KR20090108402A - 동결보존에 의한 스킨 드레싱 가공 방법 - Google Patents

Abstract

피부를 항생제가 포함된 세포배양용 배지에 침지시키고 보관하는 단계;보관된 피부를 상온에서 조직헹굼용액으로 세척하는 단계;세척이 끝난 피부를 동결보호용액에 침지하는 단계;동결보호용액에 침지된 피부를 꺼내어 재단하는 단계;재단된 피부를 밀봉하여 포장하는 단계;및 밀봉된 피부를 단계별 제어에 의해 급격히 냉동시키는 단계;를 포함하는 스킨 드레싱 가공 방법이 제시된다.

본 발명에 의해 스킨 드레싱을 급속히 동결하여 초저온에서 보관함으로써 바이러스, 박테리아를 불활성화시키고 안전성을 확보할 수 있다. 또한 특히 피부조직의 손상이 없이 피부의 세포활성을 유지할 수 있다.

동결보호, 재단, 침지. 드레싱, 초저온 냉동.

Description

동결보존에 의한 스킨 드레싱 가공 방법{PROCESSING METHOD FOR SKIN DRESSING USING CRYO PRESERVATION}

본 발명은 피부 이식 전에 피부를 보호하는 스킨 드레싱의 가공방법에 관한 것이다. 특히 피부조직의 손상이 없이 피부의 세포활성을 유지하는 가공방법에 관한 것이다.

피부라는 얇은 막은 우리의 신체를 덮고 있으며, 주위환경으로부터 격리시킨다. 전체 유기체 표면을 덮고 있는, 피부는 전체 신체 중량의 16%에 해당하고, 단지 2.0mm 두께에 불과하지만, 광범위하고 다양한 물리적, 화학적 생물학적 제재에 대해 효과적인 경계이며, 기계적인 힘, 극한의 온도, 독 및 소량의 이온조사에 대항한다.

피부는 환경적 또는 내부적 경로들에 의해 기인한 자유 라디칼들에 대한 1차 방어를 구성하는 효소적 및 비효소적 구성분들을 포함하는 항산화 시스템을 가지며, 태양광선 특히 자외선의 해로운 효과에 대한 방어는 멜라노사이트에 의해 생산된 UV광에 대한 최대 방어를 나타내는 피부색소 멜라닌에 의해 제공된다.

상기와 같은 피부가 수행하는 중요한 역할들로 인해, 넓은 두께의 심각하고 광범위하고 깊은 피부 결손의 경우, 외피, 진피 및 피하 조직의 파괴는 자발적인 피부 재생을 불가능하게 한다. 즉, 피부는 실질적으로 탈수가 일어나고 감염조절을 하여 상기 화상을 입은 부위에 대한 방어 기능을 상실하게 된다.

특히, 광범위한 화상은 광범위 화상의 창상은 소 범위 화상과는 전혀 다른 경과를 취하게 된다. 많은 양의 초기 수액으로 화상 후 3일 전후로 상처가 깊어지게 되며, 장관에서의 세균 전위 등으로 화상 후 5-7일이면 가피에 많은 수의 그람 음성균이 자라게 된다. 따라서 초기에 가피 절제술을 시행하야 하며 이후 자가 피부 이식을 하게 된다. 경우에 따라 가피절제술시에 피부 이식술을 동시에 일부 시행하기도 하지만, 시행 범위가 넓은 경우에는 일부 실패 할 가능성이 높아, 일반적으로는 가피절제술 후 개방 창상 부위에 육아조직이 형성된 뒤에 시행하게 된다.

육아조직이란 상처 치유 과정 중에 발생하는 조직으로 섬유아세포, 아교질(collagen) 등으로 구성되어 있으며 혈액 공급이 뛰어나기 때문에 자가 피부 이식을 하게 되면 성공률이 아주 높게 된다. 하지만 육아조직 자체는 오히려 심한 반흔(hypertrophic scar)을 만들 수 있기에 피부 이식술 시에는 대부분 제거한 체 피부를 이식하게 된다. 피부 손상의 범위가 작다면 별 문제 없이 육아 조직이 형성되지만, 광범위 화상인 경우인 경우에는 가피절제술을 시행한 부위에 재감염이 일어날 수 있으며 심지어 패혈증으로 사망하기도 한다. 따라서 선진 외국에서는 가피 절제 후에 일시적으로 사체 피부를 덮어 줌으로서 상처의 상태가 좋게 한 다음, 자가 피부를 이식함을 표준 치료법으로 하고 있다.

한편, 피부 결손을 가진 사람은 자가이식을 진행할 수 있고, 이는 동일한 사 람으로부터의 조직의 이용을 의미한다. 면역학적 관점에서, 이는 가장 최선의 선택이며, 거부의 위험이 존재하지 않기 때문이다. 그럼에도 불구하고, 그러한 절차는 항상 가능한 것은 아니고, 손상된 부위가 신체의 넓은 표면을 나타내는 때 환자 자체에서 공여 받을 표면이 충분하지 않다는 문제점이 있다. 따라서 일시적인 드레싱이 요구되며 이는 인접한 조직의 수축 및 변형된 상처들의 발전을 피하면서 재생을 더욱 정확하게 하거나 촉진시킨다.

진피-외피 교체 합성(중합적 또는 생물학적)의 생명 공학적 연구는 원 조직을 대체할 수 있는 시장 상품을 가져왔다. 세계의 몇몇 영역들에 있는 조직은행은 동종이식을 제공하고, 상대적으로 쉬운 보존 및 저장으로 인해 심각한 화상들에 대한 일시적 커버로서 우선적으로 이용된다.

즉, 상기와 같이 피부는 화상 등의 피부 손상을 입은 경우 일시적인 이식물로 혹은 자가 이식물과 함께 치료에 넓게 사용된다. 이와 같은 이유로 화상 등의 치료에 사용될 일시적 이식물로서의 스킨드레싱을 피부조직의 손상이 없는 상태로 안전하게 보관하기 위한 가공방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명은 피부 이식 전에 피부를 보호하는데 사용되는 스킨 드레싱의 가공방법에 관한 것으로서 특히 스킨 드레싱의 피부조직의 손상이 없도록 안정하게 멸균하는 것을 목적으로 한다.

상기의 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 공여자로부터 적출한 피부조직을 동결보관하는 방법에 의해 가공한다. 본 발명에 있어서 피부조직의 공여자는 살아있는 사람, 시신, 동물 등을 대상으로 한다. 동물은 특히 돼지피부인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 스킨 드레싱 가공방법은 피부를 항생제가 포함된 세포배양용 배지에 침지시키고 보관하는 단계;상기 보관된 피부를 상온에서 조직헹굼용액으로 세척하는 단계;상기 세척이 끝난 피부를 동결보호용액에 침지하는 단계;상기 동결보호용액에 침지된 피부를 꺼내어 재단하는 단계;상기 재단된 피부를 밀봉하여 포장하는 단계;및 상기 밀봉된 피부를 단계별 제어에 의해 급격히 냉동시키는 단계;를 포함한다.

또한 상기 냉동된 피부는 -40℃ ~ -90℃에 보관하는 것을 특징으로 한다.

한편, 상기 세척이 끝난 피부는 동결보호용액에 80∼85 rpm 으로 90∼150 분간 침지하는 것을 특징으로 한다.

한편 돼지피부로부터 스킨 드레싱을 제조할 경우에는 세포배양용 배지에 침 지시키기 전에 세포를 제거하여야 한다.

이하 동결에 의한 스킨 드레싱의 가공방법을 단계별로 설명한다.

1. 채취된 피부의 침지

돼지로부터 적출된 피부조직으로부터 스킨 드레싱을 제조하는 경우에는 세포를 제거하여 준비한다. 세포 제거를 위해서는 진피층과 표피층을 분리하여야 하는데, 중성 단백질 분해효소인 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등을 처리하여 진피층과 표피층을 분리하거나, 1몰 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14~32시간 동안 처리 또는 20mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 37℃에서 14~32시간 동안 처리하여 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.

면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막 단백질에 의해 야기되므로 세포를 제거하면 면역반응을 최소화할 수 있다. 세포막의 주성분은 인지질로 여러가지 계면활성제를 이용하면 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 이를 위하여 소듐도데실 설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제 또는 트리톤 엑스-100, 트윈20, 트윈40, 트윈60, 트윈80, 노니데트 피-10(NP-10), 노니데트 피-40,(NP-40)등과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용된다.

진피층을 실온에서 0.2~1% 농도의 SDS용액으로 실온에서 30~120분간 처리하면 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 또 0.1~2.0% 농도의 트윈 20용액으로 실온에서 30~180분간 처리하거나, 0.1~2.0%농도의 트리톤 텍스-100 또는 노니데트피-40 용액으로 22~37℃에서 30~180분간 처리하면 연시 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 세포가 제거된 돼지피부 및 인체로부터 적출된 피부를 항생제가 포 함된 세포배양용 배지에 침지시킨다.

스킨 드레싱의 재료로서 사용되는 피부는 채취된 신선 피부 내지는 글리세롤 보관 피부이다.

2. 보관

채취된 피부 및 글리세롤 용액에 보관된 피부는 가공 전까지 격리된 냉장고에서 2~6℃의 온도로 보관한다. 냉동보관 피부는 반드시 채취된 후 14일 이내에 가공해야 하며, 피부를 보존하고 있는 조직보존용 배지는 적어도 매 72시간마다 교환해 주어야 한다. 배지를 교환하지 않을 경우에는 채취 후 96시간 내에 가공을 실시하도록 한다.

3. 세척

상기 2~6℃에서 보관된 피부는 상온에서 60 rpm으로 10분간 조직헹굼용액으로 세척한다.

4. 침지

상기 세척이 끝난 피부는 항생제가 포함된 동결보호용액에 80∼85 rpm 으로 90∼150 분까지 실온에서 침지한다. 이때 저온 동결을 위한 준비 과정에서 따뜻한 온도에 피부 노출을 최소화한다.

5. 재단

상기 동결보호용액에 침지된 피부를 꺼내어 균일하고 일정한 형태로 재단한다. 이 때 제품의 품질관리를 위해 미생물 검사용 샘플도 재단한다.

6. 밀봉

상기 재단한 피부를 non-adherent gauze에 피부의 dermis 부분이 닿도록 dermis를 붙여 내부포장용기에 넣고 열 접착기를 이용하여 밀봉한다. 밀봉된 내부포장용기를 외부포장용기에 넣고 열 접착기로 밀봉하여 이중포장한다. 이 때 미생물 검사 샘플도 준비하여 미생물 검사를 실시한다.

모든 외부포장용기에는 피부의 크기, 채취일자, 기증자 식별번호가 기재된 라벨을 부착한다.

7. 동결

상기 밀봉된 피부는 냉동전까지 얼음이 채워진 용기에 넣어두고, 급격히 온도를 떨어뜨리면서 -40℃ 이하로 냉동시킨다. -40℃ 이하로 급격히 냉동시킴으로써 피부조직의 변형을 최소화할 수 있다.

8. 냉동보관

상기 냉동된 피부는 -40℃ ∼ -90℃의 초저온에 보관한다. 상기 동결된 상태의 피부조직을 변형없이 유지시키기 위해서는 상기와 같이 초저온에서 보관하는 것이 중요하다. 그리고 미생물 검사결과 전부 음성일 때 제품으로 출고한다. 임상 사용에 대한 안전성에 보증하는 효과적인 방법으로 생리활성이 없는 모든 동물 및 인체조직의 보관 방법으로 널리 이용될 수 있다.

본 발명에 의해 스킨 드레싱을 급속히 동결하여 초저온에서 보관함으로써 바이러스, 박테리아를 불활성화시키고, 멸균에 대한 안전성을 확보할 수 있다. 또한 특히 피부조직의 손상이 없이 피부의 세포활성을 유지할 수 있다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형실시가 가능할 것이며, 이러한 변형실시는 본원발명의 보호범위에 속하는 것으로서 본원발명의 보호범위는 특허청구범위에 기재된 바에 따라 해석되어야 할 것이다.

이하에서는 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다.

가공전 보관절차

돼지로부터 적출된 피부조직으로부터 세포를 제거하여 준비한다.

세포 제거를 위해서는 진피층과 표피층을 분리하여야 하는데, 중성 단백질 분해효소인 디스파아제, 터몰리신, 트립신 등을 처리하여 진피층과 표피층을 분리하거나, 1몰 이상의 염화나트륨 용액으로 37℃에서 14~32시간 동안 처리 또는 20mM의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액으로 37℃에서 14~32시간 동안 처리하여 진피층과 표피층을 분리할 수 있다.

면역반응은 주로 세포막에 존재하는 막 단백질에 의해 야기되므로 세포를 제거하면 면역반응을 최소화할 수 있다. 세포막의 주성분은 인지질로 여러가지 계면활성제를 이용하면 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 이를 위하여 소듐도데실 설페이트(SDS)와 같은 이온성 계면활성제 또는 트리톤 엑스-100, 트윈20, 트윈40, 트윈60, 트윈80, 노니데트 피-10(NP-10), 노니데트 피-40,(NP-40)등과 같은 비이온성 계면활성제 등이 이용된다.

진피층을 실온에서 0.2~1% 농도의 SDS용액으로 실온에서 30~120분간 처리하 면 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다. 또 0.1~2.0%농도의 트윈 20용액으로 실온에서 30~180분간 처리하거나, 0.1~2.0%농도의 트리톤 텍스-100 또는 노니데트피-40 용액으로 22~37℃에서 30~180분간 처리하면 연시 조직의 손상없이 세포를 제거할 수 있다.

상기 세포가 제거된 피부는 항생제가 포함된 세포배양용 배지에 침지시킨다.

세포배양용 배지와 항생제의 조성은 다음과 같다 : total volumn 20L

RPMI 1640 (1x10L)	2 ea
Sodium bicarbonate	40 g
Gentamycin	100㎎
Amphotericin-B 1mg/ml	1 ml
EDTA 0.5M	400ml
DW	1599ml

상기 용액에 침지된 피부는 4℃ 에서 보관을 한다. 이때 저온 동결을 위한 준비과정에서 따뜻한 온도에 피부 노출을 최소화한다. 4℃ 에서 보관된 피부는 상온에서 60 rpm으로 10분간 조직헹굼용액으로 세척한다.

침지 및 재단

상기 세척이 끝난 피부는 동결보호용액에 80∼85 rpm 으로 90∼150 분까지 실온에서 침지한다. 상기 동결보호용액에 침지된 피부를 꺼내어 가능한 균일하고 일정한 형태로 재단한다. 이 때 제품의 품질관리를 위해 미생물 검사용 샘플도 재단한다. 상기 재단한 피부를 비접착성 거즈에 피부를 붙여 호일 파우치에 넣어 밀봉한다. 보호막 부착을 위해 멸균된 거즈에 피부의 표피 부분이 닿게 하여 피부의 진피부분이 위를 향하도록 한다. 나중에 잘 펼 수 있도록 느슨하게 말아준다.

말아놓은 피부는 멸균된 내부포장용기(PE재질의 봉투)에 넣고 밀봉한다. 밀 봉된 내부포장용기를 다시 멸균된 외부포장용기(알루미늄 재질의 봉투)에 넣고 열접착을 이용하여 다시 밀봉한다. 보다 확실한 밀봉을 위해 2번 접착 밀봉을 실시한다.

이 때 미생물 검사 샘플도 준비하여 미생물 검사를 실시한다. 모든 외부포장용기에는 피부의 크기, 채취일자, 기증자 식별번호가 기재된 라벨을 부착한다.3

냉동

알루미늄 봉투에 포장된 피부는 냉동전까지 얼음이 채워진 용기에 넣어두고, 단계별 제어 냉동기(Cryomed Model 1010/1011 programmable freezing system)에 넣어 급격히 온도를 떨어뜨리면서 -40℃ 이하로 냉동시킨다. 이때 선반 하나당 포장된 피부가 겹쳐지지 않도록 놓는다.

단계별 제어 냉동기는 냉동챔버 안에 액체 질소 흐름에 의해 조절되고 동결 과정 기록 그래프 용지를 통하여 온도 정보도 제공하고 있다.

1) starting temperature; 냉동챔버 선반에 가공할 제품을 넣기 전의 온도로 보통 상온온도(+22℃) 혹은 냉장온도(+4℃)를 나타낸다.

2) liquid phase cooling; 액체가 냉각되는 정도, 일반적으로 냉각율은 1℃/min 이다.

3) super change; 액체에서 고체로 상이 변화하는 직전의 온도.

4) phase change; 액체에서 고체로 상이 변화하는 과정의 시작으로 super cooled temperature 에서 freezing temperature 까지 온도가 빠르게 증가하는 특성이 있다. 이렇게 상이 변화하는 동안 온도 증가를 최소화 하기 위하여 챔버 온도를 빠르게 떨어드려야 한다.

5) solid phase Ⅰ freezing; 고체 상태로 냉각하는데 냉각율로 사용자가 임의로 선택할 수 있지만 기본적으로 liquid phase cooling 과 동일한 냉각율을 가지고 있다.

6) end solid phase Ⅰ freezing; solid phase Ⅰ freezing 사이클에서의 마지막 온도로 -30℃ ~ -50℃로 정해져 있다.

7) solid phase Ⅱ freezing; solid phase Ⅰ freezing 율과 독립된 동결속도로 분당 10℃ ~ 20℃로 빠르게 떨어뜨릴 수 있다.

8) end freeze temperature; solid phase Ⅱ freezing 사이클에서의 마지막 온도로 -90℃로 정해져 있다.

온도 확인용 피부 조각은 튜브에서 꺼내어 단계별 제어 냉동기에 넣는데 피부 조각 내에 온도 탐침이 들어갈 수 있도록 한다.

동결 과정이 완료되면 작동 절차에 따라 냉동기 작동을 정지시킨다. 냉동기가 꺼지면 즉시 피부를 꺼내어 관련 라벨이 부착된 보관용 박스에 넣은 후 보관용 박스를 액체 질소 냉동고(-170 ∼ -196℃)에 보관하거나 -40℃ 이하의 온도가 유지될 수 있는 격리된 냉동고에 보관한다.

냉동된 피부는 초저온 -70℃ 에 보관한다. 보관된 피부는 분배 허가(미생물 검사 결과 합격)에 따라 전부 음성으로 사용이 결정될 때까지 격리해 놓는다. 임상 사용에 대한 안전성에 보증하는 효과적인 방법으로 생리활성이 없는 모든 동물 및 인체조직의 보관 방법으로 널리 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 동결보존된 피부조직은 도 1 및 도 2 에서와 같이 조직학적 검사, SEM, TEM(콜라겐 지름 감소 여부 및 비정상 bundle 형성 여부 확인), 무균검사(미생물검사), 인장강도, flexibility, opacity, 구성성분 확인 결과 피부조직의 손상이 없이 피부의 세포활성을 유지하는 것을 알 수 있다.

도 1은 신선한 피부조직의 Histological analysis 결과 사진,

도 2는 동결보존된 피부조직의 Histological analysis 사진이다.

Claims (9)

1. 피부를 항생제가 포함된 세포배양용 배지에 침지시키고 보관하는 단계;

   상기 보관된 피부를 상온에서 조직헹굼용액으로 세척하는 단계;

   상기 세척이 끝난 피부를 동결보호용액에 침지하는 단계;

   상기 동결보호용액에 침지된 피부를 꺼내어 재단하는 단계;

   상기 재단된 피부를 밀봉하여 포장하는 단계;및

   상기 밀봉된 피부를 단계별 제어에 의해 급격히 냉동시키는 단계;를 포함하는 스킨 드레싱 가공 방법.
2. 제 1 항에 있어서,

   상기 피부를 포장하는 단계에서는, 멸균거즈를 펴놓고 피부조직의 표피면이 거즈를 향하고 진피부분이 위를 향한 상태로 피부조직을 거즈와 함께 말아서 멸균된 내부포장용기에 넣고 밀봉한 후, 밀봉된 내부포장용기를 외부포장용기에 넣어 밀봉하여 2중 포장하는 것을 특징으로 하는 스킨 드레싱 가공 방법.
3. 제 1 항에 있어서,

   상기 밀봉된 피부는 프로그램화된 단계별 제어에 의해 -40 ℃ 이하로 냉동되는 것을 특징으로 하는 스킨 드레싱 가공 방법.
4. 제 1 항에 있어서,

   상기 냉동된 피부는 -40℃ ∼ -90℃에 보관하는 것을 특징으로 하는 스킨 드레싱 가공 방법.
5. 제 1 항에 있어서,

   상기 세척이 끝난 피부는 동결보호용액에 80∼85 rpm 으로 90∼150 분간 침지하는 것을 특징으로 하는 스킨 드레싱 가공 방법.
6. 제 1 항에 있어서,

   상기 스킨은 신선피부 또는 글리세롤에 보관된 피부인 것을 특징으로 하는 스킨 드레싱 가공방법.
7. 제 1 항에 있어서,

   상기 스킨은 돼지피부인 것을 특징으로 하는 스킨 드레싱 가공방법.
8. 돼지피부로부터 세포를 제거하는 단계;

   상기 세포를 제거한 돼지피부를 항생제가 포함된 세포배양용 배지에 침지시키고 보관하는 단계;

   상기 보관된 피부를 상온에서 조직헹굼용액으로 세척하는 단계;

   상기 세척이 끝난 피부를 동결보호용액에 침지하는 단계;

   상기 동결보호용액에 침지된 피부를 꺼내어 재단하는 단계;

   상기 재단된 피부를 밀봉하여 포장하는 단계;및

   상기 밀봉된 피부를 단계별 제어에 의해 급격히 냉동시키는 단계;를 포함하는 스킨 드레싱 가공 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항의 가공방법에 의해 가공된 스킨 드레싱.

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