MXPA03006063A - Metodo y sistema para preparar muestras de tejidos para examenes histologicos y patologicos. - Google Patents
Metodo y sistema para preparar muestras de tejidos para examenes histologicos y patologicos.Info
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Abstract
El material biologico viable se preserva criogenicamente (criopreservacion) sumergiendo el material en un tanque de fluido refrigerante, y haciendo circular el fluido refrigerante a traves del material a una velocidad y temperatura predeterminadas, substancialmente constantes para congelar el material. El material puede ser remojado directamente en el fluido refrigerante sin preparacion, o preparado quimicamente antes del congelamiento. Un metodo de acuerdo con la presente invencion congela el material biologico con bastante rapidez para evitar la formacion de cristales de hielo dentro de las estructurales celulares (vitrificacion) y permite que las muestras Conserven la estructura anatomica y la actividad bioquimica despues de descongeladas. La temperatura del fluido refrigerante preferentemente es entre -20 degree C y -3 degree C, la cual es bastante caliente para reducir al minimo la formacion de fracturas por estres y otros artefactos en las membranas celulares por cambios termicos, las celulas congeladas utilizando un metodo de acuerdo con la presente invencion han mostrado mucho menor dano celular e intracelular en comparacion con las celulas congeladas por otros metodos de criopreservacion utilizados para las tecnicas patologicas e histologicas. Debido a que la presente invencion puede congelar material biologico de modo que el material se vitrifique, no se pierde la actividad bioquimica dentro de la celula despues del congelamiento y de este modo es posible emplear diversas modalidades del metodo presente en un sistema para preparar el material biologico para las tecnicas novedosas de criopatologia e inmunohistoquimica en las areas de investigacion y atencion a los pacientes.
Description
MÉTODO Y SISTEMA PARA PREPARAR MUESTRAS DE TEJIDOS PARA EXAMENES HISTOLÓGICOS Y PATOLÓGICOS
REFERENCIA A LA SOLICITUD RELACIONADA
Esta solicitud reclama el beneficio de acuerdo con el titulo 35 del C. E. U. A. § 119 de la siguiente solicitud de patente provisional de Estados Unidos Serie No. 60/259,418, titulada "Método y sistema para preparar muestras de tejidos para exámenes histológicos y patológicos", que fue presentada el 2 de enero 'de "2001. "
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere, en general, a la preservación criogénica y, más específicamente, a un método de preservación para propósitos de " exámenes y diagnóstico.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Los materiales biológicos como tejidos son objeto de diferentes tratamientos en un laboratorio histológico para preparar muestras sobre portaobjetos para observar en el microscopio. Los patólogos examinan cuidadosamente los portaobjetos en forma de sus hallazgos, lo cual ayuda a los médicos en el diagnóstico de enfermedades o procesos de enfermedad. La histopatologia ha dependido tradicionalmente del examen de muestras preparadas por uno o dos métodos fundamentales . En el primer método histológico, las muestras sufren procesamiento importante en el laboratorio, como la fijación para preservar tejidos, deshidratación para eliminar agua de los tejidos, infiltración con agentes de incrustación como parafinas, incrustación, seccionamiento o cortado de secciones de tejido para la colocación sobre un portaobjetos, el montaje de las secciones y tinción de las secciones para mejorar los detalles. El segundo método, la preparación criogénica, reduce de manera importante el procesamiento del primer método en cuanto a que por lo regular incluye el congelamiento instantáneo en un ambiente liquido frió, el corte en secciones, montaje y tinción.
Aunque el primer método produce visualización significativamente superior, necesita un tiempo prolongado para el procesamiento, por lo regular un mínimo de 18 a 24 horas. De este modo, este método no se puede aplicar en situaciones donde es necesario un diagnóstico rápido de un proceso patológico como durante un procedimiento quirúrgico. Además, las técnicas de procesamiento empleadas pueden destruir toda o parte de la actividad biológica de los tejidos.
El segundo método tiene la ventaja de la velocidad
(de 30 minutos a una hora) , no obstante, los especímenes titulares preparados utilizando la preparación criogénica con frecuencia son objeto de daño celular debido a la formación de cristales de hielo que también pueden causar la pérdida de la función biológica de moléculas que interesen dentro de los tejidos, y pérdida' general de la integridad del tejido manifestada como dañó a la estructura anatómica. Múltiples laboratorios patológicos comerciales estimulan el uso del tejido congelado para la inmunohistoquímica en todas menos las circunstancias especiales, porque la formación de cristales de hielo en tejidos almacenados ocasiona múltiples artefactos anormales dentro de la muestra que pueden dificultar mucho la interpretación diagnóstica o incluso' hacerla imposible en algunos casos.
Con la llegada de anticuerpos poli- y luego monoclonales , el enfoque de la histología y patología microscópica tradicional se ha desplazado desdé la observación subjetiva sencilla hasta procedimientos de tinción objetivos, directos. Estas nuevas técnicas inmunohístoquímicas (IHC) ayudan a determinar diagnósticos cuando la histopatologia sola es no concluyente. No obstante, las técnicas IHC dependen de los receptores biológicamente intactos dentro de los ejemplares para que ocurra tinción adecuada. Por tanto, seria conveniente utilizar un método de preparación de muestras de tejidos que no limite la cantidad de material biológico activo presente después de llevar a cabo la preparación.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
Por tanto, lo que se necesita es un modo mejorado para preservar criogénicamente células individuales viables, tejidos, órganos, ácidos nucleicos u otras moléculas con actividad biológica, que evite al menos algunos de los problemas inherentes en ' los métodos actualmente disponibles. Por consiguiente, la presente invención proporciona un método de criopreservación para congelar muestras de tejido con actividad biológica sumergiendo la muestra en un fluido refrigerante y haciendo circular el fluido refrigerante más allá del material. Se hace circular el fluido refrigerante más allá de la muestra de tejido a una velocidad y temperatura predeterminadas, prácticamente constantes para congelar la muestra de tejido de modo que se vitrifique, pero que la muestra de tejido mantenga su estructura anatómica y conserve su actividad biológica después de descongelada. En al menos una modalidad, el fluido refrigerante se mantiene a una temperatura entre aproximadamente -20 °C y -30 °C, y la velocidad del fluido refrigerante que atraviesa la muestra biológica es aproximadamente 35 litros por minuto por pie del fluido refrigerante a través de un área no mayor que aproximadamente 24 pulgadas de ancho y 48 pulgadas de profundidad. Además, al menos una modalidad "de la presente invención sumerge una muestra de tejido con actividad biológica en el fluido refrigerante para congelar la muestra directamente a una temperatura mayor que aproximadamente -30 °C. Otra modalidad de la presente invención propone hacer circular el fluido refrigerante a través de un serpentín intercambiador de calor de múltiples vías sumergido en el fluido refrigerante, donde el serpentín intercambiador de calor puede eliminar al menos alguna cantidad de calor del fluido refrigerante conforme el fluido refrigerante se retira de la muestra de tejido. Al menos una modalidad proporciona un sistema para llevar a cabo los métodos antes mencionados.
Un objetivo de al menos una modalidad de la presente invención es la aplicación de un método para congelar material biológico en donde se evita la formación de cristales de hielo y fracturas por estrés, y se mantiene la función bioquímica celular después del congelamiento.
Una ventaja de al menos una modalidad de la presente invención es que aumentan significativamente las tasas de recuperación de la criopreservación debido a que el material biológico se vitrifica durante el congelamiento.
Otra ventaja de al menos una modalidad de la presente invención es que se mejoran las 'tasas de recuperación de la criopreservación porque el material biológico se vitrifica a una temperatura bastante' elevada para evitar la formación de fracturas por estrés dentro de las membranas celulares.
Otra ventaja de al menos una modalidad de la presente invención es que las tasas de recuperación' de la criopreservación son tales que un porcentaje considerablemente mayor del material biológico conserva su estructura anatómica y conserva su actividad biológica después del descongelamiento en comparación con los métodos disponibles en la actualidad.
Otra ventaja de al menos una modalidad de la presente invención es que las tasas de recuperación de la criopreservación son tales que las propias muestras de material biológico se prestan a la aplicación del seccionamiento, procesamiento y examen histológico, ultraestructural e inmunohistoquímico ulterior en periodos de tiempo más cortos que las técnicas patológicas tradicionales, acortando de este modo el tiempo para los resultados.
Otra ventaja de al menos una modalidad de la presente invención es que una vez congelados, es posible utilizar las instalaciones de almacenamiento y mecanismos de criopreservación existentes para almacenar los materiales biológicos congelados.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Otros objetivos, ventajas, peculiaridades y características de la presente invención, asi como los métodos, operación y funciones de los elementos de estructura relacionados, y la combinación de partes y economía de la fabricación, serán evidentes tomando en cuenta la siguiente descripción y las reivindicaciones con referencia a los dibujos acompañantes, todos los cuales forman una parte de esta especificación, en donde números de referencia iguales designan partes correspondientes de las diferentes figuras, y en donde:
La Figura 1 es una vista lateral de un aparato enfriador para practicar un método de acuerdo con al menos una modalidad de la presente invención;
La Figura 2 es una vista de un corte transversal del aparato enfriador ilustrado en la Figura 1 indicando la instrumentación de los sistemas de enfriamiento convenientes para congelar cantidades relativamente grandes de material biológico;
La Figura 2A es una vista de un corte transversal del aparato enfriador mostrado en la Figura 1, configurado para uso con un transportador en espiral de acuerdo con una modalidad de la presente invención;
La Figura 3 es un diagrama de flujo que ilustra un sistema instrumentado de acuerdo con al menos una modalidad de la presente invención;
La Figura 4 es una gráfica de barras que muestra los resultados de comparaciones experimentales entre los diferentes métodos de congelamiento de la técnica anterior y un método de congelamiento de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención;
La Figura 5 ilustra vistas, como se observa a través de un microscopio, de la apariencia morfológica de tejido de vides no crioprotegido después de ciclos de congelamiento-descongelamiento del método de nitrógeno líquido y el método de congelamiento de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención;
La Figura 6 ilustra vistas, como se puede observar a través de un microscopio, de lá apariencia morfológica del tejido cardiaco después de congelamiento utilizando las técnicas criopreservadoras normales, y ' después de aplicación del método de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención; y
La Figura 7 es una vista en microscopio electrónico que ilustra las características ultraestructurales complejas como las mitocondrias celulares que se pueden observar después ' 'de la aplicación del método de acuerdo con la modalidad preferida de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCIÓN
En la siguiente descripción detallada de las modalidades preferidas se hace referencia a los dibujos acompañantes que forman una parte de ésta, y en los cuales se muestra como ilustración las modalidades preferidas especificas en las cuales se puede practicar la invención. Estas modalidades están descritas con suficiente detalle para permitir a los expertos en la técnica practicar la invención, y se debe entender que es posible utilizar otras modalidades y que los cambios lógicos, mecánicos, químicos y eléctricos pueden hacerse sin apartarse del espíritu o alcance de la invención. Para evitar detalles no necesarios para permitir a los expertos en la técnica practicar la invención, la descripción puede omitir cierta información conocida para el trabajador experto. Por tanto, la siguiente descripción detallada no debe tomarse en un sentido limitante, y el alcance de la presente invención se define solo por las reivindicaciones anexas.
Primero con referencia a las Figuras 1 y 2, un aparato enfriador conveniente para practicar un método de acuerdo con al menos una modalidad de la presente invención está descrito, y designado en general como unidad refrigerante 100. La unidad refrigerante 100 preferentemente consiste en el tanque 110 que contiene fluido refrigerante 140. Sumergido en el, fluido refrigerante 140 están los circuladotes 134 como motores 130 que tienen propulsores 132, serpentín intercambiador de calor 120 y un anaquel 150 que en una modalidad contiene bandejas 155 para soportar el material biológico que va a ser congelado. El material biológico puede incluir, pero no se limita a, células individuales viables, tejidos y órganos, ácidos nucleicos y otras moléculas con actividad biológica. No es necesario que el material biológico sea específico de la especie. Fuera del tanque 110, y acoplado al serpentín intercambiador de calor 120, está la unidad de refrigeración 190."
El tanque 110 puede tener cualquier dimensión necesaria para sumergir el material biológico que va a ser congelado en un volumen del fluido refrigerante 140, en el cual las dimensiones se escalan a múltiplos de 12 pulgadas por 24 pulgadas por 49 pulgadas. Es posible emplear otros tamaños de tanque consistentes con las enseñanzas establecidas en la presente. Por ejemplo, en una modalidad (no se ilustra) , el tanque 110 tiene el tamaño para contener bastante fluido refrigerante 140, de modo que recipientes como viales, tubos de ensayo, vasos de precipitados, probetas o similares, se puedan colocar en el tanque 110 para congelamiento rápido de suspensiones que incluyan materiales biológicos y crioprotectores . En otras modalidades, el tanque 110 es muy grande para sumergir completamente órganos completos y/u organismos para congelamiento rápido. Se apreciará que el tanque 110 puede hacerse más grande o más pequeño según sea necesario para albergar eficazmente los diferentes tamaños y cantidades de material biológico que va a ser congelado. El material biológico puede ser tratado con un crioprotector antes de ser sumergido en el tanque 110.
El tanque 110 contiene fluido refrigerante 140. En una modalidad, el fluido refrigerante es un soluto "grado alimenticio. Buenos ejemplos de fluidos de calidad gradó alimenticio son aquellos a base de propil'en glicol, soluciones de cloruro de sodio, o similares. En otra modalidad, el propio fluido refrigerante ' es un crioprotector como dimetilsulfóxido (DMSO) , etilen glicol, propilen glicol, polietilen glicol o similares: Observe que en algunos casos el propio crioprotector es un fluido de calidad grado alimenticio. En otras modalidades, como fluidos refrigerantes se utilizan otros fluidos y, de preferencia solutos. Aunque es posible utilizar diversos recipientes para contener el material biológico, algunas modalidades de la presente- invención proponen que el material biológico sea directamente sumergido en el fluido refrigerante para el congelamiento rápido y eficaz. Esta inmersión directa puede simplificar la criopreservación de algunos tejidos y órganos.
Para congelar material biológico evitando al mismo tiempo la formación de cristales de hielo, una modalidad de la presente invención hace circular' fluido refrigerante 140 más allá del material biológico que vá a ser congelado, a una velocidad relativamente constante de 35 litros por minuto por cada pie de fluido refrigerante contenido en un área no mayor que aproximadamente 4 pulgadas de ancho por 48 pulgadas de profundidad. Se proporciona la circulación necesaria mediante uno o más circuladotes 134, como pueden ser motores 130. En al menos una modalidad de- la presente invención, los motores sumergidos 130 impulsan propulsores 132 paira hacer circular el fluido refrigerante 140 más allá del material biológico que va a ser congelado. Otros circuladores 134, incluidas diferentes bombas (no se ilustran) se pueden emplear de acuerdo con los objetivos de la presente invención. Al menos una modalidad de la presente invención aumenta el área y volumen a través de la cual se hace circular el fluido refrigerante empleando al menos un circulador 134, además de los motores 130. En modalidades que utilizan circuladores múltiples 134, el área y volumen de la circulación del fluido refrigerante se aumentan en proporción directa a cada circulador adicional que se emplee. Por ejemplo, en una modalidad preferida, se utiliza un circulador adicional por cada pie de fluido refrigerante que ha de ser circulado a través del área de no más de aproximadamente 24 pulgadas de ancho por 48 pulgadas de profundidad.
De preferencia, los motores 130 pueden ser controlados para mantener uña velocidad constante, predeterminada del flujo del fluido refrigerante 'más allá del material biológico que va a ser preservado, manteniendo al mismo tiempo una distribución uniforme dé la temperatura del fluido refrigerante dentro de +/-0.5°C en todos los puntos dentro del "tanque 110. La velocidad predeterminada, substancialmente constante del fluido refrigerante que circula más allá del material biológico proporciona una eliminación constante, medida del calor, lo cual permite la vitrificación del material biológico durante el congelamiento. En una modalidad, las propiedades del fluido refrigerante como viscosidad, temperatura, etc., se miden y procesan, y se envían señales de control a los motores 130 para aumentar o disminuir la velocidad rotacional o torque de los propulsores 132, según sea necesario. En otras modalidades, los motores 130 se construye ' para mantener una velocidad rotacional determinada sobre un intervalo de condiciones del fluido. En un caso como este, no se regula externamente el torque o velocidad de rotación de los propulsores 132 impartida por los motores 130. Cabe señalar el hecho de que no son necesarios bombas, ejes ni poleas externas para practicar una modalidad preferida de la presente invención. Los motores 130, ü otros circuladores 134, se sumergen directamente en el fluido refrigerante 140. Como resultado, el fluido refrigerante 140 no solo congela el material biológico colocado en el tanque 110, sino que el fluido refrigerante 140 también proporciona enfriamiento para los motores 130.
El serpentín intercambiador de calor 120 preferentemente es un "serpentín de múltiples vías" qué permite viajar al refrigerante a través de múltiples vías (es decir, tres o más vías) , contrario a los serpentines para ref igeraciones tradicionales en los cuales el refrigerante generalmente está limitado a una o dos vías continuas. Además, el tamaño del serpentín está en relación directa con el área del corte transversal que contiene la cantidad medida del fluido refrigerante 140. Por ejemplo, en una modalidad preferida, el tanque 110 es de 1 pie de largo, 2 pies de profundidad y 4 pies de ancho, y utiliza un serpentín intercambiador de calor 120 que es de 1 pie por 2 pies. Si se aumenta la longitud del tanque 110 a 20 pies, entonces la longitud del serpentín intercambiador de calor 120 también aumenta a 20 pies. Como resultado, el serpentín intercambiador de calor 120 se puede hacer aproximadamente 50% del tamaño de un serpentín tradicional necesario para manejar la misma carga térmica. Los circuladotes 134, como pueden 'ser los motores 130, hacen circular el fluido refrigerante enfriado 140 sobre el material biológico que va a ser congelado, y luego transportan el fluido refrigerante más caliente al serpentín intercambiador de calor 120, el cual está sumergido en el fluido refrigerante 140". En al menos una modalidad, el serpentín intercambiador de calor 120 está conectado a la unidad de refrigeración 190 que elimina el calor del serpentín intercambiador 120 y el sistema.
En una modalidad preferida, la unidad de refrigeración 190 está diseñada para coincidir con el requisito de carga del serpentín intercambiador de calor 120, de modo que el calor sea eliminado del sistema en una forma equilibrada y eficiente, dando origen a un congelamiento rápido, controlado de un material. La eficiencia de la unidad de refrigeración 190 está directamente relacionada con el método empleado para controlar presiones de succión por la alimentación eficiente o el serpentín intercambiador de calor 120 y el rendimiento eficaz de los compresores utilizados en la unidad de refrigeración 190. Esta metodología demanda el mantenimiento de tolerancias muy estrechas entre las temperaturas del refrigerante y el fluido" refrigerante 140, y entre la temperatura de condensación' y la temperatura ambiente. Estos criterios de temperatura, junto con el diseño del serpentín intercambiador de calor 120, permiten que el serpentín intercambiador de calor 120 se alimentado con mayor eficiencia, lo cual a su vez permite que el compresor sea alimentado en una ' forma equilibrada y estrechamente controlada para' lograr en exceso de 25% más funcionamiento de los compresores de Ib que se acepta como la clasificación normal del fabricante del compresor. - -
Se observa que en la modalidad que se ilustra en la Figura 1, la unidad de refrigeración 190 es un sistema de refrigeración externo, ubicado en un sitio alejado. No obstante, en otra modalidad (no se ilustra) , la unidad de refrigeración 190 está incorporada en otra sección del tanque 110. Se apreciará que diversas configuraciones para la unidad de ref igeración 190 pueden ser más o menos adecuadas para ciertas configuraciones de la unidad refrigerante 100. Por ejemplo, si el tanque 110 es extremadamente grande, puede ser deseable una unidad de refrigeración 190 separada, mientras que una modalidad portátil puede beneficiarse de una unidad de refrigeración integrada 190. Tal integración solo puede hacerse posible por las eficacias alcanzadas al implementar los principios según se establecen en la presente, y particularmente el uso de un serpentín intercambiador de calor de tamaño reducido.
En virtud de la unidad de refrigeración "190 y el serpentín intercambiador de calor 120, en una modalidad preferida, el fluido refrigerante se enfría a una temperatura de entre -20°C y -30°C, con un diferencial de temperatura a lo largo del fluido refrigerante de menos que aproximadamente +/- 0.5°C. En otras modalidades, el fluido refrigerante se "enfría a temperaturas fuera del intervalo de -20°C a -30°C para controlar la velocidad a la cual se congela una sustancia. Otras modalidades controlan la velocidad de circulación del fluido refrigerante para lograr tasas de congelamiento deseadas. De otro modo, es posible cambiar el volumen del fluido refrigerante para facilitar una velocidad de congelamiento especifica. Se observará que diversas combinaciones de velocidad de circulación del fluido ref igerante, volumen del fluido refrigerante y temperatura del fluido refrigerante se pueden utilizar para alcanzar las tasas de congelamiento deseadas.
Ahora con referencia a la Figura 2, una vista de' un corte transversal del aparato enfriador ilustrado 'en' la Figura 1 indicando la aplicación de los sistemas de enfriamiento convenientes para congelar ' cantidades relativamente grandes del material biológico; se describe una modalidad del sistema de enfriamiento 100 conveniente para congelar cantidades relativamente grandes de material biológico. Los números de referencia en la Figura 2 que son números de referencia iguales, similares o idénticos a los números de referencia de la Figura 1 indican características iguales, similares o idénticas. El tanque 110 contiene fluido refrigerante 140, en el cual se puede descender el anaquel 150. ?1 anaquel 150 se acopla de manera que se pueda mover al soporte del anaquel 210, de modo que el anaquel 150 se pueda elevar o descender para facilitar la colocación de sustancias en el tanque 110.
Durante el uso, el material biológico que va a ser congelado se coloca en las bandejas 155 del anaquel 150. Preferentemente, las bandejas 155 se construyen de alambre, malla o, de otro modo, para que el fluido refrigerante 140 pueda circular libremente sobre, por debajo y/o alrededor de los artículos colocados en estas. De preferencia, una vez que el fluido refrigerante se enfría a la temperatura deseada, el soporte del anaquel 210 desciende el anaquel 150 hacia el tanque 110 para sumergir las bandejas 155 en el fluido refrigerante 140. El descenso del anaquel 150 se puede llevar a ' cabo en forma manual o utilizando diferentes configuraciones de engranes, cadenas y/o poleas, conocidas para el trabajador experto en la técnica. Los circuladotés 134 hacen circular el fluido refrigerante 140 a través de las sustancias colocadas en las bandejas 155 para obtener un congelamiento rápido y controlado. Se apreciará que es posible emplear otros arreglos para sumergir el material biológico en el tanque 110, y que el uso de un sistema de descenso automático no es necesariamente preferido en todos los casos.
Ahora con referencia a la Figura 2?, se describe una modalidad de la presente invención que emplea un sistema transportador con trayectoria helicoidal y con múltiples filas. Como se ilustra, el transportador helicoidal 200 puede estar configurado para ajustarse dentro del tanque 110 para sumergir el material biológico en el fluido refrigerante 140. Durante el uso, una vez que el fluido refrigerante se enfria a una temperatura deseada, los materiales que van a ser congelados se alimentan hacia una alimentación de insumos 160 donde estos son tomados sobre la banda transportadora 170. El material"" viaja desde la alimentación de insumos 160 hacia el "fluido refrigerante 140 sobre la espiral descendente 175, entre el fluido refrigerante 140 sobre la espiral ascendente 176 y entre el transportador helicoidal a la alimentación de descarga 180. Como se indicó en lo anterior, el fluido refrigerante 140 preferentemente se mantiene a una temperatura predeterminada, constante, y circula a una velocidad que garantiza el congelamiento rápido y seguro del material que va a ser congelado. El tiempo que el material pasa sumergido en el fluido refrigerante 140 puede variar ajusfando la unidad de mando 230, o por otros medios convenientes. En teoría, la velocidad de la banda transportadora 170, en combinación con la temperatura y velocidad de circulación del' fluido refrigerante 140, serán ajustados de modo que exactamente la cantidad de calor deseada sea eliminada de los materiales a medida que estos viajan a través del tanque 110 sobre el sistema transportador de trayectoria helicoidal y con múltiples filas 200.
Ahora con referencia a la Figura 3, se ilustra un método de acuerdo con una modalidad de la presente invención, y se designa, en general, con el número de referencia 300. El método que se ilustra comienza en el paso 310, donde el fluido refrigerante circula a través de un serpentín intercambiador de calor. El serpentín intercambiador de calor se acopla de manera operante a un sistema de refrigeración como ya se describió-, "y- se utiliza para reducir la temperatura del fluido refrigerante conforme el fluido refrigerante circula a través del serpentín intercambiador de calor. En el paso 320, se mide la temperatura del fluido refrxgérante, y el método procede al paso 330, donde se determina si la temperatura del fluido refrigerante está dentro de un intervalo óptimo de temperatura. Este intervalo óptimo de temperatura del fluido refrigerante puede ser diferente para diferentes aplicaciones, no obstante, un intervalo de temperatura óptimo preferido para "múltiples aplicaciones es entre -20°C y -30°C.
Si se determina que la temperatura del fluido refrigerante no está dentro de un intervalo de temperatura óptiir.o, predeterminado, se realiza el paso 335. En el paso 335, el serpentín intercambiador de calor se enfria mediante una unidad de refrigeración, y el método regresa al paso 310, en el cual el fluido refrigerante circula a través del serpentín intercambiador de calor para reducir la temperatura del fluido refrigerante. De preferencia, los pasos 310, 320, 330 y 335 se realizan en forma continua hasta que el fluido refrigerante llegue al intervalo óptimo de temperatura .
La temperatura del fluido refrigerante utilizado para congelar el material biológico es un elemento importante de al menos una modalidad de la presente invención. Para lograr la vitrificación utilizando los procesos tradicionales, el material biológico por lo regular se enfriaba en nitrógeno líquido a una temperatura de -196°C. Un cambio drástico en la temperatura como este durante un periodo de tiempo muy corto congela el agua dentro de las estructuras celulares tan rápidamente que no hay oportunidad de que se formen los cristales de hielo. No obstante, el congelamiento del material biológico utilizando nitrógeno líquido puede causar fracturas por estrés en las membranas celulares, limitando de este modo la utilidad del congelamiento en nitrógeno liquido para la criopreservación. Puesto que las temperaturas que se utilizan en una modalidad preferida de la presente invención son entre -20 °C y -30 °C, se reducen al mínimo las fracturas por estrés debido a los cambios de temperatura, y se puede lograr la vitrificación con mucho menos daño a las membranas celulares .
Mientras el fluido refrigerante se enfría a la temperatura adecuada, el material biológico que va a ser congelado se puede preparar químicamente ' para el congelamiento en el paso 305. Se apreciará que los materiales que se utilizan para la patología no requieren normalmente preparación química, y el paso 305 antes mencionado remojando los materiales que van a ser congelados directamente en un fluido refrigerante es consistente con las enseñanzas establecidas en la presente. Como ya se indicó, el material biológico incluye, pero no se limita a, células individuales viables, tejidos y órganos, ácidos nucleicos u otras moléculas con actividad biológica. El material biológico no tiene que ser específico de una especie. La preparación química del material biológico puede incluir un tratamiento previo del material biológico con agentes (estabilizadores) que aumenten la viabilidad celular eliminando sustancias perjudiciales secretadas por las células durante el crecimiento o muerte celular. Los estabilizadores útiles incluyen aquellas sustancias químicas y compuestos químicos, muchos de los cuales son conocidos para el trabajador experto, que secuestren moléculas altamente reactivas y perjudiciales como los radicales con oxígeno.
La preparación química del material biológico también puede incluir un paso de acondicionamiento (no se ilustra) . Durante o en algún tiempo después del tratamiento, el material biológico que va a ser preservado se puede aclimatar a una temperatura que sea reducida de las temperaturas de cultivo, pero todavía por encima del congelamiento. Esto puede ayudar á preparar el material biológico para el proceso de criopreservación retardando el metabolismo celular y reduciendo el shock de la transición rápida de la temperatura. No obstante, se debe indicar que no se necesita un paso de aclimatación para practicar la presente invención".
En una modalidad preferida, la preparación química del material biológico para el congelamiento incluye cargar -el material biológico con un crioprotector . La carga generalmente incluye el equilibrio del material biológico en una solución de uno o más crioprotectores . Las sustancias que se utilizan durante la carga pueden ser mencionadas como agentes de carga. Los agentes de carga útiles pueden incluir uno o más agentes deshidratantes, agentes penetrantes y no penetrantes y agentes osmóticos. Los agentes penetrantes como DMSO y etilen glicol, y una combinación de agentes osmóticos penetrantes y no penetrantes como fructosa, sacarosa o glucosa, y sorbitol, manitol o glicerol pueden utilizarse. Se apreciará que es posible emplear otros criprotectores convenientes consistentes con los objetivos de la presente invención.
Después de que el fluido refrigerante alcanza una temperatura adecuada, se realiza el paso 315, en él cual el material biológico químicamente preparado se sumerge en el fluido refrigerante. Como ya se indicó el material biológico puede estar contenido en un recipiente, o se puede colocar directamente en el fluido refrigerante. El método entonces va hacia el paso 337, en el cual se utiliza un circulador, como puede ser un motor sumergido/montaje propulsor o bomba, para hacer circular el fluido refrigerante a la velocidad anteriormente descrita, a través del material biológico sumergido. Cuando el fluido refrigerante pasa por el material biológico, se elimina calor del material, el cual está a una temperatura mayor que la temperatura del fluido refrigerante, y se transfiere hacia el fluido refrigerante el cual aleja el calor del material biológico que va a ser congelado. De acuerdo con al menos una modalidad de la presente invención, se debe mantener una circulación substancialmente constante del fluido refrigerante a través del material biológico que va a ser congelado para congelar el material biológico preparado de modo que el material preparado se vitrifique.
Después de que el fluido refrigerante circula a través del material biológico que va a ser congelado, se realiza el paso 339. El paso 339 ajusta la velocidad del fluido refrigerante según sea necesario para tomar .en cuenta los cambios en la viscosidad, temperatura y similares del fluido refrigerante. De preferencia, la velocidad del fluido refrigerante se mantiene constante ajusfando la fuerza proporcionada por uno " o "más circuladores . Una vez que el material biológico ha llegado al estado congelado deseado, éste se retira como se muestra en el paso 340. Después de que el material se retira del fluido refrigerante en el paso 340 por los medios ya descritos, éste puede ser seccionado y descongelado para exámenes histológicos, ultraestructurales e inmunohistoquímicos, como puede ser la tinción con anticuerpos marcados fluorescentes.
Los pasos que se ilustran en la Figura 3 se muestran y describen en un orden secuencial. No obstante, el método que se ilustra es de una naturaleza en donde algunos o todos los pasos se realizan en forma continua, y pueden realizarse en un orden diferente. Por ejemplo, al menos una modalidad de la presente invención utiliza un solo motor circulante para hacer circular el fluido refrigerante. En una modalidad asi,' ' el " fluido refrigerante circula a través de un serpentín intercambiador de calor como en el paso 310, y a través del material biológico que va a ser preservado ' en" el' paso 337 al mismo tiempo. Además, una modalidad de la presente invención mide las temperaturas, viscosidades y otras propiedades del fluido refrigerante continuamente y otras propiedades hidráulicas del fluido refrigerante en forma continua y en múltiples lugares dentro del sistema.
En todavía otra modalidad, algunas de las propiedades del fluido refrigerante no se miden directamente. El cambio en las propiedades del fluido refrigerante se determina indirectamente a partir de la velocidad rotacional de un motor de circulación. Si el motor está girando a una velocidad más lenta, entonces es posible alimentar más energía al motor para regresar el motor a la velocidad rotacional deseada, compensando de este modo el cambio en las propiedades del fluido refrigerante. En al menos una modalidad, el motor está configurado para mantener una velocidad de rotación prácticamente constante. Esta velocidad de rotación prácticamente constante dará origen a una velocidad substancialmente constante de la circulación' del fluido refrigerante.
Se realizó una prueba de una modalidad ' de la presente invención en la cual 5 mililitros (5 mL) de agua fueron congelados en un recipiente graduado. Con el congelamiento hubo menos de 1% de aumento en el volumen total, menos que el esperado con el congelamiento tradicional. En otra prueba, se congeló hielo en láminas en un congelador tradicional, y en un sistema refrigerante de acuerdo con un método preferido de la presente invención. Después del congelamiento se examinó el hielo bajo microscopio oscuro. Como se esperaba, el hielo tradicional mostró un modelo cristalino/ mientras que el hielo congelado de acuerdo con los principios de la presente invención no mostró desplazamiento de la luz, indicando de poca a ninguna formación de cristales de hilo.
Ahora con referencia a la Figura 4, en la cual se comparan resultados experimentales de diferentes métodos de criopreservación. La gráfica de barras 400 compara el número de células individuales dadas por el uso de 4 diferentes métodos de criopreservación: B, C, D y E contra un grupo control A. No se realizó ninguna criopreservación en el grupo control A, el método B utilizó un congelador tradicional para congelar células a una temperatura de -20 °C, el método C utilizó un congelador ultra bajo para congelar células a una temperatura de -80 °C, el método D utilizó nitrógeno liquido para congelar células a una temperatura de -196 °C, y el método E utilizó una modalidad preferida de la presente invención para congelar células a una temperatura de -25 °C.
Los resultados de los experimentos, mostrados en la gráfica de barras 400, utilizaron tejido de plantas (vides sin semillas) que fueron congelados "por los métodos tradicionales anteriormente descritos, asi como por el método incorporado por la presente invención, sin ninguna forma de preparación o crioprotector . El tejido de plantas congelado fue luego descongelado y se cortaron secciones delgadas que luego fueron examinadas, no teñidas, utilizando microscopía de contraste 'de fases. Se empleó tejido de plantas en los experimentos por la grande formación del tejido por formación de cristales de hielo o porque la expansión del agua causada por el congelamiento rompería la estructura de las paredes celulares del tejido y se podría observar fácilmente. Los resultados, como se ilustran en la Figura 4, muestran claramente la superioridad del método realizado conforme con una modalidad preferida de la presente invención. Como se esperaba, el control A no mostró dañó celular. El método B, el congelador a -20 °C mostró' "daño en aproximadamente 45% de las estructuras de la- pared celular; el método C, el congelador a -80 °C, mostró daño en aproximadamente 55% de las estructuras de la' pared celular; el método D, nitrógeno líquido, mostró daño eñ aproximadamente 59% de las estructuras de la pared celular. No obstante, el método realizado de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención solo mostró aproximadamente 12.5% de daño celular.
La superioridad del método realizado de acuerdo con una modalidad preferida también se observa en la Figura 5 que ilustra vistas, como se pueden observar a través de un microscopio de contraste de fases, de la apariencia morfológica del tejido de vides no protegido. Después de ciclos de congelamiento-descongelamiento del método de nitrógeno liquido y el método de congelamiento de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención. En la Figura 5 se observa la forma y estructura alteradas del tejido indicando daño de la pared celular; el daño es considerablemente menor en el método de congelamiento-descongelamiento realizado de acuerdo con una modalidad preferida en comparación con el observado en la pista del tejido sometido a ciclos de congelamiento-descongelamiento con un método utilizando nitrógeno liquido.
Ahora con referencia a la Figura 6, se describen las pistas, según se observaron a través de un microscopio, de la apariencia morfológica del tejido cardiaco después del congelamiento utilizando las técnicas de criopreservación normales, y después de la aplicación del método de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención. La Figura 6 muestra los resultados de un experimento diferente que se realizó en muestras de tejidos recolectadas post mortem de ratones y cadáveres caninos. Las muestras de tejidos fueron recolectadas de cinco sistemas de órganos: ovario, corazón, hígado, riñon y pulmón. Los tejidos fueron preparados para histología tradicional, crioseccionamiento o examen ultraestructural utilizando las técnicas de congelamiento normal, y también siguiendo el congelamiento por el método realizado de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención. Las secciones resultantes fueron luego evaluadas por un patólogo clínico capacitado. Como se esperaba, las muestras que nunca fueron congeladas mostraron morfología superior tras la evaluación histológica. No obstante, el informe del patólogo establece que el tejido congelado de acuerdo con el método de una modalidad preferida de la presente invención estaba al menos tan bien preservado como el tejido tratado utilizando la tecnología criogénica normal, y además que algunos tipos " dé tejidos, principalmente riñon y músculo (cardiaco) mostraron notable mejoramiento en la integridad tisular cuando se congelaron de acuerdo con el método incorporado por la presente invención. La Figura 6 indica evidentemente que la técnica de criopreservación normal tiene numerosos artefactos, como puede ser "los pliegues de acordeón" 605 observados dentro de la muestra de músculo cardiaco, en comparación con la muestra de músculo cardiaco que fue sometida al método incorporado por la presente invención.
Ahora con referencia a la Figura 7, en la cual una vista en microscopio electrónico ilustra las complejas características ultraestructurales , como las mitocondrias celulares 705, observadas después de aplicación del método de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención en comparación con un control que nunca fue congelado. Las vistas al microscopio electrónico ilustradas en la Figura 7 muestran claramente poca, si es que hay alguna, diferencia entre los tejidos congelados por el método de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención y el tejido control que nunca había sido congelado. Además, los tejidos congelados por las técnicas normales de nitrógeno líquido o congelamiento mecánico (no se ilustra)" " mostraron significativamente más daño que los tejidos congelados por el método de acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención.
Como ya se mencionó, un problema principal con secciones congeladas creadas utilizando la tecnología actual es la pérdida de reacciones químicas específicas después del congelamiento. La pérdida de esta actividad prácticamente inutiliza estas muestras para las técnicas más modernas de inmunohistoquímica basadas en tinción con anticuerpos. Un experimento que fue realizado utilizando un anticuerpo marcado fluorescente (5.1H11, un NCAM humano especifico de músculo) demostró que las células satélite primarias de porcino que anteriormente eran teñidas para fluorescencia con este anticuerpo seguían fluorescentes después del congelamiento cuando fueron preparadas de acuerdo con el método de una modalidad preferida de la presente invención. Sin embargo, las células congeladas en nitrógeno liquido ya no eran fluorescentes después del descongelamiento. Los resultados de este experimento indican que el método de una modalidad preferida permitirá aplicar las técnicas novedosas de criopatología e inmunohistoquímica en las áreas de investigación y cuidados del paciente.
Debido a que la presente invención puede congelar material biológico de modo que el material " esté vitrificado, se reduce al mínimo la" formación de fracturas por estrés en las membranas celulares, y no sé pierde la actividad química dentro de la célula 'después del congelamiento, diversas modalidades de la presente invención pueden encontrar aplicación en otros campos médicos con la preparación química adecuada, como injertos de piel, almacenamiento de córneas, almacenamiento de vasos circulatorios, congelamiento de tejidos para trasplante y tratamiento a la infertilidad, asi como en la investigación de enfermedades de regeneración celular (cáncer) .
Aunque una modalidad de la presente invención se ha mostrado y descrito con detalle en la presente, junto con ciertas variantes de ésta, muchas otras modalidades diferentes que incorporen las enseñanzas de la invención pueden ser fácilmente consideradas por el trabajador experto en la técnica. Por consiguiente, la presente invención no se propone para que esté limitada a la forma especifica establecida en la presente, sino por el contrario, se propone para cubrir estas alternativas, modificaciones y equivalentes, como puedan estar razonablemente incluidas dentro del espíritu y alcance de la invención.
Claims (21)
- REIVINDICACIONES ün método que consiste en: congelar una muestra de tejido con actividad bioquímica, en donde el congelamiento incluye: sumergir la muestra de tejido en fluido refrigerante; hacer circular el fluido refrigerante a través de la muestra de tejido a una velocidad y temperatura predeterminadas, substancialmente constantes para congelar la muestra de tejido de modo que la muestra de tejido se vitrifique; y en donde: la muestra de tejido conserve su estructura anatómica y conserve la actividad biológica después de descongelamiento; descongelar la muestra de te ido; y examinar la muestra de tejido descongelada.
- El método de conformidad con la reivindicación ' 1, además consiste en seccionar la muestra de tejido.
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el examen de la muestra de tejido descongelada incluye el examen histológico.
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el examen de la muestra de tejido descongelada incluye el examen ultraestructural .
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el examen incluye el uso de examen inmunohistoquímico .
- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la inmunóhistoquimica incluye tinción con anticuerpos marcados fluorescentes .
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque más que aproximadamente 55% de la muestra de tejido no presenta daño a la estructura anatómica celular y conserva la actividad biológica después de descongelada.
- El método de conformidad con la reivindicación 1 caracterizado porque más de aproximadamente 45% de la muestra de tejido no presenta daño a la estructura anatómica celular y conserva su actividad biológica después de descongelada.
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque más de aproximadamente 85% de la muestra de tejido conserva su estructura anatómica y permanece sin daño después de descongelada.
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido refrigerante se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente -20 °C y aproximadamente -30 °C.
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la velocidad con la que el fluido refrigerante atraviesa la muestra de tejido es aproximadamente 35 litros por minuto por pie del fluido refrigerante a través de un área no mayor que aproximadamente 24 pulgadas de ancho y 48 pulgadas de profundidad.
- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el fluido refrigerante circula por medio de un montaje motor/propulsor sumergido en el fluido refrigerante.
- El método de conformidad con la reivindicación 1, además consiste en hacer circular el - fluido refrigerante a través de un serpentín intercambiador de calor de múltiples vias sumergido en el fluido refrigerante, y en donde el serpentín intercambiador de calor es capaz de eliminar el menos la misma cantidad de calor del fluido refrigerante conforme el fluido refrigerante se retira de la muestra de tej ido .
- Un método para uso en la preparación de una muestra de tejido para examen, el método consiste en: sumergir una muestra de tejido con actividad biológica en el fluido refrigerante; y congelar la muestra de tejido directamente a una temperatura mayor que aproximadamente -30 °C haciendo circular el fluido refrigerante a través de la muestra de tejido a una velocidad y temperatura predeterminadas, substancialmente constantes de modo que la muestra de tejido se vitrifique, la muestra de tejido conserva su estructura anatómica, y la muestra dé tejido sigue teniendo actividad biológica después de descongelada .
- El método de conformidad con la reivindicación 14, además consiste en seccionar la muestra de tejido.
- 16. El método de conformidad con la reivindicación 14, además consiste en descongelar la muestra de tej ido .
- 17. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el examen incluye el examen histológico.
- 18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el examen incluye el examen ultraestructural .
- 19. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el examen incluye el uso de examen inmunohistoquímico .
- 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la inmunohistoquimica incluye tinción con anticuerpos marcados fluorescentes.
- 21. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque más de aproximadamente 40% de la muestra de tejido conserva su estructura anatómica y conserva su actividad biológica después de descongelada. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque más de aproximadamente 80% de la muestra de tejido conserva su estructura anatómica y conserva su actividad biológica después de descongelada. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque más de aproximadamente 85% de la muestra de tejido conserva su estructura anatómica y permanece sin daño después de descongelada . El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el fluido refrigerante se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente -20 °C y aproximadamente -30 °C. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la velocidad con la que el fluido refrigerante pasa por la muestra de tejido es aproximadamente 25 litros por minuto por pie del fluido refrigerante a través de un área no mayor que aproximadamente 24 pulgadas de ancho y 48 pulgadas de profundidad. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el fluido refrigerante circula mediante un montaje de motor/propulsor sumergido en el fluido refrigerante. El método de conformidad con la reivindicación 14 además consiste en hacer circular el fluido refrigerante a través de un serpentín intercambiador de calor de múltiples vías sumergido en el fluido refrigerante, y en donde el serpentín intercambiador de calor es capaz de eliminar al menos la cantidad de calor del fluido refrigerante, a medida que el fluido refrigerante se retira de la muestra de tejido. Un sistema para uso en la preparación de una muestra de tejido para examen, el sistema consiste en: un depósito de fluido refrigerante configurado para recibir una muestra de tejido con actividad biológica para inmersión en el fluido refrigerante; uno o más circuladotes del fluido refrigerante configurados para hacer circular el fluido refrigerante; un serpentín intercambiador de calor para retirar calor del fluido refrigerante; una unidad de refrigeración configurada para eliminar calor del serpentín intercambiador de calor; y en donde el depósito del fluido refrigerante, uno o más circuladotes y la unidad de refrigeración cooperan para congelar la muestra de tejido directamente a una temperatura mayor que aproximadamente -30 °C haciendo circular el fluido refrigerante a través de la muestra de tejido a una velocidad y temperatura predeterminadas, substancialmente constantes, de modo que la muestra de tejido se vitrifique, la muestra de tejido mantiene su estructura anatómica, y la muestra dé tejido conserva su actividad bioquímica después de descongelada. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el examen incluye examen histológico . El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el examen incluye examen ultraestructural . El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el examen incluye el uso de examen inmunohistoquímico . El sistema de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque la inmunohistoquímica incluye tinción con anticuerpos marcados fluorescentes . El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque más de aproximadamente 40% de la muestra de tejido conserva su estructura anatómica y conserva su actividad bioquímica después de descongelada. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque más de aproximadamente 80% de la muestra de tejido conserva su estructura anatómica y conserva su actividad bioquímica después de descongelada. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque más de aproximadamente 85% de la muestra de tejido conserva su estructura anatómica y permanece sin daño. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el fluido refrigerante se mantiene a una temperatura de entre aproximadamente -20 °C y aproximadamente -30 °C. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la velocidad con la qúe el fluido refrigerante atraviesa la muestra de tejido es aproximadamente 35 litros por minuto por pie del fluido refrigerante a través de un área no mayor que aproximadamente 24 pulgadas de ancho y 48 pulgadas de profundidad. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el circulador es un montaje de motor/propulsor sumergido en el fluido refrigerante. El sistema de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el fluido refrigerante se circula a través de un serpentín intercambiador de calor de múltiples vías sumergido en el fluido refrigerante, y en donde el serpentín intercambiador de calor es capaz de eliminar al menos la misma cantidad de calor del fluido refrigerante conforme el fluido refrigerante se retira de la muestra de tejido. RESUMEN DE LA INVENCIÓN El material biológico viable se preserva criogénicamente (criopreservación) sumergiendo el material en un tanque de fluido refrigerante, y haciendo circular el fluido refrigerante a través del material a una velocidad y temperatura predeterminadas, substancialmente constantes para congelar el material. El material puede ser remojado directamente en el fluido refrigerante sin preparación, o preparado químicamente antes del congelamiento. Un método de acuerdo con la presente invención congela el material biológico con bastante rapidez para evitar la formación de cristales de hielo dentro de las estructurales celulares (vitrificación) y permite que las muestras conserven la estructura anatómica y la actividad bioquímica después de descongeladas. La temperatura del fluido réfrigérante preferentemente es entre -20°C y -30°C, la cual" es bastante caliente para reducir al mínimo la ' formación "de fracturas por estrés y otros artefactos en las mémbrarias celulares por cambios térmicos, las células congeladas utilizando un método de acuerdo con la presente invención han mostrado mucho menor daño celular e intracelular en comparación con las células congeladas por otros métodos de criopreservación utilizados para las técnicas patológicas e histológicas. Debido a que la presente invención puede congelar material biológico de modo que el material se vitrifique, no se pierde la actividad bioquímica dentro de la célula después del congelamiento y de este modo es posible emplear diversas modalidades del método presente en un sistema para preparar el material biológico para las técnicas novedosas de criopatología e inmunohistoquímica en las áreas de investigación y atención a los pacientes.
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