KR100328742B1

KR100328742B1 - 배양된조직등가체의동결보존과저장을위한방법및패키지디자인

Info

Publication number: KR100328742B1
Application number: KR1019970705324A
Authority: KR
Inventors: 알. 왓슨 스티븐; 토너 메멧; 지. 츄마코우 알렉산더
Original assignee: 오가노제네시스, 인코오포레이티드
Priority date: 1995-01-30
Filing date: 1996-01-30
Publication date: 2002-09-17
Also published as: SG106553A1; SK103397A3; PT807234E; EP0807234A1; PL181762B1; HU223789B1; FI972563A0; EP1516532A1; WO1996024018A1; AU716869B2; EP0807234B1; NO310491B1; JP2007161723A; JPH11501298A; EP1516532B1; EP0807234A4; NO973463D0; NO973463L; CN1173220A; JP4361550B2

Abstract

본 발명은 수집된 포유동물 조직과 생체외 기술에 의해 만들어진 살아있는 배양된 조직 등가체의 효율적인 동결 보존 패키지 디자인을 목적으로 한다. 본 발명은 포유동물 조직 또는 배양된 조직 등가체를 동결 방지제 용액에 침액시키는 단계, 동결 방지제 용액과 침액된 조직을 교반하여 동결 방지제 용액이 조직으로 효과적으로 투과하도록 하는 단계, 이어서 상기 조직을 매우 느린 동결 속도로 동결하는 단계와 관련된다. 동결 단계에서, 세포외 얼음 형성은 종정형성에 의해 시작된다. 동결 보존된 조직은 사용하기 전에 무한한 시간 동안 저장될 수 있다. 배양된 조직 등가체는 피부 또는 각막같은 등가의 인체 조직의 생체외 모델이며, 저장 상태에서 해제되어 생체내 이식을 위해 또는 생체외 화합물 감별을 위해 이용될 수 있다.

Description

배양된 조직 등가체의 동결 보존과 저장을 위한 방법 및 패키지 디자인{METHOD AND PACKAGE DESIGN FOR CRYOPRESERVATION AND STORAGE OF CULTURED TISSE EQUIVALENTS}

생체외 기술은 생체외 시험 또는 상처 치료를 위한 생체내 이식의 목적으로 조직 등가체를 개발하였다. 그러한 조직 등가체를 생성하는 방법은 미국 특허 제4,485,096호, 4,604,346호, 4,835,102호와 5,374,515호 그리고 미국 출원 제08/193,809호와 제08/337,830호에서 개시되며 이들은 본 명세서에서 참고로 통합된다.

살아있는 조직의 보존기간은 제한되며, 따라서 이용 기간이 짧아 많은 낭비를 야기한다. 선적과 저장등의 경우처럼 그러한 조직을 사용할 때까지 장기간 저장하는 것이 필요하다. 동결 보존 방법 및 동결 보존과 저장을 위한 패키지의 개발은 사용 기간을 무제한으로 연장시킬 것이며, 선적을 용이하게 하고 재고품의 유지를 허용할 것이다. 화상 치료 센터와 병원에서 조직의 저장을 가능하게 하는 것 또한 바람직하다. 다른 잇점은 샘플이 품질 관리 공문서를 위해 제조 사이클의 다른 단계로부터 보유될 수 있으며 그들이 냉동 상태로 유지될 수 있으므로 더 많은 생산량이 만들어질 수 있다.

현재, 세포 생물학적 재료의 저장 기간은 "저온(cryogenic)" 온도로 냉각시킴으로써 연장된다. 시스템의 온도를 낮춤으로 인한 액체상으로부터 고체상으로의 전이는, 물분자의 질서정연한 배열에 관련되는 결정화(얼음)로 일어날 수도 있고, 그러한 결정 단계의 질서정연한 배열이 없으면 유리화 또는 비결정화(유리 형성)로 일어날 수도 있다. 저온 생물학자에게 있어서 과제는 세포를 저온으로 가져가고 이어서 그들을 손상시키지 않고 생리학적 조건으로 되돌리는 것이다.

세포와 조직의 동결 보존에 대한 두가지 기본적인 접근 방법이 있는 바, 동결-해동과 유리화이다. 동결-해동 기술에서는, 세포외 용액이 동결되지만(즉, 결정 형태), 세포내 얼음 형성을 최소화하기 위해 여러 단계들이 취해진다. 유리화 과정에서는, 전체 시료를 통한 얼음 형성을 막기 위해 노력한다. 전자의 방법은 만일 세포내에서 얼음 결정이 형성되면, 해동시에 세포의 생존능력에 치명적일 수있다는 점에서 문제가 된다. 하지만, 만일 세포가 동결방지제가 비독성 농도로 존재하는 상태에서 조절되는 속도로 냉동된다면, 동결-해동 사이클에서 살아남을 수 있을 것이다. 후자인 유리화 방법은 매우 높은 농도의 용질 및/또는 중합체를 이용하여 얼음 형성을 억제하여 세포내 및 세포외 얼음의 잠재적인 손상 효과를 피하기 위해 노력한다. 하지만, 유리화에 요구되는 독성 농도의 이들 첨가물에 장시간 노출됨으로써 세포 손상이 일어날 수 있다.

동결방지제는 동결 과정에 관련되는 스트레스로부터 살아있는 세포를 보호한다. 동결방지제가 세포를 보호하는 한 가지 방법은 물이 얼음으로 바뀜에 따라 미동결 용액에서 점점 농축되는 염을 희석시키는 것이다. 얼음의 양은 용액의 온도와 초기 조성에 의해 결정된다. 반면 미동결 분율의 양은 온도만의 함수이다. 동결방지제는 몇 가지 다른 기능을 가진다. 중요한 한 가지는 그들이 일반적으로 세포내 얼음 형성 온도를 낮춘다는 것이다. 다른 기능은 그들이 막과 단백질을 안정화시킨다는 것이다.

모든 용액은 그들이 결정 형성을 위한 임의의 핵형성 위치를 찾을 때까지 그들의 빙점 이하로 과냉각할 것이다. 동결-해동 방법에 의해 동결 보존할 때, 세포외 배지에서의 얼음 형성은 낮은 정도의 과냉각에서의 종정(種晶)형성에 의해 시작되어야 한다. 만일 얼음 형성이 종정형성에 의해 유도되지 않으면, 얼음은 용액이 평형 빙점보다 훨씬 아래로 냉각될 때 자발적으로 형성될 것이다. 이 과정은 자연에서는 임의적이므로, 얼음 형성은 임의의, 예측할 수 없는 온도에서 일어날 것이며, 결과적으로 생존능력은 동일한 동결 프로토콜(protocol)로 반복되는 시도들 사이에서 매우 다를 것이다. 더욱이, 얼음이 매우 과냉각된 용액에서 형성될 때 일어나는 극히 빠른 결정화는 세포와 조직에 손상을 야기할 수 있다. 더욱이, 세포외 얼음 형성이 과다한 과냉각에서 시작되면, 세포내 얼음 형성의 가능성은 극적으로 증가할 것이다. 이러한 현상은 동결-야기된 세포 탈수의 지연된 착수로부터 생기며, 이로 인해 세포내 물의 보유가 증가되며, 따라서 세포에서 얼음 형성의 가능성이 더 높아진다.

일단 세포외 얼음이 형성되기 시작하고 시료가 얼음상에 의해 둘러싸이면, 시료를 동결 보존 상태로 냉각시키는 것이 필요하다. 냉각 단계는 동결-해동 프로토콜에서 가장 중요한 단계중의 하나이다. 얼음, 즉 순수한 물의 형성으로 인해, 부분적으로 동결된 세포외 용액은 세포내 구획보다 더 농축된다. 결과적으로, 세포는 열역학적 평형을 회복하기 위한 노력으로 물을 손실함으로써 탈수될 것이다. 시스템이 냉각됨에 따라, 더 많은 세포외 얼음이 생성되고 용질의 농도가 올라가고 세포가 더욱 탈수되도록 강요한다. 세포에는 그들의 탈수 속도를 조절하는 세 가지 특징이 있다. 하나는 세포막의 물 투과성이다; 물 투과성이 낮을수록, 세포가 탈수되는 데는 더 많은 시간이 걸린다. 다른 하나는 세포막의 물 투과성의 온도 의존성이다; 모든 세포는 온도가 내려감에 따라 그들의 물 투과성을 감소시킨다. 마지막 특징은 세포의 크기이다; 큰 세포가 작은 세포보다 탈수하는 데 오래 걸린다. 각 세포 유형이 극적으로 다른 특성을 가질 수 있으므로, 적절한 동결 보존 조건은 세포 유형에 따라 많이 다를 수 있다.

동결 보존동안의 세포 손상의 정확한 기작이 완전히 밝혀지지 않았지만, 냉각 속도의 함수로써 세포 생존능력을 측정함으로써 생성된 특징적인 생존 기호는 모든 세포 유형에 대해 성질상 유사하며 뒤집어진 U자 모양의 곡선을 보여준다. 매우 느리고 매우 빠른 냉각 속도에서는 세포 생존은 낮고, 중간 정도의 냉각 속도가 적절한 생존능력을 낳는다. 적절한 냉각 속도와 곡선의 넓이가 다른 세포 유형에 대해 극적으로 다를 수 있는데도 불구하고, 성질상의 행동은 보편적인 것으로 나타난다. 더 빠른 냉각 속도는 세포가 탈수할 충분한 시간을 허락하지 않으며 세포는 내부적으로 얼음을 형성한다. 빠른 냉각 속도에서의 세포 손상은 세포내 얼음 형성에 기인한다. 느린 속도의 냉각에서, 세포 손상은 매우 농축된 세포내- 및 세포외 염과 동결방지제 용액에의 노출의 효과 또는 세포와 세포외 얼음사이의 기계적 상호작용에 기인하는 것으로 생각된다.

세포가 세포내 얼음 핵형성 곡선을 넘기 전에 가능한 많이 세포를 탈수시키는 것이 필요하다. 실제적으로 이 시점에서 세포에 남아있는 모든 물이 핵을 형성하고 얼음을 형성할 것이다. 이것이 일어나는 정확한 온도를 결정하는 것은 불가능하지만, 세포가 1몰 내지 2몰의 동결방지제 존재하에서 천천히 동결될 때는 대략 -40℃ 내지 -50℃이다. 이 온도에서 세포내에서 얼음으로 변하는 물의 양은 동결될 때는 해가 없을 수 있으나, 만일 충분히 빨리 녹여지지 않으면, 해동시에 팽창하여 세포를 죽일 것이라는 것을 주목하는 것이 중요하다. (The Biophysics of Organ Cryopreservation, Pg.117-140, David E. Pegg와 Armand M. Karow, Jr.NATO ASI Series A: Life Science Vol. 147 1987 Plenum Press, New York 233 Spring St., New York, NY 10013).

시판되는 생육할 수 있는 피부 등가체의 개발 전에는, 시체 피부가 이식을 위해 이용되었다. 동결 보존 프로토콜이 개발됨으로써 화상 센터와 병원이 피부 은행을 유지할 수 있었다. 다른 동결 보존제, 동결 속도, 포장 형태 및 저장 조건을 이용하는 많은 다른 프로토콜이 개발되었다. 대부분의 연구자들은 빠른 해동 프로토콜에 동의했다. 프로토콜의 성공 또는 실패는 상처 부위에의 이식편 수용에 의해 또는 세포 생존능력 분석에 의해 측정되었다.

베이상(Beisang)에게 특허된 미국 특허 제3,842,831호에서는 시체 피부 절편의 동결 보존을 위한 방법이 개시된다. 그 방법은 시체 피부를 느슨하게 짜여진 면포 또는 안감에 부착하고 피부 절편과 면포를 동결전에 함께 마는 것에 관련된다. 발명자들은 글리세린 또는 DMSO의 이용을 제안하지만, 동결방지제는 이용되지 않는다. 이 동결 프로토콜은 -70℃의 저온까지의 빠른 비조절성(고정된 온도) 동결 속도 프로토콜을 이용한다.

메이 에스알(May SR)과 에프에이 드클레멘트(FA DeClement)(Skin Banking Methodology, 17, 33-45(1980))는 피부분절 시체 피부를 이용해서 포장 기하학과 냉각 속도 및 데우기 속도의 평가를 수행했다. 그 결과는 시체 피부가 말려있기보다는 평평해야하며, 더 느린 동결 조절 속도가 이용되어야 함을 제안했다.

터보(Tubo)에게 특허된 미국 특허 제5,040,677호는 상피세포 시트(sheet)의 각각의 이식을 위한, 가스가 새지않는 밀봉 용기를 개시한다. 상기 용기는 상피 세포 시트가 클립을 이용해 접착 기질 시트 또는 안감에 접착될 것을 요구한다.

터보(Tubo)에게 특허된 미국 특허 제5,145,770호는 약 -1℃/분의 냉각 속도로, 덱스트란같은 비(非)세포 투과제와 글리세롤같은 세포 투과제의 동결방지제를 이용하는, 각질세포 시트를 위한 동결 보존 방법을 개시한다. 유사하게, 차오(Chao)등에게 특허된 유럽특허 제0 364 306호는 동결방지제로 DMSO와 글리세롤 둘다 이용하고 바람직하게는 -1℃/분의 동결 프로토콜을 이용하는, 살아있는 배양된 상피 세포 시트를 동결 보존하는 방법을 개시한다.

칸세다(Cancedda)등에게 특허된 미국 특허 제5,298,417호는 미국 특허 제4,016,036호, 4,304,866호 및 4,456,687호에 개시된 대로 제조된 상피 시트같은 단층 구조체를 위해 개발된 동결 보존 프로토콜을 개시한다. 표피 시트를 8-15% 글리세롤 또는 DMSO의 동결방지제와 함께 항온처리하고, 냉각 속도가 프로토콜의 마지막에서보다 처음에 더 느리며 동결 과정의 절정전의 온도 상승을 특징으로 하는 속도 조절 프로토콜을 이용해 동결 보존한다.

콜라겐 젤내의 피부 섬유아세포의 동결 방지를 위한 방법을 테스대일(Teasdale) 등이 Burns, 19(5) 406-410(1993)에서 조사했다. 테스데일은 적절한 세포 생존능력은 DMSO를 동결방지제로 하여 -0.5℃/분으로 동결함으로써 얻어질 수 있다고 결정했다.

낸찰(Nanchahal)등은 "Cultured composite skin grafts: Biological skin equivalents permitting massive expansion," The Lancet, 2(8565), 191-193(1989년 7월 22일)에서 Medium 199에서 15% 글리세롤과 10% FCS의 동결방지제를 이용하여 혼성의 배양된 조직 이식체의 저장 기술을 토론한다. 이식체와 동결방지제는 2시간 동안 37℃에서 항온처리되고 이어서 -1℃/분으로 -70℃까지 동결되고 이어서액체 질소에 보관되었다. 이식체의 빠른 해동후, 2주 동안 배양하고 털이 없는 마우스에 이식하여 그들의 생존 능력을 결정했다. 문신 절제중인 세 환자에게 이식하여 최종 평가를 했다.

존스톤(Johnstone)등은 "Cryopreservation of Rabbit and Cat Corneas at -18 to -24℃," Cornea, 11(3): 211-220(1992)에서 액체 질소 또는 매우 낮은 온도의 냉동고보다는 가정용 냉동고를 이용하는, 토끼와 고양이 각막의 동결 보존을 위한 간단한 과정을 개시한다. 농도가 증가되는 글리세롤과 글루코스를 가진 50% 태아 소 혈청과 맥캐리-카우프만 배지의 연속적인 용액에 각막을 둠으로써 동결 보존제의 관류가 이루어진다.

공지된 방법을 이용할 때, 배양된 조직 등가체는 상대적으로 두껍고 이질 세포층이기 때문에 그들을 동결 보존하는 것은 불가능하다. 이들 조직의 생체내 기능중의 하나는 투과성 장벽을 제공하는 것이다. 조직 기능은 동결 보존 프로토콜의 개발에서 고려되어져야 한다.

본 발명자들은 많은 배양된 조직 등가체와 포유동물 피부에 적용할 수 있는 동결 보존 방법, 특히 패키지 디자인을 발견했으며 이것은 배양된 조직 등가체의 동결 보존을 위해 매우 효과적이며 상업적으로 실용적인 패키지이다.

본 발명은 수집된 조직 및 생체외(in vitro) 기술을 이용하여 만들어진 배양된 조직 등가체(等價體)의 동결 보존에 관한 것이다. 본 발명은 또한 수집된 조직과 배양된 조직 등가체 둘다를 위한 동결 보존 패키지 디자인에 관한 것으로, 상기 패키지 디자인은 동결 보존될 조직 또는 조직 등가체가 최대 생존능력을 갖도록 하는 것으로 비용면에서 효율적이며 다루기가 용이하다. 동결 보존 기술을 이용하여, 동결 보존된 수집된 조직 또는 동결 보존된 배양 조직은 사용하기 전에 무한한 기간동안 저장될 수 있다. 배양된 조직은 등가의 인체 조직의 생체외 모델로서, 저장된 상태에서 해제되어 생체 내에서의 이식을 위해, 또는 생체외에서 화합물 선별을 위해 이용될 수 있다.

도 1A와 1B는 뚜껑의 도면을 보여준다.

도 2는 시일의 상면도를 보여준다.

도 3A와 3B는 뚜껑에 올려진 시일을 보여준다.

도 4A와 4B는 담체의 도면을 보여준다.

도 5A와 5B는 쟁반의 도면을 보여준다.

도 6A와 6B는 분해된 조립물과 완성된 조립물의 측면도를 보여준다.

도 7은 조립물의 상세도를 보여준다.

도 8은 완성된 조립물의 상면도를 보여준다.

도 9는 비동결 보존된 배양 조직과 비교한 동결 보존된 배양 조직의 생존능력의 그래프를 보여준다. MTT에 의해 측정되는 동결 보존된 배양 조직의 생존능력이 나타난다. LSE는 LDH분석에 의해 부가적으로 측정되었다. 모든 배양된 조직은 연령에 맞춘 비동결 보존된 컨트롤과 비교되고 컨트롤의 비율로 표현된다.

본 발명은 해로운 세포내 얼음 결정의 형성을 피하고, 잠재적으로 해로운 화학물질의 효과적인 농축을 최소화하고, 프로그램화할 수 있는 동결 장치를 이용하여 알맞은 온도에서 동결방지제를 빨리 주입하고 제거하는 것을 허락하는, 배양된조직 등가체를 매우 낮은 온도에서 성공적으로 동결 보존하기 위한 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 배양된 조직 등가체의 동결 보존, 저장 및 분배를 위해 개발된 새로운 패키지 디자인을 제공한다. 상기 새로운 디자인은 기존의 패키지 디자인에 비해 많은 잇점을 제공한다. 현재, 상업적으로 이용가능한 동결 보존된 배양 조직 등가체는 없으며, 그래서 이용가능한 당장 손에 넣을 수 있는 패키지가 없다. 새로운 패키지의 디자인은 더 효율적인 열 전달 때문에 동결 챔버의 외부 온도를 패키지 내부가 더 잘 쫓아갈 수 있도록 한다. 개선된 열 전달율은 더 잘 조절되는 과정을 허용하며; 따라서 배양 조직 등가체의 일정한 냉각과 데우기 속도를 가능하게 하고 그래서 세포 생존 능력에서의 변이를 감소시킨다.

발명자들은 배양된 조직 등가체가 생존 능력과 인체 조직의 등가체로서의 유용성을 유지하도록 하기 위해 생체외 기술로부터 만들어진 배양된 조직 등가체를 동결 보존하는 방법을 발견했다. 본 발명은 효율적인 양의 동결방지제의 통과를 증진시키기 위한 교반의 이용을 포함한다. 본 발명의 방법은 구조적인 보전과 세포 생존 능력을 보호하는 방식으로 수집된 조직과 배양된 조직 등가체 둘다를 위한 동결 보존법을 제공한다.

본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다:

1) 수집된 조직 또는 배양된 조직 등가체를 동결방지제 용액에 침액시키고 동결방지제 용액과 침액된 조직을 교반하여 동결방지제 용액이 조직속에 효과적으로 투과하도록 하는 단계(조직의 관류); 및

2) 동결방지제 용액을 조직에 관류시킨 후, 동결방지제를 위한 고체-액체 상 평형 온도 범위로 냉각시키고; 세포외 얼음을 종정 형성하고 느린 동결 속도로 적어도 약 -70℃ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 -120℃ 또는 그 이하, 더욱 바람직하게는 -140℃ 그리고 가장 바람직하게는 -196℃까지 조직을 동결하여 동결 보존된 상태로 냉각하는 단계.

일단 동결되면, 동결 보존된 조직은 약 -120℃ 내지 액체 질소의 온도인 약 -196℃, 사이에서 무한한 기간동안 저장될 수 있다.

동결 보존된 조직을 해동하는 것은 약 1 내지 2분내에 이루어지는, 높은 속도로 동결 조직을 데움으로써 이루어진다. 동결 조직은 데워진 배양 배지를 직접 가하거나 또는 생리적 완충액에 의해 또는 다른 빠른 가열 방법에 의해 해동될 수 있다. 패키지 디자인은 중요한 해동 과정동안 멸균성을 유지하면서 빠른 데우기 속도와 조절된 열적 단일성 둘다를 보장하므로 패키지를 워터 배스(waterbath)에 담궈 조직을 해동하는 것을 허용한다.

이식 또는 생체외 시험을 위해, 인체 조직을 위한 등가체로 사용하기 전에, 해동된 배양된 조직 등가체는 동결방지제 용액을 제거하기 위해 세척된다. 동결방지제 용액은 예를 들어, 생리적 pH의 등장 완충액으로 세척함으로써 제거될 수 있다. 배양된 조직 등가체는 이어서 사용전에 완충액에 일시적으로 저장되거나 또는 적절한 세포 배지에서 재배양될 수 있다.

조직 공학은 화학적 제제 또는 약학 제제에 의한 상처에의 반응을 검사하기 위해 이용될 수 있는 조직 등가체를 만들기 위해 배양된 조직 세포를 이용하는 새로운 분야이다. 배양된 조직은 또한 이식가능한 인체 조직을 형성하기 위해 이용될 수도 있다. 조직 등가체는 미국 특허 제4,485,096호, 4,485,097호, 4,539,716호, 4,546,500호, 4,604,346호, 4,837,379호, 및 5,374,515호를 포함하는 많은 특허에서 광범위하게 개시되어왔으며 이들은 모두 참고로 본 명세서에 통합된다. 조직 등가체의 한 가지 성공적인 적용은 "살아있는 피부 등가체"로 불리며, 이것은 실제의 인체 피부에 유사한 형태를 가진다. 살아있는 피부 등가체(Living Skin Equivalent, LSE)는 두 층으로 이루어진다: 윗부분은 콜라겐 기질에서 인체 피부 섬유아세포의 하층을 덮는, 분화되고 층상인 인체 표피성 각질세포로 이루어 진다. Parenteau, et al., "Epidermis Generated In Vitro: Practical Considerations and Applications,"J.of Cellular Biochemistry, 45:245-251(1991); Parenteau, et al., "The organotypic culture of human skin keratonocytes and fibroblasts to achieve form and function," Cytotechnology, 9:163-171(1992); and Bell et al., "The Living Skin Equivalent: Its Manufacture, Its Organotypic Properties and Its Responses to Irritants,"Toxic.in Vitro, 5:591-596(1991).이식을 위한 LSE는 절개 수술, 화상, 정맥 울혈성 궤양, 당뇨병성 궤양, 욕창성 궤양, 및 만성 염증성 궤양과 같은 일부 두께와 전체 두께 피부 상처에 관련되는 징후를 위한 임상 시험에서 조사중이다. LSE는 전체 두께의, 두층의, 생체외 조작된 피부 조직이다.

눈 각막의 생체외 기관 등가체는 미국 특허 제5,374,515호에서 개시된 대로 개발되었으며 본 명세서에서 참고로 인용된다. 각막 조직 등가체는 세가지 다른세포 층을 가지는 바, 층상의 편평 상피인 외부층; 콜라겐 섬유와 기질 세포의 중간층; 그리고 각막 내피라고도 불리는 간단한 편평 상피인 내층이다. 생체외 각막 등가체는 많은 유형의 산물과 재료에 대한 생체내 안구와 피부 염증 가능성의 정확하고 값싼 비-동물 예측 모델로 작용하기 위해 생체외 독성 분석을 위해 이용될 수 있다.

동결 보존의 목표는 무한한 기간동안 생물학적 재료의 구조적 완전성과 생명력을 보존하여 이들 재료가 필요할 때 이용될 수 있도록 하는 것이다. 짧은 생명력을 가지는 복잡한 조직은 산물의 이용가능성과 유용성을 확장하기 위해 동결 보존을 요구할 것이다. 하지만, 생물학적 재료의 동결 보존의 역사는 특정 세포를 위한 동결 보존 프로토콜의 최적화가 다른 유형의 세포에 또는 한 조직내의 다른 세포에 이용될 때 반드시 좋은 결과를 주지는 않는다는 것을 보여주었다. 세포 밀도, 수분 함량 및 전체 두께 조직 등가체의 구조적 조직화의 정도의 차이에 기인하는 더욱 특화된 방법의 개발이 요구되었다. 본 발명의 동결 보존 프로토콜은 놀랍게도 단층 표피 및 피부층, 이층 조직 등가체, 삼층 각막등가체 및 수집된 포유동물 피부에 적용이 가능하다. 패키지 디자인의 개발은 이들 조직의 동결 보존이 생산 규모 과정에 실용적이도록 한다.

본 명세서에서 사용된 것처럼, "배양된 조직 등가체"는 포유동물 조직의 조직 등가체를 의미하며, 여기서 조직 등가체는 생체외 기법에 의해 만들어지며 진피 등가체 또는 표피 시트인 단층 피부 등가체 ; 이층 피부 등가체, 특히 LSE; 그리고 삼층 각막 등가체와 피부 등가체를 포함하는 것을 의미한다. 배양된 조직 등가체의 형태는 생체내 포유동물 기관, 일반적으로 인체 기관에 유사하다. 예를 들어, LSE의 형태는 인체 피부에 많은 유사점을 가진다. 대사적으로 그리고 유사 분열적으로 활성인 인체 피부 섬유아세포(HDF)는 구조체의 피부층 전체에 걸쳐 발견되며, 콜라겐과 다른 기질 성분을 격자로 분비하는 것으로 나타났다. 표피세포는 인체 피부와 유사한 유사분열 속도로 분열하는 것으로 나타나는 기저층으로 이루어진다. 상기저층의 표피는 층상 각질세포에 의해 덮인 각질초자질과 층판성 과립을 함유하는 미세한 극상 및 입자층을 가지는, 생체내 피부와 동일한 조직층을 가지는 것으로 나타난다. 면역조직화학은 라미닌, 유형 IV 콜라겐 및 카라닌(GB3)같은, 정상 인체 피부의 피부-표피 접합부에서 일상적으로 발견되는 세포외 기질 성분의 존재를 보여준다.

살아있는 피부 등가체(LSE)같은, 오가노타이픽(organotypic) 배양 방법에 의해 얻어진 배양된 조직 등가체는 등가체를 형성하기 위한 뼈대로서 담체를 이용한다. 배양된 조직 등가체는, 제조, 선적 및 최종 사용동안 구조체에 직접 닿지 않고 구조체를 조작하도록 하는 담체에 건조된다. 담체상의 배양된 조직 등가체를 생산하는 방법이 미국 특허 제5,374,515호와 미국 출원 제08/193,809호와 08/337,830호에 개시된다.

담체는 본질적으로 관상인 지지체의 한 쪽 말단에 부착되는 평면의 투과성 막을 포함한다. 관상 지지체의 다른 쪽 말단은 바깥쪽으로 신장되는 플랜지를 포함하며 이 플랜지는 조직 배양 디쉬내의 그리고 본 발명의 패키지 디자인내의 웰의 상부 말단에 걸 수 있는 테를 가진다. 막-지지체 조합물은 그 지지체 주위에 적절한 틈새를 제공하고 웰의 상부 말단을 연결하기 위해 적어도 하나의 특정 크기의 웰을 가지는 배양 디쉬와 이용될 수 있는 크기이다. 막-지지체 조합물은 다른 크기의 배양 디쉬와 동결 보존 및 저장 패키지 둘다와 함께 이용되기 위해 다른 크기로 만들어질 수 있다. 이들 담체의 예는 미국 특허 제5,466,602호에서 개시된 TRANSWELL(상표명)(Costar)이다. 배양 용기내에 지지와 연결의 다른 수단을 이용하는 유사한 담체를 수용하기 위해 패키지 디자인의 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있다. 유사한 담체는 미국 특허 제5,358,871호와 제5,366,893호 또는 미국 특허 제4,871,674호에 개시된다.

본 발명의 바람직한 패키지 디자인은 담체 뼈대를 포함하며 미리 결정된 조건에 따라 조절될 수 있는 조직 등가체 주위의 환경을 정의한다. 본 발명은 바람직하게는 의학적 등급의 양질이며 넓은 범위의 온도를 견딜 수 있는 제품을 이용한다. 이들 재료는 밀봉 수단에 의해 함께 밀봉될 수 있는 쟁반과 뚜껑을 형성하도록 성형된다. 상기 새로운 패키지는 조직 등가체가 그 위에서 형성되는 담체 지지체를 가지도록 고안된다.

새로운 패키지 디자인은 쟁반, 뚜껑 그리고 그들 사이의 단단한 시일(seal)을 포함한다. 쟁반과 뚜껑은 부착된 조직 등가체를 포함하는 기존의 담체에 맞도록 고안된다. 부착된 조직 등가체를 가진 담체를 쟁반에 놓고 동결방지제 용액을 첨가한다. 이어서 뚜껑을 쟁반에 놓고 패키지의 내부와 외부 환경 사이에 단단한 시일을 형성하기 위해 두 부분을 단단하게 밀봉한다.

상기 패키지 디자인은 동결방지제가 조직 등가체와 쟁반 및 뚜껑에 접촉하도록 하면서 담체의 아래와 조직 등가체의 표면 위에서 동결방지제가 동등하게 분배되도록 한다. 패키지의 디자인은 조절되는 냉각과 동결 속도가, 동결 보존되는 배양된 조직의 위와 아래에서 유사한 기하학으로 배열되는 동일한 부피의 동결방지제로 유지될 수 있다는 것에 기초한다. 이 배열은 배양된 조직 등가체의 상부와 바닥 표면으로부터 패키지의 외부 벽까지 측정할 때, 일정한 거리를 제공한다(만일 패키지가 또한 일정한 두께를 가진다면).이러한 균일성은 냉각시 조직 등가체로부터 동결 용기로; 그리고 해동시 외부 환경으로부터 조직 등가체로 일정한 열 교환을 제공한다.

쟁반은 측벽 및 플랜지와 연속적인 바닥 표면을 포함한다. 플랜지는 뚜껑에 쟁반을 밀봉하기 위한 평면 표면을 제공한다. 쟁반의 측벽은 측벽으로부터 안쪽으로 신장하며 측벽과 통합되는 연속적인 하나의 지지체 또는 불연속적인 복수의 지지체를 가진다. 배양된 조직 등가체를 함유한 담체의 상부 가장자리는, 쟁반에 위치될 때, 쟁반의 측벽에 의해 제공되는 지지체에 걸린다. 공간은 걸린 담체와 쟁반의 바닥 표면사이에서 조직 등가체의 크기 정도의 면적과 약 1.0 ㎜ 두께로 정의된다.

뚜껑은 측벽 및 플랜지와 연속적인 평면 바닥 표면을 포함한다. 뚜껑 플랜지의 직경은 쟁반 플랜지의 직경보다 약간 작다. 뚜껑 플랜지는, 담체를 함유하는 쟁반에 놓일 때, 쟁반 플랜지와 뚜껑 플랜지의 상부 표면이 동일 평면상 또는 동일 평면 주위에서 접촉하도록 배향되도록 하기 위해 담체에 놓인다. 두 번째 공간은 뚜껑과 배양된 조직 등가체 표면에 의해 정의되며 조직 등가체의 크기 정도의 면적을 가진 1.0 ㎜ 두께로 측정된다.

상기 디자인은 쟁반과 조직 등가체 함유 담체의 바닥 사이의 약 1 ㎜, 그리고 뚜껑과 쟁반 둘 다와 접촉하고 있는, 조직 등가체 위와 아래의 동결방지제를 가진 조직 등가체와 뚜껑 사이의 약 1 ㎜를 허용한다.

뚜껑이 배지를 함유하는 쟁반에 놓일 때, 뚜껑은 패키지내의 모든 공기를 담체의 관상 지지체를 함유하는 주변 공간으로 대체한다.

뚜껑은 쟁반의 상부 표면과 뚜껑 플랜지에 의해 형성되는 노출된 평면을 따라 쟁반에 밀봉된다. 밀봉은 열, 접착제 또는 공지된 다른 수단에 의해 이루어질 수 있다. 뚜껑과 쟁반 사이의 밀봉은 동결방지제의 누출을 막고 장치 내부의 멸균성을 유지한다. 바람직하게는 열로 밀봉할 수 있는 뚜껑대의 환상 시트가 쟁반과 뚜껑 플랜지 둘 다에 열에 의해 밀봉된다. 뚜껑 대는 바람직하게는 벗겨서 제거하여 조직 등가체에 접근하기 위해 쟁반으로부터 뚜껑을 열 수 있도록 하기 위한 탭을 가진다. 다른 구체예에서, 쟁반 플랜지와 대략 동일한 직경의 플랜지를 가진 뚜껑을 내부에 배열된 담체를 가진 쟁반에 놓아 뚜껑 플랜지의 바닥 표면이 쟁반 플랜지의 상부 표면에 매우 가까이 접촉하도록 한다. 이어서 플랜지들은 밀봉 수단에 의해 함께 밀봉된다.

도 1A와 1B는 뚜껑 (10); 뚜껑 플랜지 (11); 뚜껑 측벽 (12); 및 바닥 표면 (13)을 보여준다. 뚜껑 플랜지 (11), 뚜껑 측벽 (12), 및 바닥 표면 (13)은 연속적인 표면을 형성한다.

도 2는 환상 시일 (20)과 손잡이 (21)를 보여준다.

도 3A와 3B는 시일 (20); 뚜껑 (10); 뚜껑 플랜지 (11)를 보여준다. 시일 (20)은 밀봉 과정동안 시일의 정렬을 촉진하기 위해 사용전에 뚜껑 (10)의 뚜껑 플랜지 (11)에 올려놓는다.

도 4A와 4B는 담체 (30); 담체 고리 (31); 투과성 막 (32); 및 관상 지지체 (33)를 보여준다. 투과성 막 (32)은 관상 지지체 (33)에 의해 결합되어 그곳에 배치된 배양 조직 등가체를 함유한다. 담체 (30)은 동결 보존 과정동안 조직 등가체와의 접촉 또는 제거없이 조직 등가체의 이전을 허용한다.

도 5A와 5B는 쟁반(40); 쟁반 바닥 표면(41); 쟁반 측벽(42); 쟁반 플랜지 (43); 및 담체 지지체(44)를 보여준다. 쟁반 바닥 표면(41), 쟁반 측벽 (42), 쟁반 플랜지(43), 및 담체 지지체(44)는 연속적인 표면을 형성한다. 담체 지지체(44)는 쟁반내의 담체와 접촉하고 지지한다.

도 6A와 6B는 시일(20); 뚜껑(10); 담체(30); 및 쟁반(40)을 보여준다. 조직 등가체를 함유한 담체(30)는 쟁반(40)에 배치되고 쟁반내에 걸린다. 시일(20)을 가진 뚜껑(10)은 담체(30)위에 놓이고 담체위에 걸린다.

도 7은 시일(20); 뚜껑 플랜지(11); 뚜껑(10); 담체(30); 담체 고리(31); 담체 지지체(44); 및 쟁반(40)을 보여준다. 조직 등가체를 그 위에 함유한 담체(30)는 쟁반(40)에 배치되고 담체 고리(31)의 바닥 표면이 담체 지지체(44)의 상부 표면에 접촉함으로써 쟁반내에 걸린다. 시일(20)을 가진 뚜껑(10)은 담체(30)위에 놓이고 뚜껑 플랜지(11)의 바닥 표면이 담체 고리(31)의 상부 표면에 접촉함에 의해 담체위에 걸린다. 뚜껑 플랜지(11)와 쟁반 플랜지(43) 둘다의 상부 표면은 시일(20)을 위한 평면 표면을 형성한다.

도 8은 조립체의 상면도를 보여준다.

쟁반과 뚜껑이 제조될 수 있는 재료는 단단하거나 반가요성인 가열가소성 물질로서, 가열될 때, 진공에 의해 성형되거나, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 또는 폴리에틸렌 테레프탈레이트 글리콜(PETG)처럼 주입 성형된다. 패키지 쟁반과 뚜껑은 바람직하게는 공지된 방법에 의해 사용전에 멸균된다. 쟁반과 뚜껑을 제작하기 위해 이용되는 물질이, 이용될 수 있는 멸균 방법을 결정할 것이다. PTFE 또는 PETG를 멸균하기 위해서는, 2.5 내지 3.0 메가라드의 감마선이 바람직하다. 공지된 전기적 및 화학적 멸균 방법이 이용될 수도 있다.

배양된 조직 등가체는 제제에 의해 수축된 수화된 콜라겐 격자의 진피 등가체, 바람직하게는 섬유아세포를 포함한다. 한가지 구체예에서, 표피 세포의 층상의 층은 진피 등가체의 표면에서 배양된다. 다른 구체예에서, 각막실질세포에 의해 수축된, 수화된 수축 콜라겐 격자는 격자의 표면에서 배양된 각막 상피 세포의 층상의 층을 가진 각막 내피 세포층에 배치된다. 다르게는, 표피 세포만이 배양되고 유도되어 표피 세포 시트를 형성하도록 성층될 수도 있다. 배양된 조직 등가체는 담체의 다공성막 또는 담체의 바닥 표면의 다공성 막에 부착된 콜라겐 젤상에서 형성된다. 더욱이, 다른 배양된 조직 등가체는 임의의 배양된 표피 시트, 임의의 배양된 진피 등가체, 임의의 배양된 각막 등가체, 또는 수집된 포유동물 피부를 포함하나 여기에 제한되지 않으면서 본 발명의 방법에 따라 동결 보존될 수 있다. 본 발명은 이제 조직 등가체와 바람직한 패키지 디자인을 예시로 이용하여 설명될것이다. 설명되는 방법에 변형이 가능하며 그러한 변형이 본 발명의 범위내라는 것은 당업자에 의해 이해될 것이다.

동결방지제 용액으로 조직 등가체를 관류하는 방법은 조직 등가체와 거기에 부착된 담체를, 시료를 침액시키고 조직 등가체의 위와 아래에 동일한 부피의 동결방지제 용액을 가지도록 하기에 충분한 부피의 동결방지제 용액에 침액시키는 것이다. 조직 등가체와 담체를 함유하고 있는 100 ㎜ 페트리 디스크에 DMEM내의 2M 글리세롤 25 mL을 시료를 완전히 관류하기에 충분한 시간 동안, 바람직하게는 한 두 시간사이, 하지만 가장 바람직하게는 약 한 시간 동안 첨가한다. 동결방지제 용액속에 있는 시간이 길어지면 조직내의 세포의 생존능력의 감소로 귀결되며, 반면 너무 짧은 기간은 동결방지제의 조직내로의 완전한 투과를 보장하지 못한다. 단층 구조체는 일반적으로 그들이 더 적은 세포층과 감소된 장벽 기능을 가지므로 관류를 위해 더 적은 시간을 요구한다. 이 시간 동안, 동결방지제 용액의 침투는 시료와 동결방지제 용액을 교반함으로써, 일반적으로 페트리 디쉬를 10% CO₂가스 용기내에서 오비탈 플랫폼 쉐이커(orbital platform shaker)(Bellco orbital shaker)상에서 70rpm으로 흔들어줌으로써 증가된다. 조직 등가체가 제조되는 배양 환경과 동일한 10% CO₂환경은 배지에서 기체가 손실되는 것을 방지하여, 동결방지제의 염기 배지 성분의 pH를 유지한다. 교반은 동결방지제가 더 빨리 그리고 더 완전히 조직 등가체내로 관류하도록 하며 동결 조직 등가체 사이의 결과의 재현성을 더 좋게 한다. 오비탈 쉐이커를 다른 공간 평면으로 교반 운동을 하는 장치와 대체할수 있다. 부가적으로, 기계적으로 증진된 관류의 다른 방법은 받침대상에서 용기내에서 동결방지제와 함께 구조체를 흔들거나 구조체를 동결방지제와 함께 원심분리하고 펌프를 이용하여 구조체 주위에서 동결방지제를 관류시키는 것을 포함하며, 이에 한정되지 않는다.

담체와 부착된 조직 등가체를 쟁반에 놓고 약 16.0 ㎖의 동결방지제 용액을 첨가한다. 패키지 디자인은 동결방지제의 동등한 분배를 허용하여 담체 아래에 약 8.0 ㎖ 그리고 조직 등가체 표면상에 8.0 ㎖이 존재한다. 이어서 뚜껑을 쟁반에 놓고 두 부분을 바람직하게는 뚜껑대에 열 밀봉한다.

포장된 조직 등가체를 이어서 상온, 바람직하게는 20.0℃의 온도로 시작 온도가 고정된 프로그램할 수 있는 냉동고에 놓는다. 포장된 조직 등가체를 함유한 냉동 챔버를, 일반적으로 DMEM내의 2.0M 글리세롤을 위해서는 약 -5.3℃와 -6.0℃사이의 온도인 동결방지제를 위한 고체-액체 상 평형 온도까지 -10.0℃/분으로 냉각한다. 고체-액체 상 평형 온도는 동결방지제에서 얼음의 종정형성에 필요한 온도이다. 챔버 온도는 포장된 조직 등가체의 내부 온도를 챔버 온도와 평형시킬 목적으로 일정 시간 동안 유지된다. 종정형성 온도를 얻기 위해 이용되는 냉각 속도는 중요하지 않다. 약 40분의 유지 시간이 열적 평형을 보장하기에 충분하지만 그 시간은 챔버 크기, 챔버내의 공기 순환, 그리고 동결되어야 할 패키지의 수에 따라 달라질 것이다. 30분 이상이 일반적으로 필요한데, 평형을 얻기 위해 1시간이 걸릴 수도 있다. 유지 시간후, 종정형성에 의한 세포외 얼음 형성이 시작된다. 얼음의 종정형성은 세포외 동결방지제에서 얼음 형성을 시작하는 방법으로 정의된다.얼음 종정형성의 한 가지 바람직한 방법은 조직을 함유하고 있는 쟁반의 측면에 액체 질소에서 얼린(-196℃) 강철 막대같은 얼린 프로우브(probe)를 접촉시키는 것이다. 패키지에의 막대 접촉 부위는 패키지내에서 동결방지제 동결 배지보다 아래여야한다. 다른 바람직한 방법은 프레온 또는 CO₂같은 팽창 가스를 패키지의 바깥쪽으로 직접 방출하는 것이다. 얼음 형성은 챔버의 온도가 얼음 결정을 형성하기에 충분한 범위내에서 낮춰지고 올려지는 챔버 스파이크(spike)에 의해 시작될 수 있다. 얼음 종정형성의 공지된 다른 방법으로 대체될 수 있다.

모든 조직 등가체가 얼음 결정으로 종정형성된후, 상기 유니트(unit)는 열역학적 평형이 일어나고 얼음 종정 결정이 동결방지제를 통해 퍼져 나가도록 추가로 한 시간을 유지한다. 이어서 바람직하게는 약 -0.02 내지 약 -0.3℃; 더욱 바람직하게는 약 -0.05 내지 약 -0.1℃/분; 그리고 가장 바람직하게는 -0.07℃/분의 속도로 -70.0℃ 또는 그 이하; 더욱 바람직하게는 -120℃; 더욱 바람직하게는 -140℃; 가장 바람직하게는 -196℃의 최종 온도까지 냉각을 재개한다. 최종 동결 온도가 물의 유리 전이 온도인 -120℃에 가까워지면, 최종 저장 위치로의 이전동안 해로운 온도 유동이 일어날 가능성은 적어진다.

동결 보존된 조직 등가체는 프로그램할 수 있는 냉동고로부터 약 -120℃ 내지 -150℃ 사이 온도의 증기상 액체 질소 저장 탱크(Dewar) 또는 -196℃의 액체 질소에서 사용할 때까지 보관된다.

해동하기 위해, 동결 보존된 배양된 조직 등가체를 증기상 액체 질소 저장으로부터 제거하여 약 -75℃까지 데우기 위해 드라이 아이스로 옮긴다. 일단 -75℃에서 평형이 되면, 이어서 배양된 조직 등가체를 바람직하게는 37℃로 고정된; 또는 더욱 바람직하게는 4℃로 고정된; 또는 가장 바람직하게는 상온에 고정된 워터 배스같은 환경으로 옮긴다. 일단 모든 동결 보존제 배지가 액체상으로 변하는 것이 보이면, 배양된 조직 등가체 패키지 유니트는 바람직하게는 생물학적으로 안전한 상자, 또는 다른 멸균된 곳으로 옮기고 에탄올로 소독한다. 유니트의 바닥으로부터 뚜껑대를 벗기거나 잘라 접시의 뚜껑을 제거한다. 과량의 동결방지제를 버리면서 배양된 조직 등가체를 함유한 담체를 페트리 디쉬로 옮긴다. 배양된 조직 등가체에서 잔여 동결방지제를 제거하기 위해, 상온의 세척 용액 바람직하게는 DMEM 25 mL을 배양된 조직 등가체를 함유하고 있는 페트리 디쉬에 30분 동안 첨가한다. 다른 충분한 세척 제제, 바람직하게는 세포 배양 배지 또는 인산 완충 식염수같은 생리학적 강도의 용액이 당업자에 의해 선택될 수도 있다. 세척 용액은 추가 30분 동안 두 번째로 교환된다. 세척 시간은 조직의 복잡성에 따라 변할 수 있다.

배양된 조직 등가체 유니트를 이어서 그것의 원래의 배양 접시로 옮겨 37℃/10%CO₂에서 배양 보존 배지에서 재배양한다. 다르게는, 등가체는 환자에게 적용되거나 또는 미국 특허 제 4,835,102호에서 개시되는 것처럼 물질과의 접촉에 대한 반응성이 시험될 수도 있다.

하기 실시예는 본 발명의 실용성을 좀 더 명확히 하기 위해 제공되며 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자들은 본 발명의 목적과 범위에서 벗어나지 않으면서 본 명세서에 설명된 방법의 변형이 가능하다는 것을 인식할 것이다.

실시예 1 내지 3

실시예 1 내지 3은 바람직한 패키지 디자인을 이용하는 본 발명의 동결 보존과 해동 기술을 보여준다.

실시예 1: 패키지 디자인을 이용한, 살아있는 피부 등가체(LSE)의 동결 보존

살아있는 피부 등가체(LSE) 구조체를 미국 출원번호 제 08/193,809호에 따라 제조했다. 공수후 9 내지 10일째에 LSE와 부착된 75 ㎜담체 삽입물(TRANSWELL(상표명), Costar, Cambridge)을 100 ㎜ 페트리 디쉬(Costar)에 놓았다. LSE 구조체와 트랜스웰을 100 ㎜ 페트리 디쉬에서 동결 보존 배지인, DMEM내의 2M 글리세롤 25 mL에 한 시간 동안 침액시켜 동결방지제로 관류시켰다. 관류동안, 구조체를 10% CO₂가스 용기에서 70rpm으로 오비탈 쉐이커(Bellco)에서 한 시간 동안 교반했다. 교반은 더욱 완전한 관류와 동결 보존법의 더 나은 재현성을 허용한다. LSE가 관류된후, LSE, 담체 삽입물 및 세포외 동결 배지(2M 글리세롤과 DMEM)를 함유한 페트리 디쉬를 동결 보존 패키지에 넣고 열밀봉했다. 동결 보존 패키지는 본 출원과 동일자로 출원된 공계류중인 특허 출원, 미국 출원번호 --/---,---호에 개시된다.

프로그램할 수 있는 냉동고(Planar) 챔버는 본 명세서에서 기술된 발명에 제공되었다. 냉동고를 20.0℃의 시작 온도에 고정했다. 배관선에 존재하는 모든 공기를 제거하기 위해 한 번 1초동안 프레온으로 배관 선을 세척했다. 포장된 LSE 유니트를 각각 8개의 LSE 유니트를 수용하는 랙에 안전하게 놓는다. 위치 핀에 의해 안내 되는대로 랙을 분사 걸이 옆에 놓았다. 냉동고의 챔버 문을 닫아 외부 환경으로부터 챔버를 밀봉했다.

LSE 유니트를 -10℃/분으로 -6℃까지 냉각하고 동결방지제와 관류된 구조체를 챔버 온도와 평형시키기 위해 용기 온도를 40분 동안 -6℃에서 유지했다. 40분 동안 유지한 후, 패키지의 측면에 아주 가깝게 1초동안 프레온을 직접 배출시킴으로써 세포외 얼음이 시작되었다. 프레온은 패키지의 표면으로부터 증발되면서, 프레온의 접촉 부분이 세포외 얼음 형성을 시작하기에 충분한 온도로 떨어지도록 했다.

모든 LSE 유니트가 얼음 결정으로 종정형성된후, 유니트를 -6℃에서 한 시간 동안 평형이 되도록 허용한다. 이어서 챔버 온도를 -0.07℃/분으로 최종 온도 -20℃까지 냉각시켰다. 이어서 챔버를 -0. 5℃/분으로 최종 온도 -70℃까지 냉각시켰다. 일단 LSE 유니트가 동결 보존되면, 그들을 -120℃ 내지 -150℃의 온도의 증기 상 저장 탱크(Dewar)로 이전했다.

실시예 2: 동결 보존된 LSE 해동시키기

동결 보존된 LSE를 증기 상 액체 질소 저장에서 제거하여 약 -75℃까지 데우기 위해 드라이아이스로 옮겼다. 일단 -75℃에서 평형이 되면, 배양된 조직 등가체를 바람직하게는 37℃; 또는 더욱 바람직하게는 4℃; 가장 바람직하게는 상온으로 고정된 워터 배스로 옮겼다. 일단 모든 동결 보존제 배지가 액체상으로 변하는 것이 보이면, 배양된 조직 등가체 패키지 유니트는 바람직하게는 생물학적으로 안전한 상자, 또는 다른 멸균된 곳으로 옮기고 에탄올로 소독한다. 유니트의 바닥으로부터 뚜껑대를 벗기거나 잘라 접시의 뚜껑을 제거한다. 과량의 동결방지제를 버리면서 배양된 조직 등가체를 함유한 담체를 페트리 디쉬로 옮긴다. 배양된 조직 등가체에서 잔여 동결방지제를 제거하기 위해, 세척 용액 바람직하게는 DMEM(상온) 25 mL을, 배양된 조직 등가체를 함유하고 있는 페트리 디쉬에 30분 동안 첨가한다. 세포 배양 배지 또는 인산 완충 식염수같은 다른 충분한 생리학적 세척제가 당업자에 의해 선택될 수도 있다. 세척 용액은 부가적인 30분 동안 두 번째로 교환된다.

해동된 동결 보존된 시료와 컨트롤 시료를 조직학적 방법에 의해 가공하고 형태 조직과 생존 능력에 대해 광학 현미경으로 평가한 결과 거의 100% 생존 능력을 나타냈으며 컨트롤과 거의 구별할 수 없었다.

실시예 3: 데우는 속도와 열적 단일성에 대한 동결 보존 패키지 디자인의 평가

본 발명의 동결 보존 패키지를 일정한 열 전달에 대해 평가했다. 배양된 조직 등가체없는, 담체막에 다섯 개의 열전기쌍을 하나는 중앙에 그리고 네 개는 담체의 말단벽으로부터 똑같이 1.0 ㎜ 간격으로 올려놓았다. 열전기쌍 납은 뚜껑과 쟁반 플랜지 사이의 측면으로부터 패키지를 나와 온도 기록기(Azonix Scanner Plus)로 이어졌다. 패키지는 동결방지제 17 mL로 채우고 열밀봉했다. 패키지를 -70℃로 평형시키고 이어서 20℃로 고정된 워터 배스로 옮겼다. 온도 기록기는 데우기동안 매 1 내지 2초마다 각 열전기쌍에서 온도를 기록했다. 패키지를 처음에는 700℃/분의 속도로 데우고 동결방지제 용액의 융점에 가까워짐에 따라 속도를 늦췄다. 열적 단일성은 가장 빠른 데우기 속도 동안 평균 열전기쌍 온도인 2℃와 6℃ 사이였으며 용액의 융점에 도달했을 때는 8℃에 가까웠다.

실시예 4 내지 12는 다른 조직에서 본 발명의 동결 보존 방법을 보여준다.

실시예 4: 표피 시트의 동결 보존

표피 시트는 공수후 12일째에 성숙한 LSE로부터 얻었다. 핀셋으로 표피층으로부터 피부 기질층을 벗기고 진피층을 버림으로써 표피 시트를 제거하였다. 각 시트를 세 조각의 등가체로 잘랐다. 각 시트의 한 조각을 컨트롤로 고정했다. 각 시트의 나머지 두 조각을 100 ㎜ 배양 접시(Costar)에서 75 ㎜ 폴리카보네이트 트랜스웰 막(Costar)의 상부에 놓았다. 각 조각을 한 시간 동안 DMEM과 2M 글리세롤 25 mL로 관류했다. 구조체를 함유한 접시를 10% CO₂가스 용기내에서 한 시간 동안 70rpm의 오비탈 쉐이커(Bellco)에 놓았다. 표피 시트가 관류된후, 표피 시트, 트랜스웰, 및 세포외 동결 배지(2M 글리세롤과 DMEM)를 함유하는 페트리 디쉬를 봉투에 넣고 5초 진공과 3.9초 밀봉 시간의 프로그램으로 진공 밀봉시켰다(Audiovox).

포장된 표피 시트를 20.0℃의 시작 온도에서 프로그램할 수 있는 냉동고(Planer)에 놓았다. 표피 시트를 -10.0℃/분으로 -6. 0℃까지 냉각했다. 챔버 온도로 평형을 맞추기 위해 20분 동안 -6.0℃에서 온도를 유지했다. 20분 동안의 유지후, 액체 질소로 얼린 프로우브를, 냉동 배지아래에서 봉투의 바깥쪽과 접촉시킴으로써 세포외 얼음이 시작되었다. 모든 표피 시트가 얼음 결정으로 종정형성된 후, 온도를 -6.0℃에서 추가로 5분 동안 유지했다. 이어서 챔버를 -1.0℃/분으로 -8.0℃까지 냉각했다. 이어서 시료 전체에 얼음이 일정하게 분배되도록 온도를 30분 동안 -8.0℃에서 유지했다. 이어서 챔버를 -0.1℃/분으로 -70.0℃의 최종 온도까지 냉각했다.

동결 보존된 표피 시트를 냉동고에서 제거하고 봉투를 페트리디쉬에서 자르고 뚜껑을 제거한다. 해동하기 위해, 따뜻한(37℃) DMEM 40 mL을 무균적으로 각 페트리 디쉬에 부었다. 45초 후에, 모든 액체를 디쉬로부터 제거하고 부가적인 40 mL을 2분 동안 각 디쉬에 첨가했다. 모든 얼음이 녹은 후, 표피 시트를 30분 동안 DMEM 25 mL로 세척했다. 배지를 부가적인 30분 동안 다시 교환했다. 이어서 표피 시트를 분석에 앞서 24시간 동안 37℃/10%CO₂에서 배양 보존 배지에서 항온처리했다. 항온처리 시간은 동결 세포가 정상 상태 조건을 재수립하는 데 일반적으로 걸리는 시간 동안 허용되었다. 다시, 항온처리 시간을 냉동 세포가 정상 상태 조건을 재수립하는 데 일반적으로 걸리는 시간 동안 허용했다.

각 표피 시트로부터의 나머지 두 조각 중에서, 하나는 조직학을 위해 가공하고, 하나는 MTT분석 프로토콜에 따라 분석했다. 실시예 4의 비동결 보존된 표피 시트와 동결 보존된 표피 시트의 광현미경 사진의 비교는 표피의 세 가지 기본적인 특징인 표피의 기저층, 표피의 상기저층 및 표피의 층상 각질층이 모두 이 방법에 의해 보존됨을 보여주었다. 모든 층은 그대로이며 동결 보존된 표피 시트의 전체적인 형태는 비동결 보존된 표피 시트와 동일했다.

실시예 5: 진피 등가체의 동결 보존

본 연구에서 이용된 진피 등가체는 LSE의 비표피화된 성분이었다. 진피 등가체는 채취후 8일째에 냉동시켰다. 100 ㎜ 페트리 디쉬(Costar)에 놓인 75 ㎜ 트랜스웰(Costar)에 부착된 진피 등가체를 1시간 동안 DMEM과 2M 글리세롤 25 mL에 침액시킴으로서 동결방지제로 관류했다. 페트리 디쉬를 10%CO₂가스 용기에서 1시간 동안 70rpm에서 오비탈 쉐이커(Bellco)에 놓았다. 진피 등가체를 관류시킨후, 페트리 디쉬, 진피 등가체, 트랜스웰 및 세포외 동결 배지를 20.0℃의 시작 온도에서 프로그램할 수 있는 냉동고(Planer)에 놓았다. 챔버를 -10.0℃/분으로 -6. 0℃까지 냉각했다. 챔버 온도로 평형을 맞추기 위해 20분 동안 -6.0℃에서 온도를 유지했다. 20분 동안의 유지후, 액체 질소로 얼린 프로우브를, 냉동 배지 아래에서 디쉬의 바깥쪽과 접촉시킴으로써 세포외 얼음이 시작되었다. 모든 진피 등가체가 얼음 결정으로 종정형성된후, 온도를 -6.0℃에서 추가로 5분 동안 유지했다. 이어서 챔버를 -1.0℃/분으로 -8.0℃까지 냉각했다. 이어서 시료 전체에 얼음이 일정하게 분배되도록 챔버 온도를 30분 동안 -8.0℃에서 유지했다. 이어서 진피등가체 유니트를 -0.1℃/분으로 -70.0℃의 최종 온도까지 냉각했다.

동결 보존된 진피 등가체를 냉동고에서 제거하고 디쉬의 뚜껑을 제거했다. 해동을 위해, 따뜻한(37℃) DMEM 40 mL을 무균적으로 각 페트리 디쉬에 부었다. 45초 후에, 모든 액체를 디쉬로부터 제거하고 부가적인 40 mL을 2분 동안 각 디쉬에 첨가했다. 모든 얼음이 녹은 후, 진피 등가체를 30분 동안 DMEM 25 mL로 세척했다. 배지를 부가적인 30분 동안 다시 교환했다. 트랜스웰에 부착된 진피 등가체를 배양 디쉬로 옮기고 분석에 앞서 24시간 동안 37℃/10%CO₂에서 배양 보존 배지에서 배양했다. 배양 시간은 냉동 세포가 정상 상태 조건을 재수립하는 데 일반적으로 걸리는 시간 동안 허용되었다. 시료를 MTT분석 프로토콜을 이용해 분석했다.

실시예 6: 각막 등가체의 동결 보존

24 ㎜ 배양 트랜스웰(Costar)에 부착된 각막 등가체를 습윤 공수후 9일째에 여섯 웰짜리 디쉬(Costar)에 놓았다. 동결방지제로 각막 등가체를 관류시키는 방법은 각 각막 등가체와 트랜스웰을 여섯 웰짜리 디쉬에서 1시간 동안 4 mL의 세포외 동결 배지에 침액시키는 것이었다. 각막 구조체를 함유한 여섯 웰짜리 디쉬를 10%CO₂가스 용기에서 1시간 동안 70rpm의 오비탈 쉐이커(Bellco)에 놓았다. 각막 등가체를 관류시킨후, 각막 등가체, 트랜스웰 및 세포외 냉동 배지를 함유한 페트리 디쉬를 20.0℃의 시작 온도에서 프로그램할 수 있는 냉동고(Planer)에 놓았다. 각막 등가체를 -10.0℃/분으로 -6.0℃까지 냉각했다. 챔버 온도로 평형을 맞추기 위해 20분 동안 -6.0℃에서 온도를 유지했다. 20분 동안의 유지후, 액체 질소로 얼린 프로우브를, 냉동 배지 아래에서 플레이트의 각웰의 바깥쪽과 접촉시킴으로써 세포외 얼음이 시작되었다. 모든 각막 등가체가 얼음 결정으로 종정형성된 후, -1.0℃/분으로 -8.0℃까지 냉각하기 전에 온도를 -6.0℃에서 추가로 5분 동안 유지했다. 이어서 시료 전체에 얼음이 일정하게 분배되도록 온도를 30분 동안 -8.0℃에서 유지했다. 각막 구조체 유니트를 -0.1℃/분으로 -70.0℃의 최종 온도까지 냉각했다.

동결 보존된 각막 등가체를 냉동고에서 제거했다. 디쉬의 뚜껑을 제거했다.해동을 위해, 따뜻한(37℃) DMEM 6 mL을 무균적으로 플레이트의 각 웰에 부었다. 45초 후에, 모든 액체를 디쉬로부터 제거하고 부가적인 6 mL을 2분 동안 디쉬에 첨가했다. 살균된 핀셋을 이용해 각막 등가체와 부착된 트랜스웰을 새 디쉬로 옮겼다. 세척하기 위해 4 mL의 DMEM을 30분 동안 각 웰에 첨가했다. 배지를 부가적인 30분 동안 다시 교환했다. 이어서 각막 등가체를 동일한 배양 디쉬로 옮기고 분석에 앞서 24시간 동안 37℃/10%CO₂에서 각막 보존 배지에서 항온처리했다. 배양 시간은 냉동 세포가 정상 상태 조건을 재수립하는 데 일반적으로 걸리는 시간 동안 허용되었다. 시료를 MTT분석 프로토콜을 이용해 분석했다.

실시예 7: 수집된 쥐 피부의 동결 보존

야생형 마우스, B6CB6YF1 계통을 넴부탈(Nembutal) 과량 투여에 의해 죽였다. 피부를 무균적으로 수집했다. 과다한 혈관, 지방 및 결합 조직을 진피에서 제거했다. 쥐 피부를 1cm x 2 cm 직사각형 조각으로 잘랐다. 이어서 쥐 피부 조각을 100 ㎜ 페트리 디쉬(Costar)내의 75 ㎜ 트랜스웰(Costar)에 놓았다. 쥐 피부를 한시간 동안 100 ㎜ 페트리 디쉬에서 DMEM내의 2M 글리세롤 25 mL에 침액시킴으로써 동결방지제로 관류시켰다. 관류동안, 쥐 피부와 트랜스웰을 함유한 페트리 디쉬를 한 시간 동안 10%CO₂가스 용기에서 70rpm의 오비탈 쉐이커(Bellco)에서 흔들었다. 컨트롤인, 비동결 보존된 마우스 피부를 피부 이식전에 동결 보존과 해동 과정의 기간동안(2일) 4℃에서 영양 배지에서 유지했다. 쥐 피부를 관류시킨후, 쥐 피부, 트랜스웰 및 세포외 냉동 배지를 함유한 페트리디쉬를 20.0℃의 시작 온도에서 프로그램할 수 있는 냉동고(Planer)에 놓았다. 쥐피부를 -10.0℃/분으로 -6.0℃까지 냉각하고 챔버 온도로 평형을 맞추기 위해 20분 동안 -6.0℃에서 온도를 유지했다. 20분 동안의 유지후, 액체 질소로 얼린 프로우브를 디쉬의 바깥쪽과 접촉시킴으로써 세포외 얼음이 시작되었다. 접촉 부위는 동결배지 아래여야 한다. 모든 쥐 피부가 얼음 결정으로 종정형성된 후, -1.0℃/분으로 -8.0℃까지 냉각하기전에 온도를 -6.0℃에서 추가로 5분 동안 유지했다. 시료 전체에 얼음이 일정하게 분배되도록 온도를 30분 동안 -8.0℃에서 유지했다. 이어서 유니트를 -0.1℃/분으로 -70.0℃의 최종 온도까지 냉각했다.

동결 보존된 쥐 피부를 냉동고에서 제거하고 디쉬의 뚜껑을 제거했다. 해동을 위해, 따뜻한(37℃) DMEM 40 mL을 무균적으로 각 페트리 디쉬에 부었다. 45초후에, 모든 액체를 디쉬로부터 제거하고 부가적인 40 mL을 2분 동안 각 디쉬에 첨가했다. 모든 얼음이 녹은후, 쥐 피부를 디쉬에서 DMEM 25 mL로 30분 동안 세척했다. 부가적인 30분 동안 배지를 갈았다.

녹인 동결 보존된 시료와 컨트롤 시료를 조직학을 위해 가공하거나 마우스에 이식했다. 동결 보존된 마우스 피부와 비교한 비동결 보존된 마우스 피부의 광현미경 사진은 마우스 피부의 네 가지 기본적인 특징인, 섬유아세포를 가진 진피, 표피의 기저층, 표피의 상기저층 및 표피의 층상 각질층이 이 방법에 의해 보존됨을 보여주었다. 모든 층은 그대로였고 동결 보존된 마우스 피부의 전체적인 형태는 비동결 보존된 마우스 피부와 동일했다.

실시예 8: ATS SKIN2(상표명)의 동결 보존

SKIN2(상표명), 모델 ZK 1300(Advanced Tissue Sciences, La Jolla, CA)을 도착하자마자 선적 삽입물에 따라 포장으로부터 제거하고 배양 디쉬(Costar)에 놓았다. 피부 구조체가 잠기도록하기 위해 트랜스웰 삽입물을 SKIN2(상표명)위에 놓았다. SKIN2(상표명)를 배양 디쉬에서 DMEM내의 2M 글리세롤에 한 시간 동안 침액시킴으로써 동결방지제로 관류시켰다. 관류동안, 구조체와 트랜스웰을 함유한 배양 디쉬를 10%CO₂가스 용기에서 1시간 동안 70rpm의 오비탈 쉐이커(Bellco)에서 흔들었다. SKIN2를 관류시킨 후, 유니트를 20.0℃의 시작 온도에서 프로그램할 수 있는 냉동고(Planer)에 놓았다. SKIN2 유니트를 -10.0℃/분으로 -6.0℃까지 냉각시키고 챔버 온도로 평형을 맞추기 위해 20분 동안 -6.0℃에서 온도를 유지했다. 20분 동안의 유지후, 액체 질소로 얼린 프로우브를, 냉동 배지 아래에서 디쉬의 바깥쪽과 접촉시킴으로써 세포외 얼음이 시작되었다. 모든 SKIN2 유니트가 얼음 결정으로 종정형성된 후, 온도를 -6.0℃에서 추가로 5분 동안 유지했다. 이어서 챔버 온도를 -1.0℃/분으로 -8.0℃까지 냉각했다. 이어서 시료 전체에 얼음이 일정하게 분배되도록 SKIN2 유니트를 30분 동안 -8.0℃에서 유지했다. 이어서 SKIN2 유니트를 -0.1℃/분으로 -70.0℃의 최종 온도까지 냉각했다.

동결 보존된 SKIN2를 냉동고에서 제거하고 디쉬의 뚜껑을 제거하고 따뜻한(37℃) DMEM을 무균적으로 각 배양 디쉬에 부었다. 45초 후에, 모든 액체를 디쉬로부터 제거하고 부가적인 DMEM을 2분 동안 각 디쉬에 첨가했다. 일단 녹으면, SKIN2(상표명) 유니트와 부착된 트랜스웰을 멸균된 핀셋을 이용하여 새 배양디쉬로 옮겼다. SKIN2(상표명)에서 동결방지제를 제거하기 위해, DMEM을 SKIN2(상표명)를 함유한 각 배양 디쉬에 30분 동안 첨가했다. 배지를 부가적인 30분 동안 갈았다. 이어서 SKIN2(상표명) 유니트를 동일한 유형의 배양 디쉬로 옮기고 분석에 앞서 24시간 동안 37℃/10%CO₂에서 배양 보존 배지에서 항온처리했다. 다시, 항온처리 시간은 냉동된 세포가 정상 상태 조건을 재수립하는데 일반적으로 걸리는 시간이 허용되었다.

동결 보존된 구조체와 컨트롤 구조체를 그 제품에 동봉된 SKIN2(상표명) 모델 ZK1300의 MTT분석 프로토콜에 따라 분석하고, 조직학적 평가를 했다. 동결 보존된 SKIN2(상표명)와 비동결 보존된 SKIN2(상표명)의 광현미경 사진은 SKIN2(상표명)의 네 가지 기본적인 특징, 섬유아세포를 가진 콜라겐 격자, 표피의 기저층, 표피의 상기저층 및 표피의 층상 각질층이 이 방법에 의해 모두 보존됨을 보여주었다. 모든 층은 그대로였으며 동결 보존된 SKIN2(상표명)의 전체적인 형태는 비동결 보존된 SKIN2(상표명)와 유사했다.

실시예 9: 대사적 마이토콘드리아 활성 분석(MTT)

동결과 비동결(컨트롤) LSE, 표피 시트, 진피 등가체 및 각막 등가체를 MTT분석을 이용해 시험했다. [SKIN2(상표명)구조체를 선적 삽입물과 동봉된 "모델 ZK1300에 이용하기 위한 MTT 분석 프로토콜"에 따라 분석했다.] 구조체의 세포 생존 능력을, 세포 성장과 생존 능력을 측정하기 위해 개발된 비색 MTT 전환 분석인 MTT 분석을 이용해 측정했다. 이 분석은 게이(Gay) 등의 "The Living SkinEquivalent as a Model In Vitro for Ranking the Toxic Potential of Dermal Irritants," Toxic.in Vitro, 6:303-315(1992)에서 개시된다. 가용성 테트라졸륨염의 푸른 포마잔 침전물로의 대사적 환원은 본래의 마이토콘드리아 기능을 가진 살아있는 세포의 존재에 의존한다. 이 분석은 배양된 인체 각질 세포를 포함하는 다양한 세포 유형에서 세포 독성을 정량하기 위해 이용된다.

LSE, 표피 시트 및 진피 등가체를 함유한 배양 디쉬에, 분석 배지 40 mL을 첨가하고 각막 등가체를 함유하는 웰에 0.33 ㎎/mL MTT(Sigma Chemical Co., St.Louis, MO)를 함유한 분석 배지 1.5 mL을 첨가했다. 조직 등가체를 3-4시간 동안 MTT분석 배지에서 배양했다. 전환 기간의 마지막에, 조직 등가체를 8- ㎜ 직경 피부 생검 펀치를 이용해 생검했다. 이어서 펀치 생검을 상온에서 두 세 시간 동안 0.3 mL 이소프로판올에서 추출하고, 0.04N HCl로 산성화했다. 추출 기간의 마지막에, 각 추출물 0.2 mL을 96-웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 블랭크로 이소프로판올 추출 배지를 이용하여 570nm에서 플레이트 해독기(Dynatech)로 흡광도를 읽었다. 해동한 동결 보존된 시료로부터 얻은 MTT값을 상응하는 컨트롤 시료와 비교하여 컨트롤의 비율의 개념으로 표현했다(도 9).

실시예 10: 락토오즈 디하이드로게나제 분석(LDH)

LDH는 살아있는 세포에서 일반적으로 발견되는 효소이다. 세포에의 손상은 상기 효소의 방출을 야기하고 이 분석에서 검출되는 효소 활성의 감소를 야기한다.

LSE의 해동된 동결 보존된 시료와 컨트롤 시료를 8 ㎜ 직경 피부 생검 펀치로 구멍을 뚫었다. 세 시료를 각 LSE 유니트로부터 취했다. 펀치 시료를 0.1M 트리에탄올아민 완충액 1 mL을 가진 15 ㎜ 튜브에 놓고 전기 조직 균질기로 1분 동안 균질화했다. 이어서 시료를 4.0℃에서 1000g에서 원심분리했다. 이어서 상등액을 분석했다. 하기를 함께 섞어서 LDH 칵테일 시약을 준비했다: 3.00 mL 인산 완충액(0.1mol/l;pH 7.0), 0.1 mL 피루브산, 나트륨염(2.5 ㎎/mL), 및 0 05mL NADH, 나트륨염(10 ㎎/mL).시료 상등액 100㎕를 시약 900㎕에 첨가하고 2분 동안 반응시켰다. 2분 동안 흡광도의 변화를 기록했다. 동결 보존된 LSE 유니트당 세 시료의 평균을 비동결된 컨트롤과 비교했다. 시료 값을 상응하는 컨트롤 값과 비교하고 컨트롤의 비율로 표현했다(도 9).

실시예 11: 비동결 보존된 LSE에 대한 동결 보존된 LSE의 생물동가

동결 보존된 LSE와 비동결 보존된 LSE의 생물동가를 증명하기 위해, 무흉선 마우스에 대한 이식 연구를 수행했다.

실시예 1에서 개괄된 방법에 따라 동결 보존된 LSE 유니트를 이식 하루전에 해동하고 24시간 동안 보존 배지에서 회복시켰다.

B6CB6YF1/J-nu 계통(Jackson Harbor Labs)의 무흉선 마우스 66마리를 동결 보존된 LSE로(n=43) 또는 비동결 보존된(컨트롤)LSE로(n=23) 이식하는 네 실험을 수행했다. 동물을 넴부탈로 죽였다. 근육층을 떼어내면서, 2 x 2 cm 전체 두께 피부 절편을 각 마우스의 배로부터 잘라냈다. 컨트롤 또는 동결 보존된 LSE 이식편을 상처에 놓고 맞도록 잘랐다. 모든 이식편을 페트롤라툼으로 포화된 가제(vendor) 한 층을 입히고 두 개의 접착 붕대로 덮었다. 이식 후 7일째에 붕대를 제거했다.

이식후 14일 째에, 모든 동물을 죽이고 사진을 찍었다. 조직학적 검사와 평가를 위해 이식 부위를 잘라냈다. 전체 사진과 현미경 사진은 컨트롤 LSE 또는 해동된 동결 보존된 LSE 사이에서 이식편 통합에서 아무런 차이도 보이지 않았다. 컨트롤 또는 동결 보존된 이식편 사이에서 상처 연축의 속도에서 큰 차이가 나지 않았다.

실시예 12: 동결 보존된 마우스 피부와 컨트롤 마우스 피부의 친연성 피부 이식

동결 보존된 마우스 피부와 비동결 보존된 마우스 피부의 생물동가를 증명하기 위해 친연성 피부 이식 연구를 수행했다.

야생형 마우스, B6CB6YF1 계통을 넴부탈 과다투여로 죽였다. 피부를 무균적으로 수집했다. 과다한 혈관, 지방 및 결합 조직을 피부 이식을 위한 준비에서 진피로부터 제거했다. 마우스 피부를 실시예 7의 방법에 따라 동결 보존하고 해동했다. 컨트롤, 비동결 보존된 마우스 피부를 피부 이식전에 동결 보존과 해동 과정이 지속되는 2일동안 4℃에서 영양 배지에 유지했다.

동일한 계통의 마우스 6마리가 피부 이식을 받았는데, 두 마리는 컨트롤인, 비동결 보존된 마우스 피부를, 그리고 네 마리는 해동된, 동결 보존된 마우스 피부를 이식받았다. 마우스를 넴부탈로 죽였다. 근육층을 떼어내면서, 2 x 2 cm 전체 두께 피부 절편을 각 마우스의 배로부터 잘라냈다. 컨트롤 또는 동결 보존된 마우스 피부 이식편을 상처에 놓고 맞도록 잘랐다. 모든 이식편을 페트롤라툼으로 포화된 가제(vendor) 한 층을 입히고 두 개의 접착 붕대로 덮었다. 이식후 7일째에붕대를 제거했다.

이식후 30일째에, 모든 동물을 죽이고 사진을 찍었다. 이어서 이식 부위를 조직학적 분석과 평가를 위해 잘랐다. 전체 사진과 현미경 사진은 컨트롤 마우스 피부 또는 해동된, 동결 보존된 마우스 피부 사이에서 이식편 통합에서 아무런 차이도 보이지 않았다. 컨트롤 또는 동결 보존된 이식편 사이에서 상처 연축의 속도에서 큰 차이가 나지 않았다.

전술한 발명이 명확한 이해를 돕기 위해 예시의 방식으로 약간 상세하게 설명되었지만, 일부 변화와 수정이 청구항의 범위내에서 이루어질 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.

Claims

(a) 수집된 포유 동물 조직 또는 배양된 조직 등가체(等價體)를 동결 방지제 용액에 침액시키고, 상기 동결 방지제 용액과 상기 침액된 조직을 교반하여 상기 동결 방지제 용액을 상기 조직중에 효율적으로 투과시켜 관류된 조직을 얻는 단계;

(b) 상기 동결 방지제 용액과 관류된 조직에서 세포외 얼음의 종정(種晶)을 형성시키는 단계;

(c) 단계 (b)의 관류된 조직을 느린 동결 속도로 약 -70℃ 또는 그 이하의 온도로 동결시켜 동결 보존된 상태로 냉각시킴으로써 동결 보존된 조직을 얻는 단계;

(d) 상기 동결 보존된 조직을 약 -70℃ 또는 그 이하의 온도에서 저장하는 단계를 포함하는 수집된 포유 동물 조직 또는 배양된 조직 등가체의 동결 보존 방법.
제1항에 있어서, 단계 (a)중의 상기 침액 단계는 약 20℃의 시작 온도에서 수행되고, 이어서 관류중에, 약 -10℃/분의 속도로 약 -6℃까지 냉각되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)중의 동결은 -1℃/분의 속도로 약 -8℃의 온도까지 수행되고, 상기 조직내에서 상기 동결 방지제 용액의 물리적 및 생물학적 평형을허용하기에 충분한 시간 동안 유지되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 단계 (c)중의 온도는 상기 조직내에서 상기 동결 방지제 용액의 물리적 및 생물학적 평형을 허용하기에 충분한 시간 동안 일정하게 유지되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 냉각은 약 -70℃ 또는 그 이하의 온도까지 약 -0.3℃/분 내지 -0.02℃/분의 속도로 계속되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 수집된 포유 동물 조직이 수집된 포유 동물 피부인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양된 조직 등가체는 배양된 표피 등가체, 배양된 진피 등가체 및 배양된 각막 등가체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 동결 보존된 상태의 상기 온도가 -120℃ 또는 그 이하 내지 -196℃ 또는 그 이하인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 동결 방지제 용액은 둘베코 변형 이글 배지(Dulbeco's Modified Eagle's Medium)(DMEM) 기제중의 1.5M 내지 2.5M 글리세롤인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 유리화된 조직(vitrified tissue)을 해동시키는 단계를 더 포함하며, 상기 조직은 약 1분 내지 약 2분 내에 해동되는 방법.
측벽 및 플랜지와 연속되어 있는 바닥 표면을 포함하고, 상기 측벽은 측벽으로부터 안쪽으로 신장하며 상기 측벽과 통합된 지지체가 있는 쟁반;

본질적으로 관상인 지지체의 한 쪽 말단에 부착된 평평한 투과성 막과 상기 관상 지지체의 반대쪽 말단에 테(rim)가 있고, 상기 테는 상기 쟁반의 안쪽으로 신장된 지지체에 의해 지지되는 담체;

측벽 및 플랜지와 연속적인 평면 바닥 표면을 포함하고, 상기 플랜지는 상기 쟁반의 플랜지와 접촉하는 뚜껑; 및

상기 쟁반과 상기 뚜껑 사이의 시일을 포함하는 수집된 포유동물 조직 또는 배양된 조직 등가체의 동결 보존 장치.