DE3425744A1 - Vorrichtung zur entwaesserung und/oder polymerisationseinbettung biologischer proben bei tiefen temperaturen - Google Patents
Vorrichtung zur entwaesserung und/oder polymerisationseinbettung biologischer proben bei tiefen temperaturenInfo
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Vorrichtung zur Entwässerung und/oder Polymerisationseinbettung biologischer Proben bei tiefen Temperaturen
Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Entwässerung
und/oder Polymerisationseinbettung biologischer Proben bei tiefen Temperaturen für eine nachfolgende mikroskopische,
insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchung, mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des
Patentanspruches 1, . .
Zur raschen Stabilisierung werden biologische Proben .
für mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen in zunehmendem Umfang extrem rasch eingefroren
(Schock-Gefrieren) . Anschließend wird das in den Proben enthaltene Wasser (häufig mehr als 90 Gew.%) bei
tiefen Temperaturen gegen geeignete organische Solvenzien
beispielsweise wasserfreies Azeton oder Methanol, oder
organische Lösungen, beispielsweise OsO. und/oder Uranylacetat in wasserfreiem Azeton oder Methanol, ausgetauscht. Dieser Austausch wird zumindest in der ent- .
scheidenden anfänglichen Phase bei Temperaturen vollzogen, welche in der Regel nicht über -800C liegen, da
bei Temperaturen über -800G bereits Veränderungen in der
molekularen Struktur dieser Objekte auftreten können, die
die nachfolgenden Untersuchungen entwerten. Meistens findet
die entscheidende Anfangsphase der Entwässerung daher
aus Sicherheitsgründen im Temperaturbereich zwischen -80 und -12O0C statt, den man mit herkömmlichen Kältethermostaten
entweder überhaupt nicht oder nur mit grossem apparativem Aufwand erreichen kann. Üblicherweise
werden für die Elektronenmikroskopie in einem Arbeitsgang 1 bis 10 Gewebeblöckchen mit einem Einzelvolum
zwischen 0,1 und 10 mm einer derartigen Entwässerung unterworfen, welche je nach Grosse der
Objekte und vorgewählter Temperatur zwischen 3 Tagen und 3 Wochen erfordert. Während dieser Zeit darf die
Temperatur den jeweils für jedes Objekt zu bestimmenden Grenzwert keinesfalls überschreiten, da sich sonst die
Probe in ihrer molekularen Struktur so verändern kann, daß verbindliche wissenschaftliche Aussagen über ihre
Struktur im normalen Lebenszustand ("in vivo") nicht mehr gemacht werden können.
Es ist eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art bekannt (DE-OS 30 42 578), bei der der Behälter, in
dem die Entwässerung und/oder Einbettung stattfindet, in den Hals eines Dewargefäßes so eingehängt ist, daß
der Behälter weitgehend bündig mit dem oberen Rand des Dewarhalses abschließt und auf diese Weise einfach mit
den zum Entwässern und Einbetten gebräuchlichen Medien sowie mit den gefrorenen Proben beschickt werden kann.
Der Behälter und der Dewarhals werden während der Entwässerung und Einbettung mit einem isolierenden Deckel
abgedeckt, durch den lediglich die Welle eines Rührwerkes zum Bewegen der Medien sowie Elektroanschlüsse
für die Temperaturregelung hindurchgeführt sind. Die Temperaturregelung ist mittels einer Heizpatrone und
eines Temperaturfühlers über einen elektrischen Regelkreis realisiert. Bei Inkubationstemperaturen bis etwa
minimal -800C reicht hierbei die Kühlung durch das kalte
Stickstoffgas (GN2) aus, das laufend aus dem im Dewargefäß
befindlichen flüssigen Stickstoff (LN ) absiedet. Lediglich für den Beginn der Arbeit wird die Abkühlung des Behälters
über einen in der Höhe verstellbaren "Kühlfinger" beschleunigt, der durch direkten metallischen Kontakt mit dem LN„ vorübergehend
einen stärkeren Wärmeabfluß aus dem Behälter bewirkt.
Die vorstehend beschriebene bekannte Vorrichtung ist hinsichtlich
ihrer Leistung und ihres einfachen Aufbaues den früher verwendeten Kühlsystemen erheblich überlegen. Jedoch
ergibt sich ein gewisses Problem beim Beschicken des Behälters mit den Entwässerungsmedien und den gefrorenen Proben:
Die verwendeten Medien sind durchgehend extrem hygroskopisch und ziehen insbesondere in gekühltem Zustand sehr rasch
Wasser aus der feuchten Raumluft.an, welches dann eine
Tieftemperatur-Entwässerung der geforderten Art unmöglich
macht. Weiterhin besteht die Gefahr, daß die schock-gefrorenen
Proben beim Einbringen oberflächlich über -800C hinaus
erwärmt werden und daß hierdurch gerade in der oftmals lediglich 10μ tiefen gut erhaltenen Randzone irreversible
Wärmeschäden auftreten, die ebenfalls die Resultate einer Tieftemperatur-Entwässerung entwerten. Schwierigkeiten
ergeben sich auch, wenn man mit Medien arbeitet, die bei
Temperaturen _< -12O0C eingesetzt werden, und an die Entwässerung eine Einbettung anschließt, welche bei -35°C
durchgeführt werden muß, z.B. eine LOWICRYL-Tieftemperatur-Einbettung;(vgl.
Carlemalm et al "Resin development for electron microscopy and an analysis of embedding at low
temperatures" - Journal of Microscopy 126, S. 123 bis 143 (1982)). Denn die initiale Abkühlung auf -12O0C kann nicht
ohne eine metallische Verbindung zwischen dem Behälter und dem LN^ realisiert werden, welche anschließend jedoch
dazu führt, daß im höheren Temperaturbereich ein starkes Sieden des LN„ einsetzt, das infolge der notwendigen
Gegenheizung des Behälters nicht mehr beherrschbare Dimensionen annimmt. Schließlich wirft der bei einer an
eine Tieftemperatur-Entwässerung anschließenden Tietemperatur-Einbettung notwendige mehrfache Austausch der
Medien sowie der nach dem heutigen Stand der Technik erforderliche Transfer der entwässerten Proben in eine
gesonderte Kammer für die Tieftemperatur-Polymerisation so erhebliche Probleme auf, daß bislang diese aussichtsreiche
und wissenschaftlich interessante Methode nur in geringem Umfang genützt wird. .
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Entwässerung
und/oder Einbettung kleiner biologischer Proben (z.B. mit einem Einzelvolum unter 10 mm3) für eine nachfolgende
mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchung zu erleichtern und zu vereinfachen und eine
hierfür geeignete Vorrichtung zu schaffen. Insbesondere soll das Einbringen und Manipulieren der Proben sowie
das Einfüllen und Austauschen der Medien leichter und ohne jedes Risiko ausgeführt werden können, so daß alle
Prozesse im gesamten Temperaturbereich zwischen -150 und -3O0C ohne überhöhten Kryogenverbrauch realisiert werden
können.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch eine Vorrichtung
mit den Merkmalen gemäß dem Kennzeichen des Patentanspruches 1.
Bei der erfindungsgemässen Vorrichtung liegt die Oberseite
des Behälters wesentlich, z.B. mindestens 30 mm und mehr, unterhalb des oberen Randes des Dewarhalses und der Deckel
bleibt beim Einfüllen und beim Austausch der zum Entwässern und Einbetten erforderlichen flüssigen Medien
geschlossen. Die zum Einfüllen und Austauschen vorgesehenen Öffnungen im Deckel korrespondieren mit ent-
sprechenden Ausnehmungen, die im Behälter ausgebildet
oder diesem zugeordnet sind, und das Einfüllen der auf Raumtemperatur befindlichen Medien erfolgt über die
Kanüle im Zuge eines in der Ausnehmung entstehenden Gegenstromes mit einem Wärmeaustausch. Dieser gewährleistet,
daß das flüssige Medium beim Erreichen der Proben bereits
die für die Inkubation geforderte Temperatur aufweist.
Da die gesamte Inkubation der Proben zur Entwässerung ■
und Einbettung ohne Öffnen des Deckels erfolgt, ist das Risiko einer Wasseraufnahme somit ausgeschlossen.
Nach einer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß der zwischen der Oberseite des Behälters und der
Deckelunterseite befindliche Raum im Dewarhals durch einen - vorzugsweise mit dem Deckel eine Einheit: bildenden
thermisch isolierenden Stopfen ausgefüllt ist. Nach einer anderen . Weiterbildung der Erfindung ist in dem LN9 ein
Verdampfer angeordnet, so daß bei einem Öffnen des Dewarhalses,
z.B. bei der Entnahme der entwässerten Proben und zur Beschickung mit neuen gefrorenen Proben, grössere
Mengen von GN^ freigesetzt werden können. Diese umströmen
den im Dewarhals angeordneten Behälter und gelangen in den
zwischen Behälter und Deckel befindlichen Raum. Dadurch
und im Verein mit der tief im Dewarhals angeordneten Behälteroberseite werden Frostniederschläge ebenso verhindert
wie jegliche Erwärmung der Proben. Nach einer bevorzugten Weiterbildung kann das Anheben des Deckels,
ggf. mit dem daran befindlichen Stopfen, derartig
mechanisiert und gesteuert sein, daß es/erst nach dem Einsetzen der LN„-Vordampfung erfolgt und so langsam ausgeführt
wird, daß ein Einströmen feuchter Raumluft mit· Sicherheit ausgeschlossen wird.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung besteht darin,
daß eine thermische Isolation des Behälters den Wärme-
abfluß in den Dewarraum auf eine metallische Verbindung
beschränkt. Der Wärmeabfluß kann dabei exakt definiert und zeitlich konstant gehalten werden, indem die metallische
Verbindung mit einem massiven Metallkörper besteht, der mit dem LN„ in direktem Kontakt steht und durch diesen unabhängig
vom LN„-Füllstand im Dewar stets in seinem ganzen
Ausmaß annähernd auf der Siedetemperatur des LN- gehalten
wird.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß der Wärmeabfluß aus dem Behälter in den LN9-Raum
ohne ein Öffnen des Deckels reproduzierbar verändert werden kann. Hierzu ist die genannte Verbindung als dünnwandiges
Rohr ausgebildet, in welchem ein gut wärmeleitender Körper mit zylindrischer Oberfläche mittels
eines Zwischengliedes verschiebbar angeordnet ist. Eine automatisch geregelte Verschiebung, beispielsweise durch
einen Steuermotor, kann den LN2~Verbrauch im gesamten
Temperaturbereich des Systems zwischen -150 und -3O0C dadurch minimal halten, daß der Wärmeabfluß für jede Temperatur
durch eine entsprechende Rückkopplung minimiert wird.
Zum Einfüllen der Medien kann in weiterer Ausgestaltung die Füllvorrichtung ein Molekularsieb enthalten, durch
welches vor dem Kontakt mit den Proben evtl. noch im Medium enthaltene Wasserspuren restlos entfern werden, was im
Hinblick auf jede nachfolgende Elementanalyse von grösster Bedeutung ist.
Schließlich ist es mittels der erfindungsgemassen Vorrichtung
möglich, eine Tieftemperatur-Einbettung direkt in dem Raum durchzuführen, der zwischen der Oberseite des Behälters
und der Unterseite des Deckels im Dewarhals geschaffen ist. Die Polymerisation kann hierbei auf einfache Weise im inerten
GN„ stattfinden. Alle Manipulationen werden hierbei durch
eingespiegeltes Kaltlicht erleichtert. Ein für die Polymerisation erforderlicher UV-Strahler wird anstelle
des Deckels auf den Dewarhals aufgesetzt, und die Polymerisation findet auf oder in einer Einlage statt,
welche auf die Behälteroberfläche aufgelegt werden kann.
Ausfuhrungsbeispxelse der Erfindung werden nachfolgend
anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigen:
Fig. lA, IB rein schematische Schnittansichten von zwei
unterschiedlichen Ausführungsformen einer Vorrichtung mit einem LN2-GN2-KUhIsystem zur
. Entwässerung und/oder Einbettung bei tiefen
Temperaturen nach dem Stand der Technik;
Fig. IC einen Querschnitt durch den Behälter der
Vorrichtung gemäß Fig. IB, geschnitten längs der Linie IC-IC; ·
Fig. ID einen Axialschnitt durch einen Stapel von
Probenbehältern der Vorrichtung gemäß Fig. IB in vergrössertem Maßstab;
Fig. 2 eine zu Fig. 1 analoge Darstellung einer ersten
.Ausführungsform der erfindungsgemässen Vorrichtung;
Fig. 3 eine zu Fig. 1 analoge Darstellung einer
zweiten Ausführungsform der erfindungsgemässen
Vorrichtung;
Fig. 4 e-ine zu Fig. 1 analoge Darstellung einer
dritten Ausführungsform der erfindungsgemässen
Vorrichtung; ;
-■ · ■■ '■■■ 34257U
Fig. 4 Λ einen Teilschnitt eines im Kühlsystem
gemäß Fig. 4 verwendeten Einsatzkörpers;
Fig. 5A, 5B Draufsicht bzw. Axialschnitt, jeweils abgebrochen dargestellt, eines für eine vierte
Ausführungsform der Erfindung verwendbaren Behälters in vergrössertem Maßstab;
Fig. 6 einen Längsschnitt durch eine fünfte Ausführungsform
einer erfindungsgemässen Vorrichtung im Bereich des Dewarhalses;
Fig. 6A Draufsicht und Längsschnitt, geschnitten längs der Linie 6A-6A, eines Rührers und
eines zugeordneten Probenbehälters, und
Fig. 7 einen zu Fig. 6 analogen Teilschnitt im Bereich des Dewarhalses, gemäß dem über
dem Behälter eine Vorrichtung zur Polymerisationseinbettung angeordnet ist.
Bei der in Fig. IA im Querschnitt dargestellten Vorrichtung zur
Entwässerung und/oder Einbettung kleiner biologischer Proben befindet sich im Hals 1 eines mit LN-, 2 gefüllten Dewargefässes
3 ein metallischer Behälter 4 mit einer Ausnehmung zur Aufnahme der Proben 5 und des flüssigen Mediums
6 für ihre Entwässerung und/oder Einbettung. Die Proben 5 liegen auf einem Netz 7 im Behälter 4, so daß sie bei einer
Bewegung des Mediums 6 mittels eines durch einen Motor 8 über eine Welle 9 betriebenen Rührers 10 von allen Seiten
dauernd von dem Medium umspült werden. Der Behälter 4 ist während der Entwässerung bzw. Einbettung durch einen
Deckel 11 verschlossen, welcher bei dem Einbringen der Proben 5 bzw. der Medien 6 sowie beim Wechsel der Medien
6 vorübergehend geöffnet wird.
Der Behälter 4 erreicht im GN2 ohne direkten Kontakt
mit dem darunter befindlichen LN_ im Gleichgewichtszustand
eine Minimältemperatur im Bereich um -8O0G, welche mit
der Höhe H des LN -Spiegels im Dewargefäß 3 variiert und
mittels einer Heizpatrone 12 und eines Temperaturfühlers
13 einer Regelvorrichtung 14 auf jedem Wert über diesem Gleichgewichtswert ("steady state") konstant gehalten oder
im Sinn einer Temperatur-Zeitsteuerung reproduzierbar variiert werden kann. Soweit höhere Temperaturen im
Bereich über -5O0C realisiert werden, verhindert ein
Strahlungsschutzschild 15 ein stärkeres Siedes des LN„.
Tiefere Temperaturen können durch Herstellen einer metallisch-leitenden Verbindung zwischen dem Behälter 4
und dem LN„, beispielsweise durch Einschieben eines
zylindrischen Stabes 16 aus Aluminium, realisiert werden. Auch hierbei schwankt jedoch die erreichbare Minimaltemperatur
erheblich mit dem von der Füllhöhe H abhängigen Abstand A zwischen dem LN„-Spiegel und dem Boden des
Behälters 4, was sehr störend ist.
Soweit mehrere unterschiedliche Proben 5 gleichzeitig
inkubiert werden müssen, kann dies gemäß Fig. IB durch einen abgeänderten Aufbau und eine zusätzliche Ausgestaltung des Behälters 4' realisiert werden, dessen Probenkammer
durch einen Einsatz in mehrere Röhren 17 unterteilt ist, in denen zahlreiche kleinere Probenbehälter
18 gestapelt werden können. Der Boden der Probenbehälter
18 besteht jeweils aus einem Netz V, auf dem sich die Proben 5 befinden. Jeder Stapel ist durch einen Deckel
19 mit einem Netz 7' verschlossen, so daß die Objekte
5 aus dem obersten Probenbehälter 18 auch bei rascher
Drehung des Rührwerks 8, 9, 10 nicht aus dem Behälter
4' gespült werden können.
Die Fig/ 2 bis 7 zeigen Ausführungsformen der Vorrichtung
nach der Erfindung- Soweit nicht abweichend beschrieben,
sind diese Ausführungsformen von einem Aufbau entsprechend
der Fig. 1 und es sind demzufolge, soweit übereinstimmende Teile und Komponenten vorhanden sind, übereinstimmende
Bezugszeichen verwendet.
Die Vorrichtung gemäß Fig. 2 weist einen Behälter 20 auf,
der ebenso wie die Behälter 4, 4' bei der Vorrichtung
nach den Fig. IA und IB im Hals 1 eines mit LN_ gefüllten
Dewargefässes 3 angeordnet ist und eine zylindrische
Probenkammer 24 bildet. Ein entscheidender Unterschied zu der bekannten Vorrichtung besteht zunächst darinι
daß die Oberseite 21 des Behälters 20 mindestens 30 mm unterhalb des oberen Randes des Dewarhalses 1 angeordnet
ist und von einem dünnwandigen Rohr 22, z.B. aus rostfreiem Stahl, im Dewarhals 1 gehalten wird. Das Rohr 22
weist oberhalb des Behälters 20 einen Kranz von Öffnungen 23 auf. Seitlich von der Probenkammer 24 ist im Behälter
20 eine Bohrung 27 vorgesehen, deren oberer Rand einen Überlauf zur Probenkammer 24 bildet. Auf der gegenüberliegenden
Seite ist eine weitere Bohrung 31 im Behälter 20 ausgebildet, die an ihrer Unterseite mit der Probenkammer
in Verbindung steht. Der Dewarhals 1 ist durch einen Deckel II1 verschlossen, in dem eine mit der
Bohrung 27 fluchtende Öffnung 26 sowie eine mit der Bohrung 31 fluchtende Öffnung 32 vorgesehen ist.
Die Vorrichtung wird dadurch in Betrieb genommen, daß man nach Abnahme des Deckels 11' in den Dewarhals 1 LN„ eingießt,
der zunächst den Behälter 20 und das Rohr 22 abkühlt und danach durch die Öffnungen 23 in den Dewarbehälter
3 abfließt. Der Behälter 20 und das Rohr 22 bleiben hierbei zunächst bis zu den Öffnungen 23 mit
LN_ gefüllt, in den die gefrorenen Proben 5 für die Entwässerung ohne Risiko mittels eines kleinen Behälters
(nicht gezeigt) eingebracht werden können. Die Proben 5
befinden sich danach auf dem Netz 7 innerhalb der zylindrischen
Probenkammer 24 unter dem LN3- Spiegel, Nach dem Schließen
des Deckels II1 kann mittels des Regelsystems 13, 14 und der
daran angeschlossenen Heizpatrone 12 der LN„ aus dem Behälter
20 und dem Rohr 22 verdampft und der Behälter 20 auf die für die Entwässerung vorgewählte Temperatur erwärmt werden.
Nach Erreichen dieser Temperatur wird ein Entwässerungsmedium 6 über eine Füllvorrichtung, bestehend aus einem
Zylinder 25a und einer Kanüle 25b, eingefüllt. Das Entwässerungsmedium 6 befindet sich hierbei auf Raumtemperatur
und wird in den Zylinder 25a gegossen, während die dünne Kanüle 25b durch die Öffnung 26 im Deckel 11.' eingesteckt
ist und auf diese Weise in die korrespondierende Bohrung 27 des Behälters 20 bis nahe zu deren Boden hineinragt.
Die lichte Weite der Kanüle 25b und diejenige der Bohrung
27 sind so bemessen, daß das Medium 6 so langsam einfließt, daß es sich bei der Gegenstrombewegung innerhalb der Bohrung
27 auf die vorgewählte Temperatur des Behälters 20 abkühlt und erst nach Erreichen dieser Temperatur in die Probenkammer
24 überfließt. Da die Wärmekapazität der gesamten Flüssigkeitsmenge weniger als 5% der Wärmekapazität des
vorgekühlten Behälters 20 beträgt, erwärmt sich der Behälter 20 beim Abkühlen des Mediums 6 nur unwesentlich.
Soweit für eine nachfolgende Elementanalyse absolute
Wasserfreiheit des Mediums 6 gefordert wird, wird diese,
auf einfache. Weise durch die Anordnung eines Molekularsiebes
28 in dem Zylinder 25A erreicht, das auf einem eingeschalteten Filter 29 liegt. :■
Bei einem Austausch des Mediums 6 kann das bereits verwendete Medium durch eine zweite Kanüle 30 über die
Bohrung 31 im Behälter 20 sowie die Öffnung 32 im Deckel 11' wieder abgesaugt werden, ohne daß der Deckel 11' geöffnet
werden muß. Bei einer normalen Kryosubstitution in
Azeton/OsO. oder Methanol/OsO./Uranylacetat mit nachfolgender
Lowicryl-Monoiner-Inkubation können hierbei
alle Schritte der Inkubation und Imprägnation ohne ein Öffnen des Deckels II1 vollzogen werden und ohne
das bei den herkömmlichen Vorrichtungen nach Fig. 1 bestehende Risiko eines Wasserniederschlages und/oder
einer unreproduzierbaren Erwärmung der Proben 5. Von dem LN„ abgedampfter GNL tritt durch die Öffnungen
23 in das Innere des Rohres 22 ein und hält somit auch den Raum über dem Behälter 20 auf niedriger Temperatur.
Die Ausführungsform gemäß Fig. 3 erlaubt ein routinemässiges
und wiederholtes Öffnen der Vorrichtung zur jeweils erforderlichen Entnahme der entwässerten Proben
5 und zur Beschickung mit neuen gefrorenen Proben 5, Da eine Substitution in Methanol/OsO. binnen 6 Stunden
vollzogen werden kann, kommt diese Ausführungsform dem Bedarf der täglichen Routine in besonderer Weise entgegen.
Sie erlaubt es, den über dem Behälter 20 befindlichen Totraum durch einen Stopfen 33 aus thermisch
isolierendem Material ohne das Risiko auszufüllen, daß beim Öffnen des Deckels II1 feuchte Raumluft in den
Dewarhals 1 gelangt und zu Frostniederschlag am Behälter 20 und am Rohr 22 führt. Der Stopfen 33 ist auf beliebige
Weise mit dem Deckel 11' verbunden und mit diesem zusammen betätigbar. In dem LN» ist eine Heizpatrone
34 als Verdampfer angeordnet.
Um die vorstehend beschriebene Funktion zu erhalten, wird vor dem Öffnen des Deckels H1 und dem Herausziehen des
Stopfens 33 aus dem Dewarhals 1 die Heizpatrone 34 eingeschaltet, so daß LN„ in grösseren Mengen verdampft. Der
durch die Öffnungen 23 des Rohres 22 hindurchströmende GNp füllt den durch den Stopfen 33 beim Abheben des
Deckels 11' freigegebenen Raum sofort aus und verhindert
den Eintritt feuchter Raumluft. Zusätzlich gewährleistet dies beim Beschicken des Behälters 20 mit gefrorenen
Proben 5 eine inerte, trockene und kalte Gasatmosphäre.
Die Betätigung des Deckels 11' kann von Hand erfolgen.
Vorgezogen wird jedoch eine mechanische Betätigung, durch die der Deckel II1 automatisch mit minimaler Geschwindigkeit
angehoben wird. Dies kann beispielsweise durch einen Steuermotor realisiert werden; vorgezogen wird jedoch
die in Fig. 3 hierzu dargestellte Vorrichtung. Diese weist eine Hohlsäule 35 auf, die neben dem Dewargefäß
3 auf nicht näher gezeigte Weise befestigt ist.
Die Hohlsäule 35 nimmt einen Schaft 36 auf und bildet
mit diesem eine Art "Kolben", der mit dem Deckel 11' durch ein Joch 36a verbunden ist und durch eine vorgespannte
Druckfeder 38 nach oben beaufschlagt wird. Durch eine Sperrklinke 37 ist der "Kolben" in einer Stellung gehalten,
der dem geschlossenen Zustand des Deckels 11' entspricht. Im Boden der Hohlsäule 35 ist ein Ventil 39 angeordnet,
das ein Einströmen von Luft in das Innere nur durch eine Drasselöffnung erlaubt.
Nach Lösen der Sperrklinke 37 wird der "Kolben" durch .
die Feder 38 angehoben. Das Ventil 39 bewirkt einen langsamen Lufteinlaß in das Innere der Hohlsäule 35 beim Hub
des "Kolbens",wodurch der Deckel 11' nur langsam hochgehoben
wird. Das Ventil 39 lässt beim risikofreien Absenken des Deckels 11' die Luft wieder rasch aus der
Hohlsäule 35 austreten.
Eine weitere Ausgestaltung dieses Hubmechanismus kann
darin bestehen, daß über eine Elektronik 40 beim Drücken
eines Öffnungstasters 41 zunächst die Heizpatrone 34
eingeschaltet wird und daß erst danach mit zeitlicher Verzögerung die Sperrklinke 37 elektrisch ausgelöst wird,
"■"♦abgedichtet verschiebbar .
so daß der Hub ohne weiteres Zutun mit der erforderlichen
Verzögerung automatisch erfolgt.
Wie aus Fig. 3 weiterhin hervorgeht, erstrecken sich die Öffnungen 26 und 32 in dem Deckel 11' auch.durch
den Stopfen 33 hindurch, um das Einfüllen und den Austausch des Mediums 6 in der gleichen Weise zu bewerkstelligen,
wie das zuvor bereits beschrieben worden ist.
Durch eine weitere Ausgestaltung der Vorrichtung nach Fig. 4 kann dem häufig geäußerten Wunsch
nach besonders niedrigen oder hohen Inkubationstemperaturen entsprochen werden, welche oftmals im Zuge eines einzigen
Arbeitsganges bei einer Kryosubstitution bei -1200C mit
nachfolgender Tieftemperatur-Inkubation bei -300C notwendig
sind. Im Hinblick auf die gewünschten tiefen Temperaturen um -1200C ist hierbei ein metallischer
Kontakt zur LN2-Phase, im Hinblick auf die hohen Temperaturen
um -300C eine möglichst perfekte thermische Isolation
zwischen dem Behälter 20' und der LN2~Phase 2 erforderlich.
Um dieser Forderung zu entsprechen, ist der Behälter 20'
zumindest in seiner unteren Hälfte gegen die LN^-Phase 2 durch eine Isolationsschicht 42, beispielsweise aus Polyurethan-Hartschaum,
thermisch isoliert. Durch die Isolationsschicht hindurch ragt eine dünnwandige metallische Hülse
43, die in einer Bohrung des Behälters 20' gehalten ist, in eine entsprechende Bohrung eines massiven Metallkörpers
44 hinein und stellt einen metallischen Kontakt zwischen dem Behälter 20' und dem massiven Metallkörper 44 her.
Dieser besteht aus einem Material mit gutem Wärmeleitvermögen (z.B. Aluminium) und weist daher unabhängig vom
LKL-Füllstand im Dewargefäß 3 stets zur Gänze eine Temperatur
auf, die praktisch dem Siedepunkt des LN_ entspricht. Die
Minimaltemperatur des Behälters 20' stellt sich demnach
bei jeder vorgewählten Betriebstemperatur auf einen Wert ein, der ausschließlich durch den Querschnitt, die
Länge L und das Wärmeleitvermögen der Hülse 4 3 vorgegeben ist. Der Wärmeabfluß aus dem Behälter 20" kann durch
röhrenförmige Einsatzkörper (nicht dargestellt) in einfacher Weise variiert werden, die von oben her in die
Hülse 43 eingeschoben werden können- Damit kann das Kühlsystem ohne grossen Aufwand unterschiedlichen Betriebsbedingungen
angepasst werden.
Die Fig. 4 zeigt auch eine Ausgestaltung, die im Zuge
der Entwässerung und Einbettung unterschiedliche Betriebstemperaturen ohne Öffnen der Vorrichtung zu realisieren
gestattet. Hierzu ist ein zylindrischer Einsatzkörper 45 in der Hülse 43 verschiebbar und mit engem metallischem
Wandkontakt zur Hülse 43 angeordnet und gegen den Druck einer Druckfeder 43 mittels eines Stabes oder Rohres 47
auf- und abbewegbar. Die Fig. 4A zeigt eine zylindrische Ausnehmung 48 in einem derartigen Einsatzkörper 45, durch
die eine sehr präzise Veränderung des Wärmeabflusses
vom Behälter 20' zum Metallkörper 44 ermöglicht wird.
Die Auf- und Abbewegung des Einsatzkörpers 45 kann manuell erfolgen; vorteilhafter ist die Ausgestaltung durch einen
Motor 49 und einen Zahnstangentrieb 50, 511, so daß durch
eine über eine Regeleinheit 52' gesteuerte Bewegung des Einsatzkörpers 45 der LN„-Verbrauch durch eine Regelung
des Wärmeabflusses minimiert werden kann. Die Auf- und Abbewegung, gesteuert durch die Regeleinheit 521, erfolgt
dabei in Abhängigkeit von der durch den Temperaturfühler 13 gemessenen Temperatur des Behälters 20'.
Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung kann gemäß Fig.
dem Zweck dienen, ein und dieselbe Apparatur auf einfache
Weise ohne Umrüstung an unterschiedliche Probenzahlen anpassen zu können. Wie bereits eingangs festgestellt,
werden im Rahmen einer Entwässerung oder Einbettung bei tiefer Temperatur in aller Regel kleine Proben
mit einem Volumen unter 10 mm3 in kleiner Zahl bearbeitet. Zumeist werden hierbei nur wenige Blöcke in einem Arbeitsgang
entwässert und eingebettet. Es besteht demnach im Hinblick auf das meistens als Zusatz zum Entwässerungsmedium in hohen Konzentrationen verwendete teure OsO.
der Wunsch, mit möglichst kleinen Flüssigkeitsmengen zu substituieren. Andererseits können von Fall zu Fall
aber auch grössere Probenzahlen zur Entwässerung und Einbettung anstehen.
Diesen Anforderungen wird bei der Ausführungsform gemäß Fig. 5 dadurch entsprochen, daß der Behälter 52 zylindrisch
ausgebildet und um eine vertikale Achse A-A drehbar in einem metallischen Aufnahmeteil 51 angeordnet ist, wobei
die Achse A-A des Behälters 52 zu der Mittelachse B-B des Aufnahmeteils 51 parallel und um den Betrag E dazu
exzentrisch liegt. Der (hier nicht gezeigte) Deckel zur Abdeckung des Behälters 52 und des Dewarhalses weist
die in Zusammenhang beispielsweise mit Fig. 2 besprochenen Öffnungen zum Einbringen des Mediums 6 auf. Der Behälter
52 besitzt als Probenkammer ein Aufnahmerohr 53, das mit der Einfüll-Bohrung 27 wieder über einen Überlauf in
Verbindung steht und dessen Achse im Abstand E von der Drehachse A-A des Behälters 52 angeordnet ist. Auf der
bezüglich der Drehachse A-A gegenüberliegenden Seite, ebenfalls im Abstand E von der Achse A-A/ ist das mittlere
Rohr 55 eines aus drei miteinander kommunizierenden Röhren 54, 55 und 56 bestehenden Röhrensystems angeordnet (s. Fig.
5A). Das Röhrensystem 54, 55, 56 ist über eine Einfüll-Bohrung 27' mit Medium 6 beschickbar. Das Medium 6 kann
Ji
aus dem Aufnahmerohr 53 über die Bohrung 31 und aus dem
aus dem Aufnahmerohr 53 über die Bohrung 31 und aus dem
*und zur Durchführung der Rührwel. Ie
Röhrensystem 54, 55, 56 über die Bohrung 31' ohne Abheben
des Deckels wieder entfernt werden, wie dies in Zusammenhang mit den vorhergehenden Ausführungsformen schon
erläutert ist.
In der unteren Stirnseite des Behälters 52 sind zwei einander gegenüberliegende Bohrungen vorgesehen, von
denen jeweils eine zur Fixierung der Drehlage des Behälters
52 mit einem in den Boden des Aufnahmeteils 51 eingelassenen
Bolzen 57 zusammenwirkt.
Bei einer Drehung des Behälters 52 um-die Achse A-A um
180° wird das Aufnahmerohr 5 3 aus dei? in Fig. 5A gezeigten
Stellung herausbewegt und gelangt das Rohr 55 des Röhrensystems
54, 55, 56 in das Zentrum (Xehse B-B) des Aufnahmeteils
51. Somit kann der ursprünglicfr in das einzige Aufnahmerohr
53 eintauchende Rührer 10 mit der Rührwelle 9 nunmehr in die mittlere Röhre 55 des Höhrensystems eintauchen.
Ebenso treten an die Stelle der bis dahin mit den entsprechenden Öffnungen im Deckel korrespondierenden
Einfüllbohrung 27 bzw. Entnahmebohrung 31 die entsprechenden
Bohrungen 27' bzw.· 31', welche zu den Bohrungen 27 und 31
spiegelsymmetrisch angeordnet und an das Röhrensystem 54, 55, 56 angeschlossen sind. Die Füllung und Entsorgung
des Röhrensystems 54, 55, 56 kann nach der 180°-Drehung um die Achse A somit durch die gleichen Öffnungen im Deckel
vorgenommen werden wie das Befüllen und Entsorgen des Aufnahmerohres
53 vor der 180°-Drehung des Behälters 52. Für die jeweils korrekte Position des Behälters 52 sorgt der
Eingriff des Bolzens 57 in die entsprechende Bohrung des
Behälters 52. Durch Verwendung allein des Aufnahmerohres 53 kann somit eine geringere Anzahl von Proben bearbeitet
werden, während die Verwendung des Röhrensystems 54, 55, die Bearbeitung einer grösseren Anzahl von Proben zulässt.
*(nach einem, leichten Anheben über den Bolzen 57)
Aus Fig. 5 ist eine weitere Ausgestaltung der Erfindung
ersichtlich. Diese besteht darin, daß durch den Deckel (nicht gezeigt) mit dem Stopfen 33' aus thermisch
isolierendem Material, den metallischen Aufnahmeteil 51 und die diesen umgebende thermische Isolationsschicht
42' hindurch eine - vorzugsweise durch Metalltuben armierte - durchgehende vertikale Bohrung 58
verläuft, die an der Deckeloberfläche mit einem thermisch
isolierenden Stopfen (nicht gezeigt) verschlossen ist. Nach Öffnen dieses Stopfens kann durch die Bohrung 58
ein Rohr 59 zum Nachfüllen von LN„ eingeführt werden,
durch das ohne Unterbrechung des laufenden Substitutionsoder Einbettungsprozesses jederzeit bei Bedarf LN„ in das
Dewargefäß 3 nachgefüllt werden kann. Diese Nachfüllung
ist insbesondere in jenen Fällen entscheidend/ in denen mit apolaren hydrophoben Medien (z.B. Äther, Chloroform)
zum Zweck einer nachfolgenden Elementanalyse (EDX) wasserlöslicher
Alkali- oder Erdälkali-Ionen substituiert wird.
Infolge der geringen Affinität zwischen diesen Medien und dem H20-Molekül erfordern derartige Substitutionsprozesse oftmals mehrere Wochen und können daher ohne
das durch die vorstehend beschriebene Gestaltung mögliche zwischenzeitliche Nachfüllen von LN~ nicht ohne weiteres
zuende geführt werden.
Soweit nur wenige Proben 5 substituiert werden, ist es wünschenswert, daß die Menge des OsO.-haltigen Mediums 6
aus Kostengründen möglichst gering gehalten wird. Hierzu
bietet die Ausführungsform gemäß Fig. 6, die im wesentlichen eine Weiterbildung der Ausführungsform nach Fig. 5 vorsieht,
eine Lösung. Hierbei ist es möglich, die Höhe der Flüssigkeitssäule H im Aufnahmerohr 53 des Behälters 52
möglichst gering zu halten bzw. genau der Zahl bzw. Höhe der gestapelten Behälter 18 einschließlich Deckel 19
anzupassen. Entscheidend ist hierbei, daß die Höhenlage
des Rührers 10' variabel und von außen ohne ein Öffnen
des Deckels einstellbar ist und daß die geometrische Form des Rührers 10' den nicht direkt für die Substitution
notwendigen Totraum gering hält. Zu diesem Zweck ist die Rührwelle 9' in einem Aufnahmeteil, beispielsweise
in einer Hülse 73, vertikal auf und ab verschiebbar und in jeder beliebigen Höhenlage mittels einer Klemmvorrichtung,
beispielsweise mittels einer Spannzange 74, fixierbar. Die Rührwelte 9' ist über eine an der Hülse
73 angreifende Transmission von einem Motor 8' angetrieben (vgl. im einzelnen die Darstellung in Fig. 6).
Wie aus Fig. 6A hervorgeht, ist der Rührer 10' zur Reduktion des Totraumes und zur Erhöhung seiner
Stabilität nicht in der üblichen Weise als Propeller, sondern als Drehteil mit geschlossenem Umfang ausgebildet, dessen Durchmesser d, , d- auf die korrespondierenden
Durchmesser D,, D„ der Probenbehälter 18 bzw. der Deckel 19 für die Probenbehälter 18 abgestimmt sind. Ebenso ist
die Höhe h eines von dem Rührer 10' nach unten vorspringenden Ansatzes nach Fig. 6 so bemessen, daß der
Rührer 10' über die Welle 9" von außen bei gelöster Spannzange 74 ohne Risiko bis zum mechanischen Anschlag
an dem Rand des Deckels 19 nach unten geschoben werden kann. Nach diesem Anschlag kann die Welle 9' unter Sicht
(z.B. nach Augenmaß) um jenen kleinen Betrag angehoben werden, der gerade den in Fig. 6 dargestellten freien
Lauf innerhalb des Mediums 6 gewährleistet. Soweit nur wenige Proben 5 in einem einzigen Behälter 18 substituiert
werden und die geometrische Form des Behälters 18 und
des Rührers 10' entsprechend einander angepasst und optimiert sind, genügt für eine Substitution in dieser
Ausführungsform im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen
Vorrichtungen eine Flussigkeitsmenge von rund 2 ml.
Wie aus Fig. 6A weiterhin hervorgeht, wird die Konvektion
des Mediums 8 durch Schrägbohrungen 75 in der den Rührer 10'
bildenden Scheibe bewirkt, deren Achse in der in Fig. 6 dargestellten Weise unter einem Winkel o<'zur Achse
der Rührwelle 9' verläuft.
Bei der Ausführungsform der Fig. 5 und 6 ist zur Ermöglichung
einer Zirkulation des Mediums 6 seitlich an dem Aufnahmerohr 5 3 eine über dessen Höhe verlaufende
Nut mit der Tiefe b eingefräst.
Oftmals soll an eine Tieftemperatur-Entwässerung eine
Tieftcnipcratur-Binbettung (z.B. in LOWICRYL) direkt
anschlossen v/erden. Die erfindungsgemässe Vorrichtung
kann, wie sich aus Fig. 7 ergibt, hierfür unmittelbar ausgestaltet und angepasst werden, indem man in den
von dem Behälter 20' und dem Rohr 22' umgrenzten Raum
7 vB
einen/metallischen Einsatz 60 einsetzt, der mit der Oberfläche des Behälters 20' einen guten thermischen
Kontakt bildet und daher dessen vorgewählte Temperatur weitgehend annimmt. In dem tassenförmigen Einsatz 60
ist ein weiterer Einsatz 61 aufgenommen, der an seiner
Oberfläche Ausnehmungen 63 aufweist, welche entweder direkt zur Aufnahme von Proben 5 oder zur Aufnahme
der ublicherwei.se verwendeten Einbettungsbehälter 64
(z.B. Gelatine- oder Polyäthylen-Kapseln) dienen, in welche die Proben 5 eingebracht sind. Das monomere
Ausgangsprodukt (Monomeransatz) 6' für die Tieftemperatur-Einbettung
wird entweder direkt in din Ausnehmungen oder in die Einbettungsbehälter 64 über die Proben 5
eingefüllt. Beide Einsätze 60 und 61 weisen, wie aus der zeichnerischen Darstellung in Fig. 7 hervorgeht, mittig
einen Durchgang auf, der den Zugang zu der Probenkammer des Behälters 24 ermöglicht, so daß die Entnahme der inkubierten
Proben 5 aus der Probenkammer 24 sowie deren Transfer in die Vertiefungen 63 bzw. in die Einbettungsbehälter 64 innerhalb des Dewarhalses 1 möglich ist. Alle
diese Manipulationen bereiten erfahrungsgemäß in der Tiefe des Dewarhalses 1 gewisse Schwierig-
keiten, da die relativ enge Öffnung des Dewarhalses 1
keine hinreichende Beleuchtung ermöglicht. Die erfindungsgemässe Ausführungsform sieht daher eine Beleuchtung
durch eine Lichtquelle 65 vor, die in nicht näher gezeigter Weise außerhalb des Dewarhalses 1 befestigt oder angeordnet
ist. Das Rohr 22' ist an seinem oberen Ende mit einem Ringaufsatz verbunden, in welchem eine Öffnung
und in dieser ein um eine Horizontalachse schwenkbarer Spiegel 66 vorgesehen sind. Außerhalb des Spiegels 66
ist ein Wärmesperrfilter 67 zur weitgehenden Ausschaltung der Ultrarot-Komponente der Lichtquelle 65 angeordnet.
Der Spiegel 66 erlaubt eine gebündelte Einstrahlung des Lichtes der Lichtquelle 65 in den Arbeitsraum über dem
Einsatz 60, 61. Dabei behindert der Spiegel 66 die Präparationsarbeiten, beispielsweise das Einbringen der
gefrorenen Proben 5 in die Probenkammer 24, das Einfüllen der Proben 5 in die Behälter 18 (vgl. Fig. 5) oder den
Transfer der Proben 5 in die Ausnehmungen 6 3 oder die Einbettungsbehälter 64 in keiner Weise. Beim Schließen
des Deckels 11, 11' mit dem daran befestigten thermisch isolierenden Stopfen 33, 33' (in Fig. 7 nicht dargestellt)
wird der Spiegel 66 automatisch in die gestrichelt angedeutete Ruhestellung 66' zurückgeschwenkt. Ein Mikrokontakt
68 kann hierbei vorgesehen sein, um selbsttätig die Beleuchtung abzuschalten.
Nach dem Einbringen der Proben 5 und des Monomeransatzes
6' bzw. der Einbettungsbehälter 64 kann zur anschließenden UV-Polymerisation anstelle des Deckels 11, 11' ein Aufsatz
69 mit einem UV-Strahler 70 auf den Dewarhals 1 bzw. auf das obere Ende des Rohres 22' aufgesetzt werden.
Durch den Deckel, das Rohr 22' und den Einsatz 60., 61 wird die Polymerisationskammer umgrenzt. Soweit erforderlich,
kann die Polymerisationskammer jedoch nach oben hin auch durch eine Quarzglasplatte 71 abgeschlossen sein,
die einen Temperaturfühler 72 aufweist. Durch diesen und in Verbindung mit einer {nicht gezeigten) Temperaturregelungseinrichtung
kann di^ Polymerisationstemperatur in der unterhalb der Quarzglasplatte befindlichen Polymerisationskammer
konstant gehalten werden. Der Temperaturfühler 72 tritt rtnbei an die Stelle des Temperaturfühlers
13, der die Temperatur des Behälters 20 misst, so daß die hierfür vorgesehene Regelungseinrichtung entsprechend
umgeschaltet werden muß.
Der Einsatz 60 besteht aus einem gut wärmeleitenden Metall, während der Einsatz 61 aus einem anti-adhäsiven
Kunststoff, z.B. Siliconkautschuk oder Teflon, besteht und dem jeweils gegebenen Bedarf leicht angepasst werden
Die anhand der Fig. 2 bis 7 beschriebene Vorrichtung kann im Rahmen der Erfindung in verschiedenen Variationen
und Kombinationen verwirklicht werden, ohne hierbei ihre erfindungsgemässen Kennzeichen einzubüssen. So ist es
beispielsweise unerheblich, welche Heizelemente 12 oder
Temperaturfühler 13 verwendet werden und an welchem Ort sie bedarfsgemäß installiert werden. Ebenso bleibt
die Auswahl der Materialien und die geometrische Form der Teile 20, 42, 43, 51, 52, 60, 62 - um nur einige Teile
beispielsweise zu nennen - ohne Belang, solange sie den angeführten kennzeichnenden Eigenschaften entsprechen.
Gleiches gilt für die Steuer- und Regelelemente zur direkten oder indirekten Temperaturregelung, für die
Art und Ausführung des Rührwerks und für die Anordnung der Einzelteile im Gesamtsystem. Schließlich kann das
in Fig. 5 beispielsweise dargestellte Grundprinzip in unterschiedlicher Weise verwirklicht werden. So kann
anstelle einer Drehung um 180° der Behälter 52 bei anders gewählten Symmetrien der Einfüll- und Entnahmebohrungen
34257U
27, 31 bereits nach einer Drehung um 120° oder um 90°
ein zur Aufnahme der Proben geeignetes Röhrensystem in die zentrale Achse B-B bringen, welche der Achse
der Rührwelle 9 entspricht. Schließlich haben Art und Ausführung der Objektbehälter 18 sowie der zur Manipulation
der Objektbehälter im Kaltbereich vorzusehenden
Hilfsmittel keinen Einfluß auf die Tragweite der Erfindung und können in jeweils zweckmässiger
Weise dem Bedarf angepasst werden.
Es versteht sich auch, daß das Volumen aller derjenigen Räume des Behälters 20, 20' oder 52, die einerseits
mit Medium 6 gefüllt werden, andererseits jedoch nicht unmittelbar dem Inkubationsvorgang dienen, möglichst
gering gehalten ist. Dies gilt z.B. für die Einfüllbohrung 27 bzw. 27', deren Durchmesser a (vgl. Fig. 6)
gerade so gering ist, daß der in Zusammenhang mit Fig. beschriebene Gegenstrom-Wärmeaustauscheffekt sich einstellt.
Das gilt aber auch für die Nut mit der Tiefe b (vgl. Fig. 5A, 6), die nur so groß gewählt wird, daß /
eine hinreichende Zirkulation erfolgt.
Claims (21)
1. Vorrichtung zur Entwässerung und/oder Polymerisationseinbettung biologischer Proben bei tiefen Temperaturen
für eine nachfolgende mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchung, mit einem im
Hals eines flüssigen Stickstoff enthaltenden Dewargefässes
angeordneten Behälter zur Aufnahme der Proben
und eines Mediums zur Entwässerung bzw. Einbettung, mit einem gegenüber der Umgebung isolierenden Deckel über
dem Behälter und der Halsöffnung, mit einem in den Behälter hineinragenden Rührer und mit einer Temperatur-Regeleinrichtung
zur Regelung der Temperatur des Behälters, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberseite (21) des Behälters
(20, 20', 52) erheblich unterhalb des obersten Randes des Dewarhalses (1) liegt, daß zum Einfüllen and
zum Austausch der Medien (6) in den Behälter (20, 20", 52)
Öffnungen (26, 32) in dem Deckel (11, II1) und damit
korrespondierende Ausnehmungen (27, 31; 27', 31') in dem
Behälter (20, 20', 52) vorgesehen sind, daß die Einfüll-Ausnehmung (27, 27') des Behälters über einen Überlauf mit
dem eine Probenkammer {24, 53) bildenden Behälterinneren
in Verbindung steht, und daß eine Füllvorrichtung (25a) mit einer sich durch die Einfüllöffnung (26) hindurch
erstreckenden und in die Einfüll-Ausnehmung (27, 27') des
Behälters hineinragenden Kanüle
(25b) über dem Deckel montierbar ist, wobei sich beim Einfüllen des Mediums (6) zwischen dem im Inneren und
dem auf der Außenseite der Kanüle (25b) strömenden Medium ein Gegenstrom-Wärmeaustausch bis zur Abkühlung
des Mediums (6) auf eine vorgewählte Temperatur des Behälters (20, 20', 52) einstellt.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an dem Deckel (11, 11') ein Stopfen (33, 33') aus
thermisch isolierendem Material befestigt ist, der den zwischen der Unterseite des Deckels (11, 11') und der
Oberseite (21) des Behälters (20, 20', 52) befindlichen Raum weitgehend ausfüllt.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß unter dem Spiegel des in dem Dewargefäß (3) befindlichen
flüssigen Stickstoffes ein Heizkörper (34) angeordnet ist, und daß zum Vermeiden von Wasserniederschlägen
an dem Behälter (20, 20', 52) beim Öffnen des Deckels der Heizkörper (34) beheizbar ist, wobei eine
zusätzliche Verdampfung von Stickstoff und hierdurch ein Strom von kaltem trockenem Stickstoffgas bewirkt wird,
der den Behälter (20, 20", 52) umspült und den Zutritt feuchter Luft in den Dewarhals (1) verhindert.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zum Anheben des Deckels (11, 11') eine Vorrichtung (35,
36) vorgesehen ist, und daß die Vorrichtung (35, 36) erst mit zeitlicher Verzögerung nach dem Einschalten des Heizkörpers
(34) betätigbar ist.
5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (35, 36) ein durch eine Feder (38)
3Λ25744
■ - 3 -
belasteter Hubkolben ist, dessen Bewegung durch eine elektrisch betätigte Sperrklinke (37) auslösbar ist und
dessen Bewegungsgeschwindigkeit durch ein Ventil (39) steuerbar ist.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet
,- daß der Behälter (20'; 51, 52) auf seiner
Unterseite durch eine thermische Isolationsschicht (42, 42') abgeschirmt ist und daß in den flüssigen Stickstoff
ein massiver Metallkörper (44) mit gutem Wärmeleitvermögen eintaucht, mit dem der Behälter (201; 51, 52) durch
eine metallische Verbindung (43), die durch die Isolationsschicht (42, 42') hindurch verläuft, verbunden ist.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die metallische Verbindung (43) zwischen dem Behälter (20')
und dem Metallkörper (44) durch eine vertikal angeordnete zylindrische Röhre gebildet ist, in deren Inneres ein
zylindrischer oder hohlzylindrischer Einsatzkörper (45)
einschiebbar ist, welcher mit der Wandung der Röhre in gutem thermischen Kontakt steht und durch den der Querschnitt
der metallischen Verbindung (43) in der gesamten Ausdehnung der Röhre oder einem Teilbereich davon veränderbar
ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß
der zylindrische oder hohlzylindrische. Einsätzkörper
(45) in der zylindrischen Röhre (43) gegen den Druck einer Feder (46) über eine Betätigungsstange (47) od.dgl. von
außen in seiner Höhenlage zum Zweck einer Veränderung des Wärmeflusses verstellbar ist.
9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet,, daß
die Betätigungsstange (47) so ausgebildet, z.B. lösbar
_ 4;_ ■*. ■·■ 342.57U
angeordnet ist, daß ein Öffnen des Deckels (11, H1)
möglich ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Betätigungsstange (47) über einen Regelkreis (12, 13,
52) mittels eines Steuermotors und geeigneter übertragungselemente
(50, 5l') so steuerbar ist, daß das Ausmaß der Gegenheizung durch eine Heizpatrone (12) und damit der
Stickstoffverbrauch minimal gehalten werden.
11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß die Füllvorrichtung (25a) ein Einfüllelement mit grösserer Öffnung ist, an welchem die Kanüle
(25b) befestigt ist und das vor dem Eintritt in die Kanüle (25b) ein dem Medium (6) Wasser entziehendes Filter
(28) enthält.
12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
daß der Behälter (52) mehrere Probenkammern (53, 54 bis 56) sowie Füll- und Entnahmebohrungen (27, 31;
27', 31') zur Inkubation unterschiedlicher Probenmengen
in entsprechend angepassten Flussigkextsmengen aufweist und drehbar in einem Aufnahmeteil (51) derart angeordnet
ist, daß bei seiner Drehung um einen vorgegebenen Winkel jeweils ein Paar der Füll- bzw. Entnahmebohrungen (27, 31;
27', 31') sowie mindestens eine Probenkammer (53; 54 bis 56) mit Öffnungen (26, 32) für das Einfüllen bzw. Entnehmen
des Mediums (6) bzw. mit einer Durchtrittsöffnung für das
Rührwerk (9, 10; 9', 10') in dem Deckel (11, 11') zur
Deckung bringbar sind.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet,
daß in dem Deckel (11, ll'),ggf. in dem damit verbundenen thermisch isolierenden Stopfen (33, 33')
und in dem Behälter (51, 52) sowie ggf. in dessen Isolier-
schicht (42, 42') eine durchgehende Bohrung zum Nachfüllen
von flüssigem Stickstoff in das Dewargefäß (3) ausgebildet ist, die mittels eines thermisch isolierenden
Stopfens an dem deckelseitigen Ende verschließbar ist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Welle (9') mit dem Rührer (.10')
von außen höhenverstellbar an dem Deckel (11, II1) angeordnet
ist.
15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß
der Rührer (10') als zu der Welle (9') koaxiales Drehteil mit geschlossenem Umfang ausgebildet ist und mindestens
eine von seiner Oberseite bis zur Unterseite durchgehende Bohrung (75) aufweist, deren Achse schräg zur Achse der
Welle (91) verläuft, und daß der Rührer (10') in seinen .
Abmessungen und seiner Form an Abmessungen und Form der Probenkammer (53) oder der Probenbehälter (18) bzw. des
Probenbehälter-Deckels (19) derart angepasst ist, daß die benötigte Menge an Medium (6) minimal ist.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch
gekennzeichnet, d.aß zum Zweck der Tieftemperatur-Einbettung
über den Behälter (20, 20', 52) ein Einsatz (60, 61) in den Dewarhals (1) einsetzbar ist, der Vertiefungen (63)
zur Aufnahme der Proben (5) oder von Einbettungsbehältern (64) für die Proben (5) aufweist und einen Durchgang zu
der Probenkammer (24, 53) des-Behälters (20, 20', 52)
zum Transfer der inkubierten Proben in die Vertiefungen
(63) bzw. in die Einbettungsbehälter (64) aufweist,
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß
der Einsatz (60, 61) mit Siliconkautschuk, Teflon oder einem anderen kälteresistenten, anti-ädhäsiven Kunststoff
bedeckt ist oder daraus besteht.
18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Dewarhals (1) anstelle des
Deckels (11, II1) ein Aufsatz (69) aufsetzbar ist,
auf dessen Unterseite ein UV-Strahler (70) angeordnet ist.
19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch
gekennzeichnet, daß der Einsatz (60, 61) durch eine für UV-Strahlung durchlässige Platte (71) abdeckbar ist,
und daß in der zwischen der Platte (71) und dem Einsatz (60, 61) gebildeten Polymerisationskammer ein Temperaturfühler
zur Messung und ggf. Regelung der Temperatur in der Polymerisationskammer angeordnet ist.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet,
daß eine Auflicht-Beleuchtung des Behälters (20, 20', 52) bzw. des Einsatzes (60, 61) durch eine außerhalb
des Dewarhalses (1) angeordnete Lampe (65) über einen in einer rohrförmigen Halterung (22, 22') für den Behälter
(20, 20', 52) angeordneten schwenkbaren Spiegel (66) vorgesehen ist.
21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß in der Ruhe-Schwenkstellung des Spiegels (66) ein Schaltelement
(68) für die Lampe (65) angeordnet ist, das im Sinne eines Ausschaltens der Lampe (65) beim Einschwenken
des Spiegels betätigbar ist.
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