Bearbeitungstechnik, die potentielle Schädigungsvorfälle bei der Herstellung von komplexen Geweben auf Kollagenbasis zur Transplantation angehen. Die Technologie kombiniert sowohl biochemische als auch physikalische Bearbeitungsschritte zum Erzielen der idealen Merkmale der Templatfunktion derart, dass das Gewebetransplantat für eine lang anhaltende Erhaltung vom Wirt neu gestaltet werden kann.
KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In seiner bevorzugten Form schließt das Verfahren dieser Erfindung die Schritte des Bearbeitens von biologischen Geweben ein, einschließlich der Behandlung mit einer Stabilisierungslösung zum Reduzieren des Verleihens von Schädigung, Behandlung mit einer Bearbeitungslösung zum Entfernen von Zellen und anderen antigenen Gewebebestandteilen, Behandlung mit einer Tiefkühlschutzlösung, Einfrieren und Lagern unter spezifischen Bedingungen zum Vermeiden von funktionell deutlich schädigender Eiskristallbildung, Trocknen unter Bedingungen zum Verhindern schädigender Eisumkristallisierung, Lagerung in trockenem Zustand über Gefriertemperaturen, Rehydratisierung unter spezifischen Bedingungen und mit einer Rehydratisierungslösung zum Minimieren von Oberflächenspannungsschädigung und weiterer Steigerung der selektiven Bewahrung der Matrix und Neubildung mit lebensfähigen Zellen, die vom Wirt nicht abgestoßen werden.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Bearbeiten und Bewahren von biologischen Geweben auf Kollagenbasis zur Transplantation durch Schritte der chemischen Vorbehandlung und Zellentfernung, Tiefkühlpräparation, Trockenstabilisierung, Trocknen, Rehydratisierung und Zellneubildung bereit. Die Bearbeitungs- und Bewahrungsverfahren sind dazu bestimmt, ein transplantierbares biologisches Gewebetransplantat zu bilden, das insbesondere die folgenden Kriterien erfüllt:

(a) Bereitstellen einer extrazellulären Protein- und Kollagenmatrix, die vom Wirt neu gestaltet und ausgebessert werden kann,
(b) Bereitstellen einer intakten Basalmembran zur Gewährleistung der Wiederanlagerung von lebensfähigen Endothelial- oder Epithelialzellen,
(c) kein Auslösen einer Immunantwort durch den Wirt,
(d) kein Verkalken und
(e) leichtes Lagern und Transportieren bei Umgebungstemperaturen.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird das zu bearbeitende biologische Gewebe zuerst von einer menschlichen Leiche oder einem tierischen Spender bezogen oder entnommen und sofort in eine stabilisierende Transportlösung gegeben, die einen osmotischen, hypoxischen, autolytischen und proteolytischen Abbau verhindert, vor bakterieller Kontamination schützt und eine mechanische Schädigung, die mit Glattmuskelbestandteile (z.B. Blutgefäße) enthaltenden Geweben auftreten kann reduziert. Die Stabilisierungslösung enthält im Allgemeinen einen geeigneten Puffer, ein oder mehrere Oxidationsmittel, ein oder mehrere onkotische Mittel, ein Antibiotikum, einen oder mehrere Proteasehemmer und in manchen Fällen ein Glattmuskelentspannungsmittel.
In der bevorzugten Ausführungsform wird das Gewebe dann in einer Bearbeitungslösung inkubiert, um lebensfähige antigene Zellen (einschließlich Epithelialzellen, Endothelialzellen, Glattmuskelzellen und Fibroplasten) von der Strukturmatrix ohne Schädigung des Basalmembrankomplexes oder der Strukturintegrität der Kollagenmatrix zu entfernen. Die Bearbeitungslösung enthält im Allgemeinen einen geeigneten Puffer, ein geeignetes Salz, ein geeignetes Antibiotikum, ein oder mehrere geeignete Detergenzien, ein oder mehrere geeignete Proteasehemmer und/oder ein oder mehrere geeignete Enzyme. Die Behandlung des Gewebes mit dieser Bearbeitungslösung muss über eine Zeitdauer eine derartige Konzentration aufweisen, dass der Abbau des Basalmembrankomplexes vermieden und die Strukturintegrität der Kollagenfasern und Elastin einschließenden Matrix beibehalten wird.
Nach dem Entfernen der Zellen aus dem Gewebe wird es vorzugsweise in einer Tiefkühlbewahrungslösung inkubiert. In der bevorzugten Ausführungsform enthält diese Lösung im Allgemeinen ein oder mehrere Tiefkühlschutzmittel zum Minimieren einer Eiskristallschädigung der Strukturmatrix, die während des Einfrierens auftreten könnte, und ein oder mehrere Trockenschutzbestandteile zum Minimieren einer Strukturschädigungsabänderung während des Trocknens und kann eine Kombination aus einem Lösungsmittel und Wasser einschließen, die sich während des Einfrierens weder einer Ausdehnung noch einer Kontraktion unterzieht. Als alternatives Verfahren kann die Gewebematrix mit entfernten Zellen mit einem Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd fixiert und vor der Transplantation gelagert werden. Nach der Inkubation in dieser Tiefkühlbewahrungslösung wird das Gewebe in einem sterilen Behälter wie einem Glasfläschchen oder einem Beutel, der für Wasserdampf durchlässig, jedoch für Bakterien undurchlässig ist, verpackt.
In der bevorzugten Ausführungsform besteht eine Seite dieses Beutels aus poröser Tyvek-Membran von medizinischer Qualität, ein Markenprodukt von DuPont Company Wilmington, Delaware. Diese Membran ist für Wasserdampf porös und für Bakterien und Staub undurchlässig. Die Tyvek-Membran wird auf eine undurchlässige Polyethylenlaminatfolie mit 2,5 mm wärmeversiegelt, indem eine Seite offen gelassen wird, wodurch ein zweiseitiger Beutel gebildet wird. Der offene Beutel wird vor der Verwendung durch Gammastrahlung sterilisiert. Das Gewebe wird durch diese Öffnung aseptisch in den sterilen Beutel gegeben. Die offene Seite wird dann aseptisch wärmeversiegelt, um den Beutel zu verschließen. Das verpackte Gewebe ist hiermit während der gesamten anschließenden Bearbeitungsschritte vor Mikrobenkontamination geschützt.
In der bevorzugten Ausführungsform wird das verpackte Gewebe mit einer festgesetzten Geschwindigkeit, die mit dem bestimmten Tiefkühlschutzmittel kompatibel ist, zum Minimieren von Schädigung durch hexagonales Eis und Bilden von weniger stabilen Eisformen aus amorphen und kubischen Phasen auf eine niedrige Temperatur abgekühlt. Das Gewebe wird dann unter Vakuumbedingungen bei niedriger Temperatur derart getrocknet, dass Wasserdampf von jeder Eiskristallphase ohne Eisumkristallisation allmählich entfernt wird. Ein derartiges Trocknen wird entweder durch herkömmliches Gefriertrocknen oder unter Verwendung eines früher patentierten Molekulardestillationstrockners erzielt. Geeignete Molekulardestillationstrockner können von LifeCell Corporation, Woodlands, Texas erhalten werden und sind in den hier unter Bezugnahme eingebrachten US-Patenten Nr. 4,567,847 und 4,799,361 offenbart.
Nach Beendigung des Trocknungszyklus der in einem Beutel getrockneten Proben wird das Vakuum der Gefriertrocknungsapparatur mit einem trockenen Inertgas wie Stickstoff, Helium oder Argon aufgehoben. Während er in derselben gashaltigen Umgebung gehalten wird, wird der halbdurchlässige Beutel in einen undurchlässigen Beutel gegeben, der weiter Wärme- oder Druckversiegelt wird. Der endgültige Aufbau der trockenen Probe befindet sich deshalb in einer inerten Gasatmosphäre, indem er mit einem undurchlässigen Beutel hermetisch versiegelt ist.
Nach Beendigung des Trocknungszyklus der in einem Glasfläschchen getrockneten Proben wird das Fläschchen unter Vakuum mit einem geeigneten inerten Stopfen versiegelt und das Vakuum der Trocknungsapparatur vor dem Entleeren mit einem Inertgas aufgehoben.
In der bevorzugten Ausführungsform kann das verpackte getrocknete Gewebe für längere Zeitdauern unter Umgebungsbedingungen gelagert werden. Der Transport kann durch Standardträger und unter Standardbedingungen in Bezug auf Normaltemperaturaussetzung und Lieferzeiten erzielt werden.
In der bevorzugten Ausführungsform wird das getrocknete Gewebe vor der Transplantation rehydratisiert. Es ist wichtig, die osmotischen Kräfte und Oberflächenspannungswirkungen während der Rehydratisierung zu minimieren. Ziel bei der Rehydratisierung ist es, die selektive Bewahrung der extrazellulären Trä germatrix zu vergrößern, während jegliche restliche antigenen Zellen und andere potentiell antigenen Bestandteile entfernt werden. Eine geeignete Rehydratisierung kann durch eine anfängliche Inkubation des getrockneten Gewebes in einer Umgebung aus etwa 100% relativer Feuchtigkeit, gefolgt vom Eintauchen in eine geeignete Rehydratisierungslösung erzielt werden. In einer anderen Ausführungsform kann das getrocknete Gewebe vor der Inkubation in einer Umgebung mit hoher Luftfeuchtigkeit direkt in die Rehydratisierungslösung getaucht werden. Die Rehydratisierung sollte keine osmotische Schädigung der Probe verursachen. Eine Dampfrehydratisierung sollte anfänglich einen Restfeuchtigkeitsgehalt von mindestens 15% erzielen, und eine Fluidrehydratisierung sollte zu einem Gewebefeuchtigkeitsgehalt zwischen 20% und 70% führen.
Abhängig von dem zu rehydratisierenden Gewebe kann die Rehydratisierungslösung einfach eine gewöhnliche Kochsalzlösung, Ringer-Lactat oder ein standardmäßiges Zellkulturmedium sein. Wird das Gewebe der Wirkung von endogenen Kollagenasen, Elastasen oder autolytischer Restaktivität von früher entfernten Zellen unterzogen, werden der Rehydratisierungslösung Zusätze zugesetzt, welche Proteasehemmer einschließen. Liegt radikalische Restaktivität vor, werden Mittel zum Schutz vor Hypoxie, einschließlich Antioxidationsmittel, enzymatische Mittel, die vor radikalischer Schädigung schützen, und Mittel, die die aus hypoxischer Schädigung resultierende Störung von biochemischen Wegen mimieren, verwendet. Auch können Antibiotika zum Hemmen von Bakterienkontamination eingeschlossen sein. Onkotische Mittel, die in Form von Proteoglycanen, Dextran und/oder Aminosäuren vorliegen, können ebenso eingeschlossen sein, um eine osmotische Schädigung der Matrix während der Rehydratisierung zu verhindern. Die Rehydratisierung einer trockenen Probe ist für dieses Verfahren besonders geeignet, da sie eine schnelle und gleichmäßige Verteilung der Bestandteile der Rehydratisierungslösung gewährt. Zudem kann die Rehydratisierungslösung bestimmte früher nicht verwendete Bestandteile z.B. Diphosphonate zum Hemmen von alkalischer Phosphatase und Verhindern von anschließender Verkalkung enthalten. In der Rehydratisierungslösung können auch Mittel eingeschlossen sein, die infolge der Transplantation der rehydratisierten Extrazellulärmatrix die Gefäßneubildung und Wirtszelleninfiltration stimulieren. In einer anderen Ausführungsform kann die Rehydratisierung in einer Lösung durchgeführt werden, die ein Vernetzungsmittel wie Glutaraldehyd enthält.
Immuntolerierbare lebensfähige Zellen müssen in der rehydratisierten Strukturmatrix wiederhergestellt werden, um ein dauerhaft akzeptiertes Transplantat zu erzeugen, das durch den Wirt neu gestaltet werden kann. In der bevorzugten Ausführungsform können immuntolerierbare lebensfähige Zellen durch Zellzüchtungstechniken in vitro oder durch Neubesiedelung in vivo nach der Transplantation neu gebildet werden.
In der bevorzugten Ausführungsform hängen die zur Neubildung in vitro verwendeten Zelltypen von der Natur des transplantierbaren Transplantats ab. Das primäre Erfordernis für die Neubildung von Haut mit der vollen Dicke aus bearbeiteter und dehydratisierter Dermis ist die Wiederherstellung von Epidermalzellen oder Keratinocyten. Diese Zellen können von den vorgesehenen Empfängerpatienten in Form eines kleinmaschigen Spalthautlappentransplantats oder als isolierte Keratinocyten, die sich unter Zellkulturbedingungen Schichten ausdehnen, abgeleitet werden. In einer anderen Ausführungsform können allogene Keratinocyten, die von der Vorhaut oder vom fötalen Ursprung abgeleitet werden, zum Züchten und Neubilden der Epidermis verwendet werden.
Die wichtige Zelle zur Neubildung von Herzklappen und Gefäßröhren ist die Endothelialzelle, die die innere Oberfläche des Gewebes auskleidet. Endothelialzellen können auch in Kultur vermehrt werden und direkt von dem vorgesehenen Empfängerpatienten oder von Nabelarterien oder -venen abgeleitet werden.
Nach dem Trocknen oder nach dem Trocknen und der Rehydratisierung oder nach dem Trocknen, der Rehydratisierung und der Neubildung wird das bearbeitete Gewebetransplantat in das entsprechende Krankenhaus oder die Behandlungsein richtung transportiert. Die Wahl der Endzusammensetzung des Produkts hängt von der spezifischen beabsichtigten klinischen Anwendung ab.
Bei der Durchführung dieser Erfindung ist es grundlegend, dass vor der Bearbeitung geeignete Gewebe erhalten werden. Menschliche Leichengewebe sind durch etwa 100 Gewebebanken in der ganzen Nation erhältlich. Zusätzlich sind menschliche Gewebe direkt von Krankenhäusern erhältlich. Eine unterzeichnete Einverständniserklärung von der Spenderfamilie zum Gestatten der Entnahme von Geweben zur Transplantation ist erforderlich. Tierische Gewebe sind von einer Anzahl von Fleischverarbeitungsfirmen und von Lieferanten von Labortieren erhältlich. Der jeweilige entnommene Gewebetyp ist für das Verfahren dieser Erfindung nicht beschränkend. Jedoch wird die Bearbeitung des Gewebes durch die Verwendung von speziellen Beschaffungsverfahren und die Behandlung mit einer Stabilisationslösung zum Verhindern von bestimmten mechanischen und biochemischen Schädigungsvorfällen verbessert.
Die entnommenen Gewebe können sich während der Beschaffung einer Vielzahl von mechanischen und biochemischen Schädigungen unterziehen. Sowohl die Zellbestandteile als auch die extrazelluläre Matrix können durch diese Vorfälle verletzt werden. Eine Schädigung der extrazellulären Matrix tritt vorwiegend infolge der Destabilisierung des Zellbestandteils auf. Plan dieser Erfindung ist es, diesen Zellbestandteil letztendlich zu entfernen und die extrazelluläre Matrix optimal zu bewahren, weshalb die Stabilisierungslösung zum Minimieren der anfänglichen zellulären und demzufolge der extrazelluläre Matrixschädigung formuliert wird. Die extrazelluläre Protein- und Kollagenmatrix umfasst ein natives dreidimensionales Gitter, das verschiedene Proteine wie Kollagen Typ I, Kollagen Typ II, Kollagen Typ III, Kollagen Typ IV, Elastin, Laminin, Tensin und Actinin und Proteoglycane einschließt.
Das auslösende Ereignis bei der zellulären Schädigung ist Hypoxie (Mangel an die Körpergewebe erreichendem Sauerstoff) und ein Mangel an Nährstoffzufuhr, die für die Zelle nötig ist, um den Stoffwechsel und die Energieproduktion beizubehalten. Hypoxie insbesondere Hypoxie und Reperfusion führt zur Bildung von freien Radikalen wie Wasserstoffperoxid, eine Oxidationsspezies, die mit Zellbestandteilen, einschließlich Membranen und Proteinen reagiert. Die anschließenden Veränderungen der Lipidperoxidation und Vernetzung führen zur strukturellen und funktionellen Umordnung der Zelle und initiieren die Freisetzung von autolythischen Enzymen (die gewöhnlich in Lysosomen enthalten sind) in die extrazelluläre Matrix. Es liegt eine zweifache Schädigung der Matrix, eine Oxidationsmittelschädigung und enzymatischer Abbau, vor. Ein Fehlen an Nährstoffzufuhr verstärkt diese Abläufe dahingehend, dass die Zelle den Energiebedarf zum Bewahren ihrer Abwehrmechanismen gegen hypoxische Schädigung nicht mehr versorgen kann. Beim Minimieren dieser Vorgänge sind einige Vorgehensweisen möglich. Diese schließen die Verwendung von Enzymen (Superoxiddismutase und Catalase) zum Neutralisieren des Superoxidanions und Wasserstoffperoxid oder Verbindungen, die direkt mit anderen radikalischen Spezies reagieren oder diese neutralisieren können, ein. Diese als Antixidationsmittel bezeichneten Verbindungen schließen tertiäres Butylhydrochinon (BHT), alpha-Tocopherol, Manit, Hydroxyharnstoff, Glutathion, Ascorbat, Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und die Aminosäuren Histidin, Prolin und Cystein ein. Zusätzlich zu Antioxidationsmitteln enthält die Stabilisierungslösung im Allgemeinen Mittel zum Hemmen der hypoxischen Abwandlung zu normalen biochemischen Wegen, z.B. Allopurinol zum Hemmen von Xanthindehydrogenase, Lipoxigenasehemmstoffe, Calciumkanal-Blockierungsarzneimittel, Calciumbindungsmittel, Eisenbindemittel, Stoffwechselzwischenverbindungen und Substrate der Adenosintriphosphat(ATP)-Bildung.
Die Stabilisierungslösung enthält im Allgemeinen auch ein oder mehrere Antibiotika, Antipilzmittel, Proteoglycane und geeignete Puffer. Antibiotika sind nötig, um bakterielles Wachstum und anschließende Gewebeinfektion zu hemmen oder zu verhindern. Antibiotika können ausgewählt sein aus Penicillin, Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Bacitracin und Vancomycin. Zudem können Antipilzmittel, einschließlich Amphotericin-B, Nystadin und Polymyxin eingesetzt werden.
Proteoglycane sind in der Stabilisierungslösung eingeschlossen, um einen kolloidalen osmotischen Ausgleich zwischen der Lösung und dem Gewebe bereitzustellen, wodurch die Diffusion von endogenen Proteoglycanen aus dem Gewebe in die Lösung verhindert wird. Endogene Proteoglycane dienen für eine Vielzahl an Funktionen in der Physiologie des Bindegewebes auf Kollagenbasis. Sie können an der Regulierung von Zellwachstum und Differenzierung (z.B. Heparinsulfat und Glattmuskelzellen) beteiligt sein oder sind in einer anderen Ausführungsform beim Verhindern von pathologischer Verkalkung (wie bei Herzklappen) wichtig. Proteoglycane sind auch bei der Komplexregulierung der Kollagen- und Elastinsynthese und bei der Neugestaltung beteiligt, was für die Bindegewebefunktion grundlegend ist. Proteoglycane sind ausgewählt aus der Gruppe von Chondroitinsulfat, Heparinsulfat und Dermatansulfat. Asmotische Mittel, bei welchen es sich nicht um Proteoglycan handelt, die ebenso eingeschlossen sein können, sind Polymere wie Dextran und Polyvinylpyrolodon (PVP) und Aminosöuren wie Glycin und Prolin.
Die Stabilisierungslösung enthält im Allgemeinen auch einen geeigneten Puffer. Die Natur des Puffers ist in mehreren Aspekten bei der Bearbeitungstechnik wichtig. Kristallartige Puffer mit niedriger osmotischer Stärke waren mit der Schädigung verbunden, die während einer Beschaffung der Vena saphena und mit Hornhautlagerung auftritt. Die optimale pH-Pufferkapazität gegen die Produkte der hypoxischen Schädigung (nachstehend beschrieben) ist wichtig. In diesem Kontext weisen die organischen und Bicarbonatpuffer deutliche Vorteile auf. (Bei der Lagerung von roten Zellen zeigten sich Acetatcitratpuffer mit Glycin und Glucose beim Verlängern der Lagerzeit und Beibehalten von Zellintegrität als wirksam). Die Erfinder bevorzugen die Verwendung eines organischen Puffers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), 3-(N-Morpholin)propansulfidsäure (MPOS) und N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2- ethansulfonsäure (HEPES). In einer anderen Ausführungsform können physiologische Puffer oder Puffer mit niedrigem Salzgehalt, einschließlich Phosphat, Bicarbonat und Acetatcitrat, bei bestimmten Anwendungen geeignet sein.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform richten sich die Bestandteile der Stabilisierungslösung auf einen oder mehrere der Vorfälle, die während der Entnahme von Gefäßgeweben auftreten, wie Krampf Hypoxie, Hypoxiereperfusion, lyosomale Enzymfreisetzung, Plättchenanhaftung, Sterilitäts- und Pufferbedingungen. Eine unwillkürliche Kontraktion der Glattmuskelauskleidung einer Blutgefäßwand kann aus dem mechanischen Strecken oder Dehnen sowie aus der chemischen Wirkung von bestimmten endothelialen zellabgeleiteten Kontraktionsfaktoren, die typischerweise unter hypoxischen (wenig Sauerstoff) Bedingungen freigesetzt werden, resultieren. Diese unwillkürliche Kontraktion führt zu einer irreversiblen Schädigung des Muskels selbst, der endothelialen Zellen und der umgebenden extrazellulären Matrix. Aus diesem Grund schließt die Stabilisierungslösung für Blutgefäße ein oder mehrere Glattmuskelentspannungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe von Calcitoningen-verbundenem Peptid (CGRP), Papaverin, Natriumnitroprussid (NaNP), H7 (ein Proteinkinase-C-Hemmstoff), Calciumkanalblockierungsmittel, Calciumchelatoren, Isoproterenol, Phentolamin, Pinacidil, Isobutylmethylxanthin (IBMX), Nifedepin und Flurazin ein. Das entnommene Gewebe wird sofort in diese Stabilisierungslösung gegeben und während des Transports und Lagerung vor dem weiteren Bearbeiten bei 4°C gehalten.
Bei der Durchführung dieser Erfindung ist es wichtig, dass das entnommene Gewebe bearbeitet wird, um antigene Zellbestandteile zu entfernen.
Die Zellentfernung kann unter Verwendung einer Anzahl von chemischen Behandlungen, einschließlich Inkubation in bestimmten Salzen, Detergenzien oder Enzymen erzielt werden. Es zeigte sich, dass durch die Verwendung des Detergenzes Triton X-100, ein Markenprodukt von Rohm und Haas Company, Philadelphia, PA, Zellmembranen entfernt werden, wie detailliert in US-Patent Nr. 4,801,299 beschrieben. Andere akzeptable Zellentfernungsdetergenzien schließen Polyoxyethylen(20)sorbitmonooleat und Polyoxyethylen(80)sorbitmonooleat (Tween 20 und 80), Natriumdeoxycholat, 3-[(3-Chloamidopropyl)dimethylamino]-1-propansulfonat, Octylglucosid und Natriumdodecylsulfat ein.
In einer anderen Ausführungsform können zum Erzielen von Zellentfernung Enzyme, einschließlich, jedoch nicht beschränkt aus Dispase-II, Trypsin und Thermolysin verwendet werden. Diese Enzyme reagieren mit verschiedenen Bestandteilen von Kollagen und interzellulären Verbindungen beim Erzielen ihrer Wirkungen. Dispase-II greift Kollagen Typ IV an, bei welchem es sich um einen Bestandteil der Lamina densa und Anchorfibrile der Basalmembran handelt. Thermolysin greift das knollenartige Phamphigoidantigen im Hemidesmosom der Basalschicht von Keratinocyten an. Trypsin greift den Desmosomkomplex zwischen Zellen an. Auf Grund der proteolytischen Natur dieser Enzyme muss darauf Acht gegeben werden, dass die Zellentfernung ohne deutliche Schädigung der extrazellulären Matrix, einschließlich des Basalmembrankomplexes auftritt. Dies ist eine Funktion der Konzentration, der Zeit und der Temperatur. Falls sie zu lange oder mit einer zu hohen Konzentration verwendet wird, kann Dispase-II z.B. den Basalmembrankomplex aus der Dermis vollständig entfernen.
Zum Beispiel werden durch Dispase-II von menschlicher Leichenhaut mit 1,0 Einheiten/ml für eine Dauer von 90 Minuten bei 37°C alle Keratinocyten außer die Basalschicht entfernt, während der Basalmembrankomplex schon etwas geschädigt wird. Thermolysin mit 200 μg/ml für eine Dauer von 30 Minuten bei 4°C entfernt gelegentlich im Wesentlichen die gesamten Keratinocyten ohne Schädigung des Basalmembrankomplexes, jedoch variiert dies von Spender zu Spender, wobei in einigen Spendern ein Hinweis auf Basalmembranschädigung zu sehen ist. Die Inkubation von Haut in 1 molarem Natriumchlorid für eine Dauer von 16 Stunden für menschliche Haut und 48 Stunden für Schweinehaut gewährt routinemäßig eine saubere Auftrennung der Epidermis und Dermis ohne Schädigung des Basalmembrankomplexes.
Zusätzlich zu Salzen, Detergenzien und Enzymen enthält die Bearbeitungslösung auch bestimmte Proteasehemmer zum Verhindern des Abbaus der extrazellulären Matrix. Bindegewebe auf Kollagenbasis enthält Proteasen und Kollagenasen als endogene Enzyme in der extrazellulären Proteinmatrix. Zudem enthalten bestimmte Zelltypen, einschließlich Glattmuskelzellen, Fibroplasten und endotheliale Zellen eine Anzahl dieser Enzyme innerhalb der Lysosome genannten Bläschen. Werden diese Zellen durch Vorfälle wie Hypoxie entschädigt, werden die Liposome aufgebrochen und ihre Inhaltsstoffe freigesetzt. Infolgedessen kann sich die extrazelluläre Matrix einer schweren Schädigung durch den Protein-, Proteoglycan- und Kollagenabbau unterziehen. Diese Schädigung kann, wie in klinischen Fällen von Herzischämie bewiesen, wo eine zum Bewirken von Zelltod nicht ausreichende Reduktion im Sauerstoffgehalt zu einer deutlichen Schädigung der Kollagenmatrix führt, schwer sein. Zudem ist eine Folge des extrazellulären Abbaus die Freisetzung von Chemoanlagerungen, die entzündliche Zellen, einschließlich polymorphonukleare Leukozythen und Makrophagen zu dem Transplantat drängen, welche totes oder geschädigtes Gewebe entfernen sollen. Diese Zellen bewahren jedoch die extrazelluläre Matrixzerstörung durch eine nicht spezifische entzündliche Antwort. Demzufolge enthält die Bearbeitungslösung einen oder mehrere Proteasehemmer, ausgewählt aus der Gruppe von N-Ethylmaleimid (NEM), Phenylmethylsulfonfluorid (PMSF), Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ethylenglycolbis(2-aminoethyl(ether)N,N,N',N'-tetraessigsäure, Ammoniumchlorid, erhöhter pH-Wert, Apoprotinin und Leupeptin zum Verhindern einer derartigen Schädigung.
Zusätzlich zu Salzen, Detergenzien, Enzymen und Proteasehemmern enthält die Bearbeitungslösung im Allgemeinen einen geeigneten Puffer. Dieser kann einen oder viele verschiedene organische Puffer beinhalten, die vorstehend beschrieben sind. Die Erfinder bevorzugen die Verwendung eines organischen Puffers, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES), Tris(hydroxymethyl)aminonomethan (TRIS) und (N-[2-Hydroxyethyl]piperazin- N'-[ethansulfonsäure] (HEPES). In einer anderen Ausführungsform kann in bestimmten Anwendungen ein physiologischer Puffer oder ein Puffer mit niedrigem Salzgehalt, einschließlich Phosphatbicarbonatacatarcitratglutamat mit oder ohne Glycin geeignet sein. Physiologische Puffer oder Puffer mit niedrigem Salzgehalt können die Infiltration des Transplantats mit lebensfähigen Zellen stärker unterstützen und sind damit relevanter, wenn eine Gefäßneubildung einschließende Zellinfiltration für ein frühes Uberleben des Transplantats wie in transplantierter dermaler Matrix wichtig ist.
Da die Bearbeitungslösung Chemikalien enthalten kann, die bei einer Transplantation reizend oder entzündlich sein können, ist es für die Durchführung dieser Erfindung wichtig, dass die Bearbeitungslösung gründlich aus dem Gewebe gespült wird. In der bevorzugten Ausführungsform erfolgt diese Waschung durch Spülen in ausreichenden Wechseln eines geeigneten Puffers bis Reste der Bearbeitungslösung auf mit der Transplantation kompatible Gehalte reduziert werden. In einer anderen Ausführungsform können die Bestandteile der Bearbeitungslösung durch spezifische Hemmer, z.B. Dispase-II durch Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) oder Trypsin durch Serum neutralisiert werden.
Die Tiefkühlpräparation oder das Gefriertrocknen des Gewebes findet nach dem gründlichen Waschen statt. Biologische Materialien unterziehen sich im Allgemeinen während dem Einfrieren und Auftauen oder nach dem Gefriertrocknen durch herkömmliche Mittel einer deutlichen Verschlechterung. Demzufolge sollten diese Schritte vor der Inkubation des bearbeiteten Gewebes mit entfernten Zellen in einer Tiefkühlschutzlösung durch die in dieser Anmeldung beschriebenen Verfahren vermieden werden.
Die anfänglichen Schritte des Tiefkühlbewahrens des Gewebes mit entfernten Zellen schließt das Inkubieren des Gewebes in einer Tiefkühllösung vor dem Gefrierschritt ein. Die Tiefkühllösung umfasst einen geeigneten Puffer, ein oder mehrere Tiefkühlschutzmittel und/oder Trockenschutzmittel mit oder ohne einem organischen Lösungsmittel, das sich in Kombination mit Wasser weder einer Ausdehnung noch einer Kontraktion unterzieht.
Ein geeigneter Puffer kann beliebige der vorstehend beschriebenen Puffer beinhalten, die beim Beschaffen oder Zellentfernungsbearbeiten des entnommenen Gewebes verwendet werden.
Zusätzlich zu einem geeigneten Puffer enthält die Tiefkühllösung ein Tiefkühlschutzmittel. Tiefkühlschutzmittel erhöhen den Glasübergangstemperaturbereich des Gewebes, wodurch eine optimale Stabilisierung des Gewebes in gefrorenem Zustand gewährt wird. Durch Erhöhen dieses Bereichs kann das Gewebe mit schnellerer Geschwindigkeit getrocknet werden. Das Tieflkühlschutzmittel vermindert auch die Eisbildung für eine vorgegebene Kühlgeschwindigkeit, wodurch zu einem gewissen Grad die Verglasung (Abwesenheit eines kristallinen Gitters), jedoch zu einem größeren Grad die Bildung von Einwürfeln gewährt wird. Mit gegenwärtigen Verfahren des ultraschnellen Abkühlens in Gegenwart von Tiefkühlschutzmitteln wird die Verglasung nur mit sehr kleinen Proben und nur bis zu einer Tiefe bis zu wenigen Mikron erzielt. Kubisches oder hexagonales Eis ist dann anzutreffen. Verglastes Wasser und kubisches Eis sind für extrazelluläre Matrixbestandteile weniger schädlich als hexagonales Eis. In einigen Fällen ist es jedoch erlaubt, das Auftreten von hexagonalem Eis zu gewähren (z.B. bei der Bearbeitung von Haut). Ein gewisser Grad an Bildung von hexagonalem Eis ist zulässig, wenn dies nicht zur Verschlechterung der funktionellen Eigenschaften des Gewebes führt. Herzklappen unterziehen sich nach einer Implantation Gegenstand wiederholter Spannung und tolerieren damit weniger Eiskristallschädigung als z.B. die Dermis.
Verschiedene Tiefkühlschutzmittel können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese schließen ein: Dimethylsulfoxid (DMSO), Dextran, Saccharose, 1,2-Propandiol, Glycerin, Sorbit, Fructose, Trehalose, Raffinose, Propylenglycol, 2,3-Butandiol, Hydroxyethylstärke, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Prolin (oder andere Proteinstabilisatoren), menschliches Serumalbumin und Kombinationen davon. Geeignete Tiefkühlschutzmittel bilden Wassermoleküle, so dass der Gefrierpunkt reduziert und/oder die Geschwindigkeit des zum Erzielen der Verglasungsphase nötigen Abkühlens reduziert wird. Sie erhöhen auch den Glasübergangstemperaturbereich des verglasten Zustands.
Die Tiefkühllösung kann auch das Aussetzen des biologischen Gewebes einer oder mehreren Trockenschutzmittelverbindungen einschließen. Trockenschutzmittel stabilisieren definitionsgemäß Proben in trockenem Zustand. Einige Tiefkühlschutzmittel wirken auch als Trockenschutzmittel. Einige Verbindungen besitzen variable Mengen von jeder Aktivität, z.B. liegt Trehalose vorwiegend in einem Trockenschutzmittel und einem schwächeren Tiefkühlschutzmittel vor, wohingegen Saccharose vorwiegend in einem Tiefkühlschutzmittel und einem schwächeren Trockenschutzmittel vorliegt. Zum Beispiel bindet sich Trehalose und Polyhydroxycarbohydrate an und stabilisieren Makromoleküle wie Proteine. Verschiedene Trockenschutzmittel können in der vorliegenden Erfindung verwendet werden: Saccharose, Raffinose, Trehalose, Zink, Prolin (oder andere Proteinstabilisatoren), Myristinsäure, Spermin (oder eine polyanionische Verbindung) und Kombinationen davon.
Es zeigte sich, dass die Kombination von 0,5 M Dimethylsulfoxid, 0,5 M Propylenglycol, 0,25 M 2,3-Butandiol, 1,0 M Prolin, 2,5% Raffinose, 15% Polyvinylpyrrolidon und 15% Dextran (MWT 70.000) in Kombination mit Kühlgeschwindigkeiten in der Ordnung von –2500°C/Sekunde beim Beibehalten der Strukturintegrität von menschlichen Vena Saphena infolge sowohl von Einfrieren als auch von Trocknen wirksam ist. Die Erfinder zeigten auch, dass sich das Gewebe bei Verwendung dieser Lösung aus Tiefkühlschutzmitteln, Trockenschutzmitteln und Puffer mit einer größeren Gewebeprobe wie einer Herzklappe dann infolge von Einfrieren und/oder Trocknen einem Bruch unterzieht. Dieses Phänomen kann durch Ersetzen eines Prozentanteils des Wassers mit einem organischen Lösungsmittel wie Formamid bewältigt werden. Der Prozentanteil (50%) wird als diejenige Kombination von Lösungsmittel, Wasser, Tiefkühlschutzmitteln und Trockenschutzmitteln bestimmt, die sich während dem Einfrieren nicht ausdehnt oder zusammenzieht. Formamid (HCONH₂) ist ein hydrophiles, organisches Lösungsmittel mit einem Kohlenstoffatom, das Tiefkühlschutzmittel auf Kohlehydratbasis löst. Es kann durch andere organische Lösungsmittel mit ähnlichen Eigenschaften wie Dimethylformamid. Dimethylsulfoxid (DMSO), Glycerin, Propylenglycol, Ethylenglycol und Pyridin ersetzt werden.
Die biologischen Proben werden für eine Dauer von wenigen Minuten bis wenigen Stunden in den Tiefkühllösungen inkubiert, bevor sie schnell abgekühlt werden. Im Allgemeinen wird eine Tiefkühlbewahrung als kontinuierliche Ereignisfolgen durchgeführt. Das Gewebe wird zuerst für eine definierte Dauer (0,5 bis 2 Stunden) in der Tiefkühllösung inkubiert, bis eine vollständige Durchdringung der Bestandteile der Tiefkühllösung erzielt wird, und die Probe dann auf eine Temperatur, bei welcher sie stabil ist, gewöhnlich weniger als –20°C eingefroren.
Die Erfinder waren bei der Entwicklung von Tiefkühlfixierung und ultralangsamem Temperaturmolekulardestillationstrocknen als Verfahren zum Präparieren von biologischen Proben für eine elektronenmikroskopische Analyse beteiligt. Zum Bewerten dieser Vorgehensweise erforschten sie die Beziehung zwischen Trocknungseigenschaften und Eisphasen, die innerhalb von gefrorenen Proben vorliegen.
Die Probenpräparation für eine Elektronenmikroskopie durch rein physikalische oder Trocknungsbearbeitungstechniken weist einen theoretischen Anreiz auf, insbesondere, wenn das letztendliche Ziel die Analyse sowohl der Ultrastruktur als auch der Biochemie ist. Seit den frühesten Tagen der Elektronenmikroskopie wurden einige Versuche durchgeführt, das Verfahren des Einfrierens und Vakuumtrocknens oder des Gefriertrocknens (FD) für Zell- und Gewebeproben zu verfeinern und zu entwickeln.
Trotz den konzeptionellen Vorteilen und dem durchgeführten Fortschritt muss das Gefriertrocknen für die Elektronenmikroskopie noch den Status einer routinemäßigen breit anwendbaren Technik erzielen. Mehrere Gründe erklären dies. Erstens ist der ultrastrukturelle Schutz verglichen mit herkömmlichen chemischen oder Nassbearbeitungstechniken oder Hybridtechniken wie Gefriersubstitution häufig minderwertig. Zweitens gibt es zahlreiche praktische Probleme mit der Probenmanipulation, Temperaturregulierung, den Vakuumparametern und Endbearbeitungsprotokollen. Drittens und möglicherweise am Grundlegendsten wird angenommen, dass eine Trocknung bei Temperaturen unter –123°C zum Vermeiden von ultrastruktureller Schädigung entweder unmöglich oder unpraktisch ist. Als Ergebnis dieser praktischen und theoretischen Hindernisse wurde nur eine sporadische Untersuchung des Tieftemperaturgefriertrocknens erörtert.
Die Basis dieser theoretischen Grenze stammt von der Anwendung der kinetischen Gastherorie und der vorhergesagten Sublimationsgeschwindigkeiten, wie durch die Knudsen-Gleichung ausgedrückt:
wobei

Js: = Sublimationsgeschwindigkeit
N: = Verdampfungskoeffizient
Ps: = Sättigungsdampfdruck
Q: = universale Gaskonstante
T: = absolute Temperatur der Probe
M: = Molekulargewicht von Wasser

Für theoretisch ideale Trocknungsbedingungen gibt diese Gleichung an, dass die Sublimationsgeschwindigkeit direkt proportional zum Sättigungsdampfdruck von Wasser in der Probe und umgekehrt proportional zu der absoluten Temperatur der Probe ist. Obwohl die Temperatur der Probe klar definierbar ist, ist der Sättigungsdampfdruck ein komplexerer Parameter.
Frühere Anwendungen dieser Gleichungen verwendeten Sättigungsdampfdrücke, die theoretisch bestimmt wurden. Diese theoretischen Dampfdrücke schließen jedoch die latente Fusionswärme ein und sind damit nur auf hexagonales Eis anwendbar. Berechnungen auf der Basis dieser theoretischen Werte führten zu derartigen Rückschlüssen, dass „es bei 150 Kelvin 3,5 Jahre dauern würde, bis eine Eisschicht mit einer Dicke von 1 mm durch Gefriertrocknen vollständig entfernt ist. Es ist deshalb unrealistisch, den Versuch einer Gefriertrocknung bei Temperaturen unter 170 Kelvin zu unternehmen".
Mehrere andere Eisphasen als hexagonale Eisphasen können je nach Abkühlmodus unter Verwendung von Tiefkühlschutzmitteln in einer Probe jedoch miteinander vorliegen. Diese verschiedenen Phasen können durch mehrere Verfahren, einschließlich Dampfkondensation, Überdruck-Anwendung und ultraschnelles Abschreckabkühlen erzielt werden.
Die nun erkannten Hauptphasen von Eis sind amorph, kubisch und hexagonal. Diese Eisphasen zeigen verschiedene Stabilitäten, was nahe legen würde, dass auch die Sättigungsdampfdrücke verschieden sind. Es wurde bestimmt, dass für dampfkondensiertes Wasser bei Temperaturen, bei welchen beide Phasen miteinander vorliegen können, der Sättigungsdampfdruck von amorphen Eis einer der beiden Logs ist, die höher als kubisches Eis sind.
Die Anwendung dieser experimentell bestimmten Sättigungsdampfdrücke in der Knudsen-Gleichung reduziert die Trocknungszeit bei 150 Kelvin von 3,5 Jahren auf 0,035 Jahren oder 12,7 Tagen für amorphes Eis mit 1 mm. Da Abschreckkühltechniken von biologischen Proben etwa 5 μm dieser Phase erzielen, würde die Trocknungszeit dieses Bestandteils auf alleiniger Basis der Knudsen-Gleichung in der Ordnung von 1,5 Stunden liegen. Damit kann die theoretische Grenze für das Trocknen in Bezug auf praktische Trocknungszeiten mit ultraniedrigen Geschwindigkeiten bewältigt werden.
Das Trocknen ist jedoch kein statischer sondern ein geschwindigkeitsabhängiger Prozess. Zusätzlich zum Sättigungsdampfdruck der verschiedenen Eisphasen muss auch die Geschwindigkeit des Übergangs von einer Phase zu einer anderen bei einer Temperaturerhöhung berücksichtigt werden. Zur Elektronenmikroskopieprobenpräperation sollte das Trocknen Idealerweise ohne jeglichen derartigen Übergang oder Entglasung stattfinden. Informationen über die Geschwindigkeit dieser Übergänge sind beschränkt. Es wurde gefunden, dass der Übergang von amorph zu kubisch als nicht umkehrbares Verfahren stattfindet, das stark von der Temperatur im Bereich von –160°C bis –130°C abhängt und ausgedrückt wird durch t = 2,04 × 1028 × exp(–0,465 T)
Der Übergang von kubisch zu hexagonal war durch sein Stattfinden im Bereich von –120 bis –65°C weniger temperaturabhängig, in dem Bereich von –120°C bis –65°C und wurde ausgedrückt durch t = 2,58 × 1012 × exp(–0,126 T)
Interessanterweise fand, als die Probentemperatur mit einer Geschwindigkeit mit 5°C/Minute erhöht wurde, der Übergang von amorph zu kubisch als plötzlicher Vorfall in der Nähe von –130°C statt.
Auf der Basis der vorstehenden Daten bestimmen die Übergangsgeschwindigkeit sowie der Sättigungsdampfdruck die Tiefe, auf welche eine bestimmte Eisphase mit einer spezifischen Temperatur getrocknet werden kann. Für amorphes Eis bei –160°C beträgt die Übergangszeit 205 Tage. Auf der Basis der Extrapolierung von experimentell bestimmten Sättigungsdampfdrücken und der Knudsen-Gleichung würde dies ein Trocknen von 26 Mikron gewähren. Bei –140°C beträgt die Übergangszeit 28 Minuten und würde unter idealen Bedingungen ein Trocknen von 0,8 μm gewähren. Unter –160°C, d.h. vor dem Einsatz des Übergangs, könnte man, wenn überhaupt, eine kleine translationale kinetische Energie der Wassermoleküle und damit, wenn überhaupt, ein geringes Trocknen vorhersagen.
Auf der Basis dieser Erwägungen kann die Hypothese des Übergangstrocknens, d.h. dasjenige für eine Probe, die mehrere Eisphasen enthält, aufgestellt werden, dass es möglich ist, jede Phase während dieses Übergangs sequentiell zu trocknen. Die Menge jeder getrockneten Phase hängt offensichtlich von mehreren Parametern, einschließlich der Effizienz der Trocknungsapparatur, der Heizgeschwindigkeit und der Impedanz der Trockenschale ab.
Tiefkühlbewahrung
Tiefkühlbewahrung ist die Bewahrung von Zell- oder Gewebestruktur vor mit Gefriervorgängen verbundener Verletzung. Eine natürliche Tiefkühlbewahrung kann mit Änderungen in der Zellstruktur, Zusammensetzung und metabolischem Gleichgewicht aus dem angenommenen Stoffwechsel des Organismus resultieren, wodurch eine verbesserte Toleranz des Gefrierens erhalten wird. In Laborversuchen, wenn Zelllebensfähigkeit oder Gewebeultrastruktur nach dem Abkühlen bewahrt werden sollen, sind zwei Verfahren verfügbar. Beim Ersten handelt es sich darum, die Probe ultraschnell abzukühlen, wodurch die Gewebeflüssigkeiten verglast werden, d.h. Eiskristalle fehlen. Beim Zweiten handelt es sich darum, chemische Zusätze einzubringen, um einen Grad an Tiefkühlschutz bereitzustellen. Die Chemikalien reichen von natürlich vorkommenden Tiefkühlschutzmitteln wie Glyzerin, Prolin, Zucker und Alkoholen über organischen Lösungsmitteln wie Dimethylsulfoxid ((DMSO) zu Polymeren mit hohem Molekulargewicht wie Polyvinylpyrrolidon (PVP), Dextran und Hydroxyethylstärke (HES).
Die Verglasung von Zellen und Geweben ist durch die Geschwindigkeit, mit welcher die Probe abgekühlt werden kann, und die Isolierungseigenschaften des Gewebes selbst beschränkt. Auf Grund von physikalischen Beschränkungen kann die Verglasung einer dünneren Gewebeschicht nur unter Verwendung von Techniken des Stands der Technik erzielt werden. Dies liefert die Idee, dass chemische Zusätze zum Tiefkühlschützen und Manipulieren der Abkühlgeschwindigkeit bei Versuchen, biologische Proben ohne Verursachen von Struktur- und Funktionsschädigung abzukühlen und zu lagern, sehr attraktiv ist.
Eine Beschädigung von biologischen Proben auf Grund von Einfrieren ist grundlegenden physikalischen und biologischen Prinzipien unterworfen, wobei einige seit langem bekannt, andere jedoch erst seit Neuestem verständlich sind. Beträchtliche Untersuchungen über die Mechanismen der Beschädigung durch Einfrieren in biologischen Proben begannen nicht vor dem zweiten Viertel dieses Jahrhunderts. Diese frühen Studien wurden von der Annahme beherrscht, dass eine physikalische Schädigung durch Eiskristalle die grundlegende Ursache für eine Beschädigung durch Einfrieren war. Die Wirkungen der Dehydratisierung und eine Korrelation zwischen der Konzentration von extrazellulären gelösten Stoffen und Zell- und Gewebeschädigung wurden demonstriert. Eine „Zweifaktor"-Hypothese für die Beschädigung durch Zelleinfrierung legte nahe, dass eine Zellbeschädigung entweder aus der Konzentration der gelösten Stoffe durch extrazelluläres Eis oder durch Bildung von extrazellulärem Eis, wodurch eine mechanische Beschädigung verursacht wird, erfolgte.
Die Wirkung von Glyzerin und anderen kleinen polaren Verbindungen wurde als Durchdringen der Zellen und als Ausüben einer kolligativen Wirkung innerhalb der Zellen interpretiert. In dem Verhältnis, in welchem die kolligative Wirkung der durchdringenden Verbindungen Wasser in flüssigem Zustand bei Temperaturen unter 0°C zurückhält, wird ein erhöhtes Volumen an Zelllösung beibehalten. Dadurch wird eine übermäßige Konzentration an toxischen Elektrolyten in der nicht eingefrorenen Zelllösung vermieden. Ein ähnlicher Einfluss findet auch in in der externen Lösung statt. In diesem Zusammenhang wird die kolligative Wirkung als Wirkung durch einen fremden gelösten Stoff beim Senken des Gefrierpunkts der Lösung in Kontakt mit Eis bezeichnet. Liegt genug Schutzverbindung vor, erhöht sich die Salzkonzentration auf keinen kritisch schädigenden Gehalt, bis die Temperatur so gering wird, dass die schädigenden Reaktionen langsam genug sind, um von den Zellen toleriert zu werden. Ahnliche Konzepte der Schädigung auf Gewebematrix sowohl durch mechanischen Einfluss von Eiskristallen als auch chemischer Schädigung auf Grund der Konzentration von gelöstem Stoff und Veränderungen im pH-Wert können ebenso angewandt werden.
Die nicht durchdringenden Tiefkühlschutzmittel variieren in der Größe von Saccharose bis zu großen polymeren Substanzen wie PVP, HES und Dextran. Es wurde vorgeschlagen, dass nicht durchdringende Substanzen durch etwas andere Mittel als diejenigen, die im vorstehend beschriebenen kolligativen Mechanismus wirken. Es wird angenommen, dass die Rolle der größeren Moleküle durch osmotische Wirkung dehydratisierend ist. Wird ein großer Anteil Wasser aus den Zellen mittels eines osmotischen Differenzials abgezogen, ist weniger freies Wasser für eine intrazelluläre Eiskristallisation, die häufig als tödlicher Faktor identifiziert wird, verfügbar. In Geweben können polymere Substanzen durch Binden und Strukturieren von Wassermolekülen wirken.
Die Abkühlgeschwindigkeit in Gegenwart von Tiefkühlschutzverbindungen ist bei der Einfrierungsbeschädigung ein sehr wichtiger Faktor. Normalerweise ist für Zellen eine langsame Abkühlung besser als erhöhte Abkühlgeschwindigkeiten, da Letzteres die intrazelluläre Eisbildung unterstützt. Dies findet statt, da das Wasser nicht genug Zeit hat, um aus den Zellen zu entweichen, bevor das enthaltene Zellwasser einfriert. Mit einer langsameren Abkühlgeschwindigkeit bildet sich zuerst extrazelluläres Eis, was zur Dehydratisierung der Zelle führt, die zusammen mit der Gegenwart des Tiefkühlschutzmittels die intrazelluläre Eisbildung verhindert. Für Gewebematrixproben liegt eine direktere Korrelation mit der Gesamtreduktion im Grad der vollständigen Eiskristallbildung vor.
Es wurde angenommen, dass durchdringende Verbindungen dadurch wirken, dass sie einen übermäßigen Transport von Wasser aus den Zellen zu früh im Einfrierprozess erlauben, während nicht durchdringende Verbindungen zusammen mit einer kolligativen Wirkung der Verdünnung der Lösung um die Zellen eine dehydratisierende Wirkung auf Zellen aufweist. Jedoch erzählt keine dieser Beschreibungen die ganze Geschichte.
Gelöste Stoffe wie HES oder PVP sind vollkommen nicht durchdringende, Wasser entziehende Verbindungen mit einem kaum größeren Molekulargewicht als nicht durchdringende Saccharose. Das größere Molekulargewicht könnte solche Verbindungen weniger osmotisch und kolligativ wirksam machen, wenn sie auf Gewichtsbasis betrachtet werden. Dennoch zeigte sich in konzentrierten Lösungen eine weitaus größere kolligative Wirkung der Verbindungen als es auf der Basis lediglich einer linearen Beziehung mit der Konzentration zu erwarten wäre.
Bei einer anderen Schädigungsquelle für eingefrorenes Gewebe als diejenige vom Einfrieren selbst handelt es sich um die osmotischen und toxischen Wirkungen von vielen Tiefkühlschutzmitteln. Werden sie in Gemischen verwendet, können einige Tiefkühlschutzverbindungen der Toxizität von anderen Tiefkühlschutzmitteln entgegenwirken, wie es durch die Zugabe von Polyethylengylcol (PEG) zu einem Gemisch von DMSO und Glyzerin demonstriert wurde. Die Erfinder entwickelten mehrere Verglasungslösungen (VS).

Die Toxizität der einzelnen Verbindungen dieser Lösungen wurde getestet. In den Gemischen waren die toxischen Wirkungen geringer als bei alleiniger Verwendung einer äquivalenten Konzentration eines beliebigen Bestandteils. Die erhaltenen Lösungen waren für Zellkulturen nicht toxisch und blieben glasartig und optisch klar (d.h. kein sichtbarer Eiskristall wird gebildet), als sie in flüssigen Stickstoff getaucht wurden. Verglasungslösung 1

Dimethylsulfoxid (DMSO)	– 0,5 M
Propylenglycol	– 0,5 M
2-3-Butandiol	– 0,25 M
Prolin	– 1,0 M
Raffinose	– 2,5% (G/V)
Polyvinylpyrrolidon (PVP)	– 15% (G/V) (Ave. M. W. ≈ 40.000)
Dextran	– 15% (G/V) (Ave. M. W. ≈ 40.000–70.000)

Ein modifizierte Verglasungslösung (VS₂) wurde ebenso entwickelt, die ein Gemisch aus Folgendem umfasst:

DMSO	– 0,5 M
Propylenglycol	– 0,5 M
2-3-Butandiol	– 0,25 M
Raffinose	– 10% (G/V)
Trehalose	– 6% (G/V)
Saccharose	– 6% (G/V)
PVP	– 12% (G/V) (Ave. M. W. ≈ 40.000)
Dextran	– 12% (G/V) (Ave. M. W. ≈ 40.000–70.000)

Ein modifizierte Verglasungslösung (VS₃), die ebenso entwickelt wurde, umfasst ein Gemisch aus Folgendem:

DMSO	– 0,5 M
Propylenglycol	– 0,5 M
2-3-Butandiol	– 0,25 M
Raffinose	– 2,5% (G/V)
Saccharose	– 10% (G/V)
PVP	– 15% (G/V) (Ave. M. W. ≈ 40.000)
Dextran	– 15% (G/V) (Ave. M. W. ≈ 40.000–70.000)

Ein vierte modifizierte Lösung (VS₄) wurde entwickelt. Diese Lösung unterscheidet sich dahingehend, dass sie 50% Formamid, ein organisches Lösungsmittel, enthält. Dieses Gemisch dehnt sich durch Einfrieren weder aus noch zieht es sich zusammen und verursacht damit beim Einfrieren von größeren Gewebeproben keinen Bruch. Es umfasst ein Gemisch aus Folgendem:

Formamid – 50% (G/V)

70K-Dextran – 15% (G/V)

Raffinose – 2,5% (G/V)

40K-PVP – 15% (G/V)

Saccharose – 12% (G/V)
Zusammenfassend handelt es sich bei den die Tiefkühlschutznatur der Verbindungen beeinflussenden Faktoren um (a) chemische Zusammensetzung, (b) niedrige Toxizität, (c) Molekulargröße und Durchdringungsfähigkeit und (d) Wechselwirkung mit anderen Verbindungen im Gemisch.
Bei den physikalisch chemischen Wirkungen von Tiefkühlschutzmitteln handelt es sich um (a) Unterdrückung des Gleichgewichtsgefrierpunkts von Substrat und Cytoplasma auf kolligativer Basis, (b) Unterdrückung von homogener Eiskernbildungstemperatur, (c) reduzierte Geschwindigkeit des Eiskristallwachstums auf Grund der Veränderung in der Viskosität und Wärmediffusionsfähigkeit der Lösung und (d) dehydratisierende Wirkungen auf Zellen durch osmotische Wirkung.
Abkühlparameter
Zum Zwecke der Tiefkühlpräparation von biologischen Geweben dieser Erfindung ist es wichtig, anzumerken, dass eine Vielzahl von Abkühlverfahren verwendet werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird ein schnelles Abkühlen als wichtig betrachtet, um die genaue Eiskristallmischung zu erhalten. In der besonders bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird ein Verglasungsverfahren eingesetzt, das zur Bildung eines wesentlichen Anteils an amorphem Wasser in der biologischen Probe führt. Wie hier nachstehend offenbart, wird ungeachtet der verwendeten Form des Abkühlens angenommen, dass eine amorphe Wasserphase, kubische Eiskristalle und hexagonale Eiskristalle im Endprodukt vorliegen. Das Verfahren des Abkühlens hat einen deutlichen Einfluss auf die Verteilung der in der gekühlten Tiefkühllösung gefundenen Eiskristalltypen.
Trocknungsparameter
Ziel des gesteuerten Trocknens eines eingefrorenen biologischen Gewebes durch Molekulardestillationstrocknen ist es, Wasser ohne weitere mechanische oder chemische Schädigung, die während dieses Trocknungsverfahrens auftritt, aus der Probe zu entfernen. Dies beinhaltet das Vermeiden von zwei grundlegenden Schädigungsvorfällen unter Verwendung von geeigneten Trocknungsbedingungen. Beim Ersten handelt es sich um das Entfernen von Wasser aus eiskristallinen Phasen ohne Übergang auf größere stabilere und zerstörendere Kristalle. Beim Zweiten handelt es sich um die Entfernung von Wasser vom Feststoff, außer nichtkristallinem Wasser oder Wassergemischen aus Wasser-angelöstem Stoff ohne Schmelzen oder Kristallisation dieser festen Phasen. Dieser zweite Bestandteil bezeichnet in amorphem Zustand vorliegendes Wasser, Wasser zusammen mit gelöstem Stoff im Euthetikum oder Wasser zusammen mit einer Verbindung, die Wasser bindet und strukturiert, und damit dessen Kristallisation während des Einfrierprozesses verhindert. Dadurch kann glasartiges Wasser von niedriger Energie und Stabilität wie in ultraschnell abgekühlten reinem Wasser oder von hoher Energie und Stabilität wie dasjenige, das mit Tiefkühlschutzmitteln mit dazwischen liegenden Abkühlgeschwindigkeiten erzielt wird, sein.
Viele der zum regulierten Trocknen zum Vermeiden des Auftretens dieser Vorfälle erforderlichen Merkmale überschneiden sich. Die Gründe dafür liegen darin, dass jede Wasserform einen bestimmten Energiezustand, egal ob in einem Kristall oder gebunden an eine Tiefkühlschutzverbindung, aufweist und es dieser Energiezustand ist, der eher als seine Konfiguration die Erfordernisse zum Trocknen bestimmt. Man erwäge z.B. (1) eine Probe aus kubischem Eis, das durch Abkühlen von reinem Wasser mit einer dazwischen liegenden Abkühlgeschwindigkeit erzielt wird, und (2) verglastes Wasser, das durch Mischen von Wasser mit Glyzerin auf 45% Vol:Vol und Abkühlen mit einer dazwischen liegenden Geschwindigkeit erzielt wird. Die erste Probe ist kristallin, und Ziel des Trocknens ist es, Wasser aus diesem Zustand ohne Übergang zu hexagonalem Eis zu entfernen. Die zweite Probe ist ein amorpher Feststoff, und Ziel des Trocknens ist es, Wasser aus dieser Phase ohne Schmelzen des Glases zu einer Flüssigkeit mit anschließendem Kochen zu entfernen. Für kubisches Eis beträgt der Einsatz dieses Übergangs –130°C und ist die Übergangsgeschwindigkeit temperaturabhängig, indem sie sehr langsam bei –130°C und sehr schnell bei –90°C ist. Für 45%iges Glyzerin-Wasser beträgt die Glasübergangstemperatur –120°C und stellt den Einsatz des Schmelzens dar. Der Schmelzprozess ist sehr langsam bei –120°C und temperaturabhängig, indem er bei –90°C sehr schnell wird.
Vor dem Einsatz des Übergangs von kubisch zu hexagonal oder des Glasübergangs von 45%-Glyzerin-Wasser ist der Sättigungsdampfdruck von Wasser in diesen Phasen extrem niedrig, und das Trocknen findet mit extrem langsamen Geschwindigkeiten statt. Ziel des kontrollierten Trocknens ist es deshalb, Wasser aus der kubischen Eisphase während ihres Übergangs und innerhalb eines Zeitraums zu entfernen, der geringer als derjenige ist, der für einen merklichen Übergang zum hexagonalen Eis und von der 45%-Glyzerin-Wasser-Phase während ihres Übergangs zu einer Flüssigkeit erforderlich ist, jedoch in einem geringeren Zeitraum, als es für eine nennenswerte Bildung der Flüssigkeit erforderlich ist.
Dieses Argument kann wiederholt auf alle Formen von vorliegendem Wasser, egal ob kristallin in kubischer oder hexagonaler Form oder nicht kristallin in amorpher Form oder gebunden an ein beliebiges Molekül vorliegt, ein Tiefkühlschutzmittel, Protein, Kohlenhydrat oder Lipid ist, angewandt werden. Zum Vereinfachen dieses Konzepts kann Wasser in einer eingefrorenen biologischen Probe derart beschrieben werden, dass es ein spezifisches Energieniveau E aufweist. In einer eingefrorenen biologischen Probe liegen Wasserformen von mehreren definierbaren Energieniveaus vor:
E₁ E₂ E₃–E_n
Der Präperationsmodus, die Natur der Probe, die Verwendung von Tiefkühlschutzmitteln und anderen Zusätzen und die verwendete Abkühlgeschwindigkeit bestimmen die relativen Verhältnisse dieser unterschiedlichen Wasserformen. Jedes Energieniveau bestimmt die Einsatztemperatur ihres Übergangs oder Schmelzens und die Temperaturabhängigkeit der Geschwindigkeit des Übergangs oder Schmelzens.
Gesteuerte Trocknungsverfahren müssen jeden dieser verschiedenen Wasserzustände während des Übergangs in einem geringeren Zeitraum, als er zum Fertigstellen des Übergangs erforderlich ist, entfernen. Dieser Trocknungsmodus erfordert deshalb, dass mehrere Bedingungen erfüllt sind.
Erstens muss die eingefrorene Probe ohne Temperaturerhöhung über ihrer untersten Übergangstemperatur in den Trockner gefüllt werden. Tritt eine Temperaturerhöhung nicht auf, muss dies über einen derart kurzen Zeitraum stattfinden, dass kein merklicher Übergang auftritt. Idealerweise findet die Befüllung unter flüssigem Stickstoff bei –190°C gut über dem untersten wahrnehmbaren Übergang von –160°C von reinem, ultraschnell abgekühltem amorphem Wasser statt. Handelt es sich bei der Probe jedoch überwiegend um kubisches Eis oder ein Gemisch aus Wasser und Tiefkühlschutzmitteln mit einem Glasübergang in der Ordnung von –100°C bis –130°C, kann ein geschlossenes Kreislaufkühlsystem ausreichend sein, um das Beibehalten der Probentemperatur unter dem Einsatz des Übergangs zu ermöglichen.
Nach dem Befüllen muss die Probe einem Vakuum ausgesetzt werden und in direkter Sichtlinie der Kühleroberflächen liegen. Die Kriterien dafür werden wiederum durch die Natur der in der Probe vorliegenden Wasserphasen bestimmt. Die folgenden Aufgaben müssen erfüllt werden. Das Vakuum in der Kammer während des Trocknens einer bestimmten Phase muss einen Wasserpartialdruck bilden, der zumindest gleich oder niedriger als der Sättigungsdampfdruck von Wasser in der zu entfernenden Phase ist. Dieser Sättigungsdampfdruck hängt von der Natur der Wasserphase und ihrer Temperatur ab. Somit liegen die ungefähren Sättigungsdampfdrücke für reines amorphes Wasser im Übergangsbereich von –160°C bis –130°C 6 × 10^–12 mbar (–160°C) bzw. 5 × 10^–7 mbar (–130°C). Variieren die Übergangszeiten von amorphem zu kubischem Eis im selben Temperaturbereich, –160°C bis –130°C, von 5 × 10⁵ Minuten bis 5 Minuten, findet das Trocknen sehr langsam statt, bis Temperaturen der Ordnung von –150°C bis –140°C erreicht werden, indem ein Vakuum von 5 × 10^–10 bis 2 × 10^–8 mbar erforderlich ist. Dies stellt ein Extrem dar.
Für kubisches Eis findet wenig, wenn überhaupt ein Trocknen unter seinem Übergangseinsatz bei –130°C statt, wenn sein Sättigungsdampfdruck in der Ordnung von einem Log niedriger als für amorphes Wasser liegt. Im Übergangsbereich, –130°C bis –100°C, beträgt der Sättigungsdampfdruck von kubischem Eis etwa 5 × 10^–8 bis 9 × 10^–5 mbar. Die Übergangszeiten von kubisch zu hexagonal betragen 700 Minuten bzw. 109 Minuten. Der Sättigungsdampfdruck bestimmt deshalb die Vakuumerfordernisse für das Trocknen und kann auf alle vorliegenden Wasserphasen angewandt werden. Es ist wichtig, anzumerken, dass dieselben Vakuumkriterien nicht auf alle Phasen anwendbar, sondern eher phasenabhängig sind.
Ein zweites Kriterium für das Vakuum ist, dass der mittlere freie Weg über dem Abstand zwischen der Probe und der Kühleroberfläche liegt. Idealerweise sollte dies ein zehnfacher Überschuss sein. Die Kühleroberfläche muss eine niedrigere Temperatur als die Einsatzübergangstemperatur der Wasserphase, die von der Probe entfernt wird, sein, sodass der Sättigungsdampfdruck von auf dieser Oberfläche kondensiertem Wasser während des Trocknens deutlich niedriger als derjenige der Wasserphase innerhalb der Probe ist. Idealerweise sollte dieser um drei Größenordnungen niedriger sein. Für eine mehrere Wasserphasen enthaltende Probe muss die Temperatur der Kühleroberfläche unter dem Übergangseinsatz der am wenigsten stabilen Eisphase, die zum Entfernen übrig bleibt, bleiben. Idealerweise sollte der Kühler ebenso in Sichtlinie der Probe liegen.
Nachdem die Probe eingefüllt und einem Vakuum und der Kühleroberflächen ausgesetzt wurde, müssen die Probe und der Probenhalter derart erwärmt werden, dass die Beweglichkeit der Wassermoleküle erhöht und dadurch ihr Entweichen bewirkt wird. Dies ist der wichtige und kritische Bestandteil des Trocknens einer Probe, die mehrere Phasen oder Energieniveaus von Wasser enthält. Die Temperatur der Probe muss genau bekannt sein. Die Temperatursteuerung und die Geschwindigkeit der Probenerwärmung müssen genau gesteuert werden. Dies ist nötig, um zu gewährleisten, dass das Trocknen jeder Wasserphase in der Probe sequenziell erfolgt.
Dadurch muss das Erwärmen dann für eine Probe, die mehreren Wasserphasen mit einem Energieniveau E₁ und E₂–E_n enthält, wobei E₁ am wenigsten stabil ist, mit einer derartigen Geschwindigkeit erfolgen, dass E₁ vor seinem Übergang zu E₂, E₂ vor seinem Übergang zu E₃ usw. entfernt wird. Dies erfordert Trocknungsbedingungen, die nicht im Gleichgewicht liegen, und ein Erwärmen mit einer kontinuierlichen Geschwindigkeit oder Halten eines konstanten Temperaturniveaus, sodass eine wie durch Folgendes bestimmte Sublimation stattfindet:
wobei

Js = Sublimationsgeschwindigkeit in gcm^–1 sec^–1
N = Verdampfungskoeffizient
Ps = Sättigungsdampfdruck
M = Molekulargewicht von Wasser
Q = universale Gaskonstante
T = absolute Temperatur der Probe

Dies stimmt mit der Übergangsgeschwindigkeit für die zu entfernende bestimmte Phase überein. Zum Beispiel ist die Geschwindigkeit des Übergangs von amorph zu kubisch angegeben durch: E = 2,04 × 1028 × exp(–0,465 T)
In einer anderen Ausführungsform variieren die Sublimationsgeschwindigkeit und die Übergangsgeschwindigkeit, wenn das Übergangsfenster T₁ zu T₂ ist, mit der Temperatur während dieses Intervalls variiert. Die Erwärmungsgeschwindigkeit während dieses Fensters T₁ zu T₂ muss derart sein, dass eine Sublimation innerhalb der Dimensionen der Probe stattfindet, bevor der Übergang einer bestimmten Temperatur vollendet ist.
Auf diese Weise wird das Ziel des kontrollierten Trocknens, d.h. der sequentiellen Entfernung jeder Wasserphase unter Bedingungen, die für die Eigenschaften jeder Phase ohne merkliche/s Einkristallwachstum, -bildung oder -schmelzen geeignet sind, erzielt. Nach dem Trocknen muss die Probe in physikalisch oder mechanisch von Wasser auf der Kühleroberfläche oder einer anderen Quelle isolierter Form und in einem geschlossenen Behälter entweder unter Vakuum oder trockenem Inertgas gelagert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben durch ein geeignetes Verfahren abgekühlt, sodass die Eiskristallbildung unter dem Grad liegt, der eine Schädigung der Probe verursachen würde. Nach dem Einfrieren wird die Probe dann unter der Übergangstemperatur der unstabilsten Eisform gelagert. Für amorphes Eis erfolgt dies vorzugsweise unter –160°C. Die Probe wird dann in einen auf –196°C vorgekühlten Probenhalter gefüllt und in einen Molekulardestillationstrockner überführt. Die getrocknete Kammer wird dann verschlossen und für Vakuumintegrität versiegelt. Zum Vermeiden einer Umkristallisation muss die hydratisierte Probe während allen Manipulationen unter der Übergangstemperatur der unstabilsten Eisform gehalten werden.
Nach dem Einfüllen der Probe wird ein Hochvakuum (10^–8 bis 10^–6 mbar) in der Kammer gebildet. Die Probe wird deutlich enger an die Kühleroberfläche (mit flüssigem Stickstoff gekühlte Kammerwände) als an den mittleren freien Weg in der Kammer positioniert. Die Kühlertemperatur muss immer unter derjenigen der Probe liegen. Für eine amorphe Probe beträgt der Kühler vorzugsweise –196°C.
Der Probenhalter wird dann durch eine programmierbare Heizmikroprozessorthermopaarschleife erwärmt. Die Heizprogramme werden gemäß der Eiszusammensetzung der Probe bestimmt. Ein typisches Programm für eine amorphes, kubisches und hexagonales Eis enthaltende Probe beträgt 10°C pro Stunde von –180°C bis –150°C, 1°C pro Stunde von –150°C bis –70°C und 10°C pro Stunde von –70°C bis +20°C.
Nachdem die Probe 20°C erreicht hat, kann sie in einem geeigneten Behälter in der Vakuumkammer versiegelt und zur anschließenden Lagerung entnommen werden. In einem Aufbau ist die Probe in einem Glasfläschchen enthalten und mit einem Butlykautschuklyophilisierungsstopfen am Ende des Zyklus versiegelt. Spezifischere Details über den Betrieb des Molekulardestillationstrockners sind in US-Patent Nr. 4,468,871 angegeben.
Neubildung
Das Einfrieren und Trocknen von biologischen Geweben vermittelt durch die Bindungskräfte, die normalerweise makromolekulare Konformation stabilisieren, eine große physikalische Spannung. Diese entstabilisierende Wirkung wird der Erhöhung in der Konzentration von Elektrolyten und einer möglichen pH-Änderungen, wenn die Lösung einfriert, zugeschrieben. Daraus können Modifikationen der Probe, einschließlich der Inaktivierung von bestimmten Enzymen und der Denaturierung von Proteinen resultieren.
Studien mit Milchsäuredehydrogenase zeigten, dass das Einfrieren und Auftauen einen Zerfall des tetrameren Enzyms in Untereinheiten verursacht, was von einer Änderung in der biologischen Aktivität begleitet ist. Es wurde gefunden, dass der Zerfall von der Ionenstärke und dem pH-Wert während des Einfrierens abhängt.
Andere Studien, die die quartäre Struktur von L-Asparaginase untersuchten, zeigten, dass dieses Enzym vom aktiven Tetramer beim Gefriertrocknen in inaktive Monomere zerfällt. Es wurde gefunden, dass dieser monomere Zustand durch Neubildung des getrockneten Enzyms mit Puffern mit hohem pH-Wert und hoher Ionenstärke stabilisiert wird. Jedoch zeigte sich, dass der Zerfall beim Wiederherstellen bei neutralem pH-Wert und niedriger Ionenstärke vollständig umkehrbar ist. Die Wirkung des pH-Werts kann andererseits Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur herbeiführen, was zu Untereinheiten führt, die konformationell durch die Reassoziation beschränkt werden.
Diese Studien weisen auf die Wichtigkeit des Bestimmens der Bedingungen von optimalem pH-Wert und optimaler Ionenstärke nicht nur der im Tiefkühlschutzprotokoll verwendeten Formulierung sondern auch der Neubildungslösung hin. Auf diese Weise kann eine maximale Probenaktivität und -stabilität erhalten werden.
Andere Variablen der Neubildung wie Dampfphasenrehydratisierung oder Temperatur kann ebenso für die Bewahrung der Aktivität nach dem Einfrieren und Trocknen wichtig sein. Andere Beschäftigte dieses Gebiets demonstrierten einen deutlichen Unterschied in der Vermehrungsantwort zu Lectinen je nach Rehydratisierungstemperatur oder je nachdem, ob Proben durch die Dampfphase neu gebildet wurden. Verbesserte Antworten auf Lectine wurden notiert, als die gefriergetrockneten Lymphozyten bei Trockeneistemperaturen rehydratisiert wurden, und man sie dann erwärmen lies. Dieses stufenweise Verfahren der Neubildung reduzierte die durch eine plötzliche Rehydratisierung herbeigeführte osmotische Spannung.
Bei der Bearbeitung von biologischen Geweben kann der Rehydratisierungsschritt auch zum Vergrößern der bei den Beschaffungs- und Bearbeitungsschritten verwendeten Bearbeitungs- und Stabilisierungsverbindungen verwendet werden. Diese schließen Bestandteile zum Minimieren der Wirkungen von Hypoxie und Bildung von freien Radikalen, Enzyme hemmende Mittel, onkotische Mittel, einschließlich Proteoglycane, Dextran und Amionsäuren zum Verhindern von osmotischer Schädigung ein.
Zusätzlich kann die Rehydratisierung von bestimmten Geweben, z.B. der Gefäßröhren und Herzklappen spezifische Mittel erfordern, um eine Plättchenaggegation während der frühen Postimplantatperiode zu hemmen. Wo das biologische Gewebe vernetzt werden soll, weist eine Rehydratisierung direkt in das Fixativ den zusätzlichen Vorteil der unmittelbaren und gleichmäßigen Verteilung des Fixativs im gesamten Gewebe auf.
Lagerungsbedingungen
Bei einer Sublimation von Wasser aus einer eingefrorenen Probe handelt es sich um ein Verfahren zum Bewahren der aktiven Bestandteile des biologischen Materials. Jedoch erfordert die optimale Bewahrung von Aktivität mit lang anhaltender Stabilität eine kritische Steuerung des Trocknungsprozesses und der Lagerungsbedingungen. Nach der Entfernung von freiem oder ungebundenem Wasser, verläuft der Prozess des sekundären Trocknens, indem währenddessen strukturell gebundenes Wasser entfernt wird. Gebundenes Wasser ist eng mit der Beibehaltung von Proteinkonformation verbunden. Folglich ist die in der getrockneten Probe zurückbleibende Wassermenge bekannt als Restfeuchtigkeitsgehalt, eine merkliche Variable beim Trocknungsprozess. Der endgültige Restfeuchtigkeitsgehalt beeinflusst sowohl das Überleben als auch die Stabilität der Probe.
Der Restfeuchtigkeitsgehalt ist als „prozentuale Restfeuchtigkeit" ausgedrückt und gleichgesetzt mit dem Gewicht (g) des Restwassers pro Gewichtseinheit (g) der ursprünglichen Probe.
Es wurde sich allgemein darauf geeinigt, dass durch Vakuumsublimation von Eis getrocknete biologische Materialien eine erhöhte Stabilisierung zeigen, wenn sie auf optimale Restfeuchtigkeitsgehalte getrocknet wurden. Materialien, die unter- oder übertrocknet, d.h. auf über oder unter dem Optimum liegende Restfeuchtigkeitsgehalte getrocknet wurden, zeigen eine erhöhte Schädigung.
Obwohl der optimale Restfeuchtigkeitsgehalt abhängig von der jeweiligen getrockneten Probe variiert, sind möglicherweise bestimmte Stabilitätsprobleme zu erwarten, wenn die Feuchtigkeitsgehalte unter dem optimalen Bereich liegen. Ein Übertrocknen der Probe, d.h. mit Restfeuchtigkeitsgehalten von weniger als 1–2% ohne die Verwendung eines Trocknungsstabilisators führt im Allgemeinen zur Entfernung nahezu des gesamten strukturierten Wassers, wodurch eine Modifikation oder ein Blockieren der freigelegten hydrophilen Stellen von Proteinen durch Oxidation gewährt wird. Diese Oxidation verursacht einen Abbau mit einer entsprechenden Verminderung der biologischen Aktivität. Demgegenüber weisen Restfeuchtigkeitsgehalte von größer als 5% im Allgemeinen auf ein Untertrocknen hin, wobei ausreichende Mengen an „freiem Wasser" in der Probe gehalten werden, die zur Transkonformation des Proteins beitragen könnten. Die resultie renden Umordnungen der Polypeptidketten verschieben sich von typisch geordneter Anordnung des nativen Proteins zu ungeordneter Anordnung. Diese Proteinstörungen können zu einer schlechten Dauerstabilität des getrockneten Produkts führen.
Eine erfolgreiche Dauerlagerung erfordert das Probentrocknen auf optimale Restfeuchtigkeitsgehalte. Ein unangemessenes Trocknen der biologischen Proben und seine Folgen wurden in der Literatur dargestellt. Eine maximale Stabilität von durch Wassersublimation im Vakuum getrockneten Suspensionen des Grippevirus fand mit einem Restfeuchtigkeitsgehalt von etwa 1,7% statt. Eine Unter- oder Übertrocknung auf einen nicht optimalen Wassergehalt führte zum Abbau des Virus, was nahe legt, dass variierende Mengen an freiem und gebundenem Wasser in einer trockenen Probe eine Wirkung auf die Proteinstruktur und -aktivität aufweisen.
Zum Maximieren von Probenstabilität und Erfüllen von behördlichen Anordnungen für die Präparation von getrockneten Arzneimitteln oder Reagenzien ist es wichtig, dass der Restfeuchtigkeitsgehalt nach dem Probentrocknen bestimmt wird.
Mehrere Verfahren sind zum Messen von Restfeuchtigkeitsgehalten verfügbar:

1. Gravimetrisch (Heizverfahren) – Eine bekannte Menge an getrocknetem Produkt wird erwärmt, und der Gewichtsverlust kann mit dem Wassergehalt gleichgesetzt werden.
2. Chemischer Test – Dieses Verfahren basiert auf der Reaktion zwischen Wasser und freiem Iod in einem Gemisch aus Pyridin, Schwefeldioxid und Methanol. Der Endpunkt wird kolorimetrisch nachgewiesen, wenn freies Iod vorliegt. H₂O + I₂ + SO₂ + ROH + 3RN → 2RNHI + RN + HSO₄R.
3. Gaschromatographie

Jedes der Verfahren weist Beschränkungen auf, und es ist deshalb sinnvoll, sich nicht auf ein einzelnes Verfahren der Feuchtigkeitsbestimmung zu verlassen. Eher sollten mehrere Verfahren zum Bewerten der Ergebnisse eingesetzt werden.
Nach dem Trocknen auf optimale Restfeuchtigkeitsgehalte wird die Probe nach dem Entfernen von dem Vakuum auf Grund ihrer hygroskopischen Natur und Oxidationsempfänglichkeit immer noch als unstabil betrachtet. Maßnahmen müssen während der Lagerung getroffen werden, um die Probe vor atmosphärischer Rehydratisierung zu schützen und die Aussetzung an Sauerstoff zu minimieren. Ein derartiger Schutz ist wichtig, um die Dauerstabilität der Probe beizubehalten.
Eine Beweisführung in der Literatur weist darauf hin, dass gasförmige Bedingungen, unter welchen die Proben versiegelt werden, sowie die Lagertemperatur, die Dauerstabilität der Probe beeinflussen. Es wurde in einer verschiedene Gase und Lagertemperaturen vergleichenden Studie demonstriert, dass eine maximale Stabilität des Grippevirus erhalten wurde, als die Proben unter Helium- oder Wasserstoffgas bei niedriger Temperatur (–20°C) gelagert wurde. Ein Versiegeln unter anderen Gasen oder Vakuum mit verschiedenen Lagerungstemperaturen führte zu variierenden Stabilitätsgraden. Die Erfinder setzen voraus, dass diejenigen Verbindungen, die den Sauerstoffkontakt mit der Probe am effektivsten beschränken, die biologische Aktivität durch Reduzieren der Oxidation von freigelegten hydrophilen Stellen an der Proteinoberfläche deutlich verbessern. Geeignete Lagerungsparameter, d.h. Temperatur und ein Versiegeln unter Gas oder Vakuum sind wichtig, um eine Probendauerstabilität zu erhalten.
BEISPIEL 1
BEARBEITUNG UND LAGERUNG VON TRANSPLANTIERBARER HAUT
Haut eines menschlichen Spenders wird routinemäßig von Leichen entnommen und unter gekühlten oder eingefrorenen Bedingungen auf einer Anzahl an Gewebebanken innerhalb der gesamten Nation gelagert. Diese Haut wird als provisorischer Verband für Verbrennungsopfer verwendet, die sich einer extensiven Eigentransplantation unterziehen. Schweinehaut wird ebenso unter ähnlichen Bedingungen entnommen und als provisorischer Verbrennungsverband verwendet. In ihrem unbearbeiteten Zustand werden die allogene Haut und die Schweinehaut letztendlich vom Patienten abgestoßen. Dieselbe Haut ist auch zum Bearbeiten durch die nachstehend beschriebenen Verfahren verfügbar.
Spenderhaut wird unter aseptischen Bedingungen mit einem Dermatom entnommen und bei 4°C für eine Dauer von nicht mehr als 7 Tagen vor der weiteren Bearbeitung in Penicillin und Streptomycinlösung enthaltendem Gewebekulturmedium RPMI 1640 aufbewahrt. Der Transport zum Gewebebearbeitungszentrum LifeCell erfolgt durch eine Ubernachtlieferung auf nassem Eis im selben Medium. Bei Ankunft bei diesem Bearbeitungszentrum wird die Temperatur des Gewebebehälters bei mindestens 4°C bestätigt oder die Haut verworfen. Nach der Bestätigung der Behältertemperatur, der Spenderidentifikation und der Testdurchmusterungsdaten wird die Haut zur weiteren Bearbeitung in eine Laminarströmungshaube überführt.
Die Spenderhaut wird aus dem Transportbehälter entfernt und mit ihrer Netzseite nach unten auf einem Stück Maßträger, bei welchen es sich um ein Polyethylen mit niedriger Dichte handelt, positioniert. Ein geeignet bemessenes Stück Gaze wird der Epidermalseite der Haut zugesetzt, die dann in ein rechtwinkeliges Stück geschnitten wird, das so groß wie möglich, jedoch kein Quadrat ist, das größer als 4 × 4 Zoll und kleiner als 2 × 3 Zoll ist. Die Haut wird dann mit der Netzseite nach unten in einer Petrischale positioniert, welcher 50 ml Entepidermisierungslösung, bestehend aus 1 M NaCl, zugesetzt wird. Die Petrischale wird dann in einen Inkubator überführt und bei 37°C ± 2°C für eine Dauer von 18 bis 32 Stunden für menschliche Haut und 35 bis 55 Stunden für Schweinehaut inkubiert.
Nach der Inkubation wird die die Haut enthaltende Petrischale zur Entepidermisierung in eine Laminarströmungshaube überführt. Die Gaze wird zuerst entfernt und verworfen. Die Epidermis wird dann sanft mit Zangen aufgenommen und von der Dermis als Lage abgezogen. Die überschüssige Entepidermisierungslösung wird dann abgesaugt. Die Dermis wird dann in der unteren linken Ecke mit einer Länge von etwa 1 cm eingeschlitzt, um die obere und untere Oberfläche zu kennzeichnen.
Die Dermis wird als nächstes durch die Zugabe von 50 ml Gewebewaschlösung, bestehend aus steriler ausgewogener Hank-Salzlösung, in derselben Petrischale gespült. Die Petrischale wird dann für eine Dauer von 5 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 26°C) auf einer Drehvorrichtung mit 40 ± 5 UpM positioniert. Die Petrischale wird dann auf die Laminarströmungshaube zurückgegeben und der Deckel von der Petrischale entfernt, um die Gewebewaschlösung abzusaugen. Dieses Verfahren wird weitere zwei Male wiederholt.
Die Dermis wird dann mit 50 ml Zellentfernungslösung behandelt und die Petrischale für eine Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur (20 bis 26°C) auf eine Drehvorrichtung mit 40 ± 5 UpM gegeben. Die Zellentfernungslösung für menschliche Haut besteht aus 0,5% Natriumdodecylsulfat in ausgewogener Hank-Salzlösung und enthält für Schweinehaut 1 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Die Zellentfernungslösung wird durch Absaugen entfernt. Die Dermis wird dann mit 50 ml Gewebewaschlösung gewaschen. Die Petrischale wird dann für eine Dauer von 5 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 26°C) auf eine Drehvorrichtung mit 40 ± 5 UpM gegeben. Die Gewebewaschlösung wird durch Absaugen entfernt. Das Waschverfahren wird zweimal wiederholt. Nach dem die Dermis insgesamt dreimal gewaschen wurde, werden 50 ml Vorgefrierlösung der Petrischale zugesetzt. Die Schale wird dann für eine Dauer von 30 Minuten bei Raumtemperatur (20 bis 26°C) auf eine Drehvorrichtung mit 40 ± 5 UpM gegeben. Die Vorgefrierlösung für menschliche Haut besteht aus 7% Dextran (MG 70.000), 6% Saccharose, 6% Raffinose und 1 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure in ausgewogener Hank-Salzlösung. Die Vorgefrierlösung für Schweinehaut besteht aus 7,5% Dextran (MG 70.000), 6% Saccharose, 7,5% Polyvinylpyrrolidon (MG 40.000), 1,25% Raffinose und 1 mM Dinatriumethylendiamintetraessigsäure, hergestellt in ausgewogener Hank-Salzlösung.
Ein neues Stück Gaze wird dann auf der Papillarseite der Dermis positioniert und die Dermis derart umgedreht, dass die Netzseite nach oben zeigt. Die Rückseite der Netzseite des Dermisstücks wird in einen Abfallbehälter für biologisches Gefahrgut verworfen. Ein etwa 0,5 bis 1,0 cm breiter Streifen des Trägers und der Dermis wird dann von der ursprünglichen Probe abgeschnitten. Der Streifen wird in zwei Begleitstücke, jedes etwa 1,0 cm lang, geschnitten. Die gesamten nötigen Qualitätsgewährleistungen, einschließlich mikrobiologischer und struktureller Analyse, werden letztendlich von diesen Begleitproben durchgeführt.
Die Gewebe werden dann in einzelne Tyvec-Beutel überführt. Die Gewebe werden mit der Rückseite nach oben in dem Beutel positioniert, indem die weiße Lüftungsseite nach unten zeigt. Der Tyvec-Beutel wird dann wärmeversiegelt.
Der versiegelte Gefriertrocknungsbeutel wird in einen Gefriertrockner überführt, der eine Mindestlagertemperatur von –70°C und eine Mindestkühltemperatur von –85°C aufweist. Das Gewebe wird dann durch Hochfahren der Gestelltemperatur mit einer Geschwindigkeit von –2,5°C/Minute auf –35°C/Minute auf der Gefriertrocknungsgestelltemperatur eingefroren und für eine Dauer von mindestens 10 Minuten dabei gehalten.
Der Trocknungszyklus erfolgt derart, dass der endgültige Restfeuchtigkeitsgehalt der Probe weniger als 6% und optimalerweise 2% beträgt. In diesem Beispiel wird die eingefrorene Dermis durch das folgende Programm getrocknet:

1. Die Gestelltemperatur wird mit einer Geschwindigkeit von –2,5°C/Minute auf –35°C hochgefahren und dabei für eine Dauer von 10 Minuten mit einer Vakuumeinstellung von 2.000 mT gehalten.
2. Die Gestelltemperatur wird mit einer Geschwindigkeit von 1,5°C/Minute auf –23°C hochgefahren und dabei für eine Dauer von 36 Stunden mit einer Vakuumeinstellung von 2.000 mT gehalten.
3. Die Temperatur wird dann mit einer Geschwindigkeit von 1,5°C/Minute auf eine Gestelltemperatur von –15°C hochgefahren und für eine Dauer von 180 Minuten mit einer Vakuumeinstellung von 2.000 mT gehalten.
4. Die Temperatur wird dann mit einer Geschwindigkeit von 1,5°C/Minute auf eine Gestelltemperatur von –5°C hochgefahren und für eine Dauer von 180 Minuten mit einer Vakuumeinstellung von 2.000 mT gehalten.
5. Die Temperatur wird letztendlich mit einer Geschwindigkeit von 1,5°C/Minute auf eine Gestelltemperatur von 20°C hochgefahren und für eine Dauer von 180 Minuten mit einer Vakuumeinstellung von 0 mT gehalten.

Nach dem Trocknen wird der die getrocknete Dermis enthaltende gefriergetrocknete Beutel unter einer Atmosphäre aus trockenem Stickstoffgas entnommen, in einen zweiten vorgetrockneten undurchlässigen Beutel gegeben und unter derselben inerten Umgebung wärmeversiegelt.
(Während des Bearbeitungsverfahrens und vor dem Versiegeln zum Gefriertrocknen wird eine Begleitprobe von der Hauptprobe abgeschnitten und unter zu der Hauptprobe identischen Bedingungen weiter bearbeitet. Vor der Verwendung der Hauptprobe bei der Transplantation werden von der Begleitprobe alle nötigen Qualitätsgewährleistungen, einschließlich mikrobiologischer und struktureller Analyse durchgeführt).
Nach dem Trocknen wird die Probe in etwa bei Gefriertemperaturen, optimalerweise 4°C in einer lichtgeschützten Umgebung gelagert.
Vor der Verwendung wird die Probe unter aseptischen Bedingungen aus dem versiegelten Beutel entfernt und durch Eintauchen in ausgewogene Salzlösung bei 20°C bis 37°C rehydratisiert. Die Rehydratisierung ist nach 30-minütiger Inkubation in dieser Rehydratisierungslösung beendet.
Eine Analyse des Endprodukts durch Licht und Elektronenmikroskopie zeigte, dass es mit Kollagenrändern in Gegenwart von Kollagenbündeln in der Matrix der Dermis und mit struktureller Bewahrung der Lamina densa und Ankerfibrile des Basalmembrankomplexes strukturell intakt war.
Es zeigte sich, dass der Netzaspekt der bearbeiteten Dermis ein Substratum für das Auswachsen von Keratinocyten aus einem Vorhautexplantat in einem Labor durch Zellkulturverfahren bereitstellte. Es zeigte sich auch, dass die bearbeitete Dermis das Wachstum der isolierten Keratinocyten unterstützte. Unter diesen Umständen differenzieren sich Keratinocyten beim Züchten an einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche in alle identifizierbare Schichten normaler Haut und wechselwirken mit der bearbeiteten Dermis durch den Basalmembrankomplex. Es zeigte sich auch, dass bearbeitete Schweinehaut das Wachstum von Keratinocyten für menschliche Vorhautexplantate unterstützte.
Die bearbeitete Dermis, entweder in Kombination mit einem maschenförmigen, ultradünnen oder epidermen körpereigenen Implantat oder neu gebildet mit gezüchteten Keratinocyten, weist eine Anzahl an klinischen Anwendungen bei einer Hautverletzung dritten Grades auf. Diese schließen Verbrennungspatienten, Patienten, die an Venen-, diabetischen oder Druckgeschwüren leiden, und Patienten, die sich einer Neubildungsoperation oder einem Hautersatz nach einer Auslösung von Hautentfernung unterziehen, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Es zeigte sich, dass sich bearbeitete Menschen- oder Schweinehaut einer Fibroplasteninfiltration und Gefäßneubildung bei menschlichen Verbrennungspatienten und in chirurgisch herbeigeführten Hautverbrennungen dritten Grades bei Schweinen unterziehen.
BEISPIEL 2
GEFÄSSRÖHREN: VENA SAPHENA VON MENSCHLICHEM SPENDER
Vena saphena werden von Leichenspendern entnommen und sind von Gewebebanken in den USA erhältlich. Gewebebanken weisen etablierte Beschaffungsrichtlinien auf, die von der American Association of Tissue Banks veröffentlicht sind. Diese Richtlinien schließen Anweisungen zur Patientenauswahl, den Vollzug von Genehmigungsformen und eine Warnung zum Vermeiden von mechanischer Ausdehnung oder anderer mechanischer Schädigung der Vene während des Sezierungsverfahrens ein.
Die Entnahme beginnt mit dem Spülen und Strecken der Vene mit Venenspüllösung, bestehend aus 1000 cm³ PlasmaLyte-Lösung zur Injektion, ergänzt mit 5000 Einheiten Heparin und 120 mg Papaverin (1 Liter pro Vene). Die Venen werden vorsichtig unter sterilen Bedingungen mit vielen Nebenflüssen, die so intakt wie möglich gehalten werden, mit einer Länge von mindestens 5 mm entfernt. Diese Nebenflüsse werden mit 3-0-Seide verbunden. Das umgebende Fettgewebe wird ebenso mit breitem Spannen um die Vene beibehalten. Nach dem Entfernen der Vene wird sie wieder mit Venenspüllösung gespült, in kaltes (4°C) Venentransportmedium mit einem Volumen von 500 cm³, bestehend aus 500 cm³ Gewebekulturmedium RPMI 1640, ergänzt mit 60 mg Papaverin, verpackt und durch eine Ubernachtlieferung zur weiteren Bearbeitung an eine Gewebebank versandt.
Bei der Gewebebank werden alle Nebenflüsse chirurgisch abgebunden und die subkutanen Fett/Weichgewebe unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren entfernt. Nach der Sezierung wird die Vene von beliebigen Oberflächenkontaminanten durch deren Positionieren in einem Gewebekulturmedium, ergänzt mit Cefoxitin (240 mcg/ml), Lincomycin (120 mcg/ml), Polymyxin B Sulfat (100 mcg/ml) und Vancomycin (50 mcg/ml) von beliebigen Oberflächenkontaminanten desinfiziert. Die Vene wird im Antibiotikumgemisch bei 4°C für eine Dauer von 24 Stunden gehalten. Die desinfizierte Vene wird in kaltes (4°C) Transportmedium mit einem Volumen von 500 cm³, bestehend aus 500 cm³ Gewebekulturmedium RPMI 1640 gegeben und auf nassem Eis durch Ubernachtlieferung zum Gewebebearbeitungszentrum LifeCell transportiert.
Bei Ankunft wird die Behältertemperatur bei mindestens 4°C bestätigt. Nach der Bestätigung wird die Vene in einen Tiefkühllösung enthaltenden Behälter gegeben und für eine Dauer von 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Tiefkühllösung besteht aus Folgendem:
0,5 M Dimethylsulfoxid (DMSO)
0,5 M Propylenglycol
0,25 M 2-3-Butandiol
2,5% (G/V) Raffinose
12,0% (G/V) Saccharose
15,0 (G/V) Polyvinylpyrrolidon (PVP)
15,0% Dextran
Nach der Inkubation wird die Vene dann in einen inerten Kunststoffbeutel gegeben, der ein poröses Luftloch enthält, das den Durchgang von Wasserdampf gewährt, jedoch den Eintritt von Bakterien verhindert, und wärmeversiegelt. Der Beutel und die Vene werden dann durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff eingefroren. Die eingefrorene Vene wird bei Temperaturen unter –160°C gelagert.
Zum Trocknen wird die gefrorene Vene im Beutel unter flüssigem Stickstoff in einen Molekulardestillationstrockner überführt und durch in SU-Patent Nr. 4,865,871 beschriebene Verfahren getrocknet. Für in der vorstehend beschriebenen Tiefkühllösung bearbeitete und schnell eingefrorene Vena saphena liegt der optimale Bereich zum Trocknen bei –130 bis –70°C mit einer Heizgeschwindigkeit von 1°C pro Minute während der Trocknungsphase. Nach dem Trocknen wird die Vene im Behälter unter trockenem inerten Stickstoffgas versiegelt und bei Kühltemperaturen (2 bis 4°C) bis zum Bedarf zur Transplantation gelagert.
Die Vene wird in einer Dampfphase durch Öffnen des Kunststoffbeutelbehälters und Anordnen der Vene in einem befeuchteten Inkubator bei 37°C rehydratisiert. Die Vene wird für eine Dauer von 1 Stunde in diesem Inkubator gehalten, wonach sie entfernt und in einen Behälter mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gegeben wird. Die Vene wird dann mit 3 PBS-Wechseln gespült.
Eine Analyse der bearbeiteten Venen sowohl durch Licht als auch durch Elektronenmikroskopie zeigt, dass sie eine intakte extrazelluläre Matrix aufweisen. Ein Proteaseverdau weist auf keine erhöhte Empfänglichkeit von Kollagen für Abbau auf. Ein Spannungstesten auf einer dynamischen Schleife mit einem künstlichen Herzen zeigte, dass sie supraphysiologischen Drücken ohne Einbüßen ihrer Auslaufsperrfunktion für entweder Flüssigkeit oder Gas widerstehen.
BEISPIEL 3
GEFÄSSRÖHRENBEARBEITUNG FÜR DEN TIERVERSUCH
Beschaffung
Zwanzig bis dreißig Kilogramm wiegende Mischlingshunde beliebigen Geschlechts werden über Natriumpentathol induziert, intubiert und präpariert und in steriler Weise drapiert. Die Anesthesie wird mit Sauerstoff, Stickstoff und Ha lothan aufrechterhalten. Ein Mittelschnitt wird in Nacken durchgeführt, worauf die externen Halsvenen und die internen Karotidarterien freigelegt, isoliert und von umgebender Fascia befreit wurden. Während dieses Verfahrens wird eine Spüllösung, zusammengesetzt aus 5000 Einheiten Heparin und 120 mg Papavarin in 1000 cm³ steriler gepufferter Hank-Kochsalzlösung (HBSS) mit einem pH-Wert von 7,4, über eine Nadel und Spritze auf die Gefäße aufgesprüht. Die nahen und entfernten Enden der Gefäße werden dann mit atraumatischen Gefäßklemmen abgeklemmt, worauf das Gefäß schnell entfernt wird. Sofort wird das Gefäß gründlich mit der vorstehend erwähnten Spüllösung gespült und bei 4°C zum Transport in Spüllösung gegeben. In einer anderen Ausführungsform kann das Gefäß zum Inkubieren während des Transports in die nachstehend erwähnte Zellentfernungslösung A gegeben werden.
Zellentfernung
Nach dem Beschneiden jeglicher überschüssiger Fascia wird das Gefäß in Zellentfernungslösung A (DSA) gegeben. DSA ist zusammengesetzt aus 25 mM EDTA, 1 M NaCl und 8 mM CHAPS oder ähnlichem zwitterionischem Detergens in einer sterilen PBS-Phase bei pH 7,5. Nach einer 30-minütigen bis 1-stündigen Inkubation wird das Gefäß zweimal für eine Dauer von 10 Minuten in PBS gewaschen und dann in Zellentfernungslösung B (DSB) gegeben. DSB ist zusammengesetzt aus 25 mM EDTA, 1 M NaCl und 1,8 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) oder ähnlichem anionischen oder nichtionischen Detergens in einer sterilen PBS-Phase bei pH 7,5. Nach einer 30-minütigen bis 1-stündigen Inkubation wird das Gefäß zweimal für eine Dauer von 10 Minuten mit PBS gewaschen.
Verglasung
Nach der Zellentfernung wird das Gefäß für eine Dauer von 1 bis 5 Stunden in eine Verglasungslösung Fünfzig-Fünfzig (VSFF) gegeben. VSFF ist zusammengesetzt aus 2,5% Raffinose, 15% Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem Moleku largewicht von 40.000, 15% Dextran mit einem Molekulargewicht von 70.000 und 12% Saccharose in einer 50/50 (Volumen) Wasser-Formamid-Lösung. Das Gefäß wird dann schnell in flüssigen Stickstoff (LN₂) getaucht, bis es wie durch den Stillstand des Siedens nachgewiesen eingefroren ist. Das Gefäß kann dann in LN₂ oder LN₂-Dampf gelagert oder unmittelbar getrocknet werden.
Trocknen
Nach dem Verglasen wird das Gefäß in einer Stickstoffgasatmosphäre in einen speziellen auf –196 vorgekühlten Molekulardestillationstrocknerprobenhalter überführt. Der Probenhalter wird dann schnell unter Stickstoffgasatmosphäre in den Molekulardestillationstrockner überführt. Der Trockner wird dann evakuiert und nach dem speziell für VSFF entwickelten Protokoll gefahren. Unter einem Vakuum von weniger als 1 × 10^–6 mbar wird der Probenhalter gemäß dem folgenden Protokoll erwärmt:
–196°C -> –150°C über 10 Stunden
–150°C -> –70°C über 80 Stunden
–70°C -> 20°C über 10 Stunden
Der Trockner wird dann geöffnet und das Gefäß in ein versiegeltes steriles Glasfläschchen unter Stickstoffgasatmosphäre überführt. Das Gefäß wird dann bei 4°C bis zum Bedarf gelagert.
Rehydratisierung
24 Stunden vor der Verwendung wird das Glasfläschchen in einer Atmosphäre mit 100% Feuchtigkeit, 37°C, geöffnet. Man lässt das Gefäß auf diese Weise für eine Dauer von 1 bis 2 Stunden dampfrehydratisieren. Das Gefäß wird dann für eine Dauer von 2 Stunden in steriles PBS bei 4°C getaucht. Das PBS wird dann mit frischer Lösung ersetzt, worauf das Gefäß bei 4°C über Nacht gelagert wird. Das Gefäß ist am folgenden Tag zur Verwendung bereit.
BEISPIEL 4
SCHWEINEHERZKLAPPENBLÄTTER
Schweineherzklappen wurden von isolierten Herzen unmittelbar nach dem Schlachten an einem Schlachthaus isoliert. Die Scheiben von den Flügeln der intakten Klappe wurden durch Stanzbiopsie unter aseptischen Bedingungen erhalten und in eine Transportlösung, umfassend Dulbecco-PBS mit 5,6 mM Glucose, 0,33 mM Natriumpyruvat mit zugesetzten Antioxidationsmitteln, umfassend 0,025 mg/l Alpha-Tocophenolphosphat, 50 mg/l Ascorbinsäure und 10 mg/l Glutathion (Mononatrium), bei 4°C überführt.
Nach Erhalt des Gewebes wurden die Scheiben in eine Tiefkühllösung, umfassend 0,5 M DMSO, 0,5 M Proplyenglycol, 0,25 M 2,3-Butandiol, 2–5% Raffinose, 15% Polyvinylpyrrolodon, 15% Dextran und 12% Saccharose, überführt und bei 20°C für eine Dauer von 60 Minuten unter mäßigem Rühren inkubiert.
Gewebeproben wurden dann in dünne Kupfersubstrate, die auf die Größe der Gewebeprobe angepasst waren, angeordnet und durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gekühlt.
Die eingefrorenen Proben wurden dann bis zur weiteren Bearbeitung unter –160°C gelagert.
Vor dem Trocknen wurden die Proben unter flüssigem Stickstoff auf einen Probenhalter, ausgestattet mit einem Thermoelement und einem Heizer, überführt. Der Probenhalter wurde auf flüssige Stickstofftemperatur vorgekühlt und die Überführung wurde unter flüssigem Stickstoff vollendet.
Die eingefrorenen Proben wurden dann in einen Molekulardestillationstrockner gefüllt und durch Molekulardestillationstrocknen unter Einsatz des in US-Patent Nr. 4,865,871 beschriebenen Verfahrens getrocknet. Der eingesetzte Trocknungszyklus lautete: –180°C bis –150°C in 3 Stunden, –150°C bis –70°C in 80 Stunden und –70°C bis 20°C in 9 Stunden. Nach dem Trocknen wurde das Vakuum in der Trocknungskammer mit ultrareinem Stickstoffgas zurückgesetzt, und die Scheiben wurden bis zur Bearbeitung in dieser Atmosphäre gehalten.
Eine Rehydratisierung der trockenen Proben bestand zuerst aus dem Aussetzen der Proben einer 100%igen Feuchtigkeit bei 37°C für eine Dauer von 60 Minuten. Die Proben wurden dann in einer Rehydratisierungslösung rehydratisiert, die aus Folgendem bestand:

a. 0,06 M Hepespuffer
b. 0,06 M Hepespuffer + 0,06 M MgCl₂
c. 0,06 M Hepespuffer + 1% SDS
d. 0,06 M Hepespuffer + 0,5 mM PMSF

Die Proben wurden unter Rühren für eine Dauer von mindestens 4 Stunden inkubiert.
Nach der Rehydratisierung wurden die Proben unter den folgenden Kriterien geprüft:

a. Die Struktur wurde sowohl durch Licht als auch Elektronenmikroskopie geprüft und es wurde gefunden, dass die Klappenmatrix sich von derjenigen von frischen unbearbeiteten Proben nicht unterschied.
b. Es wurde gefunden, dass der Proteaseverdau gleich der frischen Probe war.
c. Es wurde beim Spannungstesten (statisch) gefunden, dass einer größeren Spannungsladung als die Kontrollproben widerstehen könnte.
d. Subkutanes Tierimplantatmodel mit anschließendem Explantat nach 7 oder 21 Tagen.

Die explantierten Proben zeigten:

i. Eine verminderte Kapselbildung in Bezug auf frische tiefkühlbewahrte Kontrollen
ii. Verminderte Verkalkung in Bezug auf Glutaraldehyd-behandelte Kontrollen
iii. Variable entzündliche Zellinfiltration je nach Natur der Rehydratisierungslösung wie folgt:

Behandlung: 0,06 M MgCl₂ in 0,06 Hepespuffer
Deutlich abgegrenzte Scheibe mit gut definierter normaler Klappenmorphologie. Probe unvollständig von dünner Kapsel mit minimaler entzündlicher Zellinfiltration nahe der Scheibenumgebung umgeben.
Behandlung: 1% SDS in 0,06 M Hepespuffer
Deutlich abgegrenzte Scheibe mit gut definierter normaler Klappenmorphologie. Probe vollständig von einer leicht dickeren Kapsel umgeben, als diejenige, die in MgCl₂-behandelter Probe beobachtet wurde. Minimale entzündliche Zellinfiltration.
Behandlung: 0,5 mM PMSF in 0,06 Hepespuffer
Gut definierte normale Klappenmorphologie. Kapselbildung fehlte nahezu. Minimale entzündliche Zellinfiltration.
Behandlung: Kontrolle – 0,06 M Hepespuffer
Schlecht definierte Klappenstruktur. Massive entzündliche Zellinfiltration, jedoch geringer Nachweis von Kapselbildung.
BEISPIEL 5
INTAKTE SCHWEINEHERZKLAPPEN
Beschaffung
Schweineherzklappen werden von isolierten Herzen unmittelbar nach dem Schlachten in einem Schlachthaus isoliert. Die Aortaklappe und mindestens ein Zoll oder mehr der aufsteigenden Aorta werden dann vorsichtig mit vorsterilisierten Instrumenten entfernt.
Die Klappe wird zweimal in steriler phosphatgepufferter Lösung (PBS) gewaschen und dann zum Transport in sterile PBS bei 10°C gegeben. Innerhalb 3-stündiger Beschaffungszeit wird die Klappe zur Einrichtung LifeCell gebracht, wo sie weiter angepasst und bearbeitet wird.
Zellentfernung
Nach dem Anpassen wird die intakte Klappe in Zellentfernungslösung A (DSA) gegeben. DSA ist aus 25 mM EDTA, 1 M NaCl und 8 mM CHAPS oder einem ähnlichem zwitterionischen Detergens in einer sterilen PBS-Base bei pH 7,5 zusammengesetzt. Nach 30-minütiger bis 1-stündiger Inkubation wird die Klappe zweimal für eine Dauer von 10 Minuten in PBS gewaschen und dann in Zellentfernungslösung B (DSB) gegeben. DBS ist zusammengesetzt aus 25 mM EDTA, 1 M NaCl und 1,8 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) oder ähnlichem anionischem oder nichtionischem Detergens in einer sterilen PBS-Phase bei pH 7,5. Nach einer 30-minütigen bis 1-stündigen Inkubation wird die Klappe zweimal für eine Dauer von 10 Minuten in PBS gewaschen.
Verglasung
Nach der Zellentfernung wird die Klappe für eine Dauer von 1 bis 5 Stunden in eine Verglasungslösung Fünfzig-Fünfzig (VSFF) gegeben. VSFF ist zusammengesetzt aus 2,5% Raffinose, 15% Polyvinylpyrrolidon (PVP) mit einem Molekulargewicht von 40.000, 15% Dextran mit einem Molekulargewicht von 70.000 und 12% Saccharose in einer 50/50 (Volumen) Wasser-Formamid-Lösung. Die Klappe wird dann schnell in flüssigen Stickstoff (LN₂) getaucht, bis sie wie durch Stoppen des Siedens nachgewiesen eingefroren ist. Die Klappe kann dann vor dem Trocknen in LN₂ oder LN₂-Dampf gelagert werden.
Trocknen
Nach dem Verglasen wird die Klappe in einer Stickstoffgasatmosphäre in einen speziellen auf –196 vorgekühlten Molekulardestillationstrocknerprobenhalter überführt. Der Probenhalter wird dann schnell unter Stickstoffgasatmosphäre in den Molekulardestillationstrockner überführt. Der Trockner wird dann evakuiert und ein Heizzyklus iniziiert, der spezifisch für die Dehydratisierung von VSFF optimiert war. Unter einem Vakuum von weniger als 1 × 10^–6 mbar wird der Probenhalter gemäß dem folgenden Protokoll erwärmt:
–196°C -> –150°C über 10 Stunden
–150°C -> –70°C über 80 Stunden
–70°C -> 20°C über 10 Stunden
Der Trockner wird dann geöffnet und die Klappe in ein versiegeltes steriles Glasfläschchen unter Stickstoffgasatmosphäre überführt. Die Klappe wird dann bei 4°C bis zum Bedarf zur Transplantation gelagert.
Rehydratisierung
24 Stunden vor der Verwendung wird das Glasfläschchen in einer Atmosphäre mit 100% Feuchtigkeit, 37°C, geöffnet. Man lässt die Klappe auf diese Weise für eine Dauer von 1 bis 2 Stunden dampfrehydratisieren. Die Klappe wird dann für eine Dauer von 2 Stunden in steriles PBS bei 4°C getaucht. Das PBS wird dann mit frischer Lösung ersetzt, worauf die Klappe bei 4°C über Nacht gelagert wird. Die Klappe ist am folgenden Tag zur Verwendung bereit.
Während die Erfindung in Bezug auf die bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, ist dem Fachmann klar, dass Variationen und Modifikationen der Zusammensetzungen, Verfahren und in den Schritten oder in der Folge der Schritte der hier beschriebenen Verfahren ohne Verlassens des Konzepts, Geists und Umfangs der Erfindung durchgeführt werden können. Derartige Substitute und Modifikationen werden als innerhalb des wie durch die anhängigen Ansprüche definierten Umfangs der Erfindung betrachtet.

Claims

Verfahren zum Bearbeiten von Gewebe auf Kollagenbasis zur Transplantation, umfassend: (i) Beschaffen des Gewebes und Anordnen des Gewebes in einer Stabilisierungslösung, wobei die Stabilisierungslösung Folgendes umfasst: (a) einen Puffer, ausgewählt aus N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, 3-(N-Morpholin)propansulfidsäure, Bicarbonat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Acetat-Citrat und Kombinationen davon, und (b) ein Antibiotikum, ausgewählt aus Penicillin, Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Polymycin, Bacitracin und Kombinationen davon, (ii) Inkubieren des Gewebes in einer Bearbeitungslösung, wobei die Bearbeitungslösung Folgendes umfasst: (a) einen Puffer ausgewählt aus N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, 3-(N-Morpholin)propansulfidsäure, Bicarbonat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Acetat-Citrat und Kombinationen davon, (b) ein Detergens, ausgewählt aus Polyethylen(100)glycol-tert-octylphenylether, Polyoxyethylen(20)sorbitmonooleat, Polyoxyethylen(80)sorbitmonooleat, Natriumdeoxycholat, 3-([3- cholamidpropyl])dimethylammonio)-1-propansulfonat, Octylglucosid, Natriumdodecylsulfat und Kombinationen davon, (c) einen Proteasehemmer, ausgewählt aus N-Ethylmaleimid, Phenylmethylsulfonfluorid, Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylenglycol-bis-(2-aminoethyl(ether)NNN'N'-tetraessigsäure, Leupeptin, Ammoniumchlorid, erhöhter pH-Wert, Apoprotinin und Kombinationen davon, und (d) ein Salz, ausgewählt aus Natriumchlorid, Magnesiumchlorid, Kaliumchlorid und Kombinationen davon, (iii) Inkubieren des Gewebes in einer Tiefkühlaufbewahrungslösung, wobei die Tiefkühlaufbewahrungslösung folgendes umfasst: (a) einen Puffer ausgewählt aus N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, 3-(N-Morpholin)propansulfidsäure, Bicarbonat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Acetat-Citrat und Kombinationen davon, und (b) ein Tiefkühlschutzmittel, ausgewählt aus Dimethylsulfoxid (DMSO), Dextran, Saccharose, 1,2-Propandiol, Glycerin, Sorbit, Fructose, Trehalose, Raffinose, Propylenglycol, 2,3-Butandiol, Hydroxyethylstärke, Polyvinylpyrrolidon (PVP), Prolin, menschlichem Serumalbumin und Kombinationen davon, und (iv) Einfrieren und Trocknen des Gewebes nach dem Bearbeiten.
Verfahren nach Anspruch 1, des Weiteren umfassend den Schritt des Fixierens des Gewebes mit einem Vernetzungsmittel nach dem Bearbeiten.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, des Weiteren umfassend den Schritt der Rehydratisierung des Gewebes auf einen Wassergehalt von 20 bis 70%.
Verfahren nach Anspruch 3, des Weiteren umfassend den Schritt der Neubildung des dehydratisierten Gewebes mit lebensfähigen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 1, des Weiteren umfassend den Schritt des Fixierens des Gewebes mit einem Vernetzungsmittel nach dem Trocknen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Gewebe auf Kollagenbasis ausgewählt ist aus Haut, Blutgefäßen, Herzklappen, Wurzelhaut, Sehnen, Knochen, Knorpel, Duramata und Nerven, abgeleitet von einem oder mehreren Säugern.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Stabilisierungslösung des Weiteren einen oder mehrere der folgenden Bestandteile enthält: (a) ein Antioxidationsmittel zum Verhindern von Schädigung durch Sauerstoffmangel, ausgewählt aus tert-Butylhydrochinon, alpha-Tocoferol, Manit, Hydroxyharnstoff Glutathion, Ascorbat, Ethylendiamintetraessigsäure, Histidin, Prolin, Cystein und Kombinationen davon, (b) ein enzymatisches Mittel zum Minimieren von Schädigung, die aus mit Hypoxie verbundener, freiradikalischer Bildung resultiert, wie Superoxiddismutase, Catalase, Glutathionperoxidase, Glutathionreductase und Kombinationen davon, (c) ein chemisches Mittel zum Hemmen von mit Hypoxie verbundenen chemischen Wegabwandlungen, ausgewählt aus Allopurinal, Lipoxigenase hemmern, Phospholipidmethylationhemmern, Calciumkanal-Blockierungsarzneimitteln, Calciumbindungsmitteln, Eisenbindemitteln, Stoffwechselzwischenverbindungen, Substraten der Adenosintriphosphat-Bildung und Kombinationen davon, (d) ein Antipilzmittel, ausgewählt aus Nystadin, Vancomycin, Amphotericin B und Kombinationen davon, (e) ein proteoglycanokotisches Mittel, ausgewählt aus Chandroitinsulfat, Heparinsulfat, Dermatansulfat und Kombinationen davon, (f) ein chemisches Mittel zum Hemmen von Flächenanhaftung, Aggregation und Aktivierung, ausgewählt aus Natriumnitroprusid, H7, Isobutylmethylxanthin, α-Aminocapronsäure, Salicylsäure, Dipyridamol, Dazoxiben, Adenosin, Prostacyclin, Amilorid, Amantadin und Kombinationen davon, (g) ein chemisches Mittel zum Verhindern von Glattmuskelkontraktion, ausgewählt aus Natriumnitroprussid, Isoproterenol, Phentolamin, Pinacidil, H7, Nifedepin, Calcitonin, Gen-related Peptid, Flurazin, Papaverin, Isobutylmethylxanthin und Kombinationen davon, (h) ein onkotisches Mittel, ausgewählt aus Dextran, Glycin, Prolin und Kombinationen davon, (i) einen Proteasehemmer, ausgewählt aus N-Ethylmaleimid, Phenylmethylsulfonfluorid, Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylenglycolbis(2-aminoethyl(ether)-N,N,N',N',-tetraessigsäure, Leupeptin, Ammoniumchlorid, erhöhter pH-Wert, Apoprotinin und Kombinationen davon,
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Bearbeitungslösung des Weiteren ein Enzym, ausgewählt aus Dispase II, Trypsin Hyaluronidase, Thermolysin und Kombinationen davon, umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd ist,
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Tiefkühlschutzlösung eine Kombination aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser enthält, wobei die Kombination sich während des Einfrierens nicht ausdehnt oder zusammenzieht.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Tiefkühlschutzlösung des Weiteren ein oder mehrere Trockenschutzmittel, ausgewählt aus Saccharose, Raffinose, Trehalose, Prolin, Zink, Myristinsäure und Spermin und Kombinationen davon, umfasst.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei der Gefrierschritt durch Abkühlen des Gewebes mit Geschwindigkeiten zwischen –1°C pro Minute und –2.500°C pro Sekunde auf eine Endgewebetemperatur von weniger als 20°C erzielt wird.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das Trocknen unter derartigen Temperatur-, Vakuum-, Kühleroberflächenorientierungs-, Kühleroberflächentemperatur- und Heiztemperaturbedingungen, dass das Trocknen unter dem Glasübergang des am geringsten wärmestabilen Eiskristalls des gefrorenen Gewebes liegt und derart sequenziell, dass jeder anschließend stabilere Eiskristall in gleicher Weise getrocknet wird, durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Trocknen das Gefriertrocknen bei Temperaturen über –70°C umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Trocknen das sequenzielle Phasentrocknen in einem mittleren Temperaturbereich von –130 bis –80°C und darüber umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Trocknen das sequenzielle Phasentrocknen durch Molekulardestillationstrocknung bei –160°C bis –90°C und darüber umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 16, wobei die Rehydratisierung durch Inkubieren des Gewebes in einer Fluidrehydratisierungslösung erzielt wird.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Rehydratisierungslösung einen Puffer, ausgewählt aus gewöhnlicher Kochsalzlösung, Ringer-Lactatlösung, Zellkulturmedium und Kombinationen davon, einschließt.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die Rehydratisierungslösung Mittel enthält, ausgewählt aus (a) einem Antioxidationsmittel zum Verhindern von hypoxischer Schädigung, ausgewählt aus tert-Butylhydrochinon, alpha-Tocoferol, Manit, Hydroxyharnstoff Glutathion, Ascorbat, Ethylendiamintetraessigsäure, Histidin, Prolin, Cystein und Kombinationen davon, (b) einem enzymatischen Mittel zum Minimieren von Schädigung, die aus mit Hypoxie verbundener, freiradikalischer Bildung resultiert, wie Superoxiddismutase, Catalase, Glutathionperoxidase, Glutathionreductase und Kombinationen davon, (c) einem chemischen Mittel zum Hemmen von mit Hypoxie verbundenen biochemischen Wegabwandlungen, ausgewählt aus Allopurinol, Lipoxigenasehemmstoffe, Phospholipidmethylationhemmstoffe, Calciumkanal-Blockierungsarzneimittel, Calciumbindungsmittel, Eisenbindemittel, Stoffwechselzwischenverbindungen, Substrate von Adenosintriphosphat-Bildung und Kombinationen davon, (d) einem Antibiotikum, ausgewählt aus Penicillin, Streptomycin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Polymycin, Bacitracin und Kombinationen davon, (e) einem Antipilzmittel, ausgewählt aus Nystadin, Vancomycin, Amphotericin B und Kombinationen davon, (f) einem Proteasehemmer, ausgewählt aus N-Ethylmaleimid, Phenylmethylsulfonfluorid, Ethylendiamintetraessigsäure, Ethylenglycolbis(2-aminoethyl(ether)-N,N,N'',N''-tetraessigsäure, Leupeptin, Ammoniumchlorid, Apoprotinin, erhöhter pH-Wert und Kombinationen davon, (g) einem proteoglycanoncotischen Mittel, ausgewählt aus Chandroitinsulfat, Heparinsulfat, Dermatansulfat und Kombinationen davon, (h) einem Puffer ausgewählt aus N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure, 3-(N-Morpholin)propansulfidsäure, Bicarbonat, Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Acetat-Citrat und Kombinationen davon, (i) einem Mittel zum Hemmen der Plättchenanhaftung, Aggregation und Aktivierung, ausgewählt aus Heparin, aus Natriumnitroprusid, H7, Iso butylmethylxanthin, α-Aminocapronsäure, Aspirin, Dipyridamol, Dazoxiben und Adenosin, und (j) einem onkotischen Mittel, ausgewählt aus Dextran, Glycin und Prolin.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Rehydratisierung des getrockneten, tiefkühlpräparierten, bearbeiteten Gewebes des Weiteren den Schritt der Zugabe einer Dampfrehydratisierungslösung, gefolgt von Inkubieren des Gemischs in einer Fluidrehydratisierungslösung unter Bildung von rehydratisiertem Gewebe umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, des Weiteren umfassend das Impfen des rehydratisierten Gewebes mit lebensfähigen Zellen, ausgewählt aus körpereigenen Zellen, allogenen Zellen oder Kombinationen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei die Rehydratisierungslösung ein Vernetzungsmittel ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Vernetzungsmittel Glutaraldehyd ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 23, wobei das rehydratisierte Gewebe Dermis umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 24, wobei das rehydratisierte Gewebe eine oder mehrere Gefäßröhren venösen oder arteriellen Ursprungs umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 25, wobei das rehydratisierte Gewebe eine oder mehrere Herzklappen umfasst.