DE102009061068B4

DE102009061068B4 - Verfahren zur Herstellung mikroskopierbarer Dünnschnitte von Gewebeproben

Info

Publication number: DE102009061068B4
Application number: DE200910061068
Authority: DE
Inventors: Uwe Höfling; Hermann Ulbrich; Ralf Eckert; Michael Eberhard
Original assignee: Leica Biosystems Nussloch GmbH
Current assignee: Leica Biosystems Nussloch GmbH
Priority date: 2009-04-17
Filing date: 2009-04-17
Publication date: 2015-05-07
Anticipated expiration: 2029-04-18
Also published as: US8959935B2; GB201006233D0; DE102009061068A1; GB2469572B; DE102009017848B4; US20100263390A1; JP2010249821A; JP5629115B2; GB2469572A; CN101865799A; DE102009017848A1

Abstract

Verfahren zur Herstellung mikroskopierbarer Dünnschnitte von Gewebeproben (60), mit folgenden Schritten: Bereithalten eines flüssigen Kühlmittels (70) in einem Gefriermikrotom (10), Einbringen der Gewebeproben (60) in das flüssige Kühlmittel (70), um die Gewebeproben (60) einzufrieren, und Schneiden der eingefrorenen Gewebeproben (60) mittels einer in dem Gefriermikrotom (10) enthaltenen Schneidevorrichtung (26), dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeproben (60) vor dem Einbringen in das flüssige Kühlmittel (70) einzeln jeweils in einer schlauchförmig ausgebildeten Schutzhülle (62) verpackt werden, und die jeweilige, in der jeweiligen Schutzhülle (62) verpackte Gewebeprobe (60) vor dem Einbringen in das flüssige Kühlmittel (70) an einer Aufnahmevorrichtung (64) angebracht und mitsamt der Aufnahmevorrichtung (64) in das flüssige Kühlmittel (70) eingebracht und nach dem Einfrieren aus dem flüssigen Kühlmittel (70) entnommen wird, wobei die Schutzhülle (62) mit der in ihr enthaltenen Gewebeprobe (60) in der Aufnahmevorrichtung (64) derart eingespannt wird, dass ihre zunächst offenen Enden durch jeweils paarweise angeordnete Klemmarme (66, 68), die an der Aufnahmevorrichtung ausgebildet sind, zusammengedrückt und damit verschlossen werden.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung mikroskopierbarer Dünnschnitte von Gewebeproben.
Mit Gefriermikrotomen werden aus Gewebeproben Dünnschnittpräparate hergestellt, die anschließend zu Diagnosezwecken unter einem Mikroskop betrachtet werden. Hierzu werden die Gewebeproben zunächst in einer Kühleinrichtung, auch als Kryostat bezeichnet, eingefroren und dann mittels einer Schneidevorrichtung geschnitten. Die Kühleinrichtung und die Schneidevorrichtung sind gemeinsam in einer Arbeitskammer des Gefriermikrotoms angeordnet.
Die Kühleinrichtung umfasst üblicherweise mittels Peltier-Elementen gekühlte Aufgefrierleisten, an denen die Gewebeproben haltende Objektträger befestigt werden. Diese Art der Probenkühlung hat den Nachteil, dass sich während des Gefrierprozesses in dem Gewebe durch die Kristallisation des zellulären und extrazellulären Wassers langgestreckte Eiskristalle bilden, die Zellen und Zellverbände des Gewebes durchstoßen und sich nachteilig auf die Gewebemorphologie auswirken. Solche Gewebeschädigungen bezeichnet man auch als Gefrierartefakte. Eine mögliche Beeinträchtigung durch Gefrierartefakte besteht beispielsweise darin, dass die beschädigten Zellen endogene Enzyme abgeben, die während einer RNA-Präparation aktiv werden und so das in der Präparation verwendete Substrat abbauen. Dies mindert die Probenqualität und erschwert in der Folge eine zuverlässige Diagnose.
Um Gefrierartefakte zu vermeiden, wird alternativ vorgeschlagen, die Gewebeproben extern, d. h. außerhalb eines Mikrotoms, direkt mittels flüssigen Stickstoffs oder unter Verwendung von stickstoffgekühltem Isopentan einzufrieren. Jedoch ist der Einsatz von flüssigem Stickstoff aufwendig und kostspielig. Zudem birgt das Eingefrieren der Gewebeproben außerhalb des Mikrotoms das Risiko, Gewebeproben zu vertauschen.
Zum Stand der Technik wird ferner auf die US 6 615 592 B2 verwiesen. Dort ist eine Kühleinrichtung beschrieben, bei der ein flüssiges Kühlmittel über Gewebeproben geleitet wird, um diese einzufrieren.
Aus der EP 1 967 836 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung mikroskopischer Dünnschnitte von Gewebeproben bekannt, bei dem sämtliche Gewebeproben in eine Kassette eingebracht werden. Die Kassette wird mit einem Deckel verschlossen, der Öffnungen aufweist. Die Kassette wird dann mitsamt den darin angeordneten Gewebeproben in ein Kühlmedium eingebracht, die durch die in dem Deckel ausgebildeten Öffnungen in das Innere der Kassette gelangt.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung mikroskopierbarer Dünnschnitte von Gewebeproben anzugeben, das eine einfache Handhabung der Gewebeproben unter weitgehender Vermeidung von Gefrierartefakten ermöglicht.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch das Verfahren nach Anspruch 1.
Das Verfahren zur Herstellung mikroskopierbarer Dünnschnitte von Gewebeproben umfasst folgende Schritte: Bereithalten eines flüssigen Kühlmittels in einem Gefriermikrotom; Einbringen der Gewebeproben in das flüssige Kühlmittel, um die Gewebeproben einzufrieren, und Schneiden der eingefrorenen Gewebeproben mittels einer in dem Gefriermikrotom enthaltenen Schneidevorrichtung.
Die Gewebeproben werden vor dem Einbringen in das flüssige Kühlmittel jeweils in einer Schutzhülle verpackt. Als Schutzhülle kann beispielsweise ein Kunststoffschlauch verwendet werden. Die Schutzhülle verhindert, dass das Kühlmittel direkt in Kontakt mit der Gewebeprobe kommt. Kreuzkontaminationen über das flüssige Kühlmittel werden so vermieden.
Die Gewebeproben können mitsamt den Schutzhüllen, in denen sie vor Einbringen in das flüssige Kühlmittel verpackt worden sind, geschnitten werden. Dies erleichtert die Durchführung des Verfahrens.
Die Durchführung des Verfahrens wird weiterhin dadurch erleichtert, dass die jeweilige Gewebeprobe vor dem Einbringen in das flüssige Kühlmittel an einer Aufnahmevorrichtung angebracht und mitsamt der Aufnahmevorrichtung in das flüssige Kühlmittel eingebracht und nach dem Einfrieren aus dem flüssigen Kühlmittel entnommen wird.
Das flüssige Kühlmittel hat zum Einfrieren der Gewebeproben vorzugsweise eine Temperatur in einem Bereich von etwa –60 bis 0°C. Ferner hat es vorzugsweise eine spezifische Wärmekapazität in einem Bereich von etwa 1,6 bis 3,5 kJ/kg·K. So hat sich herausgestellt, dass bei Verwendung eines flüssigen Kühlmittels mit diesen Kenngrößen das zelluläre und extrazelluläre Wasser beim Einfrieren des Gewebes lediglich kleine, sphärische Eiskristalle bildet, die weder Zellen noch Zellverbände schädigen. Somit bleibt die native Gewebemorphologie beim Einfrieren weitgehend erhalten. Diese Erhaltung der Morphologie unterstützt den Pathologen bei der sogenannten Schnellschnittdiagnose. Da die Zellen und Zellverbände weitgehend intakt bleiben und damit die oben genannten endogenen, abbauenden Enzyme praktisch nicht freigesetzt werden, können beispielsweise auch sehr instabile mRNA-Moleküle in relativ hohen Konzentrationen extrahiert werden. Da diese Informationsmoleküle bei der Diagnose beispielsweise von Krebs zunehmend an Bedeutung gewinnen, verspricht die Verwendung eines flüssigen Kühlmittels vorstehend genannter Art einen deutlichen Fortschritt in der Diagnose.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand eines Ausführungsbeispiels unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
1 eine perspektivische Ansicht eines Gefriermikrotoms und
2A, 2B und 2C schematische Darstellungen, die zeigen, wie eine Gewebeprobe verpackt und in das flüssige Kühlmittel eingebracht wird.
1 zeigt ein Gefriermikrotom 10. Das Gefriermikrotom 10 hat einen Gehäuseschrank 12, auf den eine Konsole 14 aufgesetzt ist. An der Konsole 14 befinden sich Bedienfelder 16 und 18 mit Tasten und Anzeigeelementen, über die eine Bedienperson den Betrieb des Gefriermikrotoms 10 steuern kann.
Das Gefriermikrotom 10 hat eine Arbeitskammer 20 mit einem verschiebbaren Deckel 22. In 1 ist der Deckel 22 eingeschoben und damit die Arbeitskammer 20 geöffnet. In der Arbeitskammer 20 sind ein Behälter 24 und eine Schneidevorrichtung 26 untergebracht sind. Ist das Gefriermikrotom 10 in Betrieb, so enthält der Behälter 24 ein in 1 nicht gezeigtes flüssiges Kühlmittel. In das Kühlmittel, dessen Temperatur im Bereich von etwa –60 bis 0°C liegt, werden Gewebeproben eingebracht. Durch das Kühlmittel werden die Gewebeproben eingefroren und damit gehärtet. Aus den gehärteten Gewebeproben können dann mittels der Schneidevorrichtung 26 Dünnschnitte hergestellt werden.
Die Schneidevorrichtung 26 umfasst eine Klemmvorrichtung 28 und ein der Klemmvorrichtung 28 zugewandtes Messer, das in 1 nicht gezeigt ist. An der Klemmvorrichtung 28 ist ein Objektträger anbringbar, der eine Gewebeprobe hält. Die Klemmvorrichtung 28 kann dem ihr zugewandten Messer angenähert werden. Ist die Klemmvorrichtung 28 dem Messer angenähert, so können von der gefrorenen Gewebeprobe Dünnschnitte abgehobelt werden, indem die Klemmvorrichtung 28 mitsamt der Gewebeprobe auf- und abwärts bewegt wird. Diese Auf-Abwärtsbewegung der Klemmvorrichtung 26 kann manuell über ein Handrad 30 oder aber motorisch bewirkt werden.
In 1 ist ferner ein Auffangbehälter 32 für Kondenswasser gezeigt, der an Vorderseite des Gehäuseschranks 12 angeordnet ist.
Unter Bezugnahme auf die 2A, 2B und 2C soll im Folgenden beispielhaft dargestellt werden, wie mittels des Gefriermikrotoms 10 mikroskopierbare Dünnschnitte von Gewebeproben hergestellt werden.
Wie in 2A gezeigt, wird zunächst eine mit 60 bezeichnete Gewebeprobe in eine Schutzhülle 62 gesteckt, die im vorliegenden Ausführungsbeispiel einfach als Kunststoffschlauch ausgebildet ist. Die Schutzhülle 62 wird mit der in ihr enthaltenen Gewebeprobe 60 in einer in 2B gezeigten Aufnahmevorrichtung 64 eingespannt. Dabei kann die Schutzhülle 62 beispielsweise so eingespannt werden, dass ihre zunächst offenen Enden durch jeweils paarweise angeordnete Klemmarme 66, 68, die an der Aufnahmevorrichtung 64 ausgebildet und von denen in den Seitenansichten nach den 2B und 2C jeweils nur ein Klemmarm 66 bzw. 68 gezeigt ist, zusammengedrückt und damit verschlossen werden. In den 2B und 2C ist dies lediglich schematisch angedeutet.
Die Aufnahmevorrichtung 64 wird dann mitsamt der an ihr gehaltenen Schutzhülle 62 in den Behälter 24 gestellt, in dem sich das in 2C mit 70 bezeichnete flüssige Kühlmittel befindet.
In dem vorliegenden Ausführungsbeispiel ist die Aufnahmevorrichtung 64 so ausgebildet, dass sie von der Bedienperson einfach in den Behälter 24 gestellt und aus diesem entfernt werden kann. Hierzu weist die Aufnahmevorrichtung 64 Füße 72 auf, mit denen sie auf den Boden des Behälters 24 gestellt wird. Ferner weist die Aufnahmevorrichtung 64 Griffe 74 auf, die aus dem flüssigen Kühlmittel 66 herausstehen, wenn die Aufnahmevorrichtung 64 in den Behälter 24 gestellt ist. Die Bedienperson kann so die Aufnahmevorrichtung 64 an den Griffen 74 einfach aus dem flüssigen Kühlmittel 70 herausnehmen.
Nachdem die Gewebeprobe 60 in dem flüssigen Kühlmittel 70 eingefroren worden ist, wird sie mit samt der Aufnahmevorrichtung 64 der Schneidevorrichtung 26 zugeführt, um die gewünschten Dünnschnitte herzustellen.
Bezugszeichenliste

10: Gefriermikrotom
12: Gehäuseschrank
14: Konsole
16, 18: Bedienfelder
20: Arbeitskammer
22: Deckel
24: Behälter
26: Schneidevorrichtung
28: Klemmvorrichtung
30: Handrad
32: Auffangbehälter
60: Gewebeprobe
62: Schutzhülle
64: Aufnahmevorrichtung
66, 68: Klemmarme
70: Kühlmittel
72: Füße
74: Griffe

Claims

Verfahren zur Herstellung mikroskopierbarer Dünnschnitte von Gewebeproben (60), mit folgenden Schritten: Bereithalten eines flüssigen Kühlmittels (70) in einem Gefriermikrotom (10), Einbringen der Gewebeproben (60) in das flüssige Kühlmittel (70), um die Gewebeproben (60) einzufrieren, und Schneiden der eingefrorenen Gewebeproben (60) mittels einer in dem Gefriermikrotom (10) enthaltenen Schneidevorrichtung (26), dadurch gekennzeichnet, dass die Gewebeproben (60) vor dem Einbringen in das flüssige Kühlmittel (70) einzeln jeweils in einer schlauchförmig ausgebildeten Schutzhülle (62) verpackt werden, und die jeweilige, in der jeweiligen Schutzhülle (62) verpackte Gewebeprobe (60) vor dem Einbringen in das flüssige Kühlmittel (70) an einer Aufnahmevorrichtung (64) angebracht und mitsamt der Aufnahmevorrichtung (64) in das flüssige Kühlmittel (70) eingebracht und nach dem Einfrieren aus dem flüssigen Kühlmittel (70) entnommen wird, wobei die Schutzhülle (62) mit der in ihr enthaltenen Gewebeprobe (60) in der Aufnahmevorrichtung (64) derart eingespannt wird, dass ihre zunächst offenen Enden durch jeweils paarweise angeordnete Klemmarme (66, 68), die an der Aufnahmevorrichtung ausgebildet sind, zusammengedrückt und damit verschlossen werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Gewebeproben (60) mitsamt den Schutzhüllen (62) geschnitten werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem die Temperatur des flüssigen Kühlmittels (70) zum Einfrieren der Gewebeproben (60) in einem Bereich von etwa –60 bis 0°C gewählt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die spezifische Wärmekapazität des flüssigen Kühlmittels (70) in einem Bereich von etwa 1,6 bis 3,5 kJ/kg·K gewählt wird.