DE2944464C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Einrichtung zur Kryosubstitution kleiner biologischer Objekte mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Zur raschen Stabilisierung werden biologische Proben für mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Unterschungen in zunehmendem Umfang extrem rasch einge­ froren (Schockgefrieren). Anschließend wird das in den Proben enthaltene Wasser (oftmals mehr als 90 Gewichts­ prozente) bei tiefen Temperaturen gegen geeignete organische Solvenzien, beispielsweise wasserfreies Azeton, oder organische Lösungen, beispielsweise Osmium­ tetroxyd, in wasserfreiem Azeton, ausgetauscht. Dieser Austausch wird zumindest in der entscheidenden initialen Phase bei Temperaturen vollzogen, welche erheblich unter -30°C liegen, da bei Temperaturen über -30°C bereits Veränderungen der molekularen Struktur der Objekte auf­ treten können, welche die nachfolgenden Untersuchungen entwerten. Oftmals findet die entscheidende Anfangs­ phase der Kryosubstitution daher aus Sicherheitsgründen im Temperaturbereich zwischen -80 und -120°C statt, den man mit herkömmlichen Kältethermostaten entweder überhaupt nicht oder nur mit großem apparativen Aufwand erreichen kann. Dieser Aufwand steht dabei angesichts der kleinen Abmessungen wie der begrenzten Zahl derartiger Proben in einem Verhältnis, welches den Einsatz teurer und voluminöser Apparaturen nicht rechtfertigt. Üblicherweise werden z. B. für die Elektronenmikroskopie in einem Arbeitsgang ein bis zehn Gewebeblöckchen mit einem Einzelvolumen zwischen 0,1 und 10 mm³ einer Kryosubstitution unterworfen, welche je nach Größe der Objekte und der Substitutionstemperatur zwischen drei Tagen und drei Wochen erfordert. Während der genannten Zeit darf die Temperatur den jeweils für jedes Objekt zu bestimmenden Grenzwert keinesfalls überschreiten, da sich andernfalls die Probe in ihrer molekularen Struktur so verändern kann, daß verbindliche wissenschaftliche Aus­ sagen über ihre Struktur im normalen Lebenszustand ("in vivo") nicht mehr gemacht werden können.

Zur Kryosubstitution werden bislang lediglich labormäßige Behelfe herangezogen, welche vorzugsweise darin bestehen, daß man die Proben in verschlossenen Behältern in Kälte­ mischungen bekannter Art (beispielsweise Kohlensäureschnee- Mischungen) lagert, welche die gewünschte Temperatur auf­ weisen. Dieses Vorgehen erfordert jedoch eine laufende Kontrolle sowie einen zumindest täglichen Neuansatz der Kältemischung. Soweit das Laboratorium über Tieftemperatur­ schränke für Temperaturen unter -80°C verfügt, werden der­ artige Systeme verwendet. Die meisten morphologisch orientierten Laboratorien verfügen jedoch nicht über der­ artige Tieftemperaturschränke. Die Anschaffung eines derartig voluminösen und teuren Systems scheidet angesichts des Platzbedarfs, des Anschlußwertes sowie der Investitions­ kosten meist aus ("Electron Microscopy after Rapid Freezing . ." von A. van Harreveld et al.; Anat. Rec. 149, S. 381-386 und "Eutectic Ethylene Glycol . ." von Daniel Pease, Journal for Ultra­ structure Research Vol, 21, S. 75-97, 1967).

Auf dem Gebiet der Gefriertrocknung sind bereits Einrichtungen bekanntgeworden, die zur Behandlung kleiner biologischer Objekte für die elektronenmikroskopische Untersuchung dienen. So ist eine Einrichtung zur Gefriertrocknung und ggf. zur Kunstharz­ imprägnation solcher Objekte bekannt, die einen metallischen Behälter in Form eines evakuierbaren Tauchkörpers aufweist, der in einem ein flüssiges Kryogen enthaltenden Dewargefäß angeordnet ist und in das Kryogen eintaucht (DE-OS 27 39 796). Der Behälter enthält einen Probenteller zur Aufnahme der Objekte so, daß der Probenteller und die Behälterwandung keinen direkten mechanischen Kontakt miteinander haben, und weist außerdem eine regelbare Heizeinrichtung auf, durch die er auf eine gewünschte Temperatur temperierbar ist. Durch Evakuierung des Behälters und ggf. durch Anordnung von Molekular­ sieben im Behälterinneren wird die Trocknung der Objekte, d. h. die Beseitigung des in den Objekten vorhandenen gefrorenen Wassers, bewerkstelligt. Diese bekannte, ausschließlich für die Gefriertrocknung bestimmte Einrichtung ist für die Kryo­ substitution nicht geeignet, da der Probenteller zur Aufnahme der Objekte keinen Platz für die Aufnahme von Substitutions­ medium bietet. Eine Füllung des Behälters selbst mit Substi­ tutionsmedium ist für die Kryosubstitution hingegen nicht zu gebrauchen, weil infolge des Tauchkontaktes des Behälters mit dem flüssigen Kryogen eine zu tiefe Temperaturabsenkung die Folge wäre. Schließlich kann eine Kryosubstitution infolge des erheblichen Dampfdruckes der Substitutionsmedien nur bei normalem Atmosphärendruck, nicht aber unter dem für die Gefrier­ trocknung erforderlichen Vakuum (besser als 10 ^-3 Torr) durch­ geführt werden.

Weiterhin ist, ebenfalls auf dem Gebiet der Gefriertrocknung, eine Einrichtung zur Behandlung von Lösungen bzw. Suspensionen bekanntgeworden, bei der ein evakuierbarer Kondensator für den bei der Trocknung anfallenden Dampf in einem eine Kälte­ mischung enhaltenden Topf angeordnet ist und über eine Viel­ zahl von rechenartig angeordneten Anschlüssen in einem Saug­ rohr mit Glasbehältern in Verbindung gebracht werden kann, welche die zu trocknenden Objekte enthalten (US-PS 21 63 996). Diese bekannte Einrichtung ist einerseits nur für Kryogene geeignet, die eine über -80°C liegende Eigentemperatur haben, andererseits steht nur der Kondensator unter dem Einfluß des Kryogens, während die zu trocknenden Objekte selbst höhere Temperatur aufweisen. Für eine Kryosubstitution kommt diese bekannte Einrichtung daher nicht in Frage.

Auf dem Gebiet der Spektroskopie radioaktiver Elemente ist auch schon eine Einrichtung bekannt, bei der zur Ultra-Tief­ kühlung radioaktiver Proben verdampfendes flüssiges Helium zur Kühlung herangezogen wird (US-PS 38 94 403).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine Kryosubstitution kleiner biologischer Proben mit einem Einzelvolumen unter 10 mm³ für eine nachfolgende insbesondere elektronenmikros­ kopische Untersuchung mit einer Einrichtung zu ermöglichen, welche in der Herstellung bzw. Handhabung einfach ist und den erforderlichen Tieftemperaturbetrieb über mehrere Tage bis Wochen mit der notwendigen Sicherheit ohne laufende Wartung sowie geringen laufenden Betriebskosten ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Ausgestaltung der Einrichtung nach der eingangs geschilderten Art entsprechend dem Kennzeichen des Patentanspruches 1 gelöst.

Nach der Erfindung erfolgt somit ein Austausch des in den gefrorenen biologischen Proben enthaltenen Eises gegen eine organische Flüssigkeit oder Lösung, das Substitutions­ medium, das in den Behälter mit den Objekten eingefüllt ist. Dabei wird die für den Substitutionsprozeß im Rahmen mikroskopischer, insbesondere elektronenmikroskopischer Untersuchungen geforderte Temperatur zwischen -30 und -120°C dadurch erzielt, daß der metallische Behälter mit den gefrorenen biologischen Proben in dem Substitutionsmedium in das Dewargefäß eingehängt wird, das flüssigen Stickstoff oder ein anderes geeignetes Kryogen mit einem Siedepunkt unter -30°C enthält. Dabei taucht der metallische Behälter nicht in das Kryogen ein oder befindet sich mit größeren Teilen seiner Oberfläche mit dem Kryogen in einem direkten wärmeleitenden metallischen Kontakt, sondern er ist so in das Dewargefäß über dem Spiegel des in dem Dewargefäß befindlichen flüssigen Kryogens eingehängt, daß er nicht von dem Kryogen umspült oder berührt wird. Jedoch ist er so angeordnet, daß er von dem laufend abrauchenden Gas des Kryogens bzw. von der kalten Gasatmosphäre ständig umspült ist und dadurch auf die gewünschte Temperatur abgekühlt wird.

Die erfindungsgemäße Einrichtung hat gegenüber den bekannten Laborbehelfen zur Kryosubstitution eine Reihe wesentlicher Vorteile: Der Aufbau der Einrichtung ist einfach und verursacht nur geringe Herstellungskosten, da als Grundgerät ein bekannter Vorratsdewar verwendet werden kann. Der Kryogenverbrauch während der Kryosub­ stitution liegt kaum über der normalen Abdampfrate des Dewargefäßes, welcher ohne Behälter bei normalem Ver­ schluß des Dewargefäßes gemessen wird. Diese Abdampfrate liegt bei einwandfreier Beschaffenheit des Dewargefäßes bei der Auf­ bewahrung von z. B. flüssigem Stickstoff unter einem halben Liter pro Tag. Infolge dieses geringen Kryogenverbrauches ist ein unbeaufsichtigter Betrieb der Einrichtung über mehrere Tage bis Wochen ohne weiteres möglich. Ein 50 l-Dewar ermöglicht bei der genannten Abdampfrate von unter 0,5 l pro Tag beispielsweise einen Substitutionsprozeß mit einer Gesamtdauer von mindestens 100 Tagen.

Der Behälter enthält ein Heizelement sowie einen Temperatur­ fühler, welche in bekannter Weise die Vorwahl und die thermostatische Einhaltung eines bestimmten Temperatur­ wertes ermöglichen, der für den jeweiligen Substitutions­ prozeß als optimal ermittelt ist.

Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist vor­ gesehen, daß zwischen der Unterseite des Behälters und dem Spiegel des Kryogens ein Strahlungsschutzschild zur Reduzierung der Wärmestrahlung vom Behälter in das Kryogen angeordnet ist. Hierdurch wird die Abdampfrate des Kryogens auf einem möglichst niedrigen Wert gehalten.

Der Wärmeaustausch zwischen dem Behälter und der Gasatmos­ phäre läßt sich auf verschiedene Art beeinflussen. So kann nach einer zweckmäßigen Weiterbildung der Erfindung die Oberfläche des Behälters zur Erzielung eines bestimmten Wärmeaustausches mit der Gasatmosphäre größenmäßig bemessen und/oder behandelt sein. Alternativ oder zu­ sätzlich kann zur Erhöhung des Wärmeaustausches zwischen dem Behälter und der Gasatmosphäre eine zumindest zeitweilige Gaszirkulation in dem Gewargefäß vorge­ sehen werden.

Nach einer vorteilhaften Weiterbildung ist überdies zur Erhöhung des Wärmeaustausches zwischen dem Behälter und dem Kryogen zumindest zeitweise eine metallische Wärmeleitverbindung mit einem vorbestimmten Wärmeleit­ widerstand zwischen dem Behälter und dem flüssigen Kryogen herstellbar. Dies kann ein sog. "Kühlfinger" sein, der dann eingesetzt wird, wenn rasch eine besonders tiefe Temperatur in dem genannten Temperaturbereich er­ reicht werden soll. Der Wärmeleitwiderstand dieses "Kühlfingers" ist durch dessen Querschnitt bestimmt. Es kann aber auch daran gedacht werden, diesen Querschnitt veränderbar zu machen, um jeweils den Wärmefluß zu er­ reichen, der zum Erreichen und Einhalten der gewünschten Temperatur erforderlich ist.

Mit besonderem Vorteil kann die regelbare Heizeinrichtung des Behälters zur zeitabhängigen Steuerung des Temperatur­ verlaufes des Behälters durch eine halb- oder vollauto­ matische Steuerung gesteuert sein. So erhält man eine besonders günstige Substitutionsdauer mit einer niedrigen Anfangstemperatur, von beispielsweise -90°C, und höheren Temperaturwerten im weiteren Verlauf, beispielsweise -60°C nach einer Woche, und -30°C nach zwei Wochen. Dieser Temperatur/Zeit-Ablauf wird zweckmäßigerweise für einen Prozeßrechner programmiert, der die Leistung des Heiz­ elementes in dem Behälter unter Verwendung eines Temperatur­ fühlers in bekannter Weise steuert.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Aus­ führungsbeispiele anhand der Zeichnungen sowie aus weiteren Unteransprüchen. In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1 einen schematischen Schnitt durch eine erste Ausführungsform einer Einrichtung zur Kryosubsti­ tution nach der Erfindung, und

Fig. 2 in vergrößertem Maßstab einen schematischen Schnitt durch eine weitere Ausführungsform mit einem gegen­ über der Ausführung gemäß Fig. 1 modifizierten metallischen Behälter.

Die erfindungsgemäße Einrichtung gemäß Fig. 1 umfaßt im wesentlichen einen durch einen Deckel verschlossenen metallischen Behälter 1 mit einer Ausnehmung zur Aufnahme der schockgefrorenen biologischen Objekte 2 und des Substitutionsmediums 3, wobei der metallische Behälter 1 so in den Hals eines Dewargefäßes 4 eingehängt ist, daß er sich über der Oberfläche des darin eingefüllten flüssigen Stickstoffes 5 bzw. eines anderen geeigneten Kryogens befindet. Der metallische Behälter 1 wird durch das an ihm vorbeistreichende Stickstoffgas (siehe die Pfeile) abgekühlt. Seine Temperatur kann durch ein Gegenheizen mit einer Heizpatrone 6 verändert sowie mit einem Temperatur­ fühler 7 gemessen werden. Übermäßige Kryogenverluste durch die Wärmeabstrahlung des beheizten metallischen Behälters 1 können durch einen mit hochglanzpolierten Aluminumfolien 8 und 8 a beschichteten Strahlungsschutzschild 9, der bei­ spielsweise aus geschäumtem Polystyrol besteht, verhindert werden.

Die Heizpatrone 6 und der Temperaturfühler 7 können in bekannter Weise an ein Steuergerät 10 angeschlossen werden, dessen Elektronik es ermöglicht, die an einem Anzeige­ instrument 11 ablesbare Temperatur mit einem kalibrierten Einstellelement 11 a vorzuwählen, wobei ein nicht näher zu beschreibendes System die thermoplastische Einhaltung der vorgewählten Temperatur gewährleistet.

Eine weitere Ausgestaltung ist nach Fig. 1 durch den Anschluß eines Prozeßrechners 12 möglich, dessen Tasten­ feld 13 die Vorwahl eines Temperatur/Zeit-Ablaufes für die Kryosubstitution sowie dessen Darstellung am TV-Schirm 14 bzw. die Eingabe vorbereiteter Programme über eine Magnetbandkassette 15 ermöglicht. Schließlich können zur Anzeige des jeweiligen Dewarfüllstandes an einem Stab 16 eine Reihe von Meßdioden 17 angebracht sein, welche über Leuchtdioden 18 am Schaltpult des Steuergerätes 10 den Füllstand anzeigen.

Bei der modifizierten Ausgestaltung der Einrichtung gemäß Fig. 2, die im übrigen in ihrer Gesamtanordnung der Einrichtung nach Fig. 1 entspricht, weist der metallische Behälter 1 a eine Bohrung 19 auf, durch welche einerseits flüssiger Stickstoff in das Dewar­ gefäß 4 ohne Positionswechsel des Behälters 1 a nachge­ füllt werden kann, durch welche andererseits aber auch ein Metallstab 20 einführbar ist, der bei komplettem Einführen in den flüssigen Stickstoff 5 eintaucht und damit zwischen dem Metallbehälter 1 a und dem flüssigen Stickstoff 5 eine Wärmeleitverbindung herbeiführt, welche bei Bedarf das Erreichen tieferer Temperaturen ermöglicht.

Auf das Erreichen tieferer Temperaturen, jedoch durch eine bessere Ausnutzung der Wärmekapazität des abrauchenden gas­ förmigen Stickstoffes, zielt auch eine Oberflächenver­ größerung des metallischen Behälters 1 a ab, welche ent­ weder in einfacher Form durch vertikal verlaufende Nuten erreicht werden kann oder in der dargestellten Weise durch eine Schraubennut 21 realisiert wird, welche die Kontakt- Weglänge des entweichenden Gases im Verein mit einer exakt dem Außendurchmesser des Behälters 1 a angepaßten Hülse 22 beträchtlich erhöht.

Schließlich kann die Gesamtdauer des Substitutionsprozesses dadurch erheblich reduziert werden, daß man das Substitutions­ medium 3 durch einen Propeller 23 in Umlauf versetzt, so daß die beispielsweise auf einem feinen Netz 23 a liegenden Objekte 2 dauernd umspült werden und sich an ihren Ober­ flächen keine Konzentrationsgradienten aufbauen können, welche die Substitution verlangsamen.

Die anhand der Fig. 1 und 2 beschriebene Einrichtung kann im Rahmen der Erfindung in verschiedenen Variationen und Kombinationen verwirklicht werden. So ist es beispiels­ weise möglich, verschiedene Einzellösungen nach Fig. 1 und Fig. 2 zu kombinieren, zur Erhöhung des Wärmeaustausches die Oberflächenbeschaffenheit zu variieren sowie innerhalb des Dewargefäßes 4 in bekannter Weise, beispielsweise durch einen Propeller 24, der in einer Ausnehmung des Strahlungsschutzschildes 9 angeordnet ist, eine Gaskonvektion zu erzeugen, welche die Kühlleistung ohne Herstellung eines metallischen Kontaktes bei Bedarf zeitweise erhöht (Fig. 2). Diese Zusatzkonvektion kann weiterhin über den Temperatur­ fühler 7 jeweils nach der vorgewählten Temperatur elektronisch gesteuert werden.

Ebenso ist es unerheblich, aus welchem Metall der Behälter 1 bzw. 1 a ausgeführt sowie mit welchen Oberflächenüberzügen er ggf. zum Schutz gegen eine Korrosion oder zum Zweck einer leichteren Reinigung versehen wird. Auch ist die Weise, in der das elektrische Steuergerät 10 oder die Füll­ standsanzeige 16, 17 und 18 angeordnet und geschaltet ist oder arbeitet, beliebig. Schließlich kann der Deckel 25 (Fig. 2), durch den eine Abdeckung der in dem Behälter 1 bzw. 1 a ausgebildeten Substitutionskammer möglich ist, einen Schraub- oder Bajonettverschluß aufweisen, und Form und Ausführung des Dewargefäßes 4 und der Verbindungs­ teile, welche zwischen dem Dewargefäß 4 und dem Behälter 1 bzw. 1 a vorgesehen sind, sind beliebig.

Claims (8)

1. Einrichtung zur Kryosubstitution kleiner biologischer Objekte für mikroskopische, insbesondere elektronen­ mikroskopische Untersuchungen, mit einem metallischen Behälter zur Aufnahme mindestens eines Objekts und eines Substitutionsmediums und mit einem auf eine vor­ bestimmte Temperatur kühlbaren Raum, in dem der Behälter angeordnet und auf die vorbestimmte Temperatur temperier­ bar ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (1, 1 a) in einem ein flüssiges Kryogen (5) enthaltendem Dewargefäß (4) über dem Spiegel des Kryogens derart angeordnet ist, daß er von kalter Gas­ atmosphäre umspült ist, und daß der Behälter (1, 1 a) eine regelbare Heizeinrichtung (6) aufweist, durch die er auf eine Temperatur zwischen -30°C und -120°C temperier­ bar ist.

2. Einrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen der Unterseite des Behälters (1, 1 a) und dem Spiegel des Kryogens (5) ein Strahlungsschutzschild (9) zur Reduzierung der Wärmestrahlung vom Behälter (1, 1 a) in das Kryogen angeordnet ist.

3. Einrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Behälters (1, 1 a) zur Erzielung eines bestimmten Wärmeaustausches mit der Gasatmosphäre entsprechend bemessen (Schraubennut 21) und/oder behandelt ist.

4. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung des Wärmeaustausches zwischen dem Behälter (1, 1 a) und der Gasatmosphäre eine zumindest zeitweilige Gaszirkulation (Propeller 24) vorgesehen ist.

5. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erhöhung des Wärmeaustausches zwischen Behälter (1, 1 a) und Kryogen (5) zumindest zeitweise eine metallische Wärmeleitverbindung (20) mit einem vorbestimmten Wärmeleitwiderstand zwischen dem Behälter (1, 1 a) und dem flüssigen Kryogen (5) herstellbar ist.

6. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß in den Behälter (1, 1 a) eine Heizpatrone (6) eingebaut ist.

7. Einrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die regelbare Heizeinrichtung (6) des Behälters (1, 1 a) zur zeitabhängigen Steuerung des Temperaturverlaufes des Behälters (1, 1 a) durch eine halb- oder vollautomatische Programmsteuerung (12, 13, 15) gesteuert ist.

8. Einrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der programmgesteuerte Temperaturverlauf dem Substitutionsverhalten des jeweils in dem Behälter (1, 1 a) befindlichen Objekts (2) anpaßbar ist.