DE3634505C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zum Behandeln einer Probe unter Verwendung eines Elektronenmikroskops, umfas­ send:

• a) eine Arbeitskammer des Elektronenmikroskops;
• b) eine Vakuumkammer, die auf ihrer einen Seite mit einer Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer versehen ist, wobei zwischen der Vakuumkammer und der Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer ein Absperr- bzw. Torventil zum Unterbrechen der Verbindung zwischen der Vakuumkammer und der Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer vorgesehen ist;
• c) einen Probenbewegungsstab zum Bewegen der Probe mittels eines Probenhalters, der mit dem Ende des Pro­ benbewegungsstabs verbindbar ist, aus der Vakuumkammer heraus;
• d) eine in der Vakuumkammer vorgesehene Einrichtung zum Zerteilen der im Probenhalter befindlichen schnellgefrorenen Probe derart, daß ein brauchbares Fragment der Probe auf einer Teilungsoberfläche soweit wie möglich freigelegt wird; und
• e) eine Einrichtung zum Beschichten der im Probenhalter befindlichen Probe mit leitfähigem Material.

Nach dem Stande der Technik ist es bei den neueren Anwendungen der Biologie wünschenswert, eine Technik zur Verfügung zu haben, die für die Verwendung in verschiedenen Untersuchungen geeignet ist, in denen winzige brauchbare Fragmente von einer Rohprobe extrahiert bzw. aus einer Rohprobe entnommen werden, um sie zu züchten oder in sonstiger Weise zu kultivieren. Beispielsweise werden Hyphae von einer gewissen Spezies von Fungi, die an einer Pflanze anhaften, extrahiert bzw. herausgezogen, und die Hyphae werden einer hochgradigen Analyse unterworfen, oder die Hyphae werden von einer gewissen Schimmel- oder Moderspezies extrahiert, und die Hyphae werden gezüchtet oder in sonstiger Weise kultiviert.

Da brauchbare Fragmente, die von einer Probe, wie beispielsweise von Fungi, extrahiert worden sind, sehr winzig sind, ist es notwendig, ein Elektronenmikroskop zu verwenden, um die Fragmente zu beobachten. Es sei hier darauf hingewiesen, daß im Rahmen der vorliegenden Ansprüche und Beschreibung der Begriff "extrahieren" insbesondere die Begriffe "herausziehen, gewinnen, herausholen, extrahieren o. dgl." umfassen soll. Die Vorgänge, die für konventionelle Untersuchungen dieser Art erforderlich sind, umfassen Zerschneiden, beispielsweise einer Pflanze, die Fungi enthält, wobei das Zerschneiden willkürlich erfolgt oder die Pflanze in dünne Abschnitte zerschnitten wird; Beobachten der abgeschnittenen Abschnitte mittels eines Rasterelektronenmikroskops und/oder mittels eines Durchstrahlungselektronenmikroskops; und Untersuchen der Abschnitte nach brauchbaren Fragmenten, die zu extrahieren sind.

Bei Anwendung einer solchen konventionellen Art und Weise muß man jedoch warten, ob und gegebenenfalls bis brauchbare Fragmente, zum Beispiel Hyphae, zufällig in oder an den abgeschnittenen Abschnitten entdeckt werden, die man von der aufs Geratewohl zerschnittenen Probe erhalten hat. Weiter ist es, selbst wenn brauchbare Fragmente entdeckt werden, technisch schwierig, die Fragmente wirksam und effektiv zu extrahieren. Demgemäß ist die konventionelle Beobachtung, die zum Extrahieren von brauchbaren Fragmenten von einer Probe erforderlich ist, sehr ineffizient bzw. wenig leistungsfähig, und es ist fast unmöglich, viele winzige brauchbare Fragmente, zum Beispiel Hyphae, von der Probe, wie beispielsweise von einer Pflanze, konstant zu extrahieren. Daher kann ein Rasterelektronenmikroskop bei ernsthaften Untersuchungen, die im Rahmen von biologischen Anwendungen stattfinden, nicht in genügendem bzw. effektivem Umfang für die Behandlung und Untersuchung verwendet werden, beispielsweise für die Extraktion eines Teils der Probe, als weitgehend nur für die Beobachtung zum Zwecke des Findens der Fragmente. Eine entsprechende Schwierigkeit ist beim Vorgang des Extrahierens winziger Abschnitte von Hochmolekülen bzw. sehr großen Molekülen in dem Zustand, in dem ein Gehalt an Wasser oder Lösungsmittel vorliegt, vor­ handen.

Eine Einrichtung der eingangs genannten gattungsgemäßen Art zum Behandeln einer Probe unter Verwendung eines Elektronenmikroskops ist aus der CH-PS 6 14 532 bekannt, wobei allerdings in dieser Einrichtung die Vakuumkammer zusammen mit ihrer Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer eine von der Arbeitskammer des Elektronenmikroskops völlig unabhängige, gesonderte Baueinheit ist. Diese bekannte Einrichtung dient lediglich zum Zerteilen, nämlich zum Zerbrechen, einer schnellgefrorenen Probe und zu deren Beschichten mit leitfähigem Material in einer einzigen Vakuumkammer, in welche die Probe samt dem Probenhalter durch die Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer und das zwischen letzterer und der Vakuumkammer befindliche Absperr- bzw. Torventil mittels des Probenbewegungsstabs eingebracht wird. Die dem Gegenstand der CH-PS 6 14 532 zugrundeliegende Aufgabe besteht daher, soweit sie zur Beurteilung der vorliegenden Erfindung von Interesse ist, im wesentlichen darin, eine Einrichtung zum Behandeln einer Probe in der Weise zur Verfügung zu stellen, daß diese Probe im schnellgefrorenen Zustand zerbrochen werden kann und die Bruchflächen mit leitfähigem Material beschichtet werden können, damit die so behandelte Probe unter einem Elektronenmikroskop beobachtet werden kann.

Im Gegensatz hierzu besteht die Aufgabe, welche der Erfindung zugrundeliegt, darin, eine Einrichtung der eingangs genannten gattungsgemäßen Art so auszubilden, daß damit winzige brauchbare Fragmente der Probe, wie beispielsweise Hyphae, in der Form von fast rohen bzw. frischen Fragmenten extrahiert werden können, damit diese brauchbaren, winzigen Fragmente für verschiedenste Studien bzw. Untersuchungen, wie beispielsweise für die Züchtung oder Kultivierung, verwendet werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß:

• 1) die Vakuumkammer an ihrer anderen Seite mit einem weiteren Absperr- bzw. Torventil versehen und über dieses mit der Arbeitskammer eines Rasterelektronen­ mikroskops verbunden ist;
• 2) die Vakuumkammer zusammen mit weiteren Vakuumkammern radial um die Arbeitskammer herum vorgesehen ist, wobei auch jede der weiteren Vakuumkammern auf ihrer einen Seite mit einer Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer und einem Absperr- bzw. Torventil zum Unterbrechen der Verbindung zwischen der jeweiligen weiteren Vakuumkammer und ihrer Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer versehen ist, sowie auf ihrer anderen Seite mit einem weiteren Absperr- bzw. Torventil, über welches die jeweilige weitere Vakuumkammer mit der Arbeitskammer des Rasterelektronenmikroskops verbunden ist;
• 3) die weiteren Vakuumkammern ebenfalls mit je einem Proben­ bewegungsstab zum Bewegen der Probe mittels eines Probenhalters, der mit dem Ende des Probenbewegungsstabs verbindbar ist, aus der Vakuumkammer heraus, versehen sind, wobei jeder Probenbewegungsstab durch das geöffnete weitere Absperr- bzw. Torventil seiner Vakuumkammer hindurch bis zu der Arbeitskammer des Rasterelektronenmikroskops, in welcher ein kühlender Objekttisch vorgesehen ist, vorschiebbar ist;
• 4) die Einrichtung zum Zerteilen eine Schneideinrichtung ist, zusammen mit welcher in der ersten Vakuumkammer eine Heizeinrichtung zum allmählichen Erwärmen der mittels der Schneideinrichtung zerschnittenen Probe, während sich diese auf dem Probenhalter befindet, und zum Sublimieren von Feuchtigkeit aus der Probe vorgesehen ist;
• 5) in einer der weiteren Vakuumkammern ein Manipulator zum Beobachten und feineren Zerschneiden der durch das Sublimieren von Feuchtigkeit behandelten Probe vorgesehen ist;
• 6) in einer anderen der weiteren Vakuumkammern die Einrichtung zum Beschichten der feiner zerschnittenen Probe vorgesehen ist; und
• 7) ein Mikromanipulator, der sich oberhalb des kühlenden Objekttisches in der Arbeitskammer des Rasterelektronenmikroskops erstreckt, zum Herausnehmen von brauchbaren Fragmenten aus der mit leitfähigem Material beschichteten und auf dem Objekttisch plazierten Probe vorgesehen ist.

Zwar sind in der Zeitschrift "Mikroskopie", September 1982, S. 960 bis 973, in der Zeitschrift "Elektronenmikroskopie", Labor-Praxis, Juli/August 1982, Seite 812 bis 824, in der DE 27 39 796 A1 und in der Zeitschrift "Mikroskopie", 2/1985, Supplement, Seite 4 bis 14, verschiedenste Einrichtungen zur Kryopräparation von Proben für die Elektronenmikroskopie bekannt. Jedoch ermöglicht es die erfindungsgemäße Einrichtung im Gegensatz zu allen diesen bekannten Einrichtungen, winzigste brauchbare Fragmente, deren Größe beispielsweise im Bereich von 1 µm oder weniger liegt, von fast rohen bzw. frischen Proben so zu extrahieren, daß diese winzigsten Fragmente beispielsweise für Züchtung oder Kultivierung weiterverwendet werden können. Alle Einrichtungen, die in den vorgenannten Druckschriften beschrieben sind, unterscheiden sich sowohl nach der ihnen zugrundeliegenden Aufgabenstellung als auch nach der in ihnen verwirklichten Lösung grundsätzlich von der erfindungsgemäßen Einrichtung. So erfolgt gemäß keiner dieser Druckschriften eine Behandlung der Probe mit einem Manipulator unter einem Rasterelektronenmikroskop zum Zwecke der Aussortierung von winzigsten Fragmenten, sondern, wenn überhaupt, in einer Sub-Kammer, wie beispielsweise gemäß der Zeitschrift "Elektronenmikroskopie", Juli/August 1982, unter einem Ultramikrotom, bei dem eine Handhabung der unter dem Ultramikrotom erzeugten Probenschnitte in üblicher Weise erforderlich ist, wobei diese Sub-Kammer eine völlig von dem Mikroskop losgelöste Kammer ist.

Mit der erfindungsgemäßen Einrichtung wird es ermöglicht:

• (a) eine Wasser enthaltende Rohprobe zu schneiden bzw. zerschneiden, während sie mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet wird, um brauchbare Fragmente von der Probe zu extrahieren;
• (b) brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, von einer Wasser enthaltenden Rohprobe, wie beispielsweise Fungi, die an einer Pflanze anhaften, exakt ohne Fehler zu extrahieren;
• (c) eine Wasser enthaltende Rohprobe, wie beispielsweise Fungi, die an einer Pflanze anhaften, in einem Kühlzustand in ein Rasterelektronenmikroskop zu bringen, ohne daß bis zum äußersten eine Änderung in der Qualität auftritt, so daß die Probe mittels des Mikroskops mit großer Effektivität beobachtet werden kann und brauchbare Fragmente bei Beobachtung mittels des Mikroskops exakt von der Probe extrahiert werden können; und
• (d) das Schneiden bzw. Zerschneiden einer Wasser enthaltenden Rohprobe, das Sublimieren von Wasser, das in der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe enthalten ist, und das Extrahieren von brauchbaren Fragmenten mittels eines Manipulators als eine Reihe von Vorgängen in einer Vakuumkammer auszuführen.

Schließlich zeichnet sich eine bevorzugte Weiterbildung der erfindungsgemäßen Einrichtung dadurch aus, daß in der Vakuumkammer, in welcher sich die Schneideinrichtung zum Zerschneiden der schnellgefrorenen Probe befindet, ein optisches Mikroskop vorgesehen ist, so daß so viel wie möglich brauchbare Fragmente freilegbar sind.

Die Erfindung sei nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren der Zeichnung anhand einiger, besonders bevorzugter Ausführungsformen der Einrichtung nach der Erfindung näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 eine Reihe von Vorgängen, die mittels einer Ausführungsform der Einrichtung gemäß der Erfindung ausgeführt werden können;

Fig. 2 eine in der Draufsicht gezeigte Schnittansicht, die eine Ausführungsform einer Einrichtung gemäß der Erfindung veranschaulicht, in welcher Vakuumkammern, die je bei einem Vorgang verwendet werden, um eine Arbeitskammer eines Rasterelektronenmikroskops herum angeordnet sind;

Fig. 3A eine Aufsicht auf einen Probenhalter;

Fig. 3B eine Längsschnittansicht des Probenhalters der Fig. 3A;

Fig. 4 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in der eine gefrorene Probe ge- bzw. zerschnitten und in der Probe enthaltendes Wasser sublimiert wird;

Fig. 5 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in der eine Probe unter einem optischen Mikroskop behandelt wird;

Fig. 6 eine Längsschnittansicht einer Vakuumkammer, in der leitfähiges Material durch Beschichtung auf eine Probe aufgebracht wird;

Fig. 7 eine Längsschnittansicht, welche die Arbeitskammer und einen kühlenden Objektträger des Rasterelektronenmikroskops zeigt;

Fig. 8 eine Längsschnittansicht eines Mikromanipulators, der zum Behandeln einer Probe unter dem Rasterelektronenmikroskop verwendet wird; und

Fig. 9A, 9B, 9C, 9D und 9E vergrößerte Aufsichten auf jeweilige verschiedene Arten von Nadeln für den Mikromanipulator.

Es seien nun die bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung beschrieben:

Zunächst sei der Aufbau einer Einrichtung zum Behandeln einer Wasser enthaltenden Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop beschrieben.

Es sei zunächst auf Fig. 2 Bezug genommen, in der ein Rasterelektronenmikroskop gezeigt ist, das eine Arbeitskammer D₁ und einen kühlenden Objekttisch D₂ hat, der im Zentrum der Arbeitskammer D₁ angeordnet ist. Das Rasterelektronenmikroskop ist mit einem Sekundärelektronendetektor D₃ versehen. Um die Arbeitskammer D₁ herum sind mehrere Vakuumkammern angeordnet, nämlich eine Vakuumkammer B₁ zum Schneiden bzw. Zerschneiden einer gefrorenen Probe, eine Vakuumkammer C₁ zum Sublimieren von Wasser, das in einer Probe enthalten ist, eine Vakuumkammer E₁ zum Behandeln einer Probe unter einem optischen Mikroskop und eine Vakuumkammer F₁ zum Aufbringen von leitfähigem Material auf eine Probe durch Beschichten. Außerdem ist ein Mikromanipulator D₄ vorgesehen, der sich in die Arbeitskammer D₁ er­ streckt. Die Vakuumkammern B₁ und C₁ sind in der gleichen Vakuumkammer bzw. werden von einander gemeinsamen Vakuumkammern umfaßt.

Die Fig. 3A und 3B zeigen einen Probenhalter 1, der mit einer Ausnehmung, einer Nut, einer Rille, einem Loch o. dgl. 1a versehen ist, worin eine Probe plaziert wird, sowie mit einer Nadel 1b, welche die Probe hält, und mit einem Behälter 1c, in welchem brauchbare Fragmente, die von der Probe extrahiert worden sind, untergebracht werden bzw. enthalten sind. Wenn die Probe eine Fungi enthaltende Suspension ist, wird die Suspension mittels ihrer Oberflächenspannung auf bzw. in der Ausnehmung o. dgl. 1a gehalten. Wenn die Probe ein Teil einer Pflanze ist, wird die Probe mittels der Nadel 1b gehalten. Der Probenhalter 1 ist an seinem Boden mit einem Vorsprung 1d zum Einspannen oder Einstecken versehen. Der Vorsprung 1d des Probenhalters 1 wird mittels eines Halteteils 2 gehalten, das in Fig. 3B durch strichpunktierte Linien angedeutet ist, und die auf dem Probenhalter 1 plazierte Probe wird in einem Gefrierprozeß A (siehe Fig. 1) schnell gefroren. Ein aktueller schnell verlaufender Gefrierprozeß A besteht darin, daß der Probenhalter 1 schnell in flüssigen Stickstoff eingetaucht wird. Der die schnellgefrorene Probe haltende Probenhalter wird in die in Fig. 2 gezeigten Vakuumkammern B₁, C₁, E₁ und F₁ gebracht, so daß die Probe verschiedenen Prozessen (die hier auch als Vorgänge oder Arbeitsgänge bezeichnet sind) in diesen Vakuumkammern unterworfen wird.

Es sei nun ein aktueller bzw. bevorzugter Aufbau der Vakuumkammern B₁, C₁, E₁ und F₁ beschrieben.

Die Fig. 4 zeigt den Aufbau der Vakuumkammern B₁ und C₁. Beide Kammern sind in einer gemeinsamen Vakuumkammer 10 angeordnet bzw. bilden eine gemeinsame Vakuumkammer 10. Die Vakuumkammer 10 wird auf einem Hochvakuum von etwa 1,33 · 10^-8 bis 1,33 · 10^-9 Pa gehalten. Die Vakuumkammer 10 steht mit der Arbeitskammer D₁ des Rasterelektronenmikroskops durch ein Absperr- bzw. Torventil 11 in Verbindung, das in Fig. 4 rechts angeordnet ist. Eine Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 12 ist auf der linken Seite der Vakuumkammer 10 angeordnet und von der Vakuumkammer 10 mittels eines Absperr- bzw. Torventils 13 getrennt. Die Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 12 wird auf einem Niedervakuum von etwa 1,33 Pa gehalten. Die Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 12 ist mittels eines Deckels 14 verschlossen, und ein Probenbewegungsstab 15, der zum Bewegen einer Probe verwendet wird, ist durch den Deckel 14 in die Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 12 eingeführt. Der Probenhalter 1 wird auf einem Tisch 15a gehalten, der lösbar mit einem Ende des Probenbewegungsstabs 15 verbunden ist.

Die Vakuumkammer B₁ umfaßt einen Kühlblock 16, eine Schneideinrichtung 17, welche die gefrorene Probe roh bzw. grob zerschneidet, und eine Kühlkammer 18, welche die Schneideinrichtung 17 kühlt. Der Kühlblock 16 ist mit flüssigem Stickstoff N₂ gefüllt. Der Tisch 15a wird auf dem Kühlblock 16 plaziert. Die Schneideinrichtung 17 kann eine sich um eine horizontale Achse oder eine sich um eine vertikale Achse drehende Schneideinrichtung bzw. ein sich um eine horizontale Achse oder ein sich um eine vertikale Achse drehendes Messer sein, und sie ist dazu geeignet, eine gefrorene Probe X₁ auf dem Probenhalter 1 manuell zu schneiden bzw. zu zerschneiden. Die Kühlkammer 18, die, wie bereits erwähnt, mit flüssigem Stickstoff N₂ gefüllt ist, und die Schneideinrichtung 17 werden auf einer niedrigen Temperatur gehalten. Ein optisches Mikroskop 19 von niedriger Vergrößerung ist oberhalb des Probenhalters 1 angeordnet. Die ge- bzw. zerschnittene gefrorene Probe X₁ kann mittels des optischen Mikroskops 19 beobachtet werden.

Die Vakuumkammer C₁ umfaßt ein Heizteil 21, das auf dem Kühlblock 16 angeordnet ist, und eine Kühlkammer 22 zur Sublimation, die oberhalb des Heizteils 21 und gegenüber demselben angeordnet ist. Das Heizteil 21 enthält in seinem Inneren eine Heizeinrichtung 23 und kann den Probenhalter 1 allmählich erhitzen. Die Kühlkammer 22 ist mit flüssigem Stickstoff N₂ gefüllt. Die Kühlkammer 22 weist eine äußere untere Oberfläche auf, die eine Sublimationsoberfläche 22a bildet, welche mit Gold plattiert ist. Der Tisch 15a wird auf dem Heizteil 21 plaziert, und die gefrorene Probe X₁, die auf dem Tisch 15a angeordnet ist, befindet gegenüber der Sublimationsoberfläche 22a, wobei ein kleiner Spalt zwischen der Probe X₁ und der Sublimationsoberfläche 22a ausgebildet ist. Die Probe X₁ wird mittels der Heizeinrichtung 23 allmählich erhitzt, so daß in der gefrorenen Probe X₁ enthaltenes Wasser, das von der geschnittenen Oberfläche derselben herkommt, sublimiert bzw. niedergeschlagen wird.

Es ist wünschenswert, daß der Sublimationsvorgang bzw. der Vorgang des Niederschlagens von Wasser ausgeführt wird, während der Tisch 15a, bezogen auf die Ansicht der Fig. 4, allmählich nach rechts bewegt wird. Um den Abstand zwischen der gefrorenen Probe X₁ und der Sublimationsoberfläche 22a feineinzustellen, kann das Heizteil 21 fein bzw. leicht nach aufwärts und abwärts bewegt werden. Wenn der Fall vorliegt, daß eine Probe bearbeitet wird, die keinen Sublimationsvorgang erfordert, kann die Vakuumkammer C₁ in einem Aufbau ausgebildet werden, in welchem das Heizteil 21 entfernt werden kann.

Die Fig. 5 zeigt den Aufbau der Vakuumkammer E₁, die dazu verwendet wird, den Vorgang des Behandelns einer Probe unter einem optischen Mikroskop auszuführen. Die Vakuumkammer E₁ dient dazu, die in der Vakuumkammer C₁ der Sublimation unterworfenen Probe mit niedriger Vergrößerung zu beobachten und die Probe in kleinere Abschnitte zu zerschneiden, wenn das notwendig ist. Die Vakuumkammer E₁ umfaßt eine Vakuumkammer 30 und eine Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 31. Die Vakuumkammer 30 ist von der Arbeitskammer D₁ des Raster­ elektronenmikroskops mittels eines Absperr- bzw. Torventils 32 getrennt, und sie ist auch von der Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 31 mittels eines Absperr- bzw. Torventils 33 getrennt. Die Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 31 ist mittels eines Deckels 34 geschlossen, durch den ein Probenbewegungsstab 35 zum Bewegen der Probe in die Vakuumkammer 31 eingeführt ist. Der Tisch 15a, auf dem die Probe X₁ mittels eines Probenhalters 1 gehalten wird, kann an das ihm zugewandte Ende des Probenbewegungsstabs 35 angekoppelt bzw. mit diesem Ende verbunden werden. In der Vakuumkammer 30 ist ein Kühlblock 36 angeordnet, der mit flüssigem Stickstoff N₂ gefüllt ist und auf einer niedrigen Temperatur gehalten wird. Der Kühlblock 36 ist mit einem Heizer 37 versehen, so daß die Temperatur des Kühlblocks 36 mittels des Heizers 37 einstellbar ist. Auf dem Kühlblock 36 ist ein aufwärts und abwärts bewegbarer Block 38 angeordnet, und der von dem Probenbewegungsstab 35 abgenommene Tisch 15a wird auf dem Block 38 plaziert. Ein optisches Mikroskop 39 vom Projektionstyp bzw. vom Auflichttyp ist oberhalb der Vakuumkammer 30 angeordnet, und das Objektiv 41 des Mikroskops 39 ist in die Vakuumkammer 30 eingeführt und befindet sich gegenüber dem Probenhalter 1 in der Vakuumkammer 30. Das Objektiv 41 hat einen großen Arbeitsabstand und kann in einer Entfernung von dem Probenhalter 1 gehalten werden, die etwa 10 mm beträgt. Die Brennweite des Objektivs 41 bzw. der Objektabstand wird durch Aufwärts- und Abwärtsbewegung des Block 38 eingestellt.

Ein manueller Manipulator 42 ist in die Vakuumkammer 30 eingeführt. Eine Nadel 42a ist an einem Ende des Manipulators 42 mittels eines Wärmeisolationsmaterials 42b angebracht. Die Nadel 42a kann die gefrorene Probe X₁ auf dem Probenhalter 1 feiner bzw. winziger schneiden bzw. zerschneiden. Vorzugsweise ist eine Mehrzahl von Manipulatoren 42 vorgesehen, von denen je einer ein Messer, eine Nadel, eine Pinzette u. dgl. jeweils hat. Der Behandlungsvorgang der Probe durch den Manipulator 42 wird auf einen Schirm 39a des Mikroskops 39 projiziert.

Die Fig. 6 zeigt den Aufbau der Vakuumkammer F₁, die dazu verwendet wird, den Vorgang des Aufbringens von leitfähigem Material auf eine Probe durch Beschichtung auszuführen. Die Vakuumkammer F₁ umfaßt eine Vakuumkammer 50, die von der Arbeitskammer D₁ des Rasterelektronenmikroskops mittels eines Absperr- bzw. Torventils 51 abgetrennt bzw. abtrennbar ist, und eine Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 52, die von der Vakuumkammer 50 mittels eines Absperr- bzw. Torventils 53 abtrennbar ist. Die Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 52 ist mit einem Deckel 54 versehen, durch den ein Probenbewegungsstab 55 zum Bewegen der Probe in die Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer 52 eingeführt ist, und der Tisch 15a wird an einem Ende des Probenbewegungsstabs 55 angebracht. In der Vakuumkammer 50 ist ein Kühlblock 56 vorgesehen. Der Kühlblock 56 ist mit flüssigem Stickstoff N₂ gefüllt und mit einem Heizer 57 versehen, so daß die Temperatur des Kühlblocks 56 mittels des Heizers 57 eingestellt werden kann (es versteht sich von selbst, daß der Kühlblock der vorliegenden Ausführungsform aus einem eigentlichen massiven Block besteht, in den der Heizer 57 eingefügt ist, und einer darunterliegenden Kammer, in die flüssiger Stickstoff eingefüllt ist). Der den Probenhalter 1 haltende Tisch 15a wird mittels des Probenbewegungsstabs 55 in bzw. auf den Kühlblock 56 bewegt.

Eine Stabaustauschkammer 60 ist oberhalb der Vakuumkammer 50 angeordnet und von der Vakuumkammer 50 mittels eines Absperrventils 61 abtrennbar. In der Stabaustauschkammer 60 sind ein Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 und eine Elektrode 63 vorgesehen, welche eine Spannung an den Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 anlegt bzw. diesem zuführt. Der Vorgang des Aufbringens von leitfähigem Material auf die Probe X₁ durch Beschichten kann in der Vakuumkammer F₁ dadurch ausgeführt werden, daß man den Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 erhitzt.

Die Fig. 7 zeigt die Arbeitskammer D₁ des Rasterelektronenmikroskops. Der kühlende Objekttisch D₂, der im Zentrum der Arbeitskammer D₁ angeordnet ist, wird mit flüssigem Stickstoff N₂ gekühlt. Obwohl das in der Figur nicht gezeigt ist, kann der auf dem kühlenden Objekttisch D₂ angeordnete Tisch 15a von außen her so eingestellt werden, daß die Drehrichtung und der Winkel desselben verändert werden kann. Der kühlende Objekttisch D₂ ist dem Kanal 71 des Rasterelektronenstrahls gegenüber angeordnet. Der Sekundärelektronendetektor D₃ ist der Arbeitskammer D₁ zugewandt. Die Vakuumkammern B₁, C₁, E₁ und F₁ sind radial um den kühlenden Objekttisch D₂ herum angeordnet, wie in Fig. 2 gezeigt ist. Die Probenbewegungsstäbe 15, 35 und 55, die in den Vakuumkammern B₁ bzw. E₁ bzw. F₁ vorgesehen sind, können über den kühlenden Objekttisch D₂ verlängert bzw. geschoben werden.

Die Fig. 8 zeigt einen bevorzugten Aufbau des Mikromanipulators D₄. Der Mikromanipulator D₄ weist eine Mikromanipulatoraustauschkammer 80 auf, die von der Arbeitskammer D₁ des Rasterelektronenmikroskops mittels eines Absperrventils 81 abtrennbar ist (wie die gesamte vorstehende Beschreibung in Verbindung mit den Figuren der Zeichnung erkennen läßt, ist unter einem Absperrventil insbesondere ein solches Absperrventil zu verstehen, durch welches hindurch Gegenstände bewegt werden können, das also gleichzeitig als Manipulations- oder Einführungs- oder Ausführungstor zwischen den beiden Kammern dienen kann, die mittels dieses Absperrventils voneinander abtrennbar sind). Eine Vorabsaugeinrichtung, die nicht dargestellt ist, ist benachbart der Mikromanipulatoraustauschkammer 80 vorgesehen. Die Mikromanipulatoraustauschkammer 80 ist mit einem Mikromanipulator 82 versehen. Der Mikromanipulator 82 wird mittels eines Antriebsmechanismus 83 so angetrieben, daß der Mikromanipulator 82 in der x-Richtung und der y-Richtung nach vorwärts und rückwärts bewegt werden kann, wie in Fig. 8 angedeutet ist. Der Antriebsmechanismus 83 weist einen Impulsmotor als Kraftquelle auf und kann den Mikromanipulator 82 so steuern, daß dieser über sehr kurze Strecken entsprechend Operationsbefehlen bewegt wird, die von einem Mikrorechner zugeführt werden.

Eine Nadel 85 ist an einem Ende des Mikromanipulators 82 mittels eines Wärmeisolationsmaterials 84 befestigt. Die Fig. 9A bis 9E zeigen Nadeln von verschiedenen Formen. Die in diesen Figuren gezeigten Nadeln 85 können, wenn notwendig, an dem Mikromanipulator 82 befestigt werden. Die Nadeln 85 sind aus Wolfram ausgebildet, das mit Gold plattiert ist. Die in Fig. 9A gezeigte Nadel 85 hat eine Plattenform, wobei an einem Ende derselben ein Pinhole ausgebildet ist, das einen Durchmesser von etwa 1 bis 2 µm hat. Die Nadel 85 der Fig. 9B ist eine Mikropinzette. Die Nadel 85 der Fig. 9C ist an einem Ende derselben mit einer ovalen Ausnehmung ausgebildet, wobei diese Ausnehmung in der vorliegenden Ausführungsform, wie die Fig. 9C zeigt, durch einen seitlichen Durchgang mit einer Seitenkante verbunden ist, so daß das freie Ende der Nadel 85 insgesamt hakenförmig ist. Die Nadel 85 der Fig. 9D ist ein Mikrobohrer, an dessen einem Ende feine Teilchen aus Diamant haften. Die Nadel 85 der Fig. 9E ist eine Mikronadel, die an ihrem einen Ende scharf bzw. sehr spitz ausgebildet ist.

Es sei nun eine bevorzugte Ausführungsform der Behandlung einer Wasser enthaltenden Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop unter Verwendung der hier vorgeschlagenen Einrichtung beschrieben.

Sämtliche Prozesse dieser Behandlung umfassen, wie in Fig. 1 dargestellt ist, folgende Vorgänge: einen Prozeß A des Schnellgefrierens einer rohen Probe X, die Wasser enthält; einen Prozeß B des Zerschneidens der gefrorenen Probe unter Vakuum bzw. des Schneidens der Probe; einen Prozeß C des Sublimation von Wasser, das in der geschnittenen bzw. zerschnittenen Probe enthalten ist, von deren Schnittoberfläche; einen Prozeß E des Behandelns der Probe unter dem optischen Mikroskop, der ein grobes Schneiden bzw. Zerschneiden der Probe nach der Sublimation mittels des Manipulators beinhaltet; einen Prozeß F des Beschichtens mit leitfähigem Material, das auf die grob ge- bzw. zerschnittene Probe aufgebracht wird; und einen Prozeß G des Behandelns der Probe unter dem Rasterelektronenmikroskop mittels des Mikromanipulators, um brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, von der Probe zu extrahieren.

Es sei nun jeder dieser vorstehend erwähnten Prozesse in näheren Einzelheiten erläutert:

Zunächst wird eine rohe Probe, die Wasser enthält, auf dem Probenhalter 1 gehaltert, wie in den Fig. 3A und 3B gezeigt ist. Wenn die Probe eine Suspension ist, die Fungi enthält, wird die Suspension durch Oberflächenspannung auf bzw. in der Ausnehmung o. dgl. 1a gehalten. Weiterhin wird die Probe, wenn sie ein Teil einer Pflanze ist, mittels der Nadel 1b gehalten.

In dem Prozeß A wird der Probenhalter 1 schnell in flüssigen Stickstoff eingetaucht, und das in der Probe X auf dem Probenhalter 1 enthaltene Wasser wird schnell auf eine niedrige Temperatur von -210°C gefroren.

Die Prozesse B und C werden in den in Fig. 4 gezeigten Vakuumkammern B₁ und C₁ ausgeführt. Der Probenhalter 1, der die schnellgefrorene Probe X₁ hält, wird auf dem Tisch 15a plaziert und wird mittels des ausgefahrenen (d. h. in die Vakuumkammer hinein ausgefahrenen) Probenbewegungsstabs 15 auf dem Kühlblock 16 der Vakuumkammer 10 durch Ausfahren des Probenbewegungsstabs 15 bewegt bzw. verschoben (sowie gegebenenfalls durch seitliches Verschwenken und/oder Hin- und Herbewegen und/oder Aufwärts- und Abwärtsverschwenken und/oder Drehen und/oder sonstiges Bewegen des Probenbewegungsstabs 15). In der Vakuumkammer B₁ wird die gekühlte Schneideinrichtung 17 unter Vakuum und bei einer niedrigen Temperatur betrieben, und die gefrorene Probe X₁ auf dem Probenhalter 1 wird mittels der Schneideinrichtung 17 aufs Geratewohl grob geschnitten bzw. zerschnitten. Der Schneidvorgang wird durch Drehen der Schneideinrichtung 17 bzw. des Schneidwerkzeugs derselben um eine horizontale Achse oder eine vertikale Achse kontinuierlich ausgeführt. Die mittels der Schneideinrichtung 17 ge- bzw. zerschnittene Probe X₁ wird sofort durch das optische Mikroskop 19 beobachtet. Die Beobachtung mittels des optischen Mikroskops 19 kann während des Schneidens bzw. Zerschneidens der gefrorenen Probe X₁ ausgeführt werden, so daß brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, in der gefrorenen Probe X₁ in der Schnittoberfläche gelassen werden. Unbrauchbare Fragmente der gefrorenen Probe X₁ werden bei dem Schneidprozeß entfernt.

Dann wird der Tisch 15a über das Heizteil 21 der Vakuumkammer C₁ bewegt bzw. verschoben, und die Heizeinrichtung 23 wird allmählich erhitzt, während die Schnittoberfläche der gefrorenen Probe X₁ gegenüber der Sublimationsoberfläche 22a liegt, wobei ein kleiner Spalt zwischen der Schnittoberfläche der Probe X₁ und der Sublimationsoberfläche 22a vorhanden ist; auf diese Weise wird in der Probe X₁ enthaltenes Wasser sublimiert bzw. an der Sublimationsoberfläche 22a niedergeschlagen. Um den Sublimationszustand der Probe X₁ zu beobachten, kann der Tisch 15a wieder unter das optische Mikroskop 19 zur Beobachtung der Probe bewegt werden. Um die Beobachtung zu fördern, kann das optische Mikroskop 19 zwischen den Vakuumkammern B₁ und C₁ angeordnet sein.

Der Prozeß E des Behandelns der Probe unter dem optischen Mikroskop wird, wenn notwendig, ausgeführt. Um mit dem Prozeß E fortzufahren, wird der Tisch 15a in der Vakuumkammer C₁ mittels des Probenbewegungsstabs 15 in die Arbeitskammer D₁ des Rasterelektronenmikroskops bewegt und einmal auf dem kühlenden Objekttisch D₂ in der Arbeitskammer D₁ plaziert. Der Probenbewegungsstab 35, der in der Vakuumkammer E₁ der Fig. 5 vorgesehen ist, wird dann ausgefahren (d. h. in die Vakuumkammer hinein ausgefahren), um an dem Tisch 15a angebracht zu werden, der auf dem kühlenden Objekttisch D₂ in der Arbeitskammer D₁ plaziert ist, und der Tisch 15a wird auf den Block 38 in der Vakuumkammer E₁ bewegt. Während die gefrorene Probe X₁ auf dem Tisch 15a, der auf dem aufwärts und abwärts bewegbaren Block 38 angeordnet ist, mittels des Mikroskops 39 in Aufsicht beobachtet wird, wird die gefrorene Probe X₁ weiter mittels des Manipulators 42 so ge- bzw. zer­ schnitten, daß Teile, die brauchbare Fragmente in der Probe enthalten, dagelassen (d. h. nicht entfernt) werden und unbrauchbare Teile entfernt werden.

Der Prozeß F des Aufbringens von leitfähigem Material wird nur dann ausgeführt, wenn es notwendig ist, die in dem Prozeß E grob ge- bzw. zerschnittene Probe mit leitfähigem Material zu beschichten. In dem Prozeß F wird, nachdem die Probe in der Vakuumkammer E₁ der Fig. 5 behandelt worden ist, der Tisch 15a mittels des Probenbewegungsstabs 35 auf den kühlenden Objektträger D₂ in der Arbeitskammer D₁ zurückgebracht. Dann wird der Tisch 15a mittels des Probenbewegungsstabs 55 in der Vakuumkammer F₁, die in Fig. 6 gezeigt ist, zu dem Kühlblock 56 gebracht. Die Absperr- bzw. Torventile 51 und 53 in der Vakuumkammer F₁ werden geschlossen, und das Absperrventil 61 wird unter Vakuum geöffnet. Eine entsprechende Spannung wird an den Kohlenstoff- bzw. Kohlestab 62 angelegt, und Kohlenstoffteilchen, die von diesem emittiert werden, werden als Beschichtung auf der gefrorenen Probe X₁ niedergeschlagen. Nach Vollendung des Prozesses F wird der Tisch 15a mittels des Probenbewegungsstabs 55 auf den kühlenden Objekttisch D₂ in der Arbeitskammer D₁ zurückgebracht.

Dann wird der Prozeß D des Behandelns der Probe unter dem Rasterelektronenmikroskop ausgeführt. In dem Prozeß D wird eine angemessene Nadel 85 aus den in den Fig. 9A bis 9E gezeigten Nadeln 85 an dem Ende des Mikromanipulators 82 der Fig. 8 befestigt. Die Mikromanipulatoraustauschkammer 80 wird vorher evakuiert, und dann wird das Absperrventil 81 geöffnet. Der Mikromanipulator 82 wird mittels eines Impulsmotors in Übereinstimmung mit Befehlen eines Mikrocomputers angetrieben, um die Nadel 85 auf die gefrorene Probe X₁ zu bewegen. Während die Probe mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet wird, werden brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, mittels der Nadel 85 von der Probe X₁ extrahiert. Es können für die Extraktion durch Austausch der Nadel 85 verschiedenste Nadeln 85 der in den Fig. 9A bis 9E gezeigten Art für die Extraktion verwendet werden. Beispielsweise wird die Oberfläche der Probe mittels der Nadel 85 der Fig. 9D rasiert, geschabt, abgeschält oder abgeschabt. Die Nadel 85 der Fig. 9A oder 9C extrahiert oder schneidet Hyphae von der Probe. Die als Mikropinzette ausgebildete Nadel 85 der Fig. 9B extrahiert Hyphae o. dgl. Die auf diese Weise von der Probe extrahierten brauchbaren Fragmente werden mittels der als Mikronadel ausgebildeten Nadel 85 der Fig. 9E durchstochen, von der Probe X₁ getrennt und in den Behälter 1c des Probenhalters 1 eingebracht.

Nach Vollendung der obigen Prozesse wird der Probenhalter 1 aus der Arbeitskammer D₁ herausgenommen, und die brauchbaren Fragmente in dem Behälter 1c werden für Studien, Untersuchungen und/oder zur Zucht, zum Kultivieren o. dgl. verwendet.

Weiter kann, wie Fig. 1 zeigt, die Einrichtung eine trockene Probe X_o behandeln. In diesem Fall wird die trockene Probe X_o zu dem Prozeß E gebracht, um diese Probe mittels des Manipulators 42 (Fig. 5) unter dem optischen Mikroskop 39 grob zu schneiden bzw. zu zerschneiden. Nach dem Prozeß F des Beschichtens der Probe mit leitfähigem Material wird die Probe zu dem Prozeß D gebracht.

Wie oben beschrieben, können mit der hier vorgeschlagenen Einrichtung zum Behandeln einer Probe unter einem Rasterelektronenmikroskop winzige brauchbare Fragmente, wie beispielsweise Hyphae, in der Form von fast rohen bzw. frischen Fragmenten extrahiert werden, da die rohe bzw. frische Probe, welche Wasser enthält und welche sehr schnell eingefroren worden ist, unter Vakuum ge- bzw. zerschnitten werden kann und da nach einer Sublimation brauchbare Fragmente von der Probe extrahiert werden können, während die Probe mittels des Rasterelektronenmikroskops beobachtet wird. Demgemäß können die brauchbaren Fragmente für verschiedenste Studien bzw. Untersuchungen, wie beispielsweise für Züchtung oder Kultivierung oder eine Analyse hohen Grades bzw. Hochgradanalyse, verwendet werden. Der Vorgang des Extrahierens der brauchbaren Fragmente von der rohen bzw. frischen Probe kann mittels einer Reihe von bestimmten Prozessen, wie sie vorstehend erläutert sind, in dieser Einrichtung exakt durchgeführt werden.

Claims (3)

1. Einrichtung zum Behandeln einer Probe unter Verwendung eines Elektronenmikroskops, umfassend:

• a) eine Arbeitskammer des Elektronenmikroskops;
• b) eine Vakuumkammer, die auf ihrer einen Seite mit einer Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer versehen ist, wobei zwischen der Vakuumkammer und der Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer ein Absperr- bzw. Torventil zum Unterbrechen der Verbindung zwischen der Vakuumkammer und der Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer vorgesehen ist;
• c) einen Probenbewegungsstab zum Bewegen der Probe mittels eines Probenhalters, der mit dem Ende des Pro­ benbewegungsstabs verbindbar ist, aus der Vakuumkammer heraus;
• d) eine in der Vakuumkammer vorgesehene Einrichtung zum Zerteilen der im Probenhalter befindlichen schnellgefrorenen Probe derart, daß ein brauchbares Fragment der Probe auf einer Teilungsoberfläche soweit wie möglich freigelegt wird; und
• e) eine Einrichtung zum Beschichten der im Probenhalter befindlichen Probe mit leitfähigem Material;

dadurch gekennzeichnet, daß;

• f) die Vakuumkammer (B₁, C₁) an ihrer anderen Seite mit einem weiteren Absperr- bzw. Torventil (11) versehen und über dieses mit der Arbeitskammer (D₁) eines Rasterelektronenmikroskops verbunden ist;
• g) die Vakuumkammer (B₁, C₁) zusammen mit weiteren Vakuumkammern (E₁, F₁) radial um die Arbeitskammer (D₁) herum vorgesehen ist, wobei auch jede der weiteren Vakuumkammern (E₁, F₁) auf ihrer einen Seite mit einer Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer (31, 52) und einem Absperr- bzw. Torventil (33, 53) zum Unterbrechen der Verbindung zwischen der jeweiligen weiteren Vakuumkammer (E₁, F₁) und ihrer Vorabsaug- bzw. Schleusenkammer (31, 52) versehen ist, sowie auf ihrer anderen Seite mit einem weiteren Absperr- bzw. Torventil (32, 51), über welches die jeweilige weitere Vakuum­ kammer (E₁, F₁) mit der Arbeitskammer (D₁) des Raster­ elektronenmikroskops verbunden ist;
• h) die weiteren Vakuumkammern (E₁, F₁) ebenfalls mit je einem Probenbewegungsstab (35, 55) zum Bewegen der Probe (X₁) mittels eines Probenhalters (1, 15a), der mit dem Ende des Probenbewegungsstabs (35, 55) verbindbar ist, aus der Vakuumkammer (E₁, F₁) heraus, versehen ist, wobei jeder Probenbewegungsstab (15, 35, 55) durch das geöffnete weitere Absperr- bzw. Torventil (11, 32, 51) seiner Vakuumkammer (B₁, C₁, E₁, F₁) hindurch bis zu der Arbeitskammer (D₁) des Rasterelektronenmikroskops, in welcher ein kühlender Objekttisch (D₂) vorgesehen ist, vorschiebbar ist;
• i) die Einrichtung zum Zerteilen eine Schneideinrichtung (17) ist, zusammen mit welcher in der ersten Vakuumkammer (B₁, C₁) eine Heizeinrichtung (23) zum allmählichen Erwärmen der mittels der Schneideinrichtung (17) zerschnittenen Probe (X₁), während sich diese auf dem Probenhalter (1, 15a) befindet, und zum Sublimieren von Feuchtigkeit aus der Probe (X₁) vor­ gesehen ist;
• j) in einer (E₁) der weiteren Vakuumkammern (E₁, F₁) ein Manipulator (42) zum Beobachten und feineren Zerschneiden der durch das Sublimieren von Feuchtigkeit behandelten Probe (X₁) vorgesehen ist;
• k) in einer anderen (F₁) der weiteren Vakuumkammern (E₁, F₁) die Einrichtung (62, 63) zum Beschichten der feiner zerschnittenen Probe (X₁) vorgesehen ist; und
• l) ein Mikromanipulator (D₄), der sich oberhalb des kühlenden Objekttisches (D₂) in der Arbeitskammer (D₁) des Rasterelektronenmikroskops erstreckt, zum Herausnehmen von brauchbaren Fragmenten aus der mit leitfähigem Material beschichteten und auf dem Objekttisch (D₁) plazierten Probe (X₁) vorgesehen ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in der Vakuumkammer (B₁, C₁), in welcher sich die Schneideinrichtung (17) zum Zerschneiden der schnellgefrorenen Probe (X₁) befindet, ein optisches Mikroskop (19) vorgesehen ist, so daß so viel wie möglich brauchbare Fragmente freilegbar sind.