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Einrichtung zur Gefriertrocknung und gegebenenfalls
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Kunstharz-Imprägnation kleiner biologischer Objekte die die elektronenmikroskopische
Untersuchung
Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Gefriertrecknung
und gegebenenfalls Kunstharz-Imprägnation kleiner biologischer Objeckte für die
elektronenmikroskopische Untersuchung, mit einem zumindest eine Vertiefung für die
Aufnahme eines Objektes aufweisenden Probenteller, der von einem evakuierbaren Behäntr
umschlossen und durch eine Kühlflüssigkeit sowie eine mit dem Probenteller verbundene
regelbare Heizeinrichtung auf eine gewünschte Temperatur temperierbar ist.
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Eine herkömmliche Einrichtung der vorstehend geschilderten Art, die
für die lichtmikroskopische, insbesondere histochemische Arbeit bestimmt ist, ist
in einem Ausführungsbeispiel in Figur 1 dargestellt. Demnach besteht die Einrichtung
aus einer Hochvakuumanlage, welche beispielsweise aus einer Rotationspumpe 1 und
einer Öldiffusionspumpe 2 sowie alls einem Rezipienten aufgebaut ist, der über einen
Dichtungsring 4 auf einer Bodenplatte 5 vakuumdicht aufliegt. In den Rezipienten
3 ist durch ein Dichtungselement 6 hindurch ein Metallstab 7 eingeführt, an dem
ein Probenhalter oder -teller 8 befestigt ist. Der Metallstab 7 wird durch eine
Kühlflüssigkeit 9, z.B. flüssigen Stickstoff (N2fl) oder ein festen Kühlmlittel,
z.B. Kohlensäureschnee, oder auch durch eine Kühlmischung (z.B. Kryohydrat Eis-Wasser-CaCl2
oder Alkohol-Kohlensäureschnee) als Kühlmittel (sog. "Kryogen") gekühlt. Die die
Proben bildenden Objekte 10 werden normalerweise durch einen elektrischen Regelkreis
auP konstanter, vorwihlbarer Temperatur gehalten. Der Regelkreis enthalt u. a. einen
Temperaturfühler 11, ein Heizelement 12, einen Sollwertgeber 13 sowie eine Temperaturanzeige
14, wobei Verbindungs kabel 15 mittels einer vakuumdichten Durchführung 16 durch
die Bodenplatte 5 in den Rezipienten 3 eingeführt werden. Einrichtungen dieser Art
gestatten es, Proben in Grössen zwischen etwa 10 und maximal 1000 mm³ bei Temperaruren
zwischen etwa -20 und -50°C für histologische und/oder histochemiche Zwecke zu trocknen,
wobei das erzeugte Hochvakuum auch bei dem stark reduzierten Wasserdampfdruck ein
fiir die Praxis hinreichend rasches lbsublimieren des Eises aus dem gefrorenen biologischen
Material (Wassergehalt in der Regel über 90 %) ermöglicht. Nach dieser Gefriertrocknung
werden die Objekte 10 zumeist in geschmolzenes
Paraffin überführt
und nach Erstarren der Paraffinschmelze an Migratomen geschnitten (Schnittdicke
etwa 1 bis 20 µm).
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Die erzeugten Schnitte werden gefärbt und/oder histochemisch behandelt
und anschließend im Lichtmikroskop untersucht.
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Nach der Einführung des höher auflösenden Elektronenmikroskopes wurde
mehrfach versucht, herkömmliche Gefriertrocknungseinrichtungen der beschriebenen
Art zur Gefriertrocknung biologischer Objeckte für eine nachfolgende elektronenmikroskopische
Untersuchung einzusetzen. Es zeigte sich dabei, daß diese Einrichtungen den andersartigen
Erfordernissen der Elektronenmikroskopie nicht voll entsprechen. Auf der einen Seite
weisen die Objekte für elektronenmikroskopische Untersuchungen sowohl im Hinblick
auf die Verbehandlung ("Kryofixation") wie die Nachbehandlung (Einbetten in Kunstharz
sowie Merlegen in Ultradännschnitte mit Dicken unter 0,2 µm) in der Regel Volumina
unter 10 mm³ (normalerweise etwa 1 mm³) auf. Die Menge des zu verdampfenden Eises
ist daher erheblich geringer, als bei Präparationen für die lichtmikroskopische
Arbeit. Auf der anderen Seite werden infolge der um zwei Zehnerpotenzen höheren
Auflösung des Elektronenmikroskopes an die Qualität des gefriergetrockneten Präparates
erheblich höhere Anforderungen gestellt.
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So stören z.B. die Niederschläge von Pumpentreibmittel (z.B.
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Diffusionspumpenöl) am Präparat erheblich. Darüberhinaus werden im
Hinblick auf die erforderliche vollständige Blockierung verschiedener enzymatisch
katalysierter, stark exothrmer biochemicher Reaktionen zum Zweck einer verlässlichen
Stabilisierung der Ultrastrucktur im makromolekularen Bereich erheblich tiefere
Trocknungstemperaturen im Bereich um -80°C benötigt. Der Dampfdruck des im Objeck
enthaltenen Eises wird hierdurch aber so stark gesenkt, daß trotz der geringeren
Grösse der Proben sehr lange Trocknungszeiten erforderlich sind, welche je nach
Präparat und spezifischen Kühlbedingungen zwischen zwei Tagen im Mindestfall und
einigen Wochen liegen. Dabei ist zu erwarten, daß man in Zukunft bei noch tieferen
Temperaturen trocknen wird, sodaß dieses Problem noch akzentuierter auftritt.
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Zum Abkühlen der Proben kommt im Hinblick auf den tiefen Temperaturbereich
vorzugsweise N2fl als Kryogen in Frage.
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@@@ len herkömmlichen Apparturen z.B. nach Fig. 1 stört Hierbei sicht
nur der grosse Kryogenverbrauch (sind. 5 N2fl ag - im Regelfall über 10 l N2fl/ag),
sondern auch de@@@enfend notwendige Nachfüllen des Erzogene, welches auch über die
Nochenenden gewünhstet werden muß. Eine automatisierte Nachfüllung verursacht -
abgesehen von der Störunfälligkeit derartiger Kryogen-Umfällanlagen - zusäötzlich
zu den bereits hohen Kryogenkosten hohe Apparturkosten.
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Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, die Gefreirtrocknung kleiner
biologischer Proben mit einem Einzelvolum unter 10 mm³ für eine nachfolgende elektronenmikroskopische
Untersuchung mit einer einfachen Einrichtung zu ermöglichen, welche in der Herstellung
bzw. Anschaffung weniger aufwendig sowie in der Handhabung einfacher und sicherer
ist und bei drastisch reduziert Ca Betriebskosten (ni edriger Kryogenverbrauch)
nicht; die Nachteile aufweist, welche durch Kondensation von mreibmitteln der Hochvakuumanlage
am Objekt entstehen.
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Erfindungsgemäss wird dies dadurch ereicht, daß der Probeni;el 1er
im Inneren und in schlecht wärmeleitendem Kontakt mit den Innenwandungen eines evakuierbaren
Tauchkörpers angeordnet ist, der in ein mit der Kühlflüssigkeit gefülltes Dewargefäß
derart einfiihrbar ist, daß der überwiegende Teil der Tauchkörperaußenfläche in
direktem Kontakt mit der Kühlfüsslgkeit steht.
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Die erfindungsgemässe Einrichtung hat gegenüber den bekannten Einrichtungen
zur Gefriertrocknung eine Reihe wesentlicher Vorteile: Der Aufbau der Einrichtung
ist einfach und verursacht damit nur geringe herstellungskosten. Der Kryogenverbrauch
ist so niedrig, daß er kaum iiber der normalen Abdampfrate des Kryogens ohne eingetauchten
Tauchkörper liegt. Infolge dieses geringen Kryogenverbrauches ist ein unbeaufsichtiger
Betrieb der Einrichtung über mehrere Tage hinweg bis zu einer Woche - abhängig von
der Probentemperatur und dem Inhalt des Dewargefüsses
möglich. Weiterhin
besitzt die erfindungsgemässe Einrichtung eine maximale Wasserdampf-Kryopunpleistung
der tief gekühlten Innenwand des Tauchkörpers, sodaß keine Rückdiffusion von Wassergelen@len
im das Objekt auftritt. Auch ist ein Betriebs der sichrichtung ohne ein Pumpaggregat
durch Anwendung eines @@@@@@@@@@@@ebes möglich und es besteht keinerlei Problem,
gesetzt reproduzierbare Trockenbedingungen durch programmierden, bei @@darf elektrisch
gesteuertren Temperatur/Zeit-Ablauf einzustellen.
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Im Gegensatz zu dem Kühlprinzip bei den bekannten Einrichtungen wird
bei der Erfindung keine direkte wärmeleitende Verbindung zwischen dem Probenteller
und der Kühlflüssigkeit hergestellt. Vielmehr steht der Probenteller mit der Innenwandung
des Tauchkörpers nur in schlecht wärmeleitendem Kontakt, woraus die geringe Abdampfrate
des Kryogens resultiert. Trotzdem ist es möglich, die erwünscht niedrigen Temperaturen
der Objekte zu erziehen, da der Tauchkörper mit dem überwiegenden Teil seine @@enfläche
in direktem Kontakt mit dem Kryogen steht.
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Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen,
daß der Tauchkörper aus zumindest zwei lösbaren Teilen besteht, die durch einen
Dichtungsring gegebseitig abgedichtet, mittels eines Gewinderiges aufeinanderpressbar
und gegen eine Relativdrehung gesichert sind. Durch die Teilbarkeit des Tauchkörpers
ist es möglich, einerseits den Probenteller mit den spiesten zu beschicken, andererseits
einen Zuführungshals, durch gen eindurch die elektrischen Leitungen für den Heizregelkreis
und die verlaufen, in seiner Überfläche so klein zu halten, daß die Wärmeleitung
in des Kryogen hinein gering bleibt.
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Mit besonderen Vorrteil ist der Probenteller mittels einer Schnellverbindung
austauschbar mit dem Tauchkörper verbunden.
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Zweckmüssigerweise dient als Schnellverbindung ein elektrischer Stockkontakt,
durch den der Probenteller elektrisch beheitz-@en und in seiner Temperatur regelbar
ist. Es versteht sich, daß, der Stockkontakt mittels einer Halterung befestigt ist,
die ebenfalls aus einem schlecht wärmeleitenden Material besteht.
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Nach einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß
die Vertiefung bzw. die mehreren Vertiefungen auf dem Probenteller auch zur Aufnahme
eines verfestigten Kunstharz-Monomeres ausgebildet ist bzw. sind, sodaß mit der
Trocknung auch die Kunstharz-Imprägnation der Objekte erfolgen kann.
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Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden
Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele anhand der beiliegenden Zeichnugen
sowie aus weiteren Unteransprüchen. In den Zeichnungen zeigen: Fig. 1 einen schematischen
Schnitt durch eine bekannte Einrichtung zur Gefreiertrocknung; Fig. 2 einen schematischen
Schnitt durch eine Einrichtung zur Gefreiertrocknung nach der Erfindung, und Fig.
3, 4 in vergrössertem Maßstab modifizierte Ausführungsformen des bei der erfindungsgemässen
Einrichtung zur Anwendung kommenden Tauchkörpers.
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Die bekannte Einrichtung zur Gefreiertrocknung gemäß Fig. 1 ist bereits
einleitend erläutert worden.
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Die erfindungsgemässe Einrichtung, wie sie nils Fig. ? hervorgeht,
umfasst im wesentlichen einen aus zwei Teilen 18, 19 bestehenden hohlen metallischen
Tauchkörper, dessen Durchmesser d unter dem Halsdurchmesser D eines herkömmlichen
und handelsüblichen Dewargefässes 20 liegt. Das Dewargefäß 20 ist beispielsweise
ein doppelwandiges Glassgefäß, das über eine Zwische lage 21 in einem Metallbehälter
22 angeordnet ist und in diese ohne Schwierigkeit von oben her eingeführt werden
kann.
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Der Teil 18 des Tauchkörpers ist als langgestreckter röhrenartiger
Hals ausgebildet, durch welchen mehradrige elektrische Zuführungen 15a für die Temperaturregelung
des nn dem Teil 18
befestigten Probentellers 8a hindurchgeführt
sind. Die Zuführungen 15a durchsetzen eine vakuumdichte Durchführung 16a in des
Tauchkörperteil 18. Über einen Anschluß 23 und ein Ventil 24 kann das Tauchkörperinnere
evakuiert werden.
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Zwischen dem Probenteller 8a und dem Tauchkörperteil 19 besteht kein
direkter mechanischer Kontakt. Vielmehr ist der Probenteller 8a mit der Innenwandung
des Tauchkörperteiles 19 in Sinne einer möglichst geringen Wärmeleitung verbunden,
sodaß die Wärmeaustauschfläche zwischen dem Teil 19 und dem Kryogen @@ diejenige
zwischen dem Tauchkörperteil 18 und dem Kryogen @@ erheblich übertrifft. Der Wärmeübergang
zwischen dem Teil 18 und dem Probenteller 8a wird durch Zwischenschaltung isolierender
Stoffe möglichst niedrig gehalten.
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Besonders zweckmässig ist es, die Vakuumdichtung 17 zwischen den Teilen
@ und 19 dadurch dem Betrieb bei tiefsten Temperaturen unter -@@0°C speziell anzupassen,
daß Metalldichtungen @@@ verwendet und durch spezielle Vorrichtungen - beispielsweise
nach Fig. 3 oder 4 - dauerhaft verschlossen werden.
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Eine vorteilhafte Ausgestalltung der Erfindung bestehet nach Fig.
3 darin, daß der Probenteller 8a über einen Steckkontakt mit dem Teil @@@ verbunden
ist und von diesem in einfachster Weise abbezogen bzw. gegen einen anderen ausgetauscht
werden kann. Darüber hinaus kann in Wege einer Ausgestaltung in an sich bekannte
Weise innen Einbringen eines Molekularsiebes 25 in den Hohlraum des Tauchkörpers
ein Vakuum erzeugt und/oder aufrecht erhalten werden. Eine weitere vorteilhafte
Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, in ebenfalls an sich bekannter Weise
eine @@ welle, halb- oder vollautomatische zeitliche Steuerung der Temperatur des
Probentellers mittels einer Regeleinheit @@ vorzusehen, welche es gestattet, die
Temperatur nach einem vorgegebenen Temperatur/Zeit-Programm anzuheben und dabei
das Objekt 10a mit Kunstharz-Monomer zu imprägnieren. Schließlich besteht eine weitere
sinnvolle Ausgestaltung darin, eine Füllstandanzeige für den Kryogenvorrat 9a im
Dewargefäß vorzusehen, welche zumindest zwei Sensoren 27 und 28 und eine optische
Warnanzeige 29
und/oder eine akustische Warnvorrichtung umfasst,
um auf den nahe bevorstehenden sowie der eingetretenen Ausfall der Kühlung infolge
Absinken des Kryogen @egel aufge@ksam zu werden.
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Die Figuren 3 und 4 zeigen spezielle Ausführungsvarianten des Tauchkörpers.
Entscheidend ist, daß beim erfindungsgemässen @@sten zwischen dem geheizten Probenteller
8a und dem Kryogen 9a zur ein sehr geringer Wärmeaustauch stattfindet, welcher sien
in wesentlichen auf den direkten Fetskörperkontakt über Die Leitungen 15a zum Sensor
11a und dem Heizelement 12a sowie gegebenenfalls die Steckverbindung 30a/@0 beschränkt,
dabei aber angerichts der Temperaturdifferenz zwischen Probenteller 8a und Kryogen
9a (-80°C/-190°C bei Verwendung von N2fl) zum Abkpühlen des Probentellers voll ausreicht.
Der Wärmeaustausch über die Gasphase spielt angesichts des Vakuums im Tauschkörper,
jener im Wege der Wärmestrahlung von Natur aus nur eine untergeordnete Rolle und
kann durch zusätzliche Maßnahmen weiter verringert werden. Auf diese Weise ist es
möglich, die Heizleistung des Heizelementes 12a bzw. den durch die Heizung verursachen
zusätzlichen Kryogenverbrauch bei Verwendung von N2fl und einer Objekttemperatur
zwischen -30°C und -40°C unter 0,5 l N2fl/Tag zu halten. Für diesen @iederen Wärmeaustausch
bzw. Kryogenverbrauch ist es wichtig, daß die Wärmeaustauschfläche zwischen Kryogen
9a und Teil 18 i Vergleichst zu @ener mit dem Teil 19 möglichst klein gehalten wird.
Die grüsser der Austauschflächen am Teil 19 entscheidet über die @ryo-Pumpwirkung
für Wasserdampf, welche durch Verwendungs eines Molekularsiebes (z. B. KEOLITHE
13 X) erheblich gesteigert wird.
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Das ebenfalls gekühlte Zuführungsrohr am Teil 18 dient als einfache
Kühlfalle für Pumpen-Teilmittel, soweit die Gewfriertrocknung bei laufender Vakuumanlage
durchgeführt wird. Bei auschlichtlicher Verwendung eines Molekularsicher erreicht
@@@ jedoch in noch einfacher Weise ohne Einsatz einer Vakuumanlage ein einreichenden
Vakuum für die Gefriertrocknung (dessendruck unter 10-@ Torr, Wasserdampf-Partialerdruck
entsprechend niedriger).
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Von grosser Bedeutung ist ein dauerhaft vakuumdichter Verschluß des
Tauchkörpers, welcher auch bei Temperaturen unter -150°C über Zeiträume von mehreren
Wochen erhalten bleibt. Nach Fig. 3 wird ein derartiger Verschluß mittels eines
()-Ringes 30a aus geeignetem Material beispielsweise dadurch erreicht, daß der tellerartig
ausgebildete und durch die Bolzen 31 gegen ein Verdrehen gesicherte Fuß des Teiles
1S3a iiber einen Satz Tellerfedern 32 mittels des Gewinderinges 33 ge genen den
Teil 19a gepresst wird. Die Federkraft der Tellerfedern gewahrleistet in diesem
Fall einen dauernd kraftschlüssigen Kontakt der Teile 18a, 17a, 19a.
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Eine andere Ausführungsvariante der erfindungsgemässen Dichtung zeigt
Fig. 4. Hier presst sich eine ringförmig umlaufende Schneide 34 des Teiles 18b in
einen Dichtungsring 17b aus einem weichen Metall ein und gewährleistet damit eine
einwandfreie Dauerdichtung. Das Anpressen wiederum kann alternativ über ein Druckkugellager
35 mittels des Gewinderinges 33a erfolgen, welcher den oberen Lagerring 35a iiber
die Kugeln 35b auf den am Tellerfuß des Teiles 18b aufliegenden unteren Lagerring
5c nresst und durch die elastische Verformung der Stahlkugeln in Form hält.
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Im ITinblick auf den Kryogenverbrauch sowie eine einfache Handhabung
spielen der elektrische Anschluß und die Anordnung des Probentellers 8 eine wesentliche
Rolle. Nach Fig. 3 kann der Probenteller mit dem Temperaturfühler 11a und dem Heizelement
12a über einen elektrischen Steckkontakt 30a/30b -beispielsweise mit korrosionsbeständigen
Goldkontakten - am Fußteil des Elementes 18a angesteckt werden. Das leichte Anstecken
und Lösen des Tellers 18b ermöglicht eine einfache Reinigung, Beschickung und Entnahme/
der Objekte. Durch Verwendung gut wärmeisolierender Materialien für die Teile sOa
und 30b des Steckkontaktes wird der Wärmetransfer vom Teller 8b zum Teil 18n auf
ein Minimum beschrinkt. Zum Zweck der Imprägnation kann in speziell hierfiir vorgesehene
Vertiefungen neben das eingefrorene Objekt 10a jeweils eine entsprechende Menge
verfestigtes
Kunstharz-Monomer 36 eingelegt werden. Nach Abschluß der Gefriertrocknung kann mittels
des Ileizelementes der Probenteller soweit aufgewärmt werden, daß sich das Monomer
verfliissigt und die trockene Probe imprägniert. Danach wird der Tauchkörper über
das Ventil 24 mit Gas, z. B. trockenem reinen Stickstoff, gefüllt. Iliermit sich
die notwendigen Schritte zur Kunstharzeinbettung des Objektes 10a vollzogen.
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Nach Fig. 4 ist in einer anderen Ausführungsvariante ein zweiteiliger
Probenteller 8c/8d vorgesehen. Das Element 8c enthalt die elektrisch fest verdrahteten
Elemente 11b und 12b und ist über ein thermisch isolierendes Zwischenglied 36 starr
mit dem u des Teiles 18b verbunden. Hierbei bietet aus kryotechnischein wie vakuumtechnischen
Gründen die Verwendung eines vollständig gekapselten Hochleistungstransistors 12b
anstelle eines normalen Heizwiderstandes besondere Vorteile. Der .Iochleistungstransistor
12b kann hierbei z. 3. an der Bodenfläche des Tellers 8c befestigt werden. Das Element
8d wird auf den Teil 8c aufgelegt. Ein guter thermischer Kontakt wird durch eine
exakt plane Ausbildung der korrespondierenden Kontaktflächen sowie beispielsweise
durch eine Feder 37 gewährleistet. Sowohl bei der Probenanordnung nach Fig. 3 wie
nach Fig. 4 ist es leicht möglich, unterschiedliche Probenteller Bb bzw. 8d vorzusehen
und bei Bedarf rasch gegeneinander auszutauschen.
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Die anhand der Figuren 2 bis 4 beschriebene Einrichtung kann im Rahmen
der Erfindung in verschiedenen Variationen und Wombinationen verwirklicht werden.
So ist es beispielsweise möglich, verschiedene Einzellösungen nach Fig. 3 und Fig.
4 zu kombinieren, die Innenfläche des Teiles 19 zur Erhöhung der Kryo-Pumpleistung
mit einer profilierten Oberflache zu versehen, die Oberfläche der verschiedenen
Teile zum Zwecke eines erhöhten oder reduzierten Wärmeaustausches beispielsweise
entweder hochglanzpoliert oder mattschwarz auszuführen oder zum Zwecke einer vereinfachten
Reinigung wie zum Entfernen von Eisniederschlägen mit einem Kunststoffüberzug (z.B.
Polytetrafluoräthylen) zu versehen. Ebenso ist es unerheblich, in welcher Weise
die elektrische Regeleinheit 26 oder eine Füllstandsanzeige 27, 28,
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angeordnet und geschaltet ist sowie arbeitet. Unerheblich ist ferner die Form (Hohlkugel
oder Zylinder) sowie die Ausführung (evakuiertes und verspiegeltes Doppelwandgefäß
aus Glas; Kunststoffschaum; Metallbehälter usw.) des Dewargefässes für dns Kryogen
sowie die Ausführung des Vakuumanschlusses °T, 24, des Elektroanschlusses 15, 16
und des Probentellers 3.
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L e e r s e i t e