JPS61198037A - 超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、サンプル自体の調整の際に組織の超微細構造
の有意的な変性を回避することによる超微細構造分析用
生体組織サンプルの凍結調整装置に関する。

〔従来技術とその問題点〕

医学技術上組織サンプルを検査し、細胞構造Ｊ３よびそ
の機能を決定するために、殆んど全ての分析方法を適用
する前に組織が固定さ”れなければならない。

用語「組織サンプル」が明細書中に使用されているが、
この用語は顕微鏡検査に適した小さな組織サンプルおよ
び移植に適切な角膜のようなより大きな組織体をも含む
。本発明装置の適用は組織の大きさや特定のタイプに限
定されず、細胞からなるどのような組織にも適用される
。本発明装置は、細胞組織のどのような大ぎさ、形ある
いはタイプのものに対しても設計可能である。それ故、
用語「組織」および「組織サンプル」は互換して使用さ
れ、本発明装置が使用される態様に限定されない。

各種顕微鏡あるいは関連した拡大装置を使用して組織サ
ンプルを検査することが長年実施されているが、ナンプ
ル構成成分の検査をＸ−線分析により２〜３　単位の点
間解像力をもって５００〜５００．０００　　単位の倍
率で行うことを可能にする現代の高解像力分析顕微鏡、
例えばＳＴＥＭ電子顕微鏡に使用するための組織サンプ
ルの調製に当り、内在する問題があった。

具体的には、組織調整過程中に生じた各種人為結果（人
為構造ということもある）の程度を同時に評価しながら
組織分析の結果を解釈することが困難である。従って、
可能な限り人為結果を回避することが必須である。もう
一つの問題は、組織サンプルが極端ではあるが、現在の
定説においては良好な調整操作に必要である程度の操作
に付された場合に、組織サンプル自体の物理的収縮から
生ずるものである。殆んどの通常の組織調整工程におい
て組織の収縮は４０〜５０％のオーダーである。この収
縮は必然的に超微細構造の変更および下部構造分解の大
きな再配列をもたらす。この超微細構造の変更の損傷の
正味の結果はこの分析操作を介した説明における不正確
な詳細である。

所謂「形態学の黄金時代」の際には、定性的および定石
的顕微鏡における基本的な目標は審美的に美しい像であ
った。この目標は現在利用可能である固定方法および装
置を用いて容易に達成可能である。しかしながら、調整
方法により生成される審美的に美しい像はまた生きた生
物体における組織の真の状態を正確に反映づる、即ち、
「いきた状態」に近似する組織サンプルも、また、もた
らすことが必須になるに至っている。これが真に本発明
装置が目的とし、その解決を図らんとり−る問題である
。分析用に現在利用可能である拡大装置は従来使用され
てきた現在の組織調整技術Ｊ：りも技術的にはるかに進
歩している。本発明の装置は、公知の拡大および分析装
置に容易に使用される組織サンプルの調整を与えるもの
である。

この出願の基本的要点は、現在の拡大装置にＪ：る分析
のための組織サンプルを調整することにあり、この発明
はこのことのみに限定されない。特に、サンプルの調整
は移植、修正、インビ１−口・インビボ細胞成長、培養
、活性懸濁液あるいｔユ更に典型的な樹脂含浸、セツテ
ィング、湿潤おＪ：び分析を予期した組織凍結固定と同
様の分析のための組織調整として理解されるべきである
。本発明装置は、従来凍結調整においてさけられないと
考えられていた超微細構造の損傷なしでどのにうな医学
的、分析的手順のための組織を調整するために使用され
ＩＨる。

本発明装置は現代の凍結乾燥装置とは区別されるもので
ある。凍結乾燥は凍結乾燥を実施するための装置と同じ
く公知の技術である。それは、たとえば、米国特許Ｎα
４．２３２．４５３に開示されている。ある凍結乾燥技
術においては、液体窒素が冷却媒体として使用され、組
織あるいはナイクルそれ自体はそのような温度に達しな
い。凍結乾燥は通常−５０℃〜−８０℃のサンプル温度
で行なわれる。

これに対して、本発明の凍結装置は、−１２０℃以下の
サンプル温度で行なわれる。それ改に、この出願におい
ては、用語″凍結装置°′および°゛凍結固定″は従来
の凍結乾燥技術（−５０℃〜−８０℃）に対して区別し
て使用されている。

本発明の実施に際して使用される極端な低温と真空は凍
結乾燥装置にはなかった特別な問題をもたらしている。

たとえば、エラストマー材料からなる伸縮可能なＯリン
グのようなシーリング装置はこれらの予期される凍結調
整温度および真空で効果的に機能しない。それ故に、凍
結調整装置は対処する極端な温度と圧力において、たと
えば液体窒素環境外で装置の一部のサンプル室のような
種々の構造をシールするように設計されなければならな
い。これは、単に凍結調整装置の設計およびその装置特
有の問題の１つに過ぎない。

本発明装置に開示され使用されている真空レベルは従来
の凍結乾燥装置では安全に達成することができない。凍
結乾燥装置における典型的な従来の真空引方法は、ガラ
ス容器内で分子ふるいを使用することを開示している上
記米国特許Ｎ。

４．２３２．４５３のものである。簡単に破れる容器内
での分子ふるいは、本発明装置によって作られる一１２
０℃以下の温度において水のＲ華のために要求される温
度を得るために、所要の真空レベルを作ってそれを維持
することが安全にはできない。

分析用組織サンプルの最も通常の従来方法は化学固定お
よび有機溶媒脱水によるものである。この方法に内在す
るものは、同時に起る人為結果の形成、サンプルの収縮
およびその結果１りられる組織特性への損（口および変
性である。これらの変性は人為結果などの形態を取ると
否とを問わず個人による解釈あるいは試料を分析あるい
は評価する装置を必要とする。これは多くの場合に不満
足ｈｌｉ差の危険性を導びく。

化学的固定法は周知の技術であり、長年に亘って分析生
物学者に役立っており、今後もある種の限られた用途に
おいては疑いなく寄与し続けるものである。しかしなが
ら、Ｉ　Ｉ　Ｉｔサンプル析の用途がより複雑になりそ
の様な分析の用途がより広範になるに従って化学的固定
法に代るものが必要とされている。これは、利用可能な
拡大および分析装置において進歩がなされるにつれて特
に必要となる。組織調整方法および装置においては、試
料の分析に使用されている分析導具即ち電子顕微鏡と同
等に進歩して１ｇ械サンプルを調！Ｉ！する必要がある
。明らかに組織サンプル調整の技術が顕微鏡の技術に遅
れている場合には、進歩した顕微鏡は形態学者その他の
組織研究者にとり何の役にも立たないことになる。

同様に、凍結調整方法および装置は他の医学技術たとえ
ば各月移植技術、形態技術および形態学と同時に発展す
ることが重要である。すなわら、凍結調整は細胞あるい
は組織を使用したり分析したりする進展工程における重
要な中間ステップである。本発明装置は医学における他
の進展と同一のベースを保持している生物組織の使用お
よび調整の調査を許すような凍結調整の躍進を示してい
る。

化学的固定法および有機溶媒脱水に代わる最も通常のも
のは凍結乾燥冷凍固定サンプルである。

冷凍固定に従う凍結乾燥は文献によく記載されており、
組織保存のための良く知られた技術ぐある。

それは幾つかの利点を有する。冷凍固定凍結乾燥の結果
、はぼ順次的な細胞代謝の捕獲が行なわれる。また、サ
ンプルとのｍ媒接触の除去により可溶性Ｉｌ胞構成成分
の安定化および保存が行なわれる。これらは、冷凍固定
および凍結乾燥技術を公知の組織調整方法に適用する試
みにおける数多くの研究努力において生じた冷凍固定−
凍結乾燥への相当な利点である。

不幸なことに、凍結乾燥の使用は多くの欠点があること
が判明した。現在利用可能な凍結乾燥技術における主た
る欠点は氷結晶形成の防止である。

容易に理解される如く、氷結晶の形成は観察されている
組織の超微ｍ構造の形態学的特徴を破壊する。像は細胞
質が細網化する際に変形される。

サンプル内における氷結晶の形成はおそらく巨大分子の
異常な架橋を引き起こす可能性のある組織のｐＨの変化
を生ぜしめる可能性がある（共晶形成）。また、蛋白質
が変性し、析出する可能性もある。これらは凍結乾燥方
法に内在する（よんの僅かな欠点を示したに過ぎない。

この一般的トビツクは、より詳細に他の従来方法ととも
に［電子顕微鏡用生体組織の凍結および乾燥」という標
題の文献に記載されている（　“　Ｆｒｅｃｚｉｎｇ　
ａｎｄ　　Ｄｒｙｉｒ＋ｇ　ｏｆ　　　Ｂｉｏｌｏａｉ
ｃａｌ王１ｓｓｕｅｓ　ｒｏｒ　　Ｅ　Ｉｅｃｔｒｏｎ
　Ｍ　１ｃｒｏｓｃｏｐｙ　１１゜Ｌｏｎｉｓ　　Ｔｅ
ｒｒａｃｉｏ　ａｎｄ　１（ａｒｌ　Ｑ、３ｃｈｗａｂ
ｅ。

ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　　Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆＨｉｓｃｏｃｈｃｍｉｓｔｒｙ　、　ｖｏｌｕｍ
ｅ　　２９．　ＮＱ９　ａｔｐｐ、１０２１〜１０２８
（１９８１））。人為構造形成形成に伴う問題は「凍結
−破壊複製にＪ３１＝ｊる人為構造の問題の理解：総説
Ｊ　　（Ｕ　ｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎａｔｈｅ　Ａ　ｒ
ｔｉｆａｃｔ　Ｐ　ｒｏｂｌｅｍ　ｉｎ　Ｆ　ｒｅｃｚ
ｅ−Ｆｒａｃｔｕｒ。

Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ：　ＡＲｅｖｉｅｗ　”　、　
Ｔｈｅ　　ＲｏｙａｌＭｉｃｒｏｓｃｏｐｉａｌ　５ｏ
ｃｉｅｔｙ（１９８２）　１０３−１２３）に記載され
ている。

組織サンプルの調整において有用性を示してきた凍結技
術に適用可能な一般原理は、冷却速度が上昇するにつれ
、組織流体が水分を細胞外空間に分離することなく凍結
されるということである。

冷ｍ速度の如何に拘らず、氷結晶がおそらく生ずるが、
冷却速度が増大するにつれて細胞内氷結晶の大ぎさが減
少することが要求されている。高い凍結速度における氷
結晶の小径は勿論これにより最少の人為構造形成および
脱水中における最少の超微細構造損１ｔｊが行なわれる
らすぎないので形態　　　　　□学的検査においては実
質的な利点である。本発明装置は、水蒸気の減少分圧の
状態において、仝＜゛組織ｌｆＡ胞に対する実質的な超
微細構造損傷なしで組織サンプルが１秒より短い時間で
ガラス質相へ高速冷却されて脱水されることを要求して
いる。

歴史的に見て、迅速凍結の技術が判断された基準は系の
冷却速度ではなく、単に組織が凍結された環境の温度で
あった。このように迅速凍結の用語は希釈剤が一１５０
℃以下の温度を有する如何なる系にも適用されてきた。

冷却系の有効性は熱がサンプルから除去される速度に依
存する。熱移動は冷」１系の温度のみならず、またその
物理的および熱的特性並びにサンプルの大ぎさおよび熱
的特性にも依存する。迅速凍結に最も普通に使用されて
いる技術は液体冷却浴拾中にサンプルを浸漬即ち「急冷
」することである。急冷に最も通常使用されている液体
は液体窒素、イソペンタン、プロパンおよびフレオン１
２およびフレオン２２などのフルオロカーボン類である
。液体窒素は一般的にその低温（−１９６℃）により理
想的な急冷流体とみなされているが、液体窒素の低い蒸
発熱による組織表面膜沸騰の発生により液体窒素の使用
には内在的な点が存在する。膜沸騰は実際にサンプルを
断熱することにより熱移動速度を阻害する液体窒素の特
性である。

迅速凍結の従来の代替法の１つに冷却金属ブロックの磨
かれた表面上の凍結がある。これは典型的には組織サン
プルを磨かれた平坦な金属表面に対して堅く押し付けて
対向さぼることよりなるものである。銀および銅が磨か
れた金属ブロックとして典型的に使用されている。この
方法は、これらの金属が液体窒素あるいは液体ヘリウム
温度までに冷ｒＪ＋された際の高い熱伝導性および熱容
ｆｉｌを利用するように設計されたものである。金属表
面上の冷却における重要な工程は、乾燥した冷却金属表
面と回転、並行移動あるいははね返りの動ぎがなくしっ
かり接触さＵることである。医学において有用性の知ら
れている市販の装置が「はね返りのない」凍結を提供す
る。この装置の１ｍ発はメアリーランド医学大学校のＡ
　ｆａｎ　３　ｏｙｎｅ博士によってなされたものと一
般的にみなされている。

最近、冷却速度と急冷液体中の超微ＩＱ構造保存の間に
直接の相関関係があるとの証明がなされている。凍結速
度が毎秒１００〜４１００℃の範囲を越えて増大すると
く液体窒氷−プロパン）、それに応じて存在する氷結晶
の大きさの減少があり、従って形態学的保存の改良が得
られる。かかる凍結流体あるいは他の迅速冷却装置の使
用が組織サンプルを１秒以内にガラス化するのに好まし
い。

引き続く組織調整過程において重要な工程は、常に、最
近断熱的「分子蒸留」過程として説明されている過冷却
組織液の昇華−脱水である。一度、適当な過冷却方法が
選択され、手段が提供されたら、凍結された水和標本の
観察を可能にする電子顕微鏡その他の拡大装置は容易に
利用可能でないので、ざらに組織を顕微鏡評価のために
加工する必要がしばしばある。このように、脱水は貯蔵
のために生体組織サンプルの調整における必須工程であ
り、しばしば組織の下部構造および超微細構造の細網化
により組繊細胞破壊は拡大装置による分析を阻害するば
かりでなく、使用たとえば移植される組織体の生存能力
および機能的特徴に悪影響を与える。

ある種の従来の乾燥技術において、結合水画室内に細胞
流体溶質が濃縮されるにつれ、共晶が形成されるために
組織サンプルは全く固化されていなかった。この溶質の
移動はゆるやかな冷却が使用される際に、物質が流体状
態にある間に生ずるものである。迅速凍結技術が使用さ
れる場合には脱水工程において特別の考慮が必要となる
。これらの問題は、脱水が液体状態よりむしろ固体状態
において、即ち昇華によって生じなければならない（水
は除去されなければならない）という事実から生ずるも
のである。この代りに効果的に使用されてきた手順は活
発な分子蒸留である。活発な分子蒸留は表面分子の離Ｍ
　ＷＡ　Ｍにおけるエネルギー坦が上昇してそれがガラ
ス相に変化することを可能にして固体相によって再び捕
集されない。

従来技術において、凍結代替手法は溶媒あるいは溶媒−
固定剤混合物を水と−７５〜−８０℃において置換する
ことによる組織水の除去を含むものであった。これは、
過去の化学固定法よりも、ｌ］ｍサンプルに対してより
おだやかな溶媒相分離および化学的変成人為構造を導入
するものである。

実用的見地からは凍結乾燥は組織サンプルが過冷却水の
蒸気圧を増大し、昇華を合理的時間内に行′　　わせる
ように加温するべきであるという要請により？ａｍなも
のである。蒸気圧の増大に加えて、温度の上昇は氷結晶
の拡大おにび同時に組織サンプルの超微細構造形態への
損傷に導く一連の物理的現象をもたらす。加温操作の際
に生ずる多くの物理的現象は存在する水の物理状態にお
ける転移に関連するものである。典型的に見られる変化
はガラス転移、失透および一連の結晶格子立体配置転移
を伴う再結晶化である。

この様に、凍結乾燥およびその他の凍結調製技術は形態
学的検査のための組織試料の調製のための例外的機会を
提供するものである。しかしながら、凍結ｗＪ製技術の
使用においては、試料の脱水および固定に伴う問題が内
在する。これらは本発明装置により向けられた問題点で
ある。

本発明の冷凍１顎装置は、角膜組織の移植において異常
な適応性を示した。本発明の前には供与者からの角膜の
除去後に必要イ≧凍結成いは凍結乾燥を含んだ角膜移植
の試みは移植時に常に曇った角膜となったというらので
あった。この移植角膜の物理的状態は角膜自体における
結晶形成および支質（基質）への同時に存する損傷によ
って生じたものであった。本発明装置を使用することに
より、眼科医は供与者から取り出した後に直ちに角膜を
凍結調製し、次いでそれらの角膜を殆んど曇り或いは結
晶形成などなしに受領者に移植することが可能になった
。その様に角膜を移植する能力は本発明の方法に特別の
利点を示すと共に角膜移植外科医術における医学的突破
口を示すものでもある。

〔発明の目的および効果〕

本発明の目的は、生体ｆｌｔａを変性することなく急速
凍結して固定することのできる超微細横ｊ告分析用生体
組織の凍結調整装置を提供することを目的とする。

本発明の利点は、粗ｉｓ胞の超微細構造の形態学的特質
の明白な破壊なしで組織の凍結調整能力にある。この発
明装置は従来の分析装置による解釈を限足りる不必要な
人為構造を創造することなく固体ガラス相に維持された
脱水によって組織の凍結調整を許ず。

〔実施例〕

以下、本発明の実施例を図によって説明する。

本発明は生体組織のサンプルを凍結法により調整する装
置に関する。この装置は生体組織を高度の真空中で迅速
に脱水させる装置を含む。真空中でガラス化させた試料
を一１４０’Ｃにり低い温度で平衡させ、その状態で脱
水し、脱水後、必要に応じ、前記サンプルにガス抜ぎし
た樹脂を含み込ませ、その後にこの樹脂を重合させて前
記試料を埋め込んだ状態にする。本発明の装置及び方法
の他の応用例では、前記脱水されるサンプルとして、た
とえば移植された生体組織のサンプルを、樹脂含浸段階
又はガス抜き段階を経ることなく使用することができる
。

本発明に基く装置はガラス相にする生体組織を支持する
サンプル保持具を右づる。このサンプル保持具及び前記
ガラス化する生体Ｉｌｌ織は低温に維持され、その間に
脱水される。超真空装置を用いて前記サンプル保持具を
真空にすることにより、所要の昇華、平衡化及び脱水の
段階を進める。

前記本発明に基く装置は、生体組織をガラス化するため
の従来の装置と組み合ゼて使用する。このガラス化のた
めのこのましい装置は金属の棒であり、この棒は前記生
体組織を一１２３℃以下の温度でガラス質に改質させる
ために取り付けられる。ガラス化される丈ンブルはサン
プル保持具に挿入され、このサンプル保持具はサンプル
室に整合収容され、このサンプル室は低温浴槽に出し入
れされる。

前記超真空装置ｔよ前記サンプル室を１０−８乃至１０
　　トールに減圧する。この超真空装置は前記サンプル
室に？Ｊ　＋Ｂ２できるように取り付けられる。

実際には、前記本発明に基く装置は、最終的に分析その
他の医学的用途たとえば移植用生体粗織を凍結法で調整
するために使用される。この装置は生体組織が如何なる
形状、大きざ、又は形態であっても使用できる。この装
置を使用すれば生体組織を凍結法で調整することができ
、作られた標本は、超微細構造にいたるまで、生きてい
た時の状態を維持しており、従来の装置では側底不可能
な分析その他の最終目的に供しやすい。これについては
後述する。

前記本発明に基く装置は、所要の生体Ｋｉｍが入手でき
ることを基本的な前提条件とづる。生体組織の瞥ナンプ
ルはたとえば外科的摘出、採血、結紮切取、その伯の従
来周知の方法で採取される。生体組織のサンプル採取方
法が本発明の装置のために制約されること（よないが、
本発明の装置で良い標本を作るためには、サンプルを採
取後極力速かに処理する必要がある。

前記生体組織のサンプルの調整は、その勺ンプルを受領
し次第、直ちに行なう。前記生体組織のサンプルは、輸
送、保管その他の処置を行なうために保存薬剤、たとえ
ばホルムアルデヒドその他の生物学的に活性な安定剤の
中に入れておくことができない。また、生体組織のサン
プルは、本発明の方法により調′Ｍ″ｔＪる前に凍結そ
の他の通常採用される物理的改質処置を施ザとこもでき
ない。

このことは本発明において極めて重要な意味を有する。

採取した生体組織のサンプルを長時間保存する場合の物
理的手段としては、最近市販されている各種の分析装置
の中での保存、または前記分析装置を用いる切断その他
の物理的処理ならば採用できる。

本発明の装置の応用の１例は、生体組織のり゛ンブルか
ら分析用サンプルを作ることである。この場合の好まし
いサンプルは生検法の検査に使用し得る新鮮な生体組織
であり、その訂は１１ＩＩ＃＋３である。このサンプル
は極力速かにガラス化処理を施さねばならない。水明１
１１１　刃においてガラス化とは、ナンプルを極低温で
固定する方法をいい、この方法は「冷凍」とは異る。ガ
ラス化する方法においては、冷却装置を用いて前記サン
プルを、その組織中の可溶性又は不溶性の成分に撹拌、
変質、改質、又は共晶を形成するような濃縮を与えない
ようにしてガラス化する。従って、液体はガラス化され
ると、剪断応力を受けた時に、たとえば窓ガラスのよう
に粉々になる。前記ガラス化は水を液体から非結晶性固
相すなわち固溶体に変換するような場合をＳむ。このガ
ラス化を行なうためには、前記生体組織のサンプルを、
約−１９６℃に維持された金属棒の（１１のように）如
く研摩され、かつ、何ら凝縮していない表面に、はじか
れないよ゛　　うに対向させて極低温まで急速冷却する
。この操作については、すでに本明細１の従来技術およ
び問題点の項で説明済みである。この極低温への急速冷
却は１秒未満の時間で完了するのが好ましい。

本発明の方法及び装置のうちで特に有用な装置は、サン
プルを「弾かない」で凍結する装置であり、この装置は
、メリーランド大学医学専攻大学院のアレンポイン博士
の創案に係るものであり、生体組織のサンプルをガラス
化するために銅のブロックを使用する。この装置は、超
低温６朗用流体、たとえば液体のちつ素、ヘリウム、プ
ロパン又は各秤フレオンを用いて生体組織のサンプルを
超低温まで冷却するが、この超低温冷却を行なう時に、
細胞内の水がまだ氷の結晶にならないうちに、又は細胞
内の水が氷の結晶になるのを防ぎながら、前記生体組織
のサンプルは、その組織内の水分を除かずにガラス化し
て、約−１２０℃より低い温度、好ましくは一１４０℃
より低い温度に保管する必要がある。

温度を管理すれば氷の結晶化をほぼ完全に防止できる。

氷が結晶化するのは約−１２３℃であると考えられてい
る。しかしながらこの結晶化の温度は細胞内の水の化学
的組成によって変化する。

故に、前記好ましい管理温度−１４０℃とすることを提
案する。この提案の意味するところは、ナンブルは、望
ましい状態で使用に供するためには、氷の結晶化開始温
度である一１２３℃より低い温度に維持しなければなら
ないが、これに最近の実験結果を加味して一１４０℃と
いう温度を選定したのである。それ故、生体組織のサン
プルの保管温度は、−１２３℃より低くすることが好ま
しく、−１４０℃より低くすることがより好ましく、＝
１９６℃より低くするのが最善である。

前記サンプルは、超低温冷却してから脱水処理を行なう
までに日時の経過することが予想される場合には、魔法
瓶すなわちデユワ−瓶中の液体ちっ素に浸漬して保存す
ることもできる。上記サンプルは、前記脱水処理を施し
、前記樹脂に適切にに埋め込んだ後は、無期限保存が可
能である。その理由は、脱水処理により細胞質の細網化
その他の細胞の分解代謝が停止し、改質や結晶格子の変
換が起らず、人為的操作によって本来はｍ胞内にない物
質または構造が細胞に形成されることがなく、従って分
析の際に理解に苦しむようなデータが出ることがないか
らである。

前記組織のナンブルは、ガラス化され、−１４０℃より
低い温度に維持される限り、標本保持具の中に収め、こ
の標本保持具を標本輸送機関利用により輸送することが
できる。この標本保持具（一般的にはサンプル保持具と
いう）は温度を制御できる容器に収められる。この容器
と前記サンプル保持具は、共に一１４０℃より低温に維
持するのが好ましい。本発明の最も好ましい実施例にお
いては、液体らつ素を用いれば一１９６℃を維持できる
。この−１４０℃が好ましい理由は、純水がえぞの温瓜
に応じて各種の相で存在するが、−１２３℃で立方晶形
の氷になり始めるからである。従来技術の項ですでに説
明したように、氷が結晶化すれば、サンプルの組織に、
超微細構造的に見て悪い影響、たとえば形態学上の細胞
化等が生ずるからである。

次に、前記サンプル、サンプル保持具、及び容器の雰囲
気を減圧する。この減圧は、通常、丈ンブル保持具を従
来型の機械式真空装置で、３００分未満の間、３×１０
−９ト一ル程度の真空状態に置くという方法による。本
発明の他の実施態様では、１０　乃至１０　　トール、
３００分未満で真空にする。前記真空度は、すでに説明
した手順の残余の分を終了し、前記組織が完全に脱水さ
れるまで、約３×１０−９に維持される。前記サンプル
を液体ちつ素又は他の適当な冷却装置で冷却し、前記サ
ンプル保持具及び容器もこの温度で平行するまで（１０
乃至１００時間）前記サンプルの冷却を継続した後、前
記減圧を行ない、前記真空度を維持する。

前記平衡が完了するまで、前記サンプルは、圧力が極め
て低く、温度も極めて低い平衡凍結温度である状態にお
かれる。平衡化が完了すれば（平衡温度は一１４０℃よ
り低い）、前記サンプルの中に各種の形態で存在する水
分は昇華を開始し、昇華、熱がサンプルの組織の昇華が
行なわれる部分に間欠的に与えられて蓄積する。この過
程は徐々に進行するが前記サンプルの調整に対しては極
めて大きい意味を有する。サンプルは、エネルギーを与
えられる都度、新しい平衡に達するのに時間を要する。

この時間をサンプルに与えることが重要である。サンプ
ルは、平衡状態になれば、その平衡温度を１乃至５時間
、少な目に見ても２乃至４時間は維持する。代表的なサ
ンプル調整法では、サンプルを一１９６℃まで急冷して
ガラス化し、前記サンプル保持具で保管又は輸送する間
、昇華（乾燥）装置の中で一１４０℃より低い渇磨に維
持する。適当な平衡化時間が経過すれば、平衡温度は一
１４０℃乃至−１９６℃の範囲内にある。この平衡進行
中週、３Ｘ１０−９１−３トール以下の超高真空度を維
持する。この超高只空度は極めて重要である。

前記平衡化段階の後、この平衡系に臂華のためのエネル
ギー（熱）が全く加えられないとすれば、看ナンブルか
ら多少なりと意味のある程度の昂の水分を気化させるた
めには極めて長い時間を要する。

これを本発明の方法の温度と圧力で行なうとすれば恐ら
く年単位にになるであろう。そこで本発明の最も好まし
い実施態様では、二次エネルギー源（加熱）装置を追加
して昇華さぼるべき水の分子を例規する。ただし、この
励起は、前記乾燥するサンプルの超微細構造に損傷を与
えないように行なう。そのために特に有用なものは成る
波圧の光迅子の放射エネルギーであると考えられる。マ
イクロ波装置、レーザー装置又は磁気装置を昇華エネル
ギー源とするのも適当である。最も好ましいエネルギー
源は核磁気共鳴装置又は電子スピン共鳴装置を前記装置
と組み併せたものである。平衡に達すれば、ｔサンプル
の組織の温度は、そのサンプルを直接取り囲む雰囲気の
パラメーターが変らない限り変化しない（室温がたとえ
ば２７℃である場合、前記パラメーターは主として前掲
の放射エネルギーである）。この温度が一定になるとこ
ろが、平衡に達したか否かを識別する一般的な目安であ
る。

サンプルが平衡に達すれば直ちに、前記ガラス化処理中
に前記サンプル中に形成された超低温の固態の水分及び
（又は）肉眼では見ない微小な氷の結晶（直径２０ナノ
メーター以下）を除去する必要がある。この脱水処理は
サンプル調整の死命を制する程の重要性を有し、前記組
織に潜在していた超微細構造的なほとんど全ての欠陥た
とえば組織の崩壊及び細網化がこの脱水処理の段階で顕
在化する。この脱水処理を完全なものにするためには、
前記サンプルが自ら行なう昇華を前記二次エネルギーに
よる昇華に切り換える時に、この二次エネルギーの投与
ｄ１の増分を最少にして、前記切換えを徐々に行なう。

この時に、最も好ましいものは前記サンプルの組織の温
度を全く上げないことである。

この」：うに二次エネルギーの投与徂を組織中の固態の
水分の背革潜熱とバランスさぼることにＪ：す、ｎａ記
超超低温冷却されている微小な結晶の氷ら前足形の水分
も、前記凍結装置で完全に除冷することができる。この
乾燥は一１５０℃乃至−１８０℃の温度で行なう。この
温度範囲を広げると、細胞中の水に細胞中の可溶成分が
しみ込み、濃度が変化するためにガラス化温度が下がり
、そのためにそれまでガラス相であった組織がガラス相
でなくなるおそれが生ずる。適当な装置たとえば残留ガ
ス分析装置を用いれば、全ての細胞が完全に乾燥したか
否かを確認することができる。この乾燥の完了が確認で
き次第、前記二次エネルギーの投与母を増加し、前記サ
ンプルの温度を室温より３℃高い温度（２８℃乃至３０
℃）まで上げて標本を仕上げる。以上説明した操作によ
って、本発明に基く処理の長所を監視することができる
。

前記段階、すなわち乾燥終了に達した組織サンプルは、
室温より３°Ｃ高い温度まで上げることができる。この
温度まで上げた後も、前記サンプルは、最初の圧力、す
なわち超低温の時の圧力、つまり超低圧に維持される。

以上の説明における室温は２４乃至２７℃とするが、こ
の温度の値は理論的には変更しても差し使えない。

本発明の属する技術分野の熟達各であれば、前記ガラス
化、平衡化、昇華、及び脱水の各段階にＪ３いて終始温
度を制御することが基本的に重要であることを容易に理
解できる筈である。前記サンプルの維持温度の精密な値
及びその変化する速さは、細胞の構造によって異るが、
何れに往よ極めて重要である。大きい細胞たとえば角膜
を処理する場合には、通常、角膜の組織は一１９０℃以
下の温度でガラス化を開始しなければならない。このサ
ンプルを４時間かけて一１５０℃まで上げる。

平衡化、昇華、及び脱水を行なう間、前記サンプルを６
０時間か１プで一１５０℃から一７０℃まで上げる（温
度の上昇率は１．３３３℃／時である）。前記脱水処理
すなわち乾燥処理は約−１１９℃で開始し、−８０℃に
なるまでに完了させる。この−８０℃では、サンプルの
ガラス相は消失し始めるからである。次に前記サンプル
を４時間かけて一７０℃から＋２５℃まで上げる。

通常、サンプルは室温より少し高目の温度にする。

これはサンプルに水分がしみ込んで凝縮するのを防ぐた
めである。

この時期に、必要に応じて前記サンプルを約１時間オス
ミウムの蒸気にさらす。これは電子顕微鏡にかけた時に
組織の影像のコントラストを強調するためである。この
電子顕微鏡にかける目的に照らして前記コントラストを
強調する必要のないことが明確である場合、又は前記電
子顕微鏡検査の結果を臨床的に利用する場合には、前記
オスミウム蒸気処理を省いでもよい。このオスミウム蒸
気は凍結沈着再結晶法により除去する。他のサンプル固
定法では緩衝溶液にバラホルムアルデヒド及び（又は）
グルタルアルデヒドを加える。このアルデヒドは通常化
学的な固定剤と呼んでいるが、最も好ましい方法の代表
は四酸化オスミウムの添加である。この四酸化Ａスミラ
ムの添加により、前記サンプルを各種分析装置にか（プ
る場合に、組織の各部構造を見易くし、］ンｉ〜ラスト
を強めることができる。

分析用サンプルを調整するためには、さらに、ガス抜ぎ
した樹脂を前記組織に加え、この組織を液圧状態に維持
する。この処理は、樹脂含浸と言われ、処理された組織
は樹脂に埋め込まれた状態になる。従来の方法に使用さ
れた樹脂を本発明の方法にも同様に使用することができ
る。これについてはたとえば米国特許第３，６７９．４
５０号、同第４．１００１５８号、同第４，１２０，９
９１号、及び同第３．２７８．７０１号を参照されたい
。

前記工程に引き続いて、前記サンプルを徐々に大気圧に
する。そのためには、前記樹脂注入口から空気を導入す
る。前記樹脂含浸処理で作られた樹脂に埋め込まれたサ
ンプルを取り出して、この樹脂をすでに説した温度で重
合させる。この重合の方法は使用される樹脂の種類によ
って大幅に異る。典型的には、樹脂をオーブンの中で６
時間加熱して重合させる。この温度は、通常は６０℃で
あるが、必要に応じて一８０℃程度の低温にすることも
できる。前記重合は、前記組織の微細構造に損傷を与え
ないように行なうことが何よりも対接である。

前記サンプルは、重合の後、室温に保管し、薄く切断し
、染色し、又はその他分析に必要な準備を行なうことが
できる。このサンプルは、本発明により開示された方法
により超低温で凍結固定され、脱水されているので、す
ぐに従来のウルトラミクロトームで極めてうずく切断し
、電子顕微鏡にかけることができる。前記サンプルは、
組織に影響が及ばないように調整処理が大幅に改善され
ており、これに伴なって従来の顕微鏡標本の固定又は調
整に見られた欠点が減少又は除去されるので、組織分析
上極めて意味ある基礎情報を提供することができる。

生体組織の構造と機能との実際の関連付けは、通常の超
薄截片切取法と従来の電子顕微鏡搬影に適用できないと
されていた染色法（たとえば任意の可溶性成分、糖類、
脂質類：および可溶性蛋白質の免疫学的分析）との組合
せ、酸素細胞化学、Ｘ線分配ＳＴＥＭ分析、組織移植調
整手術、ミクロプローブ分析、自動放射線搬影（特に可
溶性化合物）および調剤学的調整によって行なう。

この体系の実施に、他の装置を使用することもできるが
、寸でに説明した所要のパラメーターを全てとり入れる
ことができず、期待したような結果を得ることが全くで
きなかった。本発明の実施に使用する装置を第２図、及
び第６図に示す。

前記アレンポイン型の装置によって達成される迅速凍結
法を本発明の方法の実施にも使用する。

液体ちっ素又はその他の金属冷却用急冷浴は、本発明で
も細胞の水分を１秒未満の時間でガラス相にできるもの
ならば使用する。液体ちつ素゛急冷浴は、前記サンプル
保持具に入れたサンプルの温度を下げ、低温に維持する
ために使用する。ここで注目すべきことは、前記サンプ
ルを液体ちつ晃浴中に維持するが、本発明の方法に必要
に応じて使用する各種染色材料、固定材料、及び本発明
のサンプルを埋め込むための重合性の樹脂を入れるため
の配管が必要なことである。これｄの闘能は添付の図面
に略示する。しかしながら、これは本、９ｅ明の特徴を
限定するためのものではなく、利用可能技術の単なる例
示にすぎない。

本発明の装置の設計又は選定を行なう際に必要なことは
、各種材料に対する超低温及び超低圧の影響を考慮する
ことである。そのために、本発明の装置の中の、ガラス
化された材料を処理する部分は典型的にステンレス鋼で
作る。その池の材料も同様に使用できる。これと同様に
、本発明の装置を部分的にテロフン士でコーティングす
る。このテフロン士はデコボン社（Ｄ　ｕｐｏｎｔ）の
製品であり、その主成分はテトラフルオランである。

第２図は本発明の装置の略図である。第２図に示すよう
に、前記本発明の装置は大別して制御パネル１０と、こ
れ以外の部分すなわちサンプルのガラス化、昇華、及び
弊硬化を行なう部分とから成る。制御パネル１０のマイ
クロブロセツ丈１１はターボ分子ポンプ３０を制す。マ
イクロプロセッサ１１は主としてターボ分子ポンプ３０
の構成部分の毎分回転数及び前記ターボ分子ポンプの２
つの主軸承の温度を制御する 制御パネル１０のディジタル型真空計１２は前記本発明
の装置の各所に取り付けられる。さらに、ディジタル真
空計１２は機械的ポンプにも取り付けられて、前記機械
的ポンプが作り出す低圧の値と、前記ターボ分子ポンプ
が作り出す超高真空圧の値とを表示する 制御パネル１０の次の部分は残留ガス分析装置１３であ
る。この残留ガス分析装置１３はサンプル室９０の各ガ
スの分圧の読みによって作動する。

前記分析装置１３には４分極質量分析装置が含まれる。

この装置はサンプル室９０の中に存在する各ガスの原子
間を読み取ることができる。ざらに残留ガス分析装置１
３は前記サンプル室の水の蒸気のレベルを測定し、この
サンプル室は脱水の終点を求めるに使用することができ
る。

マイクロプロセッサ１１は制御パネル１０の構成装置で
あり、サンプル保持具１００（第４図）の中のサンプル
の温度を読み、かつ制御するために使用される。マイク
ロプロセッサ１１はサンプル保持具１００のサンプル支
持金属の温度を読み、サンプル自体には接触しない。マ
イクロプロセッサ１４のプログラム化できる装置は温度
制御機能と温度監視様能を行なうことができる。

制御パネル１０の構成品１５はマイクロプロセッサ１４
用のチャー１〜記録装置である。チャート記録装置１５
はマイクロプロセッサ１４が測定した温度をグラスに描
く。

機械式ポンプ２０（逆送ポンプ）、２０（粗送り）は制
御パネル１０の中にあり、前記１装Ｕに接続される。機
械式ポンプ２０は前記ターボ分子ポンプの背部を真空に
引く。この最初の真空度は典型的には１Ｘ１０−３トー
ルである。また前記機械式ポンプ２０は分子ふるいトラ
ップ２２にも接続され、このトラップ２２は機械式ポン
プ２０からターボ分子ポンプに戻る全ての炭化水素を捕
集する。炭化水素はタービン分子ポンプ３０に全く届か
ないのが基本である。機械式ポンプ及び分子ふるいトラ
ップ２２は直列に配列されるので炭化水素かつ分子ふる
いトラップ２２をバイパスすることは全くない。

分子ふるいトラップ２２はターボ分子ポンプ３０にＴ７
継手２３で結合される。低圧真空計のベルト２４はＴ７
継手２３から延びてディジタル真空計１２に接続される
。

この装置の好ましい実Ｉ＃ｉ態様では、電磁弁２５が第
２図に示す点でＴ７継手２３に結合される。

この電磁弁はターボ分子ポンプ３０に接続されている乾
燥ちつ素ガス用逆送りライン（図示Ｖず）に使用される
。前記真空又は超真空装置が故障したり停止した時には
、前記サンプル室は湿気や炭化水素を含む空気の代りに
不活性のちつ素ガスで満たされる。

ターボ分子ポンプ３０は、本発明の方法を実施するのに
必要とされる１Ｘ１０−８乃至１×１０　　トールの超
高真空を作り出すために使用される。この超高真空ポン
プであるターボ分子ポンプ３０は各種重版の真空ポンプ
の任意のもとでもよい。好ましい実ｆＩＩ！悪様はター
ボ分子ポンプであり、特にレイボルドヘラユース社（Ｌ
　ｃｙｂｏｌｄ　−ＨｅｒａｅＪ、）！１１のターボ分
子ポンプ（ＴＭＰ−３６０型）が好ましい。最も重要な
ことは、前記超高真空ポンプが、ターボ分子ポンプであ
ると否とに拘らず、炭化水素のない真空を作り出ぼるこ
とである。すでに説明したように、□械式ポンプ２０は
サンプル室９０から超高真空ポンプ３０によって取り出
されるガスを送り出すために使用される。

本発明の好ましい実施態様では、冷ＩＪ１ファン３１は
前記ターボ分子ポンプ又は他の超高只空ポンプ３０の軸
承の冷却に使用される。加熱用ベーキングジャケット３
２は超高真空ポンプ３ｏの壁を加熱して、この超高真空
ポンプ内面からガスを硼酸させる。このガス及び液体で
さえも、前記ターボ分子ポンプの内面に凝縮した状態か
ら気体に変換されるので、ターボ分子ポンプ３０によっ
て作り出される真空の真空度が高くなる。熱雷対３３は
加熱用焼成ジャケット３２のエネルギー源（図示せず）
に取りイ］けられる。

コンク２ラツトフランジ４０は前記ターボ分子ポンプを
第１スプール５０に対してシールするのに使用される。

コンフラツ１〜はバリアン工業社（Ｖａｒｉａｎ　Ｉｎ
ｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｉ　ｎｃ）の商標であり、７ランジ
の商品名である。「コンフラツト」の名称を付したフラ
ンジの形は関連業界では周知であり、一般的には、ナイ
フェツジを有する第１而が柔い金属で作られた隣接する
第２面に食い込む形状である。前記部材で前記超高真空
で所望の温度に１分シールできる機能を有する装置はす
でに数多くあるが、最も好ましいのはコンフラジ１〜フ
ランジの１００を使用することであり、これは銅Ｏリン
グシールを有するステンレス鋼のフランジである。

コンフラツトフランジシール４０において非常に重要な
ことは、前記装置のベーキングをしている間、１５０℃
までの温度で十分機能することである。これで標準的な
シール部を有するシールを十分形成することができる。

幸い、フランジ４０を、典型的には弾性材料で作られて
いる従来型の圧縮可能のＯリングでシールしようとして
も必要なシールを形成し４！７ない。

スプール５０はターボ分子ポンプ３０からゲート弁６０
までの管路になる。このスプール５０は４つのコンフラ
ン１〜ノランジを含む。その第１はターボ分子ポンプ３
０と共通のコンフラツトフランジである。第２はコンフ
ラン１−フランジ５１である。第３及び第４のコンフラ
ツトフランジは符号５２．５３で示す。第３のコンフラ
ン１−フランジ５２はスプール５０を残留ガス分析装置
１３の検知用頭部に接続し、第４のコンフラツトフラン
ジ５３は素５０とペイヤードアルバート計器（Ｂ　ａｙ
ａｒｄ−△１ｐｅｒｔ　ｔｌａｌｌ（ｌｅ）との間をシ
ールする。

電気空気式超高真空振子ゲート弁６０は主弁を有し、タ
ーボ分子ポンプ３０をサンプル室９０から分離させる。

ピストンハウジング６１の中のピストンはゲート弁６０
の開閉機構を有する。電磁弁６２とちつ素ガスはゲート
弁６０の開閉に使用される。

第２スプール７０は第２に示したが細部は第３図に示し
たので第３図を参照されたい。第２スプール７０はゲー
ト弁６０からサンプル室９０までの通路を形成し、延長
部７１’、７２，７４．７８を有し、この延長部７１．
７２．７４．７８はスプールのハウジングの主部に接続
される。フランジ７１はサンプル室９０から制御パネル
１０までの電気の通路を有する。フランジ７２と低圧真
空のベルトである。フランジ７２の外側の端部は低圧真
空計ベルト７３のための配管である。低圧真空計ベルト
７３はディジタル真空計１２に接続される。機械式ポン
プ２１に対する超高真空弁７５はスプール７０の延長部
７４の端部にある。この弁７５はサンプル室９０を先行
的にすなわち「成る程度」真空にする。コンフラツトフ
ランジ７６゜７７はスプール７０をゲート弁６０及びセ
ラミック分離スプール８０にたいしてシールするのに使
用される。スプール７０の延長部は第３図に仮想線で示
す過大圧力逃がし弁７８である。

セラミック分離スプール８０はスプール７０及びサンプ
ル室９０に挿入される。この分離スプール８０は、スプ
ール７０の上の装置の部材からその下の凍結用デユワ−
瓶９９への熱の伝達を完全に遮断する（第４図）。この
分離スプール８０がなければ、超高真空ポンプ装置３０
及びこれに接続された伯の部材の外部に霜や氷が頻繁に
付着し成長する。また分離スプール８０は超低圧冷却剤
ずなわら液体ちつ素の使用効率を高める。

サンプル室９０はサンプル保持具１００を支持するのに
使用する。この部材を第４図及び第５図に示す。サンプ
ルｖ９０の樹脂収容室９５と、この樹脂収容室９５の中
をのぞいて見るためのガラス窓を有する。金でシールさ
れた超高真空弁９７と配管９８は樹脂をサンプル室９０
の中に入れるために使用する。ガラス管９１はガラスを
金属に取り付けるアダプタ９２を介してサンプル室９０
に取り付けられ、配管８８は丁字形の金属フランジ９３
に接続される。較正された漏気弁９４は乾燥したちっ素
ガスその他の不活性材料をサンプル室９０に噴出又は浸
透させるのに使用する。管９１は四酸化オスミウムの結
晶を含み、染色処理を行なう段階で四酸化オスミウムの
蒸気をサンプル室に導くのに使用される。支持部材９４
は配管８８．９８をサンプル室９０のハウジングから化
較的遠く引き離して支持するために使用される。

超低温用のデユワ−瓶９９は超低温用冷却剤たとえば液
体ちっ素を貯えておくためのものである。

本発明の装置の最も好ましい態様においては、超低温用
デユワ−瓶９つの中の超低温用冷却剤たとえば液体ちつ
素の液面を検知して自動的に制御するための装置を設（
プる。液体ちつ素やこれと似た冷却剤を使用する時に、
これらの冷却剤は送人後成る時間経過すると蒸発が激し
くなるので、冷却剤の液面を所定の高さに維持するよう
に定期的に冷却剤を補充しなければならない。この補充
は、手動で行なうか、又は自動的に冷却剤の液面を検知
して冷却剤を補充する機構を組み込むことにＪ：り行な
うことができる。

サンプル保持具１００は、第５図及び第６図に示すよう
に、実際のサンプルを支持するために使用される。典型
的には、凍結塔９９はデユワ−瓶の中の液体ちっ索であ
。その基本的特性は前記サンプル温度を一１４０℃Ｊ：
り上げないことである。

凍結塔９９からサンプル保持具ＩＣ）Ｏへの冷却作用は
前記Ｗ３造によって強化される。具体的には第４図を参
照され！こい。

本発明の最も好ましい実７１Ｉ態様においては、エネル
ギー放射加熱装置１２５が設けられ、この装置１２５が
サンプルに対するエネルギー放射源になる。典型的には
前記加熱装置は電圧切換器又は熱雷対により制御される
。制御パネル１０の構成品１４として示すような温度表
示装置が典型的に使用されるので、前記凍結塔環境及び
サンプルの温度を具体的に制御することができる。本発
明の好ましい実７１Ｉ態様においては、放射型加熱装置
及び温度表示装置は全て、コンピュータのマイクロプロ
セッサによって、精密に規定された範囲内に制御される
。

前記以外の形のエネルギーも同様に本発明の装置に使用
することができる。より詳細には、たとえばマイクロ波
、無線放送波、音響波、可視光線、紫外線、又は近紫外
線等の電磁波を使用することかできる。磁束も使用でき
、特に前記形で放射されるエネルギーの何れかと組み合
せれば有用である。この組み合せはその使い方と前記装
謂入れるサンプルに応じて使用する。赤外線照射は避Ｇ
プなければならない。サンプルの特性は、最適のエネル
ギー源を選定するうえで最も重要である。

実際の操作では、サンプルを液体らつ素の温度、すなわ
ら−１４０℃より低い温度でガラス化する。

次にこのサンプルを予め冷却されたビンセットを用いて
液体ちり索のデユワ−瓶から、液体うつ素の温度に冷ｉ
１され池サンプル保持具１００に移す。

このサンプル保持具１００を、予め冷やしたサンプル室
９０の中に入れる。次にサンプル保持具１００から延び
ている熱雷対のリード線１０２を、スプール７０から下
に延びているリード線１０４（第３図）に接続する。こ
れと同様に、加熱装置のリード線１０３をリード線１０
５に接続し、このリード線１０５はスプール７０を貫い
て延びる。

次にサンプル’１９０をスプール７０に、コンフラツト
フランジ７７を介して結合させる。この結合は液体らっ
素浴の中で行なわなければならない。

次に機械式ポンプ２１を作動させてスプール７０とサン
プル室９０を約ｌＸ１０’トールに減圧（粗減圧）する
。次に前記機械式ポンプをサンプル室９０につなぐ弁を
閉じ、ターボ分子ポンプ３０とサンプル室９０との間の
主弁６０を開く。

この時に乾燥工程寸なわら脱水工程が始まる。

前記系統を、制御パネル１０に接続して常に監視されて
いる間は、熱的に平行さ仕ることができる。前記ターボ
分子ポンプで、１×１０−８乃至１×１０　　トールの
真空に引く。前記サイクルそれ自体は残菌ガス分析装置
１３で監視され、この分析装置１３は四分極質が分析装
置を含んでいる。

前記サンプルの温度が１乃至５時間、好ましくは２乃至
４時間変らなければ前記サンプルが平衡状態に達したこ
とを示し、この平衡状態に達した時に、前記温度制御装
置がサンプルの温度を一１５０℃から約−７０℃まで上
げる。この温度を上昇させる速さは１時間当り１乃至３
℃又はそれ以上とＪるのが好ましい。最も好ましい実施
態様では、前記渇匿の上界率を１時間当り１乃至１０℃
にする。温度を上界さけて、残留ガス分析装置１３が示
す水の蒸気の値に変化が認められなくなった時に、前記
サンプルの乾燥が終了したものとする（！Ｉ！型的には
−８５乃至−７０℃である）。次に前記温度を２５℃に
上げる。前記サンプルが２５℃になった時に、前記デユ
ワ−瓶の液体もつ素を排出しサンプル室９０の外壁を室
温にする。

必要に応じてオスミウムの蒸気を前記アダプター９２か
ら導入する。その後、このオスミウムの蒸気を液体ちつ
素トラップの中で再度結晶させて除去する。また、前記
樹脂材料を樹脂収容室９５から配管９８を経て加える。

その後に前記サンプルを取り出してＭ１４脂を重合させ
ることができる。

第１図は本発明の装置を使用Ｊるための段階を略示する
。第１図の破線で囲んだ部分は新規な部分ではなく、本
発明の装置の新規な部分のために使用される装置にすぎ
ない。前記説明および第１図から明らかなように、本発
明の最も重要な点は、ガラス化、分子蒸溜、昇華、脱水
、及びサンプルの平衡にある。これは、従来実施できな
いとされて来たブロスであ。本発明の装置を用いること
により、従来不可能と考えられて来た医学的目標を達成
することができる。

以上、本発明の装置の好ましい実施例をやや訂しく説明
したが、具体的な最終用途のための凍結装置を設語する
者ならば、前記実施例に各種改良を施すことは容易であ
る。前記本発明の詳細な説明は、本発明を限定するため
のものではｔｔり、本発明の好ましい実ｔ１ＭＭ様を示
すにすぎないものである。以上説明した実施例を改良し
変更させた他の装■又はその構成部は本出願に包含され
るべきものである。

本発明の装置を適当に機能さける上で基本的なことは、
サンプル保持具１００を、サンプル室９０の中に整合で
きる形状寸法とし、１箇以上のサンプルを、平衡、昇華
、及び脱水の間、ガラス゛　　化に適する条件のもとに
維持することである。サンプル保持具１００について、
本発明の装置における使用法を具体的に説明したが、よ
り具体的に第４図乃至第６図に示す。

第５図において、サンプル保持具１００は金属のブロッ
ク１１０より成る。この金属ブロック１１０は銅、銀、
または金、あるいは銅、銀、又は金の合金を組み合せた
ものとするのが好ましい。

最も好ましい実施態様では、銀と銅の合金に金をメッキ
したものを使用する。金属ブロック１１０の１つの面に
複数の孔１１１，１１１．・・・を設ける。また、金属
ブロック１１０の中央に孔１２６を設ける。放用熱源装
置１２５を孔１２６に挿入する。前記凍結調整されたサ
ンプルを、すでに説明したように予め冷却したピンセラ
１〜を用いてサンプル収容部１１１に、それぞれ別々に
入れる。

次に前記サンプルを蓋１１３で覆う。この蓋１１３は２
１金で作られた綱部１１４と側壁１１５を有する。この
蓋１１３の形状を、より具体的に第６図に示す、綱部１
１４を特殊な真空接着剤で側壁１１５に取り付ける。半
田付けは適当でない。

その理由はほとんどの半田が通気性を右するからである
。綱部１１４の網目を細かくする稈、所要のガスの移動
が効率よくなる。また、Ｍ１１３は、ゲート弁６０を開
閉した時ような圧力の急変がサンプルに影響するのを防
ぐ作用もする。

テフロン士のスペース１２０は金属ブロック１１０の外
面に間隔をおいて配設され、サンプル室９０の壁その他
の冷えた面との間に適当な空間を形成する。テフロン士
のスリーブ１１９は中央の孔１２６の中に螺合されてリ
ード１１０２゜１０３の接触を防止する。熱電対はサン
プル保持具１００の最上面の位置１２２から外に出る。

サンプル保持具１００は、分析用サンプルを凍結調整に
適する形状寸法で図示したが、より大きいサンプル又は
他の形のサンプルを収容できるように′！Ｊ−ることも
できる。

実際のサンプル調整を行なう時には、各サンプルをサン
プル収容部１１１の中に入れ、蓋１１３を挿入して前記
サンプルの外面をおおう。第５図に示すように、蓋１１
３はサンプル保持具１００の面より少し上まで延びて、
この蓋１１３の取り入れの時につかみ易い部分を形成す
る。本発明の最も好ましい実施態様では、側壁１１５に
長穴１１６があり、この長穴１１６によって前記蓋１１
３を着脱する時に、この蓋１１３が成る程度撓み得るよ
うにする。Ｍ１１３の孔のある面１１４は脱水及び昇華
の際にサンプル収容部１１２の壁に不要な結露が生ずる
のを防ぐ。固い金属ブロック１１０を作るのに好ましい
材料は銅であるが、これ以外の金属、たとえば銀及び金
、または銅、銀、ｂｔ、＜は金の合金の組合せも、すで
に説明したように、銅と同じように使用できる。

金属ブロック１１０を特徴づける機能は、サンプルを超
低温にし、本発明のｌｉ結副調整装置超高真空圧力及び
超低温の条件のもとで、その機能を維持できる点にある
。

放射加熱装置１２５は第５図に示してあり、サンプルに
対する放射熱源を有する。この放射加熱装置１２５は制
御パネル１０により制御される。

制御パネル１０は前記加熱装置を無条件で変化さけるこ
とができる。詳細には、温度の読み取り及び（又は）記
録する装置１４とブヤート記か装置１５は、サンプル収
容部１１２及びその中のサンプルの温度及びその温度の
制御に関する情報を保存する。以上’／１１挙したよう
に、サンプル及びその周囲の温度の制御は本発明の装置
の機能を発揮するために絶対に欠かせないものである。

サンプル保持具１００の最も好ましい態様を第５図に示
ず。この１少ンブル保持具に放射加熱装置１２５が符号
１２６で示すように挿入される。放射加熱装置１２５の
最も好ましい形は２２０ボルト１００ワッ１−のカート
リッジ型加熱器である。

この加熱装置は、サンプル収納部の蓋１１３の側壁の内
面が（分光学的に）研磨され、サンプルに対してエネル
ギーを効率よく放射できる材料でコーティングされてい
れば、効率がさらによくなる。

従って、どうを使用した好ましい態様においては、前記
壁１１５を硫化カリウムで処理して内面を黒色にするこ
とにより、サンプルに対する放射加熱を制御する機構を
作る。必要に応じて壁１１１の内面を同様に分光学的に
処理する。

このにうにして、放射加熱装置たとえばカートリッジ型
加熱器１２５を温度読取記録装置１４ににり制御ｌツる
。前記加熱装置は手動で選択的に作動させることもでき
るが、フランジ化されたコンピュータ又はマイク０プロ
セツサで所要の温度に維持し、温度を所要の速さで変化
させるのが好ましい。金属ブロック１１０を加熱するこ
、とにより、サンプル収容部１１２に熱が伝えられ、こ
の熱がＮ１．１３又は（及び）側壁１１５の分光学的な
］−ティング部分に吸収される。次にこの分光学的なコ
ーティング部分がサンプルに対する放射加熱源として作
用する。

以上、本発明の１ナンブル保持具の好ましい態様をやや
詳細に説明したが、この実施態様は装置の最終目的に応
じて容易に変更できるものである。

前記好ましいサンプル保持具の説明は本発明を限定する
ことを意図するものではなく、本発明の好ましい態様の
単なる例示にすぎない。以上説明した実施例を改良し、
または変更した他のサンプル保持具は本出願に含まれる
ものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の装置の使用に関連を有する方法のフロ
ーチＶ−トの略図、第２図は本発明の装置の斜視略図、
第３図は本発明の装置の真空装置をサンプル室に結合す
る部分の分解図、第４図は本発明の装置のサンプル室と
サンプル保持具の分解図、第５図は本発明のサンプル保
持具の斜視図、第６図は本発明のサンプル保持具に使用
するサンプル収容部の蓋の斜視図である。 １０・・・制御パネル、１１・・・マイク０プロセツサ
、１３・・・残留ガス分析装置、１４・・・温度表示装
置、１５・・・チャート記録装置、２０・・・機械式真
空ポンプ、２２・・・分子ふるいトラップ、２４・・・
低真空計ヘッド、３０・・・ターボ分子ポンプ、３２・
・・ベーキングジャケラ１〜．３３・・・熱雷対、４０
・・・フンフラットフランジ、６０・・・ゲート弁、９
０・・・サンプル室、９５・・・樹脂収容室、９９・・
・凍結浴、１００・・・サンプル保持具、１１０・・・
金属ブロック、１１１・・・サンプル収容部、１１３・
・・蓋、１２５・・・放（ト）加熱装置。 出願人代理人　　佐　　藤　　−雄 ＠面の浄書（内容に変更なし） 手続？１１正書（方式） 昭和６１年３月２７日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、生体組織をガラス状に凍結してサンプルを調整する
   超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置において、前
   記超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置は、 ガラス化された生体組織を支持するサンプル保持具と、 サンプル保持具を凍結温度に維持する装置と、サンプル
   保持具内部雰囲気を減圧する超高真空装置と、 前記ガラス化された生体組織のサンプルを −８０℃より低い凍結温度に維持しつつ前記サンプルを
   脱水する装置とを有することを特徴とする超微細構造分
   析用生体組織の凍結調整装置。 ２、前記生体組織のサンプルは−１４０℃より低い温度
   でガラス化されることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項に記載の超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置。 ３、前記ガラス化は液体ちっ素の装置によって行なわれ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の超微
   細構造分析用生体組織の凍結調整装置。 ４、前記ガラス化は１秒以内に完了することを特徴とす
   る特許請求の範囲第３項に記載の超微細構造分析用生体
   組織の凍結調整装置。 ５、前記減圧は前記サンプルを取り囲む雰囲気を真空に
   引く装置によって行なわれることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項に記載の超微細構造分析用生体組織の凍結
   調整装置。 ６、前記真空は１×１０＾−＾８乃至１×１０＾−＾１
   ＾０トールにされることを特徴とする特許請求の範囲第
   ５項に記載の超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置
   。 ７、前記真空は３０分未満の時間で作り出されることを
   特徴とする特許請求の範囲第６項に記載の超微細構造分
   析用生体組織の凍結調整装置。 ８、前記ガラス化された生体組織のサンプルの平衡の完
   了は、１乃至５時間の範囲の予め選定された時間、温度
   が一定であることにより示されることを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載の超微細構造分析用生体組織の
   凍結調整装置。 ９、前記一定の湿度は−１４０乃至−１９６℃であると
   を特徴とする特許請求の範囲第８項に記載の超微細構造
   分析用生体組織の凍結調整装置。 １０、前記脱水は昇華装置又は強力な分子蒸溜装置によ
   り行なわれることを特徴とする特許請求の範囲第１項に
   記載の超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置。 １１、前記脱水は第２のエネルギー供給装置からのエネ
   ルギーを加えることにより強められることを特徴とする
   特許請求の範囲第１０項に記載の超微細構造分析用生体
   組織の凍結調整装置。 １２、前記第２のエネルギー供給装置のエネルギーは、
   熱エネルギーであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １１項に記載の超微細構造分析用生体組織の凍結調整装
   置。 １３、前記第２のエネルギー供給装置のエネルギーは放
   射エネルギーであることを特徴とする特許請求の範囲第
   １１項記記載の超微細構造分析用生体組織の凍結調整装
   置。 １４、前記放射エネルギーは核磁気共鳴装置によるもの
   であることを特徴とする特許請求の範囲第１３項に記載
   の超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置。 １５、コントラストを強める材料を加えることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の超微細構造分析用生
   体組織の凍結調整装置。 １６、前記コントラストを強める材料は四酸化オスミウ
   ムであることを特徴とする特許請求の範囲第１５項に記
   載の超微細構造分析用生体組織の凍結調整装置。 １７、前記重合は熱によつて行なわれることを特徴とす
   る特許請求の範囲第１６項に記載の超微細構造分析用生
   体組織の凍結調整装置。 １８、前記重合は紫外線の光により行なわれることを特
   徴とする特許請求の範囲第１６項に記載の超微細構造分
   析用生体組織の凍結調整装置。 １９、生体組織をガラス相にするために取り付けられた
   金属の棒状部材を含み、前記棒状部材との接触により前
   記生体組織のサンプルを−１２３℃より低い温度に維持
   する生体組織のサンプルを迅速に超低温に冷却する装置
   と、 前記ガラス化された生体組織を入れるサンプル保持具が
   入るように取り付けられ、凍結浴装置に挿入取出し出来
   るように移動することのできるサンプル室と、 前記サンプル室を１×１０＾−＾８乃至１×１０＾−＾
   １＾０トールに減圧し、前記サンプル室に取り外し得る
   ように取り付けられる超高真空ポンプ装置と、前記サン
   プル室の温度を−１２３℃より低い温度に維持し、前記
   サンプル室の少なくとも一部分を受け入れ得る凍結浴装
   置とを有することを特徴とする生体組織凍結調整装置。 ２０、機械式ポンプを有し、この機械式ポンプは前記超
   高真空装置に結合させることを特徴とする特許請求の範
   囲第１９項に記載の生体組織凍結調整装置。 ２１、前記機械式ポンプ及び前記超高真空ポンプに直列
   に接続された炭化水素捕集トラップを有することを特徴
   とする特許請求の範囲第２０項に記載の生体組織凍結調
   整装置。 ２２、前記炭化水素捕集トラップは分子ふるいトラップ
   であることを特徴とする特許請求の範囲第２１項に記載
   の生体組織凍結調整装置。 ２３、前記超高真空ポンプ装置はターボ分子ポンプを含
   むことを特徴とする特許請求の範囲第１９項に記載の生
   体組織凍結調整装置。 ２４、前記ターボ分子ポンプはベーキングジャケットの
   中に収められることを特徴とする特許請求の範囲第２３
   項に記載の生体組織凍結調整装置。 ２５、ゲート弁を有し、このゲート弁は前記超高真空ポ
   ンプ装置と前記サンプル室装置との間に取り付けられる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１９項に記載の生体
   組織凍結調整装置。 ２６、前記サンプル室は生体組織を樹脂に埋め込むチャ
   ンバを含むことを特徴とする特許請求の範囲第１９項に
   記載の生体組織凍結調整装置。 ２７、前記サンプル室装置は前記生体組織を染色する装
   置を含むことを特徴とする特許請求の範囲第１９項に記
   載の生体組織凍結調整装置。 ２８、前記生体組織を染色する装置は四酸化オスミウム
   を含むことを特徴とする特許請求の範囲第２７項に記載
   の生体組織凍結調整装置。 ２９、サンプル保持具を有し、このサンプル保持具は前
   記サンプル室装置に収容されて整合することを特徴とす
   る特許請求の範囲第１９項に記載の生体組織凍結調整装
   置。 ３０、制御パネルを有することを特徴とする特許請求の
   範囲第１９項に記載の生体組織凍結調整装置。 ３１、前記制御パネルは真空計監視装置、残留ガス分析
   装置、及び温度監視装置を含むことを特徴とする特許請
   求の範囲第３０項に記載の生体組織凍結調整装置。 ３２、生体組織をガラス相にするために取り付けられた
   銅の棒状部材を有し、この棒状部材は前記生体組織を−
   １４０℃より低い温度に維持する生体組織迅速超冷却用
   装置と、 前記ガラス化される生体組織を保持する形のサンプル保
   持具と、 せかガラス化される生体組織を収容するサンプル保持具
   を受け入れるように取り付けられ、凍結浴装置に挿入取
   出しできるよう移動できるサンプル室装置と、 前記サンプル室装置に接続されて前記サンプル室装置を
   １×１０＾−＾３トールに減圧する機械式低真空ポンプ
   と、 前記サンプル室装置を１×１０＾−＾８乃至１×１０＾
   −＾１＾０トールに減圧し、前記サンプル室装置に着脱
   できるように取り付けられた超高真空ポンプ装置と、 前記サンプル室装置を−１４０℃以下の温度に維持し、
   前記サンプル室装置の少なくとも一部分を受け入れ得る
   ように取り付けられた凍結浴装置と、 前記サンプル室内の真空度、温度、及び残留ガスを監視
   するために前記サンプル室装置に電気的に接続された制
   御パネルを有することを特徴とする生体組織凍結調整装
   置。 ３３、分子ふるいトラップを有することを特徴とする特
   許請求の範囲第３２項に記載の生体組織凍結調整装置。 ３４、前記超高真空ポンプ装置はターボ分子ポンプを含
   むことを特徴とする特許請求の範囲第３３項に記載の生
   体組織凍結調整装置。 ３５、前記ターボ分子ポンプはベーキングジャケットの
   中に収められることを特徴とする特許請求の範囲第３４
   項に記載の生体組織凍結調整装置。 ３６、ゲート弁を有し、このゲート弁は前記超高真空ポ
   ンプ装置と前記サンプル室装置との間にあることを特徴
   とする特許請求の範囲第３２項に記載の生体組織凍結調
   整装置。 ３７、前記サンプル室装置は生体組織を樹脂に埋め込む
   チャンバを含むことを特徴とする特許請求の範囲第３２
   項に記載の生体組織凍結調整装置。 ３８、前記サンプル室は前記生体組織を染色する装置を
   含むことを特徴とする特許請求の範囲第３２項に記載の
   生体組織凍結調整装置。 ３９、前記生体組織を染色する装置は四酸化オスミウム
   であることを特徴とする特許請求の範囲第３８項に記載
   の生体組織凍結調整装置。 ４０、生体組織をガラス相にするために取り付けられた
   銅の固い棒状部材を含み、この棒状部材が前記生体組織
   を−１４０℃以下の温度に維持する生体組織の迅速超低
   湿冷却用装置と、 前記ガラス相にされる生体組織を保持する形であり、放
   射加熱装置に接続されたサンプル保持具と、 前記ガラス相にされる生体組織を収容するサンプル保持
   具を受け入れ得るように取り付けられ、凍結浴装置に挿
   入取出しできるよう移動でき、樹脂うめこみようチャン
   バとサンプルを染色する装置とを含むサンプル室装置と
   、 前記サンプル室に接続された前記サンプル室を１×１０
   ＾−＾３トールに減圧する機械式の低真空ポンプ装置と
   、 前記サンプル室装置を１×１０＾−＾８乃至１×１０＾
   −＾１＾０トールに減圧すると共に前記サンプル室装置
   に着脱できるよう取り付けられるターボ分子ポンプと、 前記ターボ分子ポンプと前記サンプル室装置との間にあ
   り、シールされたゲート弁と、 前記ターボ分子ポンプを取り込むベーキングジャケット
   と、 前記サンプル室装置の温度を−１４０℃より低く維持し
   、前記サンプル室装置の少なくとも一部分を受け入れ得
   るように取り付けられた凍結浴装置と、 前記サンプル室装置に接続されて前記サンプル室装置内
   部の真空度、温度及び残留ガスを監視する制御パネルと
   を有することを特徴とする生体組織凍結調整装置。 ４１、前記サンプル保持具は、 生体組織を支持するために取り付けられ、前記生体組織
   の湿気を流出させ、前記サンプルからエネルギーをうば
   い、前記サンプルにエネルギーを与える１箇以上の生体
   組織収納部と、 前記１箇以上の生体組織収納部及び前記生体組織を支持
   し、前記生体組織を凍結温度及び超高真空に維持する装
   置と、 前記１箇以上の生体組織収納部と共働し、前記生体組織
   に対して熱エネルギーを与える放射加熱装置とを有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１９項、第２９項、
   第３２項、又は第４０項に記載の生体組織凍結調整装置
   。 ４２、前記サンプル保持具は１箇以上の生体組織収納部
   の蓋を有し、この蓋は前記１箇以上の生体組織収納部に
   入って整合できる大きさであり、前記１箇以上の蓋のそ
   れぞれの少なくとも一部分に孔があり、この孔から前記
   各生体組織の湿気が流出し、前記各生体組織のエネルギ
   ーを取り、前記生体組織にエネルギーを与えることを特
   徴とする特許請求の範囲第４１項の生体組織凍結調整装
   置。 ４３、前記サンプル保持具の支持装置は金属ブロックを
   有し、この金属ブロックは１つの面に１箇以上の生体組
   織収納部を有し、前記金属ブロックは銅、銀、金、及び
   その組合せの中から選定された材料で作られることを特
   徴とする特許請求の範囲第４１項に記載の生体組織凍結
   調整装置。