DE3634505A1 - Verfahren zum behandeln einer wasser enthaltenden probe unter einem rasterelektronenmikroskop und einrichtung hierfuer - Google Patents

Verfahren zum behandeln einer wasser enthaltenden probe unter einem rasterelektronenmikroskop und einrichtung hierfuer

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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln einer Wasser enthaltenden Probe mittels eines Mikromanipulators unter einem Rasterelektronenmikroskop und eine Einrichtung hierfür, und zwar betrifft die Erfindung insbesondere ein solches Verfahren zum Behandeln einer Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop, in welchem eine Wasser enthaltende Rohprobe ge- bzw. zerschnitten wird, während sie mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet wird, und brauchbare Fragmente von der Probe zu extrahieren bzw. aus der Probe herauszuholen, und außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine Einrichtung hierfür.
Nach dem Stande der Technik ist es bei den neueren Anwendungen der Biologie wünschenswert, eine Technik zu entwickeln bzw. zur Verfügung zu haben, die für die Verwendung in verschiedenen Untersuchungen geeignet ist, in denen winzige brauchbare Fragmente von einer Rohprobe extrahiert bzw. aus einer Rohprobe entnommen werden, um sie zu züchten oder in sonstiger Weise zu kultivieren. Beispielsweise werden Hyphae von einer gewissen Spezies von Fungi, die an einer Pflanze anhaften, extrahiert bzw. herausgezogen, und die Hyphae werden einer hochgradigen Analyse unterworfen, oder die Hyphae werden von einer gewissen Schimmel- oder Moderspezies extrahiert, und die Hyphae werden gezüchtet oder in sonstiger Weise kultiviert.
Da brauchbare Fragmente, die von einer Probe, wie beispielsweise von Fungi, extrahiert worden sind, sehr winzig sind, ist es notwendig, ein Elektronenmikroskop zu verwenden, um die Fragmente zu beobachten. Es sei hier darauf hingewiesen, daß im Rahmen der vorliegenden Ansprüche und Beschreibung der Begriff "extrahieren" insbesondere die Begriffe "herausziehen, gewinnen, herausholen, extrahieren o. dgl." umfassen soll. Die Vorgängen, die für konventionelle Untersuchungen dieser Art erforderlich sind, umfassen Zerschneiden, beispielsweise einer Pflanze, die Fungi enthält, wobei das Zerschneiden willkürlich erfolgt oder die Pflanze in dünne Abschnitte zerschnitten wird; Beobachten der abgeschnittenen Abschnitte mittels eines Rasterelektronenmikroskops und/oder mittels eines Durchstrahlungselektronenmikroskops; und Untersuchen der Abschnitte nach brauchbaren Fragmenten, die zu extrahieren sind. Bei Anwendung einer solchen konventionellen Art und Weise muß man jedoch warten, ob und gegebenenfalls bis brauchbare Fragmente, zum Beispiel Hyphae, zufällig in oder an den abgeschnittenen Abschnitten entdeckt werden, die man von der aufs Geratewohl zerschnittenen Probe erhalten hat. Weiter ist es, selbst wenn brauchbare Fragmente entdeckt werden, technisch schwierig, die Fragmente wirksam und effektiv zu extrahieren. Demgemäß ist die konventionelle Beobachtung, die zum Extrahieren von brauchbaren Fragmenten von einer Probe erforderlich ist, sehr ineffizient bzw. wenig leistungsfähig, und es ist fast unmöglich, viele winzige brauchbare Fragmente, zum Beispiel Hyphae, von der Probe, wie beispielsweise von einer Pflanze, konstant zu extrahieren. Daher kann ein Rasterelektronenmikroskop bei ernsthaften Untersuchungen, die im Rahmen von biologischen Anwendungen stattfinden, nicht in genügendem bzw. effektivem Umfang für die Behandlung und Untersuchung verwendet werden, beispielsweise für die Extraktion eines Teils der Probe, als weitgehend nur für die Beobachtung zum Zwecke des Findens der Fragmente. Eine entsprechende Schwierigkeit ist beim Vorgang des Extrahierens winziger Abschnitte von Hochmolekülen bzw. sehr großen Molekülen in dem Zustand, in dem ein Gehalt an Wasser oder Lösungsmittel vorliegt, vorhanden.
Kurz zusammengefaßt ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Probenbehandlungsverfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem man in der Lage ist, brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, von einer Wasser enthaltenden Rohprobe, wie beispielsweise Fungi, die an einer Pflanze anhaften, exakt ohne Fehler zu extrahieren.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Probenbehandlungsverfahren zur Verfügung zu stellen, in dem eine Wasser enthaltende Rohprobe, wie beispielsweise Fungi, die an einer Pflanze anhaften, in einem Kühlzustand in ein Rasterelektronenmikroskop gebracht wird, ohne daß bis zum äußersten eine Änderung in der Qualität auftritt, so daß die Probe mittels des Mikroskops mit großer Effektivität beobachtet werden kann und brauchbare Fragmente bei Beobachtung mittels des Mikroskops exakt von der Probe extrahiert werden können.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Einrichtung zur Verfügung zu stellen, in bzw. mit welcher die Verfahrensschritte des Schneidens bzw. Zerschneidens einer Wasser enthaltenden Rohprobe, des Sublimierens von Wasser, das in der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe enthalten ist, und des Extrahierens von brauchbaren Fragmenten mittels eines Manipulators als eine Reihe von Vorgängen in einer Vakuumkammer ausführbar sind.
Das Verfahren und die Einrichtung nach der Erfindung sind insbesondere in den Patentansprüchen angegeben, wenngleich die Erfindung nicht auf die Gegenstände dieser Patentansprüche beschränkt ist, sondern vielmehr alles, was den vorliegenden Unterlagen insgesamt zu entnehmen ist, sofern es nicht ausdrücklich als zum Stand der Technik gehörend bezeichnet ist, zur Erfindung gehört.
Die Erfindung ist nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren der Zeichnung anhand einiger, besonders bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens und der Einrichtung nach der Erfindung näher erläutert; es zeigen:
Fig. 1 eine Reihe von Vorgängen, die mittels einer Ausführungsform des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt werden;
Fig. 2 eine in der Draufsicht gezeigte Schnittansicht, die eine Ausführungsform einer Einrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht, in welcher Vakuumkammern, die je bei einem Vorgang verwendet werden, um eine Arbeitskammer eines Rasterelektronenmikroskops herum angeordnet sind;
Fig. 3A eine Ansicht auf einen Halter einer Probe bzw. für eine Probe;
Fig. 3B eine Längsschnittansicht des Halters der Fig. 3A;
Fig. 4 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in der eine gefrorene Probe ge- bzw. zerschnitten und in der Probe enthaltendes Wasser sublimiert wird;
Fig. 5 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in der eine Probe unter einem optischen Mikroskop behandelt wird;
Fig. 6 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in der leitfähiges Material durch Beschichtung auf eine Probe aufgebracht wird;
Fig. 7 eine Längsschnittansicht, welche die Arbeitskammer und einen kühlenden Objektträger des Rasterelektronenmikroskops zeigt;
Fig. 8 eine Längsschnittansicht eines Mikromanipulators, der zum Behandeln einer Probe unter dem Rasterelektronenmikroskop verwendet wird; und
Fig. 9A, 9B, 9C, 9D und 9E vergrößerte Aufsichten auf jeweilige verschiedene Arten von Nadeln für den Mikromanipulator.
Es seien nun die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben:
Zunächst sei der Aufbau einer Einrichtung zum Behandeln einer Wasser enthaltenden Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop beschrieben.
Es sei zunächst auf Fig. 2 Bezug genommen, in der ein Rasterelektronenmikroskop gezeigt ist, das eine Arbeitskammer D 1 und einen kühlenden Objektträger D 2 hat, der im Zentrum der Kammer D 1 angeordnet ist. Das Mikroskop ist mit einem Sekundärelektronendetektor D 3 versehen. Um die Arbeitskammer D 1 herum sind mehrere Vakuumkammern angeordnet, nämlich eine Vakuumkammer B 1 zum Schneiden bzw. Zerschneiden einer gefrorenen Probe, eine Vakuumkammer C 1 zum Sublimieren von Wasser, das in einer Probe enthalten ist, eine Vakuumkammer E 1 zum Behandeln einer Probe unter einem optischen Mikroskop, eine Vakuumkammer F 1 zum Aufbringen von leitfähigem Material auf eine Probe durch Beschichten und eine Arbeitskammer D 4, deren Benutzung mit einem Mikromanipulator erfolgt. Die Vakuumkammern B 1 und C 1 sind in der gleichen Vakuumkammer bzw. werden von einander gemeinsamen Vakuumkammern umfaßt.
Die Fig. 3A und 3B zeigen einen Halter 1 für eine Probe. der Halter 1 ist mit einer Nut, Rille, Ausnehmung o. dgl. oder einem Loch 1 a versehen, worin eine Probe plaziert wird, sowie mit einer Nadel 1 b, welche die Probe hält, und mit einem Behälter 1 c, in welchem brauchbare Fragmente, die von der Probe extrahiert worden sind, untergebracht werden bzw. enthalten sind. Wenn die Probe eine Fungi enthaltende Suspension ist, wird die Suspension mittels ihrer Oberflächenspannung auf bzw. in der Ausnehmung 1 a gehalten. Wenn die Probe ein Teil einer Pflanze ist, wird die Probe mittels der Nadel 1 b gehalten. Der Halter 1 ist an seinem Boden mit einem Einspann- bzw. Einsteckvorsprung 1 d versehen. Der Vorsprung 1 d des Halters 1 wird mittels eines Halteteils 2 gehalten, das in Fig. 3B durch strichpunktierte Linien angedeutet ist, und die auf dem Halter 1 plazierte Probe wird in einem Gefrierprozeß A (siehe Fig. 1) schnell gefroren. Ein aktuelles bzw. bevorzugtes Verfahren des Schnellgefrierprozesses A besteht darin, daß der Halter 1 schnell in flüssigen Stickstoff eingetaucht wird. Der die schnellgefrorene Probe haltende Halter wird in die in Fig. 2 gezeigten Vakuumkammern B 1 bis F 1 gebracht, so daß die Probe verschiedenen Prozessen (die hier auch als Vorgänge oder Arbeitsgänge bezeichnet sind) in den Vakuumkammern unterworfen wird.
Es sei nun ein aktueller bzw. bevorzugter Aufbau der Vakuumkammern B 1 bis F 1 beschrieben.
Die Fig. 4 zeigt den Aufbau der Vakuumkammern B 1 und C 1. Beide Kammern sind in einer gemeinsamen Vakuumkammer 10 angeordnet bzw. bilden eine gemeinsame Vakuumkammer 10. Die Vakuumkammer 10 wird auf einem Hochvakuum von etwa 10-10 bis 10-11 Torr gehalten. Die Vakuumkammer 10 steht mit der Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops durch ein Absperrventil 11 in Verbindung, das in Fig. 4 rechts angeordnet ist. Eine Vorabsaugkammer 12 bzw. eine Schleusenkammer 12 ist auf der linken Seite der Vakuumkammer 10 angeordnet und von der Vakuumkammer 10 mittels eines Absperrventils 13 getrennt. Die Vorabsaugkammer 12 wird auf einem Niedervakuum von etwa 10-2 Torr gehalten.
Die Kammer 12 ist mittels eines Deckels 14 verschlossen, und ein Stab 15, der zum Bewegen einer Probe verwendet wird, ist durch den Deckel 14 in die Kammer 12 eingeführt. Der Halter 1 wird auf einem Tisch 15 a gehalten, der lösbar mit einem Ende des Stabs 15 verbunden ist.
Die Vakuumkammer B 1 umfaßt einen Kühlblock 16, eine Schneideinrichtung 17, welche die gefrorene Probe roh bzw. grob zerschneidet, und eine Kühlkammer 18, welche die Schneideinrichtung 17 kühlt. Der Kühlblock 16 ist mit flüssigem Stickstoff N2 gefüllt. Der Tisch 15 a wird auf dem Kühlblock 16 plaziert. Die Schneideinrichtung 17 kann eine sich um eine horizontale Achse oder eine sich um eine vertikale Achse drehende Schneideinrichtung bzw. ein sich um eine horizontale Achse oder ein sich um eine vertikale Achse drehendes Messer sein, und sie ist dazu geeignet, eine gefrorene Probe X 1 auf dem Halter 1 manuell zu schneiden bzw. zerschneiden. Die Kühlkammer 18, die, wie bereits erwähnt, mit flüssigem Stickstoff N2 gefüllt ist, und die Schneideinrichtung 17 werden auf einer niedrigen Temperatur gehalten. Ein optisches Mikroskop 19 von niedriger Vergrößerung ist oberhalb des Halters 1 angeordnet. Die ge- bzw. zerschnittene gefrorene Probe X 1 kann mittels des optischen Mikroskops beobachtet werden.
Die Vakuumkammer C 1 umfaßt ein Heizteil 21, das auf dem Kühlblock 16 angeordnet ist, und eine Kühlkammer 22 zur Sublimation, die oberhalb des Heizteils 21 und gegenüber demselben angeordnet ist. Das Heizteil 21 enthält in seinem Inneren einen Heizer 23 und kann den Halter 1 allmählich erhitzen. Die Kühlkammer 22 ist mit flüssigem Stickstoff N2 gefüllt. Die Kühlkammer 22 weist eine äußere untere Oberfläche auf, die eine Sublimationsoberfläche 22 a bildet, welche mit Gold plattiert ist. Der Tisch 15 a wird auf dem Heizteil 21 plaziert, und die gefrorene Probe X 1, die auf dem Tisch 15 a angeordnet ist, befindet gegenüber der Sublimationsoberfläche 22 a, wobei ein kleiner Spalt zwischen der Probe X 1 und der Sublimationsoberfläche 22 a ausgebildet ist. Die Probe X 1 wird mittels des Heizers 23 allmählich erhitzt, so daß in der gefrorenen Probe X 1 enthaltenes Wasser, das von der geschnittenen Oberfläche derselben herkommt, sublimiert bzw. niedergeschlagen wird.
Es ist wünschenswert, daß der Sublimationsvorgang bzw. der Vorgang des Niederschlagens von Wasser ausgeführt wird, während der Tisch 15 a, bezogen auf die Ansicht der Fig. 4, allmählich nach rechts bewegt wird. Um den Abstand zwischen der gefrorenen Probe X 1 und der Sublimationsoberfläche 22 a feineinzustellen, kann das Heizteil 21 fein bzw. leicht nach aufwärts und abwärts bewegt werden. Wenn der Fall vorliegt, daß eine Probe bearbeitet wird, die keinen Sublimationsvorgang erfordert, kann die Vakuumkammer C 1 in einem Aufbau ausgebildet werden, in welchem das Heizteil 21 entfernt werden kann.
Die Fig. 5 zeigt den Aufbau der Vakuumkammer E 1, die dazu verwendet wird, den Vorgang des Behandelns einer Probe unter dem optischen Mikroskop auszuführen. Die Vakuumkammer E 1 dient dazu, die in der Vakuumkammer C 1 der Sublimation unterworfenen Probe mit niedriger Vergrößerung zu beobachten und die Probe in kleinere Abschnitte zu zerschneiden, wenn das notwendig ist. Die Vakuumkammer E 1 umfaßt eine Vakuumkammer 30 und eine Vorabsaugkammer 31 bzw. eine Schleusenkammer 31. Die Vakuumkammer 30 ist von der Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops mittels eines Absperrventils 32 getrennt, und sie ist auch von der Vorabsaugkammer 31 mittels eines Absperrventils 33 getrennt. Die Vorabsaugkammer 31 ist mittels eines Deckels 34 geschlossen, durch den ein Stab 35 zum Bewegen der Probe in die Kammer 31 eingeführt ist. Der Tisch 15 a, auf dem die Probe 1 gehalten wird, kann an das ihm zugewandte Ende des Stabs 35 angekoppelt bzw. mit diesem Ende verbunden werden. In der Kammer 30 ist ein Kühlblock 36 angeordnet, der mit flüssigem Stickstoff N2 gefüllt ist und auf einer niedrigen Temperatur gehalten wird. Der Kühlblock 36 ist mit einem Heizer 37 versehen, so daß die Temperatur des Kühlblocks 36 mittels des Heizers 37 einstellbar ist. Auf dem Kühlblock 36 ist ein Aufwärts- und abwärts-Block 38 bzw. ein aufwärts und abwärts bewegbarer Block 38 angeordnet, und der von dem Stab 35 abgenommene Tisch 15 a wird auf dem Block 38 plaziert. Ein optisches Mikroskop 39 vom Projektionstyp bzw. vom Auflichttyp ist oberhalb der Vakuumkammer 30 angeordnet, und die Objektivlinse 41 bzw. das Objektiv 41 des Mirkoskops 39 ist in die Vakuumkammer 30 eingeführt und befindet sich gegenüber dem Halter 1 in der Kammer 30. Die Objektivlinse 41 bzw. das Objektiv 41 hat einen großen Arbeitsabstand und kann in einer Entfernung von dem Halter 1 gehalten werden, die etwa 10 mm beträgt. Die Brennweite des Objektivs 41 bzw. der Objektabstand wird durch Aufwärts- und Abwärtsbewegung des Block 38 eingestellt.
Ein manueller Manipulator 42 ist in die Vakuumkammer 30 eingeführt. Eine Nadel 42 a ist an einem Ende des Manipulators 42 mittels eines Wärmeisolationsmaterial 42 b angebracht. Die Nadel 42 a kann die gefrorene Probe X 1 auf dem Halter 1 feiner bzw. winziger schneiden bzw. zerschneiden. Vorzugsweise ist eine Mehrzahl von Manipulatoren 42 vorgesehen, von denen je einer ein Messer, eine Nadel, eine Pinzette u. dgl. jeweils hat. Der Behandlungsvorgang der Probe durch den Manipulator 42 wird auf einen Schirm 39 a des Mikroskops 39 projiziert.
Die Fig. 6 zeigt den Aufbau der Vakuumkammer F 1, die dazu verwendet wird, den Vorgang des Aufbringens von leitfähigem Material auf eine Probe durch Beschichtung auszuführen. Die Vakuumkammer F 1 umfaßt eine Vakuumkammer 50, die von der Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops mittels eines Absperrventils 51 abgetrennt bzw. abtrennbar ist, und eine Vorabsaugkammer 52 bzw. eine Schleusenkammer 52, die von der Vakuumkammer 50 mittels eines Absperrventils 53 abtrennbar ist. Die Vorabsaugkammer 52 ist mit einem Deckel 54 versehen, durch den ein Stab 55 zum Bewegen der Probe in die Kammer 52 eingeführt ist, und der Tisch 15 a wird an einem Ende des Stabs 55 angebracht. In der Vakuumkammer 50 ist ein Kühlblock 56 vorgesehen. Der Kühlblock 56 ist mit flüssigem Stickstoff N2 gefüllt und mit einem Heizer 57 versehen, so daß die Temperatur des Kühlblocks 56 mittels des Heizers 57 eingestellt werden kann (es versteht sich von selbst, daß der Kühlblock der vorliegenden Ausführungsform aus einem eigentlichen massiven Blocks besteht, in den Heizer 57 eingeführt ist, und eine darunterliegende Kammer, in die flüssiger Stickstoff eingefüllt ist). Der den Halter 1 haltende Tisch 15 a wird mittels des Stabs 55 in bzw. auf den Kühlblock 56 bewegt.
Eine Stabaustauschkammer 60 ist oberhalb der Vakuumkammer 50 angeordnet und von der Vakuumkammer 50 mittels eines Absperrventils 61 abtrennbar. In der Stabaustauschkammer 60 sind ein Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 und eine Elektrode 63 vorgesehen, welche eine Spannung an den Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 angelegt bzw. diesem zuführt. Der Vorgang des Aufbringens von leitfähigem Material auf die Probe X 1 durch Beschichten kann in der Kammer F 1 dadurch ausgeführt werden, daß man den Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 erhitzt.
Die Fig. 7 zeigt die Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops. Der kühlende Objektträger D 2, der im Zentrum der Arbeitskammer D 1 angeordnet ist, wird mit flüssigem Stickstoff N2 gekühlt. Obwohl das in der Figur nicht gezeigt ist, kann der auf dem kühlenden Objektträger D 2 angeordnete Tisch 15 a von außen her so eingestellt werden, daß eine bzw. die Drehrichtung und ein bzw. der Winkel desselben verändert werden kann. Der kühlende Objektträger D 2 ist dem Kanal 71 des Rasterelektronenstrahls gegenüber angeordnet. Der Sekundärelektronendetektor D 3 ist der Arbeitskammer D 1 zugewandt. Die Vakuumkammern B 1, C 1, E 1 und F 1sind radial um den kühlenden Objektträger D 2 herum angeordnet, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die Stäbe 15, 35 und 55, die in den Vakuumkammern B 1 bzw. E 1 bzw. F 1 vorgesehen sind, können über den kühlenden Objektträger D 2 verlängert bzw. geschoben werden.
Die Fig. 8 zeigt einen bevorzugten Aufbau des Mikromanipulators D 4. Der Mikromanipulator D 4 weist eine Mikromanipulatoraustauschkammer 80 auf, die von der Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops mittels eines Absperrventils 81 abtrennbar ist (wie die gesamte vorstehende Beschreibung in Verbindung mit den Figuren der Zeichnung erkennen läßt, ist unter einem Absperrventil insbesondere ein solches Absperrventil zu verstehen, durch welches hindurch Gegenstände bewegt werden können, das also gleichzeitig als Manipulations- oder Einführungs- oder Ausführungstor zwischen den beiden Kammern dienen kann, die mittels dieses Absperrventils voneinander abtrennbar sind). Eine Vorabsaugeinrichtung, die nicht dargestellt ist, ist benachbart der Austauschkammer 80 vorgesehen. Die Austauschkammer 80 ist mit einem Mikromanipulator 82 versehen. Der Mikromanipulator 82 wird mittels eines Antriebsmechanismus 82 so angetrieben, daß der Mikromanipulator 82 in der x-Richtung und der y-Richtung nach vorwärts und rückwärts bewegt werden kann, wie in Fig. 8 angedeutet ist. Der Antriebsmechanismus 83 weist einen Impulsmotor als Kraftquelle auf und kann den Mikromanipulator 82 so steuern, daß dieser über sehr kurze Strecken entsprechend Operationsbefehlen bewegt wird, die von einem Mikrorechner zugeführt werden.
Eine Nadel 85 ist an einem Ende des Mikromanipulators 82 mittels eines Wärmeisolationsmaterials 84 befestigt. Die Fig. 9A bis 9E zeigen Nadeln von verschiedenen Formen. Die in diesen Figuren gezeigten Nadeln 85 können, wenn notwendig, an dem Mikromanipulator 82 befestigt werden. Die Nadeln sind aus Wolfram ausgebildet, das mit Gold plattiert ist. Die in Fig. 9A gezeigte Nadel hat eine Plattenform, wobei an einem Ende derselben ein Pinhole ausgebildet ist, das einen Durchmesser von etwa 1 bis 2 µm hat. Die Nadel der Fig. 9B ist eine Mikropinzette. Die Nadel der Fig. 9C ist an einem Ende derselben mit einer ovalen Ausnehmung ausgebildet, wobei diese Ausnehmung in der vorliegenden Ausführungsform, wie die Fig. 9C zeigt, durch einen seitlichen Durchgang mit einer Seitenkante verbunden ist, so daß das freie Ende der Nadel 85 insgesamt hakenförmig ist. Die Nadel der Fig. 9D ist ein Mikrobohrer, an dessen einem Ende feine Teilchen aus Diamant haften. Die Nadel der Fig. 9E ist eine Mikronadel, die an ihrem einen Ende scharf bzw. sehr spitz ausgebildet ist.
Es sei nun eine bevorzugte Ausführungsform des hier vorgeschlagenen Verfahrens zur Behandlung einer Wasser enthaltenden Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop unter Verwendung der obigen Einrichtung beschrieben.
Sämtliche Prozesse des Verfahrens umfassen, wie in Fig. 1 dargestellt ist, folgende Vorgänge: einen Prozeß A des schnellen Gefrierens einer rohen Probe X 1, die Wasser enthält; einen Prozeß B des Schneidens bzw. Zerschneidens der gefrorenen Probe unter Vakuum; einen Prozeß C des Sublimierens von Wasser, das in der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe enthalten ist, von deren Schnittoberfläche; einen Prozeß E des groben Schneidens bzw. Zerschneidens der Probe nach der Sublimation, und zwar mittels des Manipulators unter dem optischen Mikroskop; einen Prozeß F des Aufbringens von leitfähigem Material auf die grob ge- bzw. zerschnittene Probe durch Beschichten; und einen Prozeß G des Behandelns der Probe mittels des Mikromanipulators unter dem Rasterelektronenmikroskop, um brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, von der Probe zu extrahieren.
Es sei nun jeder dieser vorstehend erwähnten Prozesse in näheren Einzelheiten beschrieben:
Zunächst wird eine rohe Probe, die Wasser enthält, auf dem Halter 1 gehaltert, wie in den Fig. 3A und 3B gezeigt ist. Wenn die Probe eine Suspension ist, die Fungi enthält, wird die Suspension durch Oberflächenspannung auf bzw. in der Ausnehmung 1 a gehalten. Weiterhin wird die Probe, wenn sie ein Teil einer Pflanze ist, mittels der Haltenadel 1 b gehalten.
In dem Schnellgefrierprozeß A wird der Halter 1 schnell in flüssigen Stickstoff eingetaucht, und das in der Probe X 1 auf dem Halter 1 enthaltene Wasser wird schnell auf eine niedrige Temperatur von -210°C gefroren.
Die Prozesse B und C werden in den in Fig. 4 gezeigten Vakuumkammern B 1 und C 1 ausgeführt. Der Halter 1, der die schnellgefrorene Probe X 1 hält, wird auf dem Tisch 15 a plaziert und wird mittels des ausgefahrenen (d. h. in die Vakuumkammer hinein ausgefahrenen) Stabs 15 auf dem Kühlblock 16 der Vakuumkammer 10 durch Ausfahren des Stabs 15 bewegt bzw. verschoben (sowie gegebenenfalls durch seitliches Verschwenken und/oder Hin- und Herbewegen und/oder Aufwärts- und Abwärtsverschwenken und/oder Drehen und/oder sonstiges Bewegen des Stabs 15). In der Vakuumkammer B 1 wird die gekühlte Schneideinrichtung 17 unter Vakuum und bei einer niedrigen Temperatur betrieben, und die gefrorene Probe X 1 auf dem Halter 1 wird mittels der Schneideinrichtung 17 aufs Geratewohl grob geschnitten bzw. zerschnitten. Der Schneidvorgang wird durch Drehen der Schneideinrichtung 17 bzw. des Schneidwerkzeugs 17 um eine horizontale Achse oder eine vertikale Achse kontinuierlich ausgeführt. Die mittels der Schneideinrichtung 17 bzw. mittels des Schneidwerkzeugs 17 ge- bzw. zerschnittene Probe X 1 wird sofort durch das optische Mikroskop 19 beobachtet. Die Beobachtung mittels des optischen Mikroskops 19 kann während des Schneidens bzw. Zerschneiden der gefrorenen Probe X 1 ausgeführt werden, so daß brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, in der gefrorenen Probe X 1 in der Schnittoberfläche gelassen werden. Unbrauchbare Fragmente der gefrorenen Probe X 1 werden bei dem Schneidprozeß entfernt.
Dann wird der Tisch 15 a über das Heizteil 21 der Vakuumkammer C 1 bewegt bzw. verschoben, und der Heizer 23 wird allmählich erhitzt, während die Schnittoberfläche der gefrorenen Probe X 1 gegenüber der Sublimationsoberfläche 22 a liegt, wobei ein kleiner Spalt zwischen der Schnittoberfläche der Probe X 1 und der Sublimationsoberfläche 22 a vorhanden ist; auf diese Weise wird in der Probe X 1 enthaltenes Wasser sublimiert bzw. an der Oberfläche 22 a niedergeschlagen. Um den Sublimationszustand der Probe X 1 zu beobachten, kann der Tisch 15 a wieder unter das optische Mikroskop 19 zur Beobachtung der Probe bewegt bzw. verschoben werden. Um die Beobachtung zu fördern, kann das optische Mikroskop 19 zwischen den Vakuumkammern b 1 und C 1 angeordnet sein.
Der Prozeß E des Behandelns der Probe unter dem optischen Mikroskop wird, wenn notwendig, ausgeführt. Um mit dem Prozeß E fortzufahren, wird der Tisch 15 a in der Vakuumkammer C 1 mittels des Stabs 15 in die Arbeitskammer D 1 des Rasterelektronenmikroskops bewegt und einmal auf dem kühlende Objektträger D 2 in der Arbeitskammer D 1 plaziert. Der Stab 35, der in der Vakuumkammer E 1 der Fig. 5 vorgesehen ist, wird dann ausgefahren (d. h. in die Kammer hinein ausgefahren), um an dem Tisch 15 a angebracht zu werden, der auf dem kühlenden Objektträger D 2 in der Arbeitskammer D 1 plaziert ist, und der Tisch 15 a wird auf den Aufwärts-und-abwärts-Block 38 in der Vakuumkammer E 1 bewegt. Während die gefrorene Probe X 1 auf dem Tisch 15 a, der auf dem aufwärts und abwärts bewegbaren Block 38 angeordnet ist, mittels des Auflichtmikroskops 39 beobachtet wird, wird die gefrorene Probe X 1 weiter mittels des Manipulators 42 ge- bzw. zerschnitten, so daß Teile, die brauchbare Fragmente in der Probe enthalten, dagelassen (d. h. nicht entfernt) werden und unbrauchbare Teile entfernt werden.
Der Prozeß F des Aufbringens von leitfähigem Material auf die Probe durch Beschichten wird nur dann ausgeführt, wenn es notwendig ist, die in dem Prozeß E grob ge- bzw. zerschnittene Probe mit leitfähigem Material zu beschichten. In dem Prozeß F wird, nachdem die Probe in der Vakuumkammer E 1 der Fig. 5 behandelt worden ist, der Tisch 15 a mittels des Stabs 35 auf den kühlenden Objektträger D 2 in der Arbeitskammer D 1 zurückgebracht. Dann wird der Tisch 15 a mittels des Stabs 55 in der Vakuumkammer F 1, die in Fig. 6 gezeigt ist, zu dem Kühlblock 56 bewegt bzw. gebracht. Die Absperrventile 51 und 53 in der Vakuumkammer F 1 werden geschlossen, und das Absperrventil 61 wird unter Vakuum geöffnet. Eine entsprechende Spannung wird an den Kohlestab 62 angelegt, und Kohlenstoffteilchen, die von dem Kohlestab 62 emittiert werden, werden als Beschichtung auf der gefrorenen Probe X 1 niedergeschlagen bzw. aufgebracht. Nach Vollendung des Prozesses F wird der Tisch 15 a mittels des Stabs 55 auf den kühlenden Objektträger D 2 in der Arbeitskammer zurückgebracht.
Dann wird der Prozeß D des Behandelns der Probe unter dem Rasterelektronenmikroskop ausgeführt. In dem Prozeß D wird eine angemessene Nadel aus den in den Fig. 9A bis 9E gezeigten Nadeln an dem Ende des Mikromanipulators 82 der Fig. 8 befestigt. Die Austauschkammer 80 wird vorher evakuiert, und dann wird das Absperrventil 81 geöffnet. Der Mikromanipulator 82 wird mittels eines Impulsmotors in Übereinstimmung mit Befehlen eines Mikrocomputers angetrieben, um die Nadel 81 auf die gefrorene Probe X 1 zu bewegen. Während die Probe mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet wird, werden brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, mittels der Nadel 85 von der Probe X 1 extrahiert. Die Extraktion wird durch Austauschen der Nadel 85 von verschiedenen Arten, wie in Fig. 9A bis 9E gezeigt, durchgeführt bzw. es können für die Extraktion durch Austausch der Nadel verschiedenste Nadeln der in den Fig. 9A bis 9E gezeigten Art für die Extraktion verwendet werden. Beispielsweise wird die Oberfläche der Probe mittels der Nadel der Fig. 9D rasiert, geschabt, abgeschält oder abgeschabt. Die Nadel der Fig. 9A oder 9C extrahiert oder schneidet Hyphae von der Probe. Die Mikropinzette der Fig. 9B extrahiert Hyphae o. dgl. Die auf diese Weise von der Probe extrahierten brauchbaren Fragmente werden mittels der Mikronadel der Fig. 9E durchstochen, von der Probe X 1 getrennt und in den Behälter 1 c des Halters 1 eingebracht.
Nach Vollendung der obigen Prozesse wird der Halter 1 aus der Arbeitskammer D 1 herausgenommen, und die brauchbaren Fragmente in dem Behälter 1 c des Halters werden für Studien, Untersuchungen und/oder zur Zucht, zum Kultivieren o. dgl. verwendet.
Weiter kann, wie Fig. 1 zeigt, die Behandlungseinrichtung eine trockene Probe Xo behandeln. In diesem Fall wird die trockene Probe Xo zu dem Prozeß E gebracht, um die Probe mittels des Manipulators unter dem optischen Mikroskop grob zu schneiden bzw. zu zerschneiden. Nach dem Prozeß F des Beschichtens der Probe mit leitfähigem Material wird die Probe zu dem Prozeß D gebracht.
Wie oben beschrieben, können mit dem Verfahren zur Behandlung von Proben unter dem Rasterelektronenmikroskop gemäß der vorliegenden Erfindung winzige brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, in der Form von fast rohen bzw. frischen Fragmenten extrahiert werden, da die rohe bzw. frische Probe, welche Wasser enthält und welche sehr schnell eingefroren worden ist, unter Vakuum ge- bzw. zerschnitten werden kann und da nach einer Sublimation brauchbare Fragmente von der Probe extrahiert werden können, während die Probe mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet wird. Demgemäß können die brauchbaren Fragmente für verschiedenste Studien bzw. Untersuchungen, wie beispielsweise für Züchtung oder Kultivierung oder eine Analyse hohen Grades bzw. Hochgradanalyse, verwendet werden.
Weiter kann der Vorgang des Extrahierens der brauchbaren Fragmente von der rohen bzw. frischen Probe exakt mittels einer Reihe von Prozessen unter Verwendung der Probenbehandlungseinrichtung nach der Erfindung, in der ein Rasterelektronenmikroskop verwendet wird, durchgeführt werden.

Claims (5)

1. Verfahren zum Behandeln einer Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Verfahrensschritte umfaßt:
schnelles Gefrieren einer rohen Probe (X 1), die Wasser enthält;
weitgehendes und willkürliches bzw. aufs Geratewohl erfolgendes Schneiden bzw. Zerschneiden der gefrorenen Probe (X 1) unter Vakuum;
ein allmähliches Erwärmen bzw. Erhitzen der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe (X 1) unter Vakuum, so daß Wasser, welches in der Probe (X 1) enthalten ist, sublimiert wird;
Aufbringen eines leitfähigen Materials auf die Probe (X 1) durch Beschichten nach der Sublimation; und
Herausnehmen brauchbarer Fragmente der Probe (X 1) mittel eines Mikromanipulators (82), während man die beschichtete Probe (X 1) durch das Rasterelektronenmikroskop beobachtet.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Verfahrensschritt des weitgehenden und willkürlichen bzw. aufs Geratewohl erfolgenden Schneidens bzw. Zerschneidens der gefrorenen Probe (X 1) unter Vakuum unter einem optischen Mikroskop (39) ausgeführt wird.
3. Einrichtung zum Behandeln einer Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgendes umfaßt:
eine erste Vakuumkammer (B 1) die einen Teil (16) aufweist, in bzw. auf dem eine schnell gefrorene Probe (X 1) plaziert wird, und eine Schneideeinrichtung (17) bzw. ein Schneidwerkzeug (17) zum weitgehenden und willkürlichen bzw. auf Geratewohl erfolgenden Schneiden bzw. Zerschneiden der Probe (X 1);
eine zweite Vakuumkammer (C 1), die einen Teil aufweist, in bzw. auf dem die weitgehend und willkürlich bzw. aufs Geratewohl geschnittene bzw. zerschnittene Probe (X 1) plaziert wird, und ein Heizteil (21) zum allmählichen Erwärmen bzw. Erhitzen der Probe (X 1) zur Sublimierung von Wasser, das in der Probe (X 1) enthalten ist;
eine dritte Vakuumkammer (F 1) zum Beschichten der Probe (X 1) mit leitfähigem Material nach der Sublimation;
wobei die erste, zweite und dritte Vakuumkammer (B 1, C 1, F 1) benachbart einer Arbeitskammer (D 1) des Rasterelektronenmikroskops angeordnet sind;
einen kühlenden Objektträger (D 2), auf dem die Probe (X 1) nach der Sublimation plaziert wird; und
einen sich bis zu dem kühlenden Objektträger (D 2) erstreckenden Mikromanipulator (82) zum Herausnehmen von brauchbaren Fragmenten aus der Probe (X 1) unter dem Rasterelektronenmikroskop;
wobei der kühlende Objektträger (D 2) und der Mikromanipulator (82) in der Arbeitskammer (D 1) des Rasterelektronenmikroskops angeordnet sind.
4. Einrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die erste, zweite und dritte Vakuumkammer (B 1, C 1, F 1) radial um die Arbeitskammer (D 1) des Rasterelektronenmikroskops herum angeordnet sind, und daß jede der Vakuumkammern (B 1, C 1, F 1) von der Arbeitskammer (D 1) durch ein Absperr- bzw. Torventil (11, 32, 51) abtrennbar ist.
5. Einrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein optisches Mikroskop (19) umfaßt, das benachbart der ersten Vakuumkammer (B 1) angeordnet ist.
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