DE2944806A1

DE2944806A1 - Einrichtung zur metallspiegel-kryofixation sowie zur nachfolgenden kryopraeparation biologischer objekte

Info

Publication number: DE2944806A1
Application number: DE19792944806
Authority: DE
Inventors: Prof. Dr.phil. Hellmuth Seefeld Tirol Sitte
Original assignee: C Reichert Optische Werke AG
Current assignee: C Reichert Optische Werke AG
Priority date: 1979-11-06
Filing date: 1979-11-06
Publication date: 1981-05-14
Also published as: FR2468926A1; FR2468926B1; ATA425180A; US4302950A

Description

C. Reichert, Optische Werke AG

Wien, Österreich 19 948/9 2o/h

Einrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation sowie zur nachfolgenden Kryopräparation biologischer Objekte

(Zusatz zu Patentanmeldung P 29 06 153.8)

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation sowie zur nachfolgenden Kryopräparation biologischer Objekte für mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen, mit einem in einer durch gasförmiges Kryogen bespülbaren metallischen Kühlkammer angeordneten, durch ein Kryogen tiefgekühlten hochglanzpolierten Metallspiegel, auf den ein Objekt durch eine Injektionsvorrichtung oder dgl. aufbringbar ist, wobei die Kühlkammer ein für eine Kryopräparation und zur Aufnahme dafür erforderlicher Vorrichtungen ausreichendes Volumen aufweist.

Bei der Kryopräparation von biologischen Objekten für mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen verwendet man in zunehmendem Umfang Präparationskammern mit einem Volumen über 1 1, in denen sowohl die Objekte wie auch die benötigten Werkzeuge reproduzierbar auf tiefen Temperaturen gehalten werden können, ohne infolge des Niederschlages von .*..· Luftfeuchtigkeit zu vereisen. Als wesentliches Hilfsmittel zur Kryofixation biologischer Objekte dienen hierbei hochglanzpolierte Metallflächen ("Metallspiegel"), welche mit einem geeigneten Kryogen auf Temperaturen unter 1oo°K abgekühlt werden und auf die das interessierende biologische Objekt mittels eines präzise geführten Injektors mit hoher Geschwindigkeit aufgebracht wird. Unmittelbar nach dem Auftreffen der Objektfläche auf den Metallspiegel wird eine etwa 1o bis 2o.um breite

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Randzone des Objektes durch den direkten thermischen Kontakt mit dem Metallspiegel mit einer Abkühlrate über 1.000⁰C/see binnen kürzester Zeit gefroren. Dieses rapide Einfrieren der Randzone (Kryofixation durch Temperaturschock) erfolgt im Gegensatz zum Einfrieren der anschließenden tieferen Objektzonen, welche von der Grenz- und Kontaktzone "Metall/Objekt" mehr als 1o bis 2o ,um entfernt sind, ohne elektronenmikroskopisch erkennbare Entmischung der wässrigen plasmatischen Mischphasen, welche die Matrix biologischer Objekte bilden, wogegen die tieferen Bereiche infolge der hier auftretenden geringeren Abkühlraten unter 1.ooo°C/sec Entmischungsphänomene zeigen, welche durch das Auftreten von Eiskristallen innerhalb der Zellen sowie in den Interzellularräumen gekennzeichnet sind» Da diese Eiskristalle als Kunstprodukte ("Artefakte") jede sinnvolle Untersuchung der Mikro- bzw. Ultrastruktur ausschließen, trachtet man danach, die Temperaturdifferenz zwischen der üblichen Temperatur des lebenden Objektes (z.B. 37°C bei Warmblütern) und der Metallspiegel-Kühlfläche möglichst groß zu halten, um durch einen möglichst steilen Temperaturgradienten eine möglichst tiefe Randzone des Objektes lebensgetreu, d.h. ohne Eiskristallartefakte, zu erhalten. Es ist daher naheliegend, den Metallspiegel mit einem Kryogen zu kühlen, dessen Temperatur unter der Siedetemperatur des N₂fl (-196⁰C) liegt. Hierzu kommt sowohl partiell verfestigter Stickstoff ("Nitrogen-slush", d.h. "Stickstoffmatsch¹¹ mit der Schmelztemperatur des Stickstoffes von -210⁰C) oder He_f1 (Minimaltemperatur bei K etwa 4°K) infrage.

iJ. ρ

Es ist eine Einrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation bekannt, bei der eine Kühlkammer mit einem Volumen unter loo ml verwendet wird, deren Boden von der hochglanzpolierten Oberfläche eines massiven Silberkörpers gebildet wird. Der Silberkörper taucht in teilweise verfestigten Stickstoff, welcher sich in einem Dewargefäß befindet. Er erreicht dabei eine Temperatur unter -2oo C. Um eine Kondensation von Luftstickstoff am Metallspiegel zu vermeiden, kann diese Kühlkammer mit Heliumgas durchspült werden, welches vor seinem Eintritt in die Kühlkammer durch den im Dewar befindlichen Stickstoffmatsch geleitet und daher auf eine Temperatur vorgekühlt wird, welche etwa der Temperatur des Silberspiegels entspricht.

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(siehe Journal of Microscopy Vol. 111 Pt 1, September 1977, S. 35-38). Eine Kryopräparation ist mit dieser bekannten Einrichtung aufgrund des kleinen Kühlkammervolumens nicht möglich.·

Im Gegensatz zur oben beschriebenen Anordnung weist eine Einrichtung der eingangs genannten Art nach einem älteren Vorschlag der Anmelderin (P 29 06 153.8) ein grösseres Volumen über 1 1 auf. Es bestehen dabei sowohl der Kammerboden wie die . Seitenwände der Kammer aus Metall, wobei zumindest zwei Seitenwände, alternativ alle Seitenwände sowie Kammerboden mit flüssigem Kryogen, vorzugsweise mit flüssigem Stickstoff (N-fl), abgekühlt werden. Soweit man hierbei auf ein teilweises Verfestigen des N^fI und die damit verbundene relativ geringfügige Temperaturreduktion von -196 C um 14 C auf -21o C verzichtet, genügt eine relativ einfach zu verwirklichende Spülung mit vorgekühltem trockenen Stickstoffgas, welches beispielsweise durch ein Rohr eingeführt werden kann, und darin vorher durch den N₂fl geführt wird, welcher zum Kühlen der metallischen Kammerwände dient.

Kühlkammern der vorstehend beschriebenen Art verfügen nach dem Stand der Technik über Einrichtungen, welche es beispielsweise gestatten, am interessierenden biologischen Objekt unmittelbar vor seiner Injektion in die Kühlkammer und damit vor seiner Kryofixation am tiefgekühlten Metallspiegel eine frische plane Anschnittfläche zu erzeugen und damit jene Ebene dieses Objektes artefaktfrei im Schock einzufrieren und auf diese Weise mikroskopisch oder elektronenmikroskopisch darzustellen.

Die vielfach gewünschte und versuchte Abkühlung eines Metallspiegels mittels He_f ■■ auf Temperaturen im Bereich um 2o K oder darunter ist durch technische Schwierigkeiten wie durch den immensen Kostenaufwand behindert. Versuche gingen beispielsweise dahin, kleine Kühlkammern mit einem Volumen unter 1oo ml so stark mit Heliumgas zu spülen, daß sich trotz der extrem niedrigen Temperatur am Metallspiegel kein Gas der Raumatmosphäre, insbesondere kein fester Stickstoff niederschlägt.

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Dieses Verfahren scheidet jedoch bei der Verwendung grösserer Präparationskammern mit Volumina :s» 1 1, insbesondere bei der aus methodischen Gründen zumeist notwendigen Präparations-* arbeit in der offenen Kühlkammer im Hinblick auf die hohen Kosten des Heliumgases aus. Aus den gleichen Gründen ist es; praktisch unmöglich, grössere Metallspiegelflächen oder gar die metallischen Wände von Kühlkammern mit einem Volumen in der Grössenordnung von 1 1 oder darüber mit verflüssigtem Helium zu kühlen. In jüngster Zeit unternommene Versuche, mit flüssigen Helium gekühlte Metallspiegelflächen in Vakuum anzu ordnen, machen es notwendig, die interessierenden biologischen Objekte zunächst unter Verwendung einer entsprechenden Schleuse in das Vakuum einzubringen. Auch wenn die Kpnstruktion derartiger Schleusensysteme aus der elektronenmikroskopischen Gerätetechnik bekannt ist, so scheint der hiermit verbundene Aufwand deswegen sinnlos, weil sich gerade die im Rahmen einer Kryofixation erfassbare, 1o bis maxiamal 2o ,um tiefe Randzone eines stark wasserhaltigen biologischen Objektes in dem dabei benötigten Hochvakuum sofort extrem verändert. Nach dem Stand der Technik erscheint demnach die Kryofixation bei tiefen Temperaturen sowohl apparativ wie hinsichtlich der enormen, mit einer Heliumkühlung verbundenen Kosten nicht zufriedenstellend gelöst. Ein routinemässiger Einsatz einer Heliumkühlung scheidet daher nach dem Stand der heutigen Technik aus.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Kühlkammer der eingangs beschriebenen Art zu realisieren, welche die oben erwähnten Mangel und Einschränkungen nicht aufweist und es daher bei einem tragbaren Kostenaufwand gestattet, die für die Kryofixation benötigte Metallspiegelfäche mit einer Abmessung von z.B. zwischen 1 und 1o cm mit He^. auf Temperaturen S^

ο ^ri

2o K abzukühlen, ohne daß sich auf diesem Metallspiegel hierbei vor dem Auftreffen des Objektes darauf Niederschläge, insbesondere von festem Stickstoff bilden und ohne daß hierdurch der zur nachfolgenden Kryopräparation benötigte Kammerraum auf Volumina unter 1 1 bzw. die für die Kryopräparation benötigte

2 kalte Bodenfläche auf ein Ausmaß unter z.B. 5o cm eingeschränkt wird. Denn die genannten Niederschläge mindern oder vereiteln die Resultate der Kryofixation.

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Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe ausgehend von der Einrichtung nach dem älteren Vorschlag der Anmelderin dadurch gelöst, daß der Metallspiegel einen von der restlichen Spiegelfläche thermisch isolierten Spiegelbereich geringer Flächenausdehnung aufweist, der durch einen mit dem Spiegelbereich einen hohlen Innenraum umschließenden, abschwenkbaren Deckel abdeckbar und durch flüssiges Helium getrennt kühlbar ist, und daß der Innenraum über dem getrennten Spiegelbereich durch kaltes gasförmiges Helium getrennt spülbar ist.

Die hochglanzpolierte Oberfläche des metallischen Kammerbodens besteht somit im Gegensatz zum Stand der Technik aus zwei thermisch weitgehend voneinander getrennten Abschnitten, welche vorzugsweise in der gleichen Ebene liegen, wobei ein kleiner Abschnitt mit einer Fläche zwischen 1 und Io cm mit He^₁ auf eine Temperatur ^ 2o°K, ein grösserer Ab-

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schnitt mit einer Fläche .se 5o cm mit einem Kryogen höherer Temperatur, vorzugsweise N„fl, auf eine Temperatur ^" 1oo K gekühlt wird und feste oder flüssige Niederschläge auf diesen Metallspiegelflächen durch die ,Spülung mit jeweils geeigneten vorgekühlten Schutzgasen, beispielsweise durch gesonderte Spülung der He^,-gekühlten kleineren Fläche mit He-Gas, der N„f1-gekühlten grösseren Fläche mit N₂~Gas vermieden werden. Hierbei wird die Spülung der kleineren Metallspiegelfläche tiefster Temperatur mit He-Schutzgas dadurch in einer wirkungsvollen Weise mit minimalen Heliummengen erreicht, daß man diese Fläche während der gesamten Abkühlphase bis unmittelbar vor der Injektion des Objektes mit einem Deckel geringer Wärmekapazität und geringer Masse abgedeckt hält, dessen Unterseite eine Ausnehmung aufweist, in welche das vergekühlte Heliumgas eintritt und dessen Ränder den Tiefsttemperaturbereich oder dem anschließenden Bereich so eng anliegen, daß das Helium durch einen schmalen Spalt zwischen Deckel und Spiegelfläche

2 mit einem Gesamtquerschnitt unter 1o mm entweicht. In diesem Fall genügt ein sehr geringer Durchsatz von Heliumgas in der Grössenordnung unter 1o ml/min, um ein Eindiffundieren von ^-Spülgas aus dem Kammerraum über die heliumgekühlte Tiefsttemperaturflache restlos auszuschalten. Die beschriebene

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Helium-Schutzgasspülung der Tiefstteraperaturfläche wird erst unmittelbar vor dem Auftreffen der biologischen Probe auf diesen Abschnitt des Metallspiegels durch Abschwenken des Deckels unterbrochen.

Die erfindungsgemässe Einrichtung hat gegenüber den bislang bekannten Metallspiegel- und Kryopräparationssystemen eine Reihe wesentlicher Vorteile: Die aufwendige Heliumkühlung bleibt auf einen kleinen, thermisch weitgehend isolierten Teil der Metallspiegelfläche beschränkt und arbeitet daher mit minimalem Kryogen- bzw. Kühlaufwand, wobei das zur Kühlung verwendete Helium in bekannter Weise in einem Umlaufverfahren eingesetzt werden kann und damit nicht verloren geht. Durch die gesonderte Spülung dieses Metallspiegel-Anteiles mit Helium-Schutzgas ist es infolge der speziellen Abdeckung möglich, mit einem sehr geringen Helium-Gas-Durchlauf das Auslangen zu finden. Dies erscheint besonders deswegen wichtig, weil das zur Spülung verwendete Schutzgas nicht in einer Umlaufanordnung zurückgewonnen werden kann. Schließlich wird vermieden, daß das Objekt physikochemischen Einflüssen, insbesondere einem Hochvakuum, ausgesetzt wird, welche gerade die im Wege einer Kryofixation für mikroskopische oder elektronenmikroskopische Untersuchungen zugänglichen Randzonen irreversibel schädigen und

die Dauer des Präparationsvorganges nach dem Herstellen einer frischen Anschnittfläche in einer ebenfalls schädigenden Weise verzögern. Das Objekt kann vielmehr ohne zusätzliche Maß .-nahmen - wie eine Hochvakuum-Einrichtung mit entsprechenden Pumpen, Ventilen, Vakuummeßgeräten und Schleusen, welche auch den apparativen Aufwand erheblich erhöhen, den Präparationsgang in unzumutbarer Weise verlängern und das Erreichen einer artefaktfreien Randzone daher nicht gewärleisten - nach dem Herstellen einer frischen Anschnittfläche bzw. der Montage am Injektor binnen Sekundenbruchteilen auf den Metallspiegel

aufgebracht werden. j

Nach einer vorteilhaften Weiterbildung ist vorgesehen, daß die ; Stickstoffspülung des grösseren Teiles des Metallspiegels wie der Kammer insgesamt auf einfache und zweckmässige Weise durch '

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Umlenkbleche bewirkt wird, welche einen Teil des N_-Gases, welches beim Kühlen der metallischen Kammer laufend entsteht, auf den Kammerboden lenken. Die herbei resultierende laminare Stickstoffspülung der Kammer verhindert ohne weiter aufwendige Maßnahmen auf einfachste Weise jede Eisbildung in der Kühlkammer, auch wenn mit vollkommen offener Kammer gearbeitet wird. Bei Bedarf kann in weiterer Ausgestaltung dieses Prinzips der Stickstoffdurchfluß durch die Kühlkammer mittels eines oder mehrerer Heizelemente stufenlos gesteigert werden, welche zusätzliches N₂-Spülgas verdampfen und in die Umlenkbleche leiten.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung kann darin bestehen, daß unmittelbar nach dem Aufbringen des Objekts auf dem Tiefsttemperatur-Metallspiegel, d.h. den getrennten Spiegelbereich, gegebenenfalls in geeigneter Wirkverbindung mit dem Injektionsprozeß, sowie bei sonstigem Bedarf durch Anheben des N₂fl-Niveaus in dem umgebenden N,f1-Behälter N_fl aus dem Kühltank in den Kammerraum gefüllt wird, so daß eine extrem rasche komplette Abkühlung der Probe stattfindet bzw. für die Kryopräparation eine extrem niedrige Temperatur erreicht wird, welche dem Siedepunkt des N₂fl sehr nahe kommt.

Weitere Vorteile und Merkmale ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele anhand der beiliegenden Zeichnungen sowie aus weiteren Unteransprüchen. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 einen schematischen Schnitt durch eine kleine Kühlkammer herkömmlicher Art mit einem Metallspiegel und einem Injektionssystem zur Kryofixation,

Fig. 2 einen schematischen Schnitt durch eine Kühlkammer nach dem älteren Vorschlag P 29 06 153.8 mit grösserem Volumen und N_?f1-Nachfüllung über einen Phasenseparator sowie Schutzgasspülung in vereinfachter Darstellung unter Weglassung des Injektionssystemes nach Fig. 1,

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Fig. 3 einen schematischen Schnitt durch die Kühlkammer einer erfindungsgemässen Einrichtung mit zwei getrennten Metallspiegelflächen unterschiedlicher Temperatur, gesonderten Schutzgasspülungen für die getrennten Kühlbereiche und N_f1-Schnellkühlung im Kammerraum, sowie

Fig. 4 einen Vergleich unterschiedlicher Lösungen (a) bis (f) zur thermischen Trennung der beiden Metallspiegelflächen unterschiedlicher Temperatur im schematischen Schnitt.

Der Aufbau der in Fig. 1 schematisch dargestellten kleinen Kühlkammer zur Metallspiegel-Kryofixation ist herkömmlicher Art: Der im Dewargefäß 1 enthaltene Stickstoff 2 ist durch Anschluß eines Vakuumsystems an den Stutzen 3 des über eine Dichtung aufliegenden Deckels 5 teilweise verfestigt und weist daher eine Temperatur von -21o°C auf. Der an seiner Oberfläche 6a ("Metallspiegel") hochglanzpolierte S über zylinder 6 erreicht daher eine Temperatur unter -2oo°C. Zum Vermeiden von Kondensaten oder Sublimaten auf der Spiegelfläche 6a wird eine kleine Kühlkammer 7 über das Rohr 8 dauernd mit Heliumgas 9 gespült. Zur Injektion des Objektes 1o dient der in einer exakten zylindrischen Führung 11 geführte Stempel 12, an dessen Unterteil 12a das Objekt 1o beispielsweise durch eine nicht dargestellte Ansaugvorrichtung in einfacher Weise gehalten wird. Bis zur Injektion des Objektes 1o bleibt die Kühlkammer 7 durch einen Deckel verschlossen. Vor der Injektion kann am Objekt 1o mittels einer in Pfeilrichtung bewegten Spezialklinge 14 eine frische Anschnittfläche erzeugt werden, welche parallel zum Metallspiegel 6a liegt. Hierbei nimmt der Unterteil 15 der Klingenhaiterung den abgeschnittenen Teil des Objektes 1o auf. Nach abgeschlossenem Schneidvorgang löst die nach links bewegte Klingenanordnung 14/15 automatisch die Sperrklinke 16 und damit den Injektionsprozeß des Stempels 12/12a mit dem Objekt 1ο(Pfeilrichtung) aus. Eine ähnliche Wirkverbindung führt zum rechtzeitigen öffnen der Kühlkammer 7 durch Entfernen des Deckels 13. Die mit der Spezialklinge 14 hergestellte frische Schnittfläche des Objektes 1o trifft danach etwa o,1 see nach dem Schneideprozeß auf dem

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tiefgekühlten Metallspiegel 6a auf. Der Hauptnachteil dieser Anordnung nach Fig. 1 besteht darin, daß es infolge des kleinen Volumens der Kühlkammer 7 nicht möglich ist, vom Objekt nach ausgeführter Kryofixation das überschüssige, durch Eiskristalle artefizierte Material zu entfernen. Ein Kryotransfer bereitet ebenso grosse Schwierigkeiten, weil der Großteil des Kammerbodens bzw. des Metallspiegels 6a durch das Objekt 1o bedeckt ist und das Objekt daher ohne Risiko einer Erwärmung der kryofixierten Oberfläche sowie der Bildung von Eisniederschlägen nicht aus der Kühlkammer 7 entfernt werden kann. Da das komplette Durchfrieren des Objektes 1o in der Kühlkammer 7 einige Zeit in Anspruch nimmt, ist es zudem unmöglich, in rascher Folge mehrere Objekte nach dieser Methode zu bearbeiten.

Diese Schwierigkeiten der Anordnung nach Fig. 1 können durch die Einrichtung nach Fig. 2 teilweise behoben werden, welche eine Kühlkammer 7 a mit einem Volum ^. 1 1 aufweist. Die Wände dieser Kühlkammer 7a bestehen durchgehend aus Metallblech 18, wobei der Boden 18b zur Kryofixation und Kryopräparation als hochglanzpolierte Spiegelfläche 18a ausgebildet ist. Der zum Kühlen vorzugsweise verwendete N_fl 19 wird über dem Phasenseparator 2o in einen Blechtank 21 eingefüllt, der die Kühlkammer 7a umgibt, so daß die metallischen Wände 18/18b der Kühlkammer durch das flüssige Kryogen direkt gekühlt werden. Ein Tauchrohr 2oa des Phasenseparators 2o bewirkt bei der Füllung, daß der gasförmige Stickstoff 22 sofort vom flüssigen Stickstoff 19 getrennt wird und arbeitet in diesem Sinn in der Art eines herkömmlichen Syphons einer Abwasserleitung. Das laufend aus dem Blechtank 21 abdampfende Stickstoffgas 22a entweicht durch einen Spalt 23 zwischen der Isolation 24/24a und dem thermostatisch mittels Temperaturfühler 25 und Heizpatronen 26 beheizten Metallmantel 27 und wird hierbei auf Raumtemperatur erwärmt. Die Kühlkammer 7a kann durch trockenes Stickstoffgas gespült werden, welches in einem Rohrsystem 28 vorgekühlt wird, welches durch den flüssigen Stickstoff 19 verläuft, welcher die Kühlkammer 7a umspült. Mittels zweier Niveausensoren 29/3O kann das N^fl-Niveau im Behälter 21 im Verein mit einem nicht dargestellten Nachfüllsystem bekannter Bauart stets automatisch zwischen einem Minimal- und einem Maximalniveau gehalten

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werden (vgl. Angaben "min" und "max" in Fig. 2). Die beschriebene Kühlkammer 7a gestattet Kryofixationen und Kryopräparationen bei Kammertemperaturen unter -15o°C, wobei durch das grosse Volumen der Kühlkammer verschiedenartigste Präparationen nebeneinander sowie Kryofixationen in rascher Folge nacheinander ausgeführt werden können. Hierzu werden die kryofixierten Objekte unmittelbar nach ihrer Injektion ohne Risiko auf einen anderen Abschnitt des großflächigen Metallspiegels 18a verschoben. Arbeiten bei Temperaturen unter -21o°C, welche eine Heliumkühlung erfordern, sind jedoch bei diesem System mit immensen Kosten verbunden, da das Kühlen und Spülen der Kammer sehr grosse Heliuramengen bzw. Kühlleistungen erfordert.

Bei der im Grundprinzip ähnlich Fig. 2 aufgebauten erfindungsgemässen Kühlkammer nach Fig. 3 wird eine Heliumkühlung und Heliumgasspülung mit vergleichweise geringen Heliuramengen dadurch ermöglicht, daß nur ein kleiner, thermisch getrennter Spiegelbereich 18c innerhalb der Spiegelfläche 18a mit flüssigem Helium 31 gekühlt wird, welches in bekannter Weise in einem Rohrsystem 32 umläuft. Die Metallspiegelflächen 18a und 18c sind hierbei durch eine Thermoisolation 33 voneinander getrennt, wobei das Helium-Kühlsystem beispielsweise durch ein Rohr 34 eingeführt wird, welches die beiden Blechtanks 18b/ 18d und 21a verbindet. Die Spülung des Tiefsttemperatur-Spiegelbereiches 18c mit Helium-Gas 35 erfolgt beispielsweise über eine Zuleitung 36, welche zunächst durch den N₂fl 19 verläuft und danach das Helium über ein gleichzeitig als Schwenkachse AA' ausgebildetes Ventil 37 in den um die vertikale Achse AA¹ schwenkbaren hohlen Deckel 38 weiterleitet. Das unter leichtem überdruck stehende Helium-Gas 35 entweicht schließlich durch i die Spalte zwischen dem Deckel 38 und der Spiegelfläche 18a ; und verhindert auch bei geringem Helium-Durchsatz infolge der geringen Höhe dieses Spaltes das Eindiffundieren von Stick- ; stoff-Gas aus dem Kammerraum. Unmittelbar vor dem Auftreffen } des Objektes auf den Spiegelbereich 18c wird der Deckel 38 | durch eine geeignete Triggerung, beispielsweise mit Hilfe einer ί Photodiode, mechanisch oder elektrisch um die Achse AA¹ zur J Seite geschwenkt und der Spiegelbereich 18c damit für die j

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Kryofixation freigegeben.

Eine sinnvolle Weiterbildung der erfindungsgemässen Kühlkammer 7b besteht nach Fig. 3 darin, daß ein Teil 22c des abdampfenden Stickstoffes durch Umlenkbleche 39 zur laufenden Stickstoffspülung der Kühlkammer 7b verwendet wird und daß nur der Rest 22 d des abdampfenden Stickstoffes analog Fig. 2 durch den thermostatisch beheizten Metallmantel 27 im Spalte 23 auf Raumtemperatur aufgewärmt wird. Hierbei kann die Menge des zur Spülung verwendeten Stickstoffgases 22c durch den Einsatz von Heizelementen 39a bei Bedarf erheblich gesteigert werden.

Eine weitere Ausgestaltung des erfindungsgemässen Systems besteht darin, daß die an den Phasenseparator 2o angeschlossene Nachfüllvorrichtung in einer Weise umgeschaltet werden kann, daß der obere Niveausensor 29 außer betrieb gesetzt und daher die Nachfüllung solange fortgesetzt wird, bis N fl über den

2 oberen Rand der Seitenwände 18d fließt und auf diese Weise einen Teil der Kühlkammer mit N₂fl füllt. Dieser Füllvorgang kann beispielsweise automatisch fortgesetzt werden, bis der N₂fl-Spiegel in der Kühlkammer 7b den Niveausensor 2o erreicht, der nunmehr die Abschaltung der Nachfüllung bewirkt. Auf diese Weise können nicht nur injizierte Objekte besonders rasch zur Gänze durchgefroren, sondern auch Präparationen unter N₂fl bei -196°C ausgeführt werden.

Weitere Ausgestaltungen der erfindungsgemässen Kühlkammer können nach Fig. 3 schließlich darin bestehen, daß der mit Helium kühlbare Spiegelbereich 18c im Metallkörper 41 mit einem Temperatursensor 42a sowie einem Heizelement 42b minimaler Wärmekapazität versehen ist, welche eine Messung der jeweils erreichten Tem- ' peratur bzw. ein rasches Abdampfen von Niederschlägen, beispielsweise von festem Stickstoff vor dem Schließen des Deckels 38 für einen neuerlichen Helium-Kühlz^yklus ermöglicht.

Die anhand von Fig. 3 beschriebene Einrichtung kann im Rahmen ■ der Erfindung in verschiedensten Variationen und Kombinationen verwirklicht werden. So ist es nach Fig. 4 beispielsweise in

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verschiedener Weise möglich, die Mecalispiegelflachen 18a und 18c bzw. die Metallkörper 18b und 41 durch eine Isolation voneinander zu trennen, wobei die Metallspiegelflächen der Spiegelbereiche 18a und 18c vollkommen voneinander getrennt sein (Fig. 4b) oder durch eine dünne Metallschicht 41b oder verbunden bleiben können (Fig. 4c, d und f). Desgleichen kann der Spiegelbereich 18c direkt an dem heliumdurchflössenen Teil 41 angebracht sein (B¹Ig. 4b) oder mit einem heliumdurchflössenen Teil 41a in innigem thermischen Kontakt stehen (Fig. 4c, d und f). Schließlich kann die gesamte Metallspiegelfläche 18a/18c aus einem durchgehenden dünnen Blech 43, beispielsweise aus einem o,5 mm starken rostfreien, hochglanzpolierten Edelstahlblech bestehen (Fig.4d und f).

Ebenso kann eine dem jeweiligen Bedarf entsprechende Ausrüstung der Kühlkammer mit e inem fakultativen Heliumzusatz dadurch realisiert werden, daß die Kammer standardmässig lediglich eine Aufnahmeöffnung mit dem Rohr 34 besitzt, welche durch einen Metallstopfen 44 sowie einen Isolationszylinder 45 (Fig. 4a) oder durch eine durchgehende Blechauflage 46 im Verein mit einem Metallzylinder 47 (Fig. 4e) verschlossen wird, wobei die Elemente 45, 46, 47 bei Bedarf gegen die heliuragekühlte Anordnung (Fig. 4b oder f) ausgetauscht werden kann. Abgesehen von diesen Varianten der Kühlfläche ist es möglich, das System durch geeignete elektrische Meß- und Schaltvorrichtungen speziellen Zwecken anzupassen, beispielsweise mit Photodioden zum Triggern bestimmter Prozesse oder Wirkverbindungen sowie mit geeigneten Anschlüssen für Oszillographen. Es ist ferner für den Erfindungscharakter unerheblich, in welcher Weise der Deckel 38 abgeschwenkt und das Objekt auf den Metallspiegel aufgebracht wird. So kann der Deckel beispielsweise um eine horizontale Achse anstelle der in Fig. dargestellten vertikalen Achse abgeschwenkt oder das Objekt auf einer Kreisbahn anstelle einer geradlinigen Injektionsbahn an die Spiegelfläche herangeführt werden. Weiterhin ist unerheblich, in welcher Weise die verschiedenen Präparationsschritte, beispielsweise das Herstellen von frischer Anschnittfläche, die Auslösung der Injektion, sowie das Abschwenken des Deckels bewirkt werden, sowie welche Injektoren für unterschiedliche feste oder flüssige Objekte verwendet werden. Unerheblich

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bleibt schließlich die Art und Weise der Kryogenversorgung einschließlich aller Anschlüsse sowie die spezielle Ausbildung des Nachfüllsystems.

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Claims

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Ansprüche

11.^Einrichtung zur Metallspiegel-Kryofixation sowie zur nachfolgenden Kryopräparation biologischer Objekte für mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen, mit einem in einer durch gasförmiges Kryogen bespülbaren metallischen Kühlkammer angeordneten, durch ein Kryogen tiefgekühlten hochglanzpolierten Metallspiegel, auf den ein Objekt durch eine Injektionsvorrichtung oder dgl. aufbringbar ist, wobei die Kühlkammer ein für eine Kryopräparation und zur Aufnahme dafür erforderlicher Vorrichtungen ausreichendes Volumen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß der Metallspiegel einen von der restlichen Spiegelfläche (18a) thermisch isolierten Spiegelbereich (18c) geringer Flächenausdehnung aufweist, der durch einen mit dem Spiegelbereich (18c) einen hohlen Innenraura umschließenden, abschwenkbaren Deckel (38) abdeckbar und durch flüssiges Helium getrennt kühlbar ist, und daß der Innenraum über dem getrennten Spiegelbereich (18c) durch kaltes gasförmiges Helium getrennt spülbar ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der getrennte Spiegelbereich (18c) eine fläche zwischen 1 und Io cm aufweist und auf ^: 2o K abkühlbar ist.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die restliche Spiegelfläche (18a) eine Fläche von mindestens 5o cm aufweist und, vorzugsweise durch flüssigen Stickstoff, auf eine Temperatur von «ζ 1oo°K abkühlbar ist.

4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der abschwenkbare Deckel (38) aus einem

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Werkstoff mit geringer Wärmekapazität und geringer Masse besteht.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der abgetrennte Spiegelbereich (18c) mit der restlichen Spiegelfläche (18a) in derselben waagrechten Ebene liegt.

6. Einrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet/ daß der abgetrennte Spiegelbereich (18c) mit dem Metallspiegel durch eine wärmehemmende dünne Metallschicht (41b) zu einem durchgehenden Metallspiegel verbunden ist.

7. Einrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der durchgehende Metallspiegel durch eine Metallfolie (43) gebildet ist, welche sich in innigem Kontakt mit den von flüssigem Helium bzw. Kryogen beaufschlagten Kühlflächen (18b, 41a) befindet.

8. Einrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Metallfolie (43) aus Edelstahl besteht.

9. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der abgetrennte Spiegelbereich (18c) einschließlich der Einrichtung für die Heliumkühlung und -spülung als eine gesonderte Zusatzeinrichtung ausgebildet ist, und daß die für den Einbau der Zusatzeinrichtung vorgesehene Aufnahme-Öffnung (34) in der restlichen Spiegelfläche (18a) durch Abdeck-, Verschluß- und Isolationselemente (45, 46, 47) gesichert ist.

1o. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der hohle Innenraum unter dem Deckel (38) unter einem leichten Helium-Überdruck steht und daß der Deckel (38) mit seiner Auflagefläche, z.B. dem getrennten Spiegelbereich (18c), dünne Auslaßspalte für das gasförmige Helium bildet.

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11. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 1o, dadurch gekennzeichnet, daß zur Spülung der Kühlkammer (7b) mit vorzugsweise kaltem gasförmigem Stickstoff Umlenkbleche (39) abdampfendes Kryogen aus dem die Kühlkammerwandung (18d) kühlenden Kryogentank (21a) in das Innere der Kühlkammer (7b) leiten und einen laminaren Kryogen-Gasstrom (22c) erzeugen.

12. Einrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Fließmenge des zur Spülung der Kühlkammer (7b) verwendeten Kryogen-Gasstromes (22c) durch eine innerhalb der Umlenkbleche (39) angeordnete Heizeinrichtung (39a) steuerbar ist.

13. Einrichtung nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß über die zur Spülung der Kühlkammer (7b) dienenden Kanäle, z.B. zwischen Kühlkammerwandung und Umlenkblechen (39), auch flüssiges Kryogen in das Kühlkammerinnere einführbar ist.

14. Einrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anzeige und/oder Begrenzung des Kryogen-PÜllstandes in der Kühlkammer (7b) ein Niveausensor (4o) und gegebenenfalls eine von dem Niveausensor (4o) gesteuerte Füllauto matik vorgesehen sind.

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