KR20040036683A

KR20040036683A - 조직학적 검사와 병리학적 검사를 위한 조직샘플 처리방법및 장치

Info

Publication number: KR20040036683A
Application number: KR10-2003-7008931A
Authority: KR
Inventors: 사무엘 디. 프라이엔; 죤 블라톤; 브라이언 우드; 앨런 제이. 카쎌
Original assignee: 수파칠 테크놀로지스 피티와이. 리미티드.
Priority date: 2001-01-02
Filing date: 2001-12-28
Publication date: 2004-04-30
Also published as: NO20033039D0; WO2002076203A2; BR0116669A; CA2433356A1; US20020100284A1; MXPA03006063A; IL156608A0; ZA200304949B; NO20033039L; US6615592B2; CN1685210A; US20040083741A1; WO2002076203A3; JP2004537035A; RU2003124058A; CZ20031811A3; NZ526793A; EP1381841A2; WO2002076203A9

Abstract

생존가능(viable)한 생물학적 재료는 냉각액의 탱크에 재료를 담그고, 재료를 냉동하기 위하여 미리결정된 실질적으로 일정한 속도와 온도로 냉각액이 재료를 통하여 순환하도록 함으로써 극저온적으로 보존(냉동보존)된다. 재료는 전처리 없이 냉각액에 직접적으로 담겨지거나, 또는 냉동되기 전에 화학적으로 처리될 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 세포구조(유리화) 내에 얼음결정의 형성을 피할 수 있을 만큼 신속하게 생물학적 재료를 냉동시키며, 해동된 후에도 샘플이 해부학적 구조를 유지하고 생화학적 활성이 잔존하도록 된다. 냉각액의 온도는 열적변화로 인한 세포막내의 피로파괴 및 다른 인공산물(artifact)의 형성을 최소화하기에 충분하게 따뜻한 온도인 -20℃ 와 -30℃ 사이에 있는 것이 선호된다. 본 발명에 따른 방법을 사용하여 냉동된 세포는 병리학적 및 조직학적 기술을 위하여 사용되는 다른 냉동보존 방법에 의해 냉동된 세포보다 세포 및 세포간의 손상이 현저하게 작게 나타낸다. 본 발명은 재료가 유리화되도록 생물학적 재료를 냉동할 수 있기 때문에, 세포내의 생물학적 활성은 냉동되어진 후에도 손실되지 않고, 따라서 본 발명의 방법에 의한 다양한 실시예는 연구분야나 환자진료의 분야에서 냉동병리학 및 면역조직화학의 새로운 기술에 대한 생물학적 재료의 처리를 위한 장치에서 사용될 수 있다.

Description

조직학적 검사와 병리학적 검사를 위한 조직샘플 처리방법 및 장치{METHOD AND SYSTEM FOR PREPARING TISSUE SAMPLES FOR HISTOLOGICAL AND PATHOLOGICAL EXAMINATION}

조직학 실험(histology laboratory)에서 조직(tissue)과 같은 생물학적 재료는 현미경으로 관찰되도록 슬라이드 위에 표본으로 준비되기 위하여 다양하게 처리된다. 병리학자(pathologist)는 슬라이드를 신중히 검사하고 그 결과물에 대해 보고를 하며, 이는 의사가 질병이나 질병절차를 진단하는 데 도움이 된다. 조직병리학(histopathology)은 일반적으로 두 가지 기본적인 방법 중 하나의 방법에 의해서 처리된 샘플의 검사에 의존하고 있다. 제 1 조직학적 방법에서 샘플은 예를 들어 조직을 보호하기 위한 응고(fixation), 조직으로부터 수분을 제거하기 위한 탈수(dehydration), 파라핀과 같은 내장제(embedding agent)에 의한침윤(infiltration), 슬라이드 상에 배치를 위한 조직의 절편(section)으로의 절단 또는 절편화(sectioning), 내장(embedment), 절편의 적층(mounting) 그리고 더 선명하게 하기 위한 절편의 염색(staining) 등과 같이 실험에서 두드러진 절차가 수행된다. 극저온 처리(cryogenic preparation)의 제 2 방법은 일반적으로 차가운 액체나 환경에 의한 급속냉동(snap freezing), 절편화(sectioning), 적층화(mounting) 그리고 염색을 포함한다는 점에서 제 1 방법의 절차보다 현저하게 감소된다.

제 1 방법은 현저하게 뛰어나 시각화(visualization)를 가지지만, 일반적으로 최소 18시간에서 24시간의 연장된 처리시간을 요구한다. 따라서, 이러한 방법은 예를 들어 수술절차와 같은 기간동안 병리학 처리의 신속한 진단이 요구되는 상황에서는 적용될 수 없다. 나아가, 채택된 처리기술은 조직의 생물학적 기능의 전부 또는 일부를 파괴할 수도 있다.

제 2 방법은 속도에 있어서 30분에서 1시간으로 장점을 가지고 있으나, 극저온처리(cryogenic preparation)를 이용하여 처리된 조직표본은 얼음결정의 형성으로 인하여 종종 세포의 손상을 받게 되며, 이는 조직내에서 관심이 되는 분자의 생물학적 기능의 손실의 원인이 되기도 하고, 해부학적 구조의 질이 저하되는 것처럼 조직 본래의 성질이 전체적인 손실되는 등의 원인이 될 수도 있다. 많은 상업상의 병리학 실험에서는 특별한 상황을 제외하고는 면역조직화학(immunohistochemistry)에 대해 냉동된 조직의 사용을 금하고 있는데, 이는 저장된 조직 내에서의 얼음결정의 형성이 진단학적인 해석을 어렵게 하거나 심지어 어떤 경우에는 불가능하게하는 샘플내의 수많은 비정상적인 결과(artifact)의 원인이 되기 때문이다.

다클론항체(polyclonal antibody)와 단일클론 항체(monoclonal antibody)의 도래와 더불어, 종래의 미세조직학과 병리학은 단순한 주관적 관찰(simple subjective observation)에서 직접적인 객관적 염색절차(direct objective staining procedure)로 주된 관심을 이동하였다. 새로운 면역조직화학(IHC) 기술은 조직학만으로는 어떤 결론을 얻을 수 없을 때에 진단법을 결정하는데 도움이 된다. 그러나, IHC 기술은 적절한 염색이 일어나는 표본내의 생물학적으로 접촉하는 수용체(receptor)에 의존적이다. 따라서, 전처리가 완료된 후에 존재하는 활성 생물학적 재료의 수량을 제한하지 않는 조직표본처리(tissue specimen preparation) 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

본 출원발명의 청구항은 35 U.S.C.119조에 따라, 2001년 1월 2일에 특허출원된 "조직학적 검사와 병리학적 검사를 위한 조직샘플 처리방법 및 장치"의 가출원(US 60/259,418)에 대한 출원이다.

본 발명은 일반적으로 극저온 보존에 관한 것이며, 더 상세하게는 검사와 진단목적에 대한 보존방법에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 최소 하나이상의 실시예에 따른 방법을 실시하기 위한 냉각장치의 측면도

도 2는 상대적으로 많은 양의 생물학적 재료를 냉동하는데 적합한 냉각장치의 실시를 나타내는 도 1에 도시된 냉각장치의 단면도

도 2A는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 나선형 콘베이어를 사용한 형상을 나타내는 도 1에 도시된 냉각장치의 단면도.

도 3은 본 발명의 따른 최소 하나이상의 실시예를 수행하기 위한 흐름도.

도 4는 본 발명의 선호되는 실시예에 따른 냉동방법과 여러 가지 종래의 냉동방법을 비교한 실험결과를 도시하는 막대그래프.

도 5는 액체질소에 의한 방법과 본 발명의 선호되는 실시예에 따라 냉동된 방법에 의해서 냉동-해동 사이클이 수행된 후의 동결방지되지 아니한 포도조직의 형태학적 모습을 현미경으로 관찰한 것을 도시한 모습.

도 6은 표준 냉동처리기술을 사용하여 냉동된 후의 모습과 본 발명의 선호되는 실시예에 따른 방법의 적용 후의 심장조직의 형태학적 모습을 현미경으로 관찰한 것을 도시한 모습.

도 7은 본 발명의 선호되는 실시예에 따른 방법의 적용 후에 세포 미토콘드리아의 모습을 나타내는 복합 초미세구조형상을 전자현미경으로 관찰한 것을 도시한 모습.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

100 : 냉각단위장치 110 : 탱크

120 : 열교환코일 130 : 모터

132 : 임펠러 134 : 순환기

140 : 냉각액 150 : 레크

155 : 트레이 170 : 콘베이어 벨트

175 : 하향 나선형장치 176 : 상향 나선형장치

180 : 출력피드 190 : 냉동단위장치

200 : 입력피드 210 : 레크지지대

230 : 드라이브 장치

따라서, 현재 사용가능한 방법에 내재되어 있는 최소한의 어떠한 문제들도 회피할 수 있으며, 생존하는 단일의 세포, 조직, 기관, 핵산 또는 다른 생물학적으로 활성 분자들을 극저온으로 보존하기 위한 개선된 방법이 필요하다. 그러므로, 본 발명은 냉각액(cooling fluid)에 샘플을 담그고 재료를 통하여 냉각액을 순환시킴으로써 생화학적 활성조직샘플을 냉동하기 위한 냉동보존(cryopreservation) 방법을 제공하는 것이다. 조직샘플을 유리화(vitrified)하기 위하여 냉동되도록 냉각액은 미리 결정되고 실질적으로 일정한 속도와 온도로 조직샘플을 통하여 순환한다. 그러나, 조직샘플은 해동된 후에도 해부학적 구조(anatomical structure)를 유지하며 생화학적 활성이 잔존한다. 최소 하나이상의 실시예에서 냉각액은 -20℃와-30℃ 사이에서 온도가 유지되고, 조직샘플을 통과하는 냉각액의 속도는 약 24인치의 폭과 48인치의 깊이 보다 크지 않은 영역을 지나는 냉각액의 피트(feet) 각각에 대하여 1분당 약 35리터이다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 중 최소 하나이상에서는 -30℃ 보다 높은 온도로 샘플을 직접적으로 냉동하기 위하여 생물학적 활성 조직샘플을 냉각액에 담근다. 본 발명에 따른 다른 실시예는 냉각액에 담겨있는 다중경로 열교환코일(multi-path heat exchanging coil)을 냉각액이 통과하도록 순환시키며, 열교환코일은 냉각액이 조직샘플로부터 제거하는 열과 최소한 동일한 양의 열을 냉각액으로부터 제거할 수 있다. 최소 하나이상의 실시예에서는 상기에서 언급된 방법을 수행하는 장치를 제공한다.

본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예의 목적은 얼음결정의 형성과 피로파괴(stress fracture)를 회피할 수 있고, 냉동이후에도 세포의 생화학적 기능이 유지될 수 있도록 생물학적 재료를 냉동하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예의 장점은 생물학적 재료가 냉동과정 동안 유리화(vitrified)됨으로써 냉동보존의 회복률(recovery rate)이 상당히 증가되는데 있다.

본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예의 다른 장점은 생물학적 재료가 세포막내의 피로파괴의 형성을 피할 수 있도록 충분히 높은 온도에서 유리화됨으로써 냉동보존의 회복률이 개선되는 데 있다.

본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예의 다른 장점은 냉동보존의 회복률은 현재 사용가능한 방법과 비교하여 해동된 후에도 생물학적 재료의 상당히 높은 비율이 해부학적 구조를 유지하고 생화학적 활성이 잔존한다는 것이다.

본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예의 다른 장점은 냉동보존의 회복률은 생물학적 재료의 샘플은 종래의 병리학 기술과 비교하여 짧은 기간에 절편화(sectioning), 프로세싱(processing)과 조직학적, 초미세구조적, 면역조직화학적 검사의 적용이 가능하고, 따라서 그 결과도 짧은 시간 안에 얻을 수 있다는 데 있다.

본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예의 또 다른 장점은 한번 냉동되면 현존하는 냉동보존 저장설비와 메커니즘은 냉동된 생물학적 재료를 저장하기 위하여 사용될 수 있다는 것이다.

본 발명의 방법, 관련된 구조요소의 기능과 작용 그리고 제작 부분과 경제성의 조합 뿐만 아니라 본 발명의 다른 목적, 장점, 특성들은 첨부한 도면과 관련하여 본 명세서와 청구항으로부터 명백하고, 첨부도면의 도면부호는 여러 가지 형상에서 상응하는 부분을 나타낸다.

선호되는 실시예의 다음의 상세한 설명에서, 도면부호는 첨부한 도면에 기재되어 있으며, 이는 본 발명이 실시되는 특정한 선호되는 실시예를 나타내는 방법으로 도시되고 있다. 이러한 실시예는 본 발명에 속하는 분야의 당업자가 실시할 수 있도록 충분히 상세하게 기재되었으며, 다른 실시예는 본 발명의 사상과 범위에서 벗어남이 없이 논리적, 기계적, 화학적, 전기적 변용이 가능하다. 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 필요하지 않은 상세한 기재를 피하기 위하여, 이미 당업자에게 공지된 내용은 명세서의 기재에서 생략하였다. 따라서, 다음의 상세한 설명은 청구항에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 한정하지는 않는다.

도1 및 도2와 관련하여, 본 발명의 최소 하나이상의 실시예에 따른 방법을 실시하기에 적합한 냉각장치가 소개되고 있으며, 일반적으로 냉각단위장치(cooling unit)는 도면부호 100으로 나타내고 있다. 냉각단위장치(100)는 냉각액(140)을 포함하고 있는 탱크(110)로 구성되는 것이 선호된다. 냉각액(140) 내에 담겨있는 것은 임펠러(impeller,132)를 가진 모터(130)와 같은 순환기(circulator, 134), 열교환코일(120)과 그리고 레크(rack, 150)가 있으며, 하나의 실시예에서는 냉동되어야 하는 생물학적 재료를 지지하기 위한 트레이(tray,155)로 구성되어 있다. 생물학적 재료는, 비록 제한되지는 않지만, 생존하는 단일의 세포, 조직 그리고 기관, 핵산 그리고 다른 생물학적 활성 분자들을 포함할 수 있다. 생물학적 재료는 특정한 종류(species-specific)에만 요구되는 것은 아니다. 탱크(110)의 외부에는 냉동단위장치(refrigeration unit, 190)가 있으며, 이는 열교환코일(120)과 연결되어 있다.

탱크(11)는 그 치수가 12인치× 24인치× 48인치의 배수로 되고 냉각액(140) 내에서 냉동되어야 하는 생물학적 재료를 담기에 필요한 치수로 될 수 있다. 다른 탱크의 크기는 여기서 설명되고 있는 내용과 일치되게 될 수도 있다. 예를 들어, 도시되지는 않았지만 하나의 실시예에서 탱크(110)는 냉각액(140)을 수용하기에 충분한 크기로 되며, 따라서 유리병, 실험용 튜브, 비이커, 눈금실린더 또는 이와 같은 용기들은 생물학적 재료와 냉동보호제(cryoprotection)를 포함한 부유물(suspension)의 급속냉동을 위해 탱크(110)내에 위치될 수 있다. 다른 실시예에서 탱크(110)는 급속냉동을 위해 기관(organ) 또는/ 및 유기체(organism) 전체가 완전히 담길 수 있도록 충분히 크게 된다. 탱크(110)는 냉동되어야 하는 생물학적 재료의 다양한 크기나 양을 효과적으로 조절하는데 필요한 만큼 더 크게 또는 더 작게 될 수 있다. 생물학적 재료는 탱크(110)내에 담겨지기 전에 냉동보호제로 처리될 수 있다.

탱크(110)는 냉각액(140)을 보유한다. 하나의 실시예에서 냉각액은 식품용 용질(food-grade solute)이다. 식품용 용액의 좋은 예는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 소금물(sodium chloride solution) 또는 이와 같은 것에 근거한 것들이다. 다른 실시예에서, 냉각액은 디메칠설폭사이드(DMSO), 에틸렌글리콜(ethylene glycol), 프로필렌글리콜, 폴리에칠렌글리콜(polyethylene glycol) 등과 같이 냉동보호제 그 자체이다. 어떤 경우에 있어서, 냉동보호제는 식품용 용액 그 자체이기도 하다. 다른 실시예에 있어서, 다른 용액 그리고 선호되는 용질이 냉각액으로서 사용되어진다. 다양한 용기가 생물학적 재료를 수용하기 위하여 사용되어지지만, 본 발명의 몇 가지 실시예는 신속하고 효과적인 냉동을 위해서 생물학적 재료가 냉각액에 직접적으로 담겨지는 것을 나타낸다. 이러한 직접 담금(immersion)은 어떤 조직과 기관의 냉동보존을 간단하게 하기도 한다.

얼음결정의 형성을 회피하면서 생물학적 재료를 냉동하기 위하여, 본 발명의 하나의 실시예는 약 24인치의 폭과 48인치의 깊이보다 크지 않은 영역 내에 포함된 냉각액의 각각의 피트(feet)마다 1분당 35리터의 상대적으로 일정한 비율로 냉각액(140)이 냉동되어야 하는 생물학적 재료를 통하여 순환하도록 한다. 모터(130)와 같은 하나이상의 순환기(134)에 의해 필요한 순환이 제공되어 진다. 본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예에 있어서, 담겨져 있는 모터(130)는 냉동되어야 하는 생물학적 재료를 통해서 냉각액(140)이 순환하도록 임펠러(132)를 운전한다. 도시되지는 않았지만 다양한 펌프를 포함하는 다른 순환기(134)가 본 발명의 목적과 일치되게 채택될 수 있다. 본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예는 모터(130)와 함께 최소 하나이상의 순환기(134)를 채택함으로써 냉각액이 순환되는 영역과 부피를 증가시킬 수 있다. 복수의 순환기(134)를 사용하는 실시예에서, 냉각액 순환의 영역과 부피는 추가적으로 채택되는 각각의 순환기에 직접적인 비율로 증가된다. 예를 들어, 선호되는 실시예에서 24인치의 폭과 48인치의 깊이보다 크지 않은 영역을 통하여 순환되어야 하는 냉각액의 각각의 피트에 대해서 하나의 추가적인 순환기가 사용되어진다.

탱크(110)내의 모든 부분에서 냉각액이 ± 0.5℃ 이내의 균일한 온도분포를 유지하도록 되면서, 보존되는 생물학적 재료를 통과하여 흐르는 냉각액의 유동속도가 일정하고 미리결정된 속도를 유지하도록 모터(130)가 제어되는 것이 선호된다. 생물학적 재료를 통하여 순환되는 냉각액의 미리 결정되고 실질적으로 일정한 속도는 냉동과정동안 생물학적 재료의 유리화(vitrification)를 허용하고, 열의 일정하고 정확한 제거를 제공한다. 하나의 실시예에서, 점성, 온도 등과 같은 냉각액의 성질은 측정되어지고 처리되어지며, 필요한 만큼 임펠러(132)의 회전속도나 토크(torque)를 증가시키거나 감소시키기기 위하여 제어신호는 모터(130)로 보내진다. 다른 실시예에서, 모터(130)는 액체조건의 전범위에 걸쳐서 주어진 회전속도를 유지하도록 제작되어진다. 그러한 경우에 있어서, 모터(130)에 의해 분배되는 임펠러(132)의 토크(torque) 또는 회전속도는 외부적으로 제어되지는 않는다. 주목할 만한 사실은 본 발명의 선호되는 실시예를 실시하기 위하여 어떠한 외부적인 펌프, 샤프트(shaft) 또는 도르래(pulley)가 필요하지 않다는 것이다. 모터(130), 또는 다른 순환기(134)는 직접적으로 냉각액(140)에 담겨진다. 그 결과, 냉각액(140)은 탱크(110)내에 위치하는 생물학적 재료를 냉동할 뿐만 아니라, 냉각액(140)은 모터(130)를 위한 냉각을 제공한다.

일반적으로 냉각제(refrigerant)가 하나 또는 두개의 연속적인 경로로 제한되는 종래의 냉각코일과는 달리, 열교환코일(120)은 냉각제(refrigerant)가 다중 경로(즉, 세 개 이상의 경로)를 통하여 운행될 수 있도록 하는 "다중경로 코일(multi-path coil)"로 되는 것이 선호된다. 게다가 코일의 크기는 냉각액(140)의 정확한 양을 포함하는 단면영역과 직접적으로 관계가 있다. 예를 들어, 선호되는 실시예에서 탱크(110)는 1 피트의 길이, 2 피트의 깊이 그리고 4 피트의 폭으로 되며, 1피트× 2피트의 열교환코일(120)을 사용한다. 만일 탱크(110)의 길이가 20피트로 증가된다면, 열교환코일(120)의 길이도 20 피트로 역시 증가하게 된다. 그 결과, 열교환코일(120)은 동일한 열적로드(heat load)를 다루기 위해 요구되는 종래의 코일의 크기에 비해 대략 50% 정도로 만들어질 수 있다. 모터(130)와 같은 순환기(134)는 냉동되는 생물학적 재료에 걸쳐서 차게 된 냉각액(140)을 순환시키고, 다음으로 더워진 냉각액을 냉각액(140)내에 담겨져 있는 열교환코일(120)로 수송한다. 최소 하나이상의 실시예에서 열교환코일(120)은 냉동단위장치(190)에 연결되어 있으며, 이는 열교환코일(120)과 장치로부터 열을 제거한다.

선호되는 실시예에서, 재료가 제어되고 급속 냉동의 결과가 되는 효율적이고 평형을 이루는 방법으로 열이 장치로부터 제거되어지도록, 냉동단위장치(190)는 열교환코일(120)의 요구되는 로드(load requirement)와 일치하도록 창작된다. 냉동단위장치(190)의 효율은 효과적인 급송(feeding)이나 열적교환코일(120) 그리고 냉동단위장치(190) 내에 사용되는 압축기(compressor)의 효과적인 출력(output)에 의하여 흡입압력(suction pressure)을 제어하기 위하여 채택된 방법과 직접적으로 관계한다. 이러한 방법은 냉각제와 냉각액(140) 온도 사이에서, 그리고 응축온도와 주위온도 사이에서 유지되어야 하는 허용오차에 매우 근접하게 되는 것이 요구된다. 열교환코일(120)의 설계와 더불어 이러한 온도기준은 열교환코일(120)이 더 효율적으로 공급이 되도록 하며, 압축기의 표준등급(standard rating)으로 인정되는 것보다 25% 이상 큰 성능을 얻을 수 있도록 평형되며 확실하게 제어되는 방법으로 압축기(compressor)가 공급되도록 한다.

도 1에서 도시되고 있는 실시예에서 주목할 점은, 냉동단위장치(190)는 외부에 이격되어 위치하고 있는 냉동장치이다. 그러나, 도시되지는 않았지만 다른 실시예에서 냉동장치는 탱크(110)의 다른 단면 내에 결합되어 있다. 이는 냉동단위장치(190)의 다양한 형상은 냉각단위장치(100)의 어떤 형상에 다소 적합할 수 있는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어 탱크(110)가 매우 크다면 별개의 냉동단위장치(190)가 바람직할 것이나, 이동할 수 있는 실시예는 일체화된 냉동단위장치(190)로부터 이익을 얻을 수 있다. 그러한 일체화는 여기에서 설명되는 원리의 실시에 의해서 얻어지는 효율과 감소된 크기의 열교환코일의 특별한 사용에 의해서만 가능하게 될 수 있다.

냉동단위장치(190)와 열교환코일(120)의 덕분으로, 선호되는 실시예에서 냉각액은 약 ± 0.5℃ 이하의 온도편차를 가지고 -20℃와 -30℃ 사이의 온도로 냉각된다. 다른 실시예에서, 물질이 냉동되는 비율(rate)을 제어하기 위하여 냉각액은 -20℃와 -30℃의 외부범위 온도로 냉각된다. 다른 실시예에서는 요구되는 냉동률(freezing rate)을 얻기 위하여 냉각액의 순환률(circulation rate)을 제어한다. 특별한 냉동률이 용이하게 되기 위하여 냉각액의 부피가 변할 수 있는 것이 대안적으로 될 수 있다. 이는 냉각액의 순환률, 냉각액 부피 그리고 냉각액 온도의 다양한 조합은 요구되는 냉동률을 얻기 위하여 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

도 2는 상대적으로 많은 양의 생물학적 재료를 냉동하기에 적합한 냉각장치의 실시를 나타내는 도 1에서 도시된 냉각장치의 단면도이며, 상대적으로 많은 양의 생물학적 재료를 냉동하기에 적합한 냉각장치(100)의 실시예를 소개하고 있다. 도 2에서 사용되는 도면부호는 도 1에서 사용된 도면부호와 같거나 또는 유사하게 되어있다. 탱크(110)는 냉각액(140)을 포함하고 있으며, 레크(rack, 150)는 하향화 될 수 있다. 레크(150)는 레크지지대(rack support, 210)에 이동가능하게 결합되며, 레크(150)는 탱크(110) 내부로 물질의 배치를 용이하게 하기위하여 상향화 되거나 하향화될 수도 있다.

사용에 있어서, 냉동되어야 하는 생물학적 재료는 레크(150)의 트레이(tray, 155)내에 위치된다. 트레이는 냉각액(140)이 그 위에 놓여져 있는 물질의 위, 아래 및/또는 주위를 자유로이 순환할 수 있도록 와이어(wire)나 메쉬(mesh) 등과 같은 것으로 구성되는 것이 선호된다. 냉각액이 요구되는 온도까지 냉각되면, 트레이(155)가 냉각액(140)내로 담겨지도록 레크지지대(210)는 레크(150)를 탱크(110)내로 하향화하는 것이 선호된다. 레크(150)를 하향화하는 것은 수동적으로 또는 다양한 기어, 체인 및/또는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 알려진 도르래 구성의 사용으로 이루어질 수 있다. 신속하고 제어된 냉동을 제공하기 위하여 순환기(134)는 트레이(155) 내에 위치한 물질을 가로질러 냉각액(140)이 순환하도록 한다. 이는 탱크(110)내에 생물학적 재료를 담그기 위한 다른 배치가 채택될 수 있으며, 자동하향화 장치의 사용은 모든 상황에 대한 사용으로 반드시 선호되지는 않는 것으로 이해된다.

도 2A는 다중계층(multi-tiered) 나선경로의 콘베이어(conveyor)를 사용하고있는 본 발명에 따른 실시예를 소개하고 있다. 도시된 바와 같이, 나선형 콘베이어(200)는 생물학적 재료를 냉각액(140)에 담그기 위하여 탱크(110)내에 맞추어지는 형상으로 될 수도 있다. 사용에 있어서 냉각액이 원하는 온도로 냉각되어지면, 냉동되는 재료는 콘베이어 벨트(170) 위에 있는 입력피드(input feed, 160)로 제공되어진다. 재료는 입력피드(160)로부터 하향 나선형장치(175)의 냉각액(140)으로 들어가서, 상향 나선형장치(176)의 냉각액(140)으로부터 나오고, 출력피드(output feed, 180)에서 나선형 콘베이어로부터 나온다. 앞서 설명된 바와 같이, 냉각액(140)은 미리 결정된 일정한 온도로 유지되고, 냉동되어야 하는 재료의 신속하고 안전한 냉동을 보장하는 비율로 순환되는 것이 선호된다. 재료가 냉각액(140)내에 담겨지는 시간은 드라이브장치(drive unit, 230)의 조절이나, 다른 적절한 장치에 의해 변화할 수 있다. 이상적으로, 재료가 다중계층 나선경로 콘베이어 장치(200)상의 탱크(110)를 통하여 이동하면서 열량의 요구되는 양이 정확하게 재료로부터 제거될 수 있도록, 냉각액(140)의 온도와 순환율의 조합으로 콘베이어 벨트(170)의 속도는 조절될 수 있다.

도 3에서는 본 발명의 하나의 실시예에 따른 방법을 소개하고 있으며, 도면부호 300으로 나타나 있다. 도시된 방법은 냉각액이 열교환코일을 통하여 순환하는 단계 310에서 시작된다. 열교환코일은 상기에서 언급된 바와 같이 냉동장치(refrigeration system)에 실시가능하게 연결되고, 냉각액이 열교환코일을 통하여 순환하면서 냉각액의 온도를 낮추기 위하여 사용되어진다. 단계 320에서는 냉각액의 온도가 측정되고, 냉각액의 온도가 최적의(optimal) 온도범위 내에 있는지를 결정하는 단계 330으로 진행된다. 최적의 냉각액 온도범위는 다른 적용에서는 다르게 될 수 있지만, 많은 적용에서 선호되는 최적의 온도범위는 -20℃에서 -30℃ 사이에 있다.

냉각액의 온도가 미리결정된 최적의 온도범위내에 있지 않다면, 단계 335가 실행된다. 단계 335에서는 열교환코일은 냉동단위장치에 의해 냉각되어지고, 냉각액의 온도를 낮추기 위하여 열교환코일을 통하여 냉각액이 순환하는 단계 310으로 돌아간다. 냉각액이 최적의 온도범위 내에 도달할 때까지 단계 310, 320, 330 그리고 335가 연속적으로 수행되는 것이 선호된다.

생물학적 재료를 냉동하기 위하여 사용되는 냉각액의 온도는 본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예에서 중요한 요소이다. 종래의 방법을 사용하여 유리화(vitrification)를 얻기 위하여, 일반적으로 생물학적 재료는 -196℃에 있는 액체질소에 담겨진다. 짧은 시간에 걸쳐 일어나는 이러한 온도의 급격한 변화는 세포구조내에 있는 수분이 매우 빨리 냉동되므로 얼음결정이 형성되지 않는다. 그러나, 생물학적 재료를 액체질소에 담금으로써 냉동하는 것은 세포막내에서 피로파괴(stress fracture)의 원인이 될 수 있고, 이는 냉동보존에 대한 액체질소에 담그는 방법의 유용성을 제한하는 점이 있다. 본 발명의 선호되는 실시예에서 사용되는 온도는 -20℃에서 -30℃ 사이에 있으므로, 온도변화에 따른 피로파괴가 최소화되고, 유리화(vitrification)는 세포막이 훨씬 적게 손상되면서 얻어질 수 있다.

냉각액이 적절한 온도로 냉각되어지는 동안, 냉동되는 생물학적 재료는 단계305의 냉동을 위하여 화학적으로 처리될 수 있다. 병리학으로 사용되는 재료는 일반적으로 화학적인 처리가 요구되지 않고, 냉각되는 재료를 냉각액에 직접적으로 담그는 이전의 단계 305는 여기에서 기술되는 설명과 일치하는 것으로 이해된다. 앞서 설명된 바와 같이 생물학적 재료는 비록 제한되지는 않지만 생존하는 단일의 세포, 조직 그리고 기관, 핵산 그리고 다른 생물학적 활성 분자들을 포함한다. 생물학적 재료는 특정한 종으로 될 필요는 없다. 생물학적 재료를 화학적으로 처리하는 것은 세포의 성장이나 소멸과정동안 세포에 의해 분비되는 유해한 물질의 제거에 의해 세포의 생존도(viability)를 증가시키는 제제(안정제)로 생물학적 재료를 전처리(pretreatment)하는 것을 포함할 수 있다. 유용한 안정제(stabilizer)는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 알려지고, 유리기 산소(oxygen radical)와 같이 매우 반작용적이고 유해한 분자를 격리하는 화학물질과 화학적 화합물들을 포함할 수 있다.

생물학적 재료의 화학적 처리는 도시되지는 않았지만 순화단계(acclimation step)를 포함할 수도 있다. 전처리 동안이나 그 후의 어떤 단계에서, 보존되어야 하는 생물학적 재료는 여전히 냉동온도 위에 있지만 배양온도(culturing teperature)로부터 감소되는 온도로 순화될 수 있다. 이러한 것은 세포대사를 늦추고 급속한 온도전이의 충격을 감소하는 것에 의해 냉동보존절차에 대한 생물학적 재료를 처리하는 데 도움이 된다. 그러나, 순화단계는 본 발명의 실시를 위해서는 요구되지는 않는다.

선호되는 실시예에서, 냉동을 위하여 생물학적 재료를 화학적으로 처리하는것은 생물학적 재료에 동결방지제(cryoprotectant)를 적재(load)하는 것을 포함한다. 로딩(loading)은 일반적으로 하나이상의 동결방지제 용액에서 생물학적 재료의 평형을 포함한다. 로딩과정동안 이용되는 물질은 로딩제(loading agent)로 언급될 수 있다. 유용한 로딩제는 하나이상의 탈수제(dehydrating agent), 침투제(permeating agent), 비침투제(non-permeating agent), 그리고 삼투압제(osmotic agent)를 포함할 수 있다. DMSO와 에틸렌글리콜과 같은 침투압제 및 과당(fructose), 자당(sucrose), 포도당(glucose), 소르비톨(sorbitol), 마니톨(mannitol) 또는 글리세롤(glycerol)과 같은 침투성과 비침투성 삼투압제의 조합이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적과 일치하는 다른 적절한 동결방지제가 사용될 수 있는 것으로 이해된다.

냉각액이 적절한 온도에 도달한 후, 화학적으로 처리된 생물학적 재료가 냉각액에 담겨지는 단계 315가 수행되어진다. 앞에서 언급된 바와 같이, 생물학적 재료는 용기에 수용될 수 있으며, 냉각액에 직접적으로 위치될 수 있다. 다음으로 단계 337로 진행되는데, 담겨진 모터/임펠러 장치 또는 펌프와 같은 순환기는 앞서 설명된 속도로 담겨진 생물학적 재료를 통과하여 냉각액이 순환되도록 사용된다. 냉각액이 생물학적 재료를 지나가면서 냉각액의 온도보다는 높은 온도에 있는 재료로부터 열이 제거되고, 이러한 열은 냉각되는 생물학적 재료로부터 열을 받아 수송하는 냉각된 액체로 전달된다. 본 발명에 다른 최소 하나이상의 실시예에 따르면, 처리된 생물학적 재료가 냉동되어 처리된 재료가 유리화될 수 있도록 냉동되는 생물학적 재료를 통과하는 냉각액의 순환은 일정하게 유지되어야 한다.

냉각액이 냉동되는 생물학적 재료를 통과하여 순환되어진 후에는, 단계 339가 수행된다. 단계 339는 냉각액의 속도, 온도 이와 유사한 것의 변화를 설명하기 위하여 필요한 만큼 냉각액의 속도를 조절한다. 냉각액의 속도는 하나이상의 순환기에 의해 제공되는 힘(force)을 조절함으로써 일정하게 유지하는 것이 선호된다. 생물학적 재료가 계획된 냉동상태에 도달하면, 단계 340에서 도시된 바와 같이 제거된다. 앞서 설명된 방법에 의해서 재료가 단계 340에 있는 냉각액으로부터 제거되어진 후, 형광표시라벨(fluorescent labeled)된 항체의 염색(staining)과 같은 조직검사, 초미세구조 검사 그리고 면역조직화학 검사를 위해 재료는 절편(section)되거나 해동될 수 있다.

도 3에서 도시되는 단계는 순차적인 순서로 소개되고 있다. 그러나, 도시된 방법은 단계의 일부 또는 전부가 연속적으로 수행될 수 있고, 다른 순서로 수행될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 최소 하나이상의 실시예에서는 냉각액을 순환하기 위하여 단일의 순환모터가 사용된다. 이러한 실시예에서, 냉각액은 단계 310에서와 같이 열교환코일을 통하여 순환하고, 동시에 단계 337에서 보존되어야 하는 생물학적 재료를 통과한다. 게다가 본 발명의 하나의 실시예는 장치내의 다양한 위치에서 냉각액의 온도, 점성 그리고 다른 유동성질을 연속적으로 측정한다.

그러나, 다른 실시예에서 냉각액의 어떤 특성은 직접적으로 측정되지 않는다. 오히려 냉각액 특성의 변화는 순환모터의 회전속도로부터 간접적으로 결정된다. 모터가 느린속도로 회전하고, 요구되는 회전속도로 모터를 되돌리기 위하여 모터에 부가적인 전원이 공급되어질 수 있다면, 냉각액 성질의 변화에 대한 보상이될 수 있다. 최소 하나의 실시예에서, 모터는 실질적으로 일정한 회전속도를 유지하도록 된다. 이러한 일정한 회전속도는 냉각액의 일정한 순환속도의 결과로 된다.

본 발명의 하나의 실시예에 대한 실험이 눈금용기(graduated container)내에서 5 ml의 수분이 냉동되도록 수행되었다. 냉동되는 동안, 전체 체적에 있어서 1% 이하의 증가가 있었으며, 이는 종래의 냉동에 의해 예상되는 것보다 훨씬 적은 것이다. 다른 실험에서는 종래의 냉동기(freezer)와 본 발명에 따른 선호되는 방법에 따른 냉각장치에 의해 시트(sheet) 내에서 얼음이 냉동되는 것이 수행되었다. 냉동이 되어진 후에, 얼음은 암시야현미경(dark microscope)에 의해 검사되었다. 예상한대로, 종래의 방법에 의한 얼음은 결정질형태(crystalline pattern)를 나타내었지만, 본 발명의 원리에 따라 냉동된 얼음은 밝은층배열(light displacement)을 나타내지 않았으며, 어떠한 얼음결정을 형성하지도 않았다.

도 4는 다양한 냉동보존 방법에 의한 실험결과를 비교하고 있다. 막대그래프(400)는 대조군(control group, A)에 대하여 네 가지의 다른 냉동보존방법 B,C,D,E의 사용에 의한 손상된 각각의 세포수를 비교하고 있다. 대조군 A는 어떠한 냉동보존이 수행되지 않았으며, 방법 B는 -20℃의 온도로 세포를 냉동하는 종래의 냉동기를 사용하고 있고, 방법 C는 -80℃의 온도로 세포를 냉동하는 초저온 냉동기를 사용하고 있고, 방법 D는 -196℃의 온도로 세포를 냉동하는 액체질소를 사용하고 있으며, 방법 E는 -25℃의 온도로 세포를 냉동하는 본 발명의 선호되는 실시예를 사용하고 있다.

막대그래프(400)에서 도시되는 실험결과는 어떠한동결방지제(cryoprotectant)나 전처리(preparation)의 형성없이 본 발명의 방법 뿐만 아니라 앞서 설명된 종래의 방법에 의해 냉동된 식물조직(씨없는 포도)을 사용한 것이다. 냉동된 식물조직은 해동되고 얇은 절편으로 절단되고 위상차현미경(phase-contrast microscopy)을 이용하여 염색 없이(unstained) 검사된다. 냉동으로 인한 수분의 팽창이나 얼음결정의 형성에 의한 조직의 큰 변형의 조직세포벽의 구조를 파괴시키고 쉽게 관찰될 수 있기 때문에, 실험에서는 식물조직이 채택되었다. 도 4에서 도시된 바와 같이 실험결과는 본 발명의 선호되는 실시예에 의해 수행되는 방법의 우수성을 명확하게 보여준다. 예상했던 바와 같이 대조군 A는 어떠한 세포손상을 나타내지 않았다. -20℃의 냉동기(freezer)인 방법 B는 대략 45%의 세포벽구조 손상을 나타내었으며, -80℃의 냉동기인 방법 C는 대략 55%의 세포벽구조 손상을 나타내었고, 액체질소인 방법 D는 대략 59%의 세포벽구조의 손상을 나타내었다. 그러나, 본 발명이 선호되는 실시예에 따라 수행된 방법은 대략 12.5%의 세포손상을 나타내었다.

도 5는 선호되는 실시예에 따라 수행된 방법의 우수성을 나타내고 있다. 도 5는 액체질소의 방법과 본 발명의 선호되는 실시예에 따른 냉동방법의 냉동-해동 순환(cycle)을 수행한 동결방지되지 않은 포도조직의 형태학적 외관에 대해 위상차 현미경을 통해 보여지는 모습을 나타내고 있다. 선호되는 실시예에 따라 수행된 냉동-해동 방법은 액체질소를 사용한 방법에 의하여 냉동-해동 순환된 조직의 모습과 비교하여 세포벽 손상을 나타내는 조직의 변경된 구조와 형태가 상당히 적게 나타나고 있다.

도 6은 표준 냉동처리(cryopreparative) 기술을 사용하여 냉동된 후, 그리고 본 발명의 선호되는 실시예에 따른 방법의 적용 후에 현미경을 통하여 보여지는 심장조직의 형태학적 모습을 나타내는 것이다. 도 6은 쥐나 개과의 사체(cadaver)로부터 사후분석(post-mortem)으로 수집된 조직샘플에 대해 수행되는 서로 다른 실험의 결과를 나타낸다. 조직샘플은 난소(ovarian), 심장(heart), 간(liver), 신장(kidney) 그리고 허파(lung)의 다섯 개의 기관으로부터 수집된다. 조직은 종래의 조직학, 냉동절편화(cyro-sectioning) 또는 표준 냉동기술을 사용한 초미세구조 검사를 위해 처리되고, 또한 본 발명의 선호되는 실시예에 따라 수행되는 방법에 의해 냉동되어진다. 능숙한 임상병리학자(clinical pathologist)에 의해 절편의 결과가 분석된다. 예상한 바와 같이, 냉동되지 않은 샘플은 조직학상 평가에서 우수한 형태를 나타낸다. 그러나, 병릭학자의 보고서에 따르면 본 발명의 선호되는 실시예의 방법에 따라 냉동된 조직은 최소한 표준 냉동유전학(cyrogenic) 기술을 사용한 조직만큼 잘 보존이 되고, 나아가 몇 가지 조직의 형태, 특히 신장과 근육(심장)은 본 발명에 의해 구체화되는 방법에 따라 냉동되어 질 때, 조직 보전(integrity)에 있어서 현저한 개선을 나타낸다. 도 6은 본 발명에 의해 구체화되는 방법에 따라 수행되는 심장근육샘플과 비교하여 표준 냉동처리기술은 심장근육샘플에서 보여지는 병풍접기(accordion fold)와 같은 수많은 인공산물(artifact)을 가지는 것을 나타낸다.

도 7은 냉동되지 않은 대조군(control)과 비교하여 본 발명의 선호되는 실시예에 따른 방법이 실행된 후에 전자현미경으로 보여지는세포미토콘드리아(cellular mitochondria)와 같은 복합 초미세구조형상(complex ultrastructural feature)의 모습을 도시하고 있다. 도 7에서 도시되는 전자현미경의 모습은 냉동되지 않은 대조군 조직과 본 발명의 선호되는 실시예의 방법에 따라 냉동된 조직 사이에는 거의 차이가 없다는 것을 명확하게 보여주고 있다. 게다가, 도시되지는 않았지만 액체질소의 표준기술이나 기계적 냉동으로 인하여 냉동되는 조직은 본 발명의 선호되는 실시예에 따른 방법에 의해 냉동되는 조직보다도 더 큰 손상이 있음을 명확하게 보여주고 있다.

상기에서 설명된 바와 같이, 현행 기술을 사용하여 이루어지는 냉동 절편(section)의 주된 문제는 냉동이 되는 동안 특정한 화학적 반응의 손실에 있다. 이러한 작용의 손실은 항체염색(antibody stain)에 근거한 최신의 면역조직화학 기술에 있어서 이러한 샘플들이 본질적으로 소용이 없게 한다. 형광표시 항체[5.1H11, 근육특이성(muscle specific)인 인간의 NCAM]를 사용하여 수행되는 실험은 이러한 항체에 미리 형광물질로 염색된 돼지의 주된 위성세포(satellite cell)는 본 발명의 선호되는 실시예의 방법에 따라 처리되고 냉동된 후에도 계속적으로 형광을 내고 있음을 나타낸다. 그러나, 액체질소로 냉동되는 세포는 해동되어진 후에는 형광을 내지는 않는다. 이러한 실험의 결과는 선호되는 실시예의 방법은 연구영역이나 환자진료의 영역에 적용되는 냉동병리학(cyropathology)과 면역조직화학의 새로운 기술에 대해서도 사용을 할 수 있다는 것을 보여준다.

본 발명은 물질이 유리화 되어야 하고, 세포막 내에서 피로파괴의 형성이 최소화되어야 하고, 세포내에서 화학적 작용이 냉동 후에도 손실되지 않도록 생물학적 재료를 냉동할 수 있기 때문에, 본 발명의 다양한 실시예는 분자재생질병(암) 뿐만 아니라 피부이식(skin graft), 각막 저장(cornea storage), 순환관 저장(circulatory vessel storage), 이식조직(transplant tissue)의 냉동 그리고 불임치료(infertility treatment)와 같은 적절한 화학적 처리를 가지는 다른 의학적 분야에도 적용될 수 있다.

비록 본 발명의 실시예가 어떠한 변형과 함께 상기에서 상세히 설명되고 도시되었지만, 본 발명의 기술적 사상과 일치될 수 있는 많은 다른 실시예가 본 발명의 속하는 분야의 당업자에 의해 쉽게 유추될 수 있다. 따라서, 본 발명은 여기에 개시되고 있는 특정한 형태로 제한되는 것은 아니며, 반대로 본 발명의 사상이나 범위 내에서 합리적으로 포함될 수 있는 대안, 변용 그리고 이와 동등한 것을 포함하고 있다.

Claims

생화학적 활성 조직샘플을 냉동하고, 조직샘플을 해동하며, 해동된 조직샘플을 검사하는 방법에 있어서,

조직샘플을 냉각액에 담그고,

조직샘플이 유리화되도록 조직샘플을 냉동하기 위하여 냉각액을 조직샘플을 통하여 사전결정된 일정한 속도와 온도로 순환시키며, 조직샘플은 해동된 후에도 해부학적 구조를 유지하며 생화학적 활성이 잔존하는 것을 포함하는 냉동을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 조직샘플을 절편화하는 것이 추가로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 해동된 조직샘플의 검사는 조직화검사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 해동된 조직샘플의 검사는 초미세구조 검사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 검사는 면역조직화학 검사의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 5 항에 있어서, 면역조직화학은 형광표시된 항체염색을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 55% 이상이 세포의 해부학적 구조에 대하여 손상을 나타내지 않으며, 생화학적 활성이 잔존하는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 45% 이상이 세포의 해부학적 구조에 대하여 손상을 나타내지 않으며, 생화학적 활성이 잔존하는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 85% 이상이 해부학적 구조를 유지하며, 손상되지 않은 상태로 잔존하는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 냉각액은 -20℃와 -30℃ 사이의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 조직샘플을 통과하는 냉각액의 속도는 24인치의 폭과 48인치의 깊이 보다 크지 않은 영역을 지나가는 냉각액의 각각의 피트에 대하여 분당 약 35리터인 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 냉각액에 담겨져 있는 모터/임펠러에 의해 냉각액이 순환되는 것을 특징으로 하는 방법
제 1 항에 있어서, 냉각액에 담겨져 있는 다중경로 열교환코일을 통과하여 냉각액이 순환되고, 열교환코일은 냉각액이 조직샘플로부터 제거하는 열과 최소한 동일한 양의 열을 냉각액으로부터 제거할 수 있는 것이 추가로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법
검사를 위해서 조직샘플을 처리하는 데 사용되는 방법에 있어서,

생물학적 활성 조직샘플을 냉각액에 담그고,

조직샘플이 유리화되고, 해동된 후에도 조직샘플이 해부학적 구조를 유지하고 생화학적 활성이 잔존할 수 있도록 사전결정된 일정한 속도와 온도로 조직샘플을 통하여 냉각액을 순환시키는 것에 의하여 조직샘플을 약 -30℃ 보다 높은 온도로 직접적으로 냉동시키는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 조직샘플을 절편화하는 것이 추가로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 조직샘플을 해동하는 것이 추가로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 검사는 조직학적 검사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 검사는 초미세구조 검사를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 검사는 면역조직화학 검사의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 19 항에 있어서, 면역조직화학은 형광표시된 항체염색을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 40% 이상이 해부학적 구조를 유지하고, 생화학적 활성이 잔존하는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 80% 이상이 해부학적 구조를유지하고 생화학적 활성이 잔존하는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 85% 이상이 해부학적 구조를 유지하고 손상되지 않은 상태로 잔존하는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 냉각액은 -20℃와 -30℃ 사이의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 조직샘플을 통과하는 냉각액의 속도는 24인치의 폭과 48인치의 깊이 보다 크지 않은 영역을 지나가는 냉각액 각각의 피트에 대하여 분당 약 35리터인 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 냉각액에 담겨져 있는 모터/임펠러에 의해 냉각액이 순환되는 것을 특징으로 하는 방법
제 14 항에 있어서, 냉각액에 담겨져 있는 다중경로 열교환코일을 통과하여 냉각액이 순환되고, 열교환코일은 냉각액이 조직샘플로부터 제거하는 열과 최소한 동일한 양의 열을 냉각액으로부터 제거할 수 있는 것이 추가로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법
냉각액에 담겨지기 위하여 생화학적 활성 조직샘플이 수용되도록 형성된 냉각액 저장기와,

상기의 냉각액을 순환하도록 형성된 하나 이상의 냉각액 순환기와,

상기의 냉각액으로부터 열을 제거하기 위한 열교환코일과,

상기의 열교환코일로부터 열이 제거되도록 형성되는 냉동단위장치로 구성되며 검사를 위해서 조직샘플을 처리하는 데 사용되는 장치에 있어서,

조직샘플이 유리화되고, 해동된 후에도 조직샘플이 해부학적 구조를 유지하며 생화학적 활성이 잔존할 수 있도록 사전결정된 일정한 속도와 온도로 조직샘플을 통하여 냉각액을 순환시키는 것에 의하여 조직샘플이 약 -30℃ 이상의 온도에 직접적으로 냉동되도록 상기의 냉각액저장기와, 하나이상의 순환기 및 냉동단위장치가 서로 협동하는 것을 특징으로 하는 장치
제 28 항에 있어서, 검사는 조직학적 검사를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 검사는 초미세구조 검사를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 검사는 면역조직화학 검사의 사용을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 31 항에 있어서, 면역조직화학은 형광표시된 항체염색을 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 40% 이상이 해부학적 구조를 유지하고 생화학적 활성이 잔존하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 80% 이상이 해부학적 구조를 유지하고 생화학적 활성이 잔존하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 해동된 후에도 조직샘플의 85% 이상이 해부학적 구조를 유지하고 손상되지 않은 상태로 잔존하는 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 냉각액은 -20℃와 -30℃ 사이의 온도로 유지되는 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 조직샘플을 통과하는 냉각액의 속도는 24인치의 폭과 48인치의 깊이 보다 크지 않은 영역을 지나가는 냉각액 각각의 피트에 대하여 분당 약 35 리터인 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 순환기는 냉각액에 담겨져 있는 모터/임펠러 장치인 것을 특징으로 하는 장치.
제 28 항에 있어서, 냉각액에 담겨져 있는 다중경로 열교환코일을 통과하여 냉각액이 순환되고, 열교환코일은 냉각액이 조직샘플로부터 제거하는 열과 최소한 동일한 양의 열을 냉각액으로부터 제거할 수 있는 것이 추가로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법