DE3425744C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Entwässerung und/oder Polymerisationseinbettung biologischer Proben bei tiefen Temperaturen für eine nachfolgende mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchung, mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruches 1.

Zur raschen Stabilisierung werden biologische Proben für mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen in zunehmendem Umfang extrem rasch eingefroren (Schock-Gefrieren). Anschließend wird das in den Proben enthaltene Wasser (häufig mehr als 90 Gew.-%) bei tiefen Temperaturen gegen geeignete organische Solvenzien, beispielsweise wasserfreies Azeton oder Methanol, oder organische Lösungen, beispielsweise OsO₄ und/oder Uranylacetat in wasserfreiem Azeton oder Methanol, ausgetauscht. Dieser Austausch wird zumindest in der entscheidenden anfänglichen Phase bei Temperaturen vollzogen, welche in der Regel nicht über -80° C liegen, da bei Temperaturen über -80° C bereits Veränderungen in der molekularen Struktur dieser Objekte auftreten können, die die nachfolgenden Untersuchungen entwerten. Meistens findet die entscheidende Anfangsphase der Entwässerung daher aus Sicherheitsgründen im Temperaturbereich zwischen -80° C und -120° C statt, den man mit herkömmlichen Kältethermostaten entweder überhaupt nicht oder nur mit großem apparativem Aufwand erreichen kann. Üblicherweise werden für die Elektronenmikroskopie in einem Arbeitsgang 1 bis 10 Gewebeblöckchen mit einem Einzelvolumen zwischen 0,1 und 10 mm³ einer derartigen Entwässerung unterworfen, welche je nach Größe der Objekte und vorgewählter Temperatur zwischen 3 Tagen und 3 Wochen erfordert. Während dieser Zeit darf die Temperatur den jeweils für jedes Objekt zu bestimmenden Grenzwert keinesfalls überschreiten, da sich sonst die Probe in ihrer molekularen Struktur so verändern kann, daß verbindliche wissenschaftliche Aussagen über ihre Struktur im normalen Lebenszustand ("in vivo") nicht mehr gemacht werden können.

Es ist eine Vorrichtung der eingangs beschriebenen Art bekannt, bei der der Behälter, in dem die Entwässerung und/oder Einbettung stattfindet, in den Hals eines Dewargefäßes so eingehängt ist, daß der Behälter in einem geringen Abstand von dem oberen Rand des Dewarhalses liegt (DE-OS 29 44 464) oder weitgehend bündig mit dem oberen Rand abschließt (DE-OS 30 42 578) und auf diese Weise einfach mit den zum Entwässern und Einbetten gebräuchlichen Medien sowie mit den gefrorenen Proben beschickt werden kann. Der Behälter und der Dewarhals werden während der Entwässerung und Einbettung mit einem isolierenden Deckel abgedeckt, durch den lediglich die Welle eines Rührwerkes zum Bewegen der Medien sowie Elektroanschlüsse für die Temperaturregelung hindurchgeführt sind. Die Temperaturregelung ist mittels einer Heizpatrone und eines Temperaturfühlers über einen elektrischen Regelkreis realisiert. Bei Inkubationstemperaturen bis etwa minimal -80° C reicht hierbei die Kühlung durch das kalte Stickstoffgas (GN₂) aus, das laufend aus dem im Dewargefäß befindlichen flüssigen Stickstoff (LN₂) absiedet. Lediglich für den Beginn der Arbeit wird die Abkühlung des Behälters über einen in der Höhe verstellbaren "Kühlfinger" beschleunigt, der durch direkten metallischen Kontakt mit dem LN₂ vorübergehend einen stärkeren Wärmeabfluß aus dem Behälter bewirkt.

Die vorstehend beschriebene bekannte Vorrichtung ist hinsichtlich ihrer Leistung und ihres einfachen Aufbaues den früher verwendeten Kühlsystemen erheblich überlegen. Jedoch ergibt sich ein gewisses Problem beim Beschicken des Behälters mit den Entwässerungsmedien und den gefrorenen Proben: Die verwendeten Medien sind durchgehend extrem hygroskopisch und ziehen insbesondere in gekühltem Zustand sehr rasch Wasser aus der feuchten Raumluft an, welches dann eine Tieftemperatur-Entwässerung der geforderten Art unmöglich macht. Weiterhin besteht die Gefahr, daß die schock-gefrorenen Proben beim Einbringen oberflächlich über -80° C hinaus erwärmt werden und daß hierdurch gerade in der oftmals lediglich 10 µ tiefen gut erhaltenen Randzone irreversible Wärmeschäden auftreten, die ebenfalls die Resultate einer Tieftemperatur-Entwässerung entwerten. Schwierigkeiten ergeben sich auch, wenn man mit Medien arbeitet, die bei Temperaturen -120°C eingesetzt werden, und an die Entwässerung eine Einbettung anschließt, welche bei -35° C durchgeführt werden muß, z. B. eine LOWICRYL-Tieftemperatur- Einbettung (vgl. Carlemalm et al "Resin development for electron microscopy and an analysis of embedding at low temperatures" - Journal of Microscopy 126, S. 123 bis 143 (1982)). Denn die initiale Abkühlung auf - 120 °C kann nicht ohne eine metallische Verbindung zwischen dem Behälter und dem LN₂ realisiert werden, welche anschließend jedoch dazu führt, daß im höheren Temperaturbereich ein starkes Sieden des LN₂ einsetzt, das infolge der notwendigen Gegenheizung des Behälters nicht mehr beherrschbare Dimensionen annimmt. Schließlich wirft der bei einer an eine Tieftemperatur-Entwässerung anschließenden Tieftemperatur-Einbettung notwendige mehrfache Austausch der Medien sowie der nach dem heutigen Stand der Technik erforderliche Transfer der entwässerten Proben in eine gesonderte Kammer für die Tieftemperatur-Polymerisation so erhebliche Probleme auf, daß bislang diese aussichtsreiche und wissenschaftlich interessante Methode nur in geringem Umfang genützt wird.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Entwässerung und/oder Einbettung kleiner biologischer Proben (z. B. mit einem Einzelvolumen unter 10 mm³) für eine nachfolgende mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchung zu erleichtern und zu vereinfachen und eine hierfür geeignete Vorrichtung zu schaffen. Insbesondere soll das Einbringen und Manipulieren der Proben sowie das Einfüllen und Austauschen der Medien leichter und ohne jedes Risiko ausgeführt werden können, so daß alle Prozesse im gesamten Temperaturbereich zwischen -150 und -30° C ohne überhöhten Kryogenverbrauch realisiert werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß dem Kennzeichen des Patentanspruches 1.

Bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung liegt die Oberseite des Behälters wesentlich, z. B. mindestens 30 mm und mehr, unterhalb des oberen Randes des Dewarhalses und der Deckel bleibt beim Einfüllen und beim Austausch der zum Entwässern und Einbetten erforderlichen flüssigen Medien geschlossen. Die zum Einfüllen und Austauschen vorgesehenen Öffnungen im Deckel korrespondieren mit entsprechenden Ausnehmungen, die im Behälter ausgebildet oder diesem zugeordnet sind, und das Einfüllen der auf Raumtemperatur befindlichen Medien erfolgt über eine Kanüle im Zuge eines in der Ausnehmung entstehenden Gegenstromes mit einem Wärmetausch. Dadurch, daß die Kanüle der Einfüllvorrichtung durch die entsprechende Öffnung im Deckel so weit in die Einfüllausnehmung hindurchgeführt ist, daß sie erst kurz über dem Boden der Einfüllausnehmung endet, kann das Medium erst dort austreten und steigt um die Kanüle herum nach oben bis zu dem Überlauf der Probenkammer an. Da sowohl der Behälter als auch die Kanüle aus Metall bestehen, weiterhin die Einfüllausnehmung - schon aus Platzgründen - so an die Kanüle in ihrer Dimension angepaßt ist, daß nur ein dünner Film des Mediums sich zwischen Kanülenaußenseite und Wand der Einfüllausnehmung bildet, und schließlich der Behälter sich durch seine Anordnung im Dewargefäß auf einer sehr tiefen Temperatur befindet, ergibt sich ein intensiver Wärmeaustausch zwischen dem zunächst mit Raumtemperatur einströmenden Medium und dem Behälter. Dieser führt dazu, daß das über den Überlauf in die Probenkammer eintretende Medium die erforderliche tiefe Temperatur von höchstens -180° C aufweist. Da die gesamte Inkubation der Proben zur Entwässerung und Einbettung ohne Öffnen des Deckels erfolgt, ist das Risiko einer Wasseraufnahme somit ausgeschlossen.

Nach einer Ausgestaltung der Erfindung ist vorgesehen, daß der zwischen der Oberseite des Behälters und der Deckelunterseite befindliche Raum im Dewarhals durch einen - vorzugsweise mit dem Deckel eine Einheit bildenden - thermisch isolierenden Stopfen ausgefüllt ist. Nach einer anderen Weiterbildung der Erfindung ist in dem LN₂ ein Verdampfer angeordnet, so daß bei einem Öffnen des Dewarhalses, z. B. bei der Entnahme der entwässerten Proben und zur Beschickung mit neuen gefrorenen Proben, größere Mengen von GN₂ freigesetzt werden können. Diese umströmen den im Dewarhals angeordneten Behälter und gelangen in den zwischen Behälter und Deckel befindlichen Raum. Dadurch und im Verein mit der tief im Dewarhals angeordneten Behälteroberseite werden Frostniederschläge ebenso verhindert wie jegliche Erwärmung der Proben. Nach einer bevorzugten Weiterbildung kann das Anheben des Deckels, ggf. mit dem daran befindlichen Stopfen, derartig mechanisiert und gesteuert sein, daß es erst nach dem Einsetzen der LN₂-Verdampfung erfolgt und so langsam ausgeführt wird, daß ein Einströmen feuchter Raumluft mit Sicherheit ausgeschlossen wird.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß eine thermische Isolation des Behälters den Wärmeabfluß in den Dewarraum auf eine metallische Verbindung beschränkt. Der Wärmeabfluß kann dabei exakt definiert und zeitlich konstant gehalten werden, indem die metallische Verbindung mit einem massiven Metallkörper besteht, der mit dem LN₂ in direktem Kontakt steht und durch diesen unabhängig vom LN₂-Füllstand im Dewar stets in seinem ganzen Ausmaß annähernd auf der Siedetemperatur des LN₂ gehalten wird.

Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß der Wärmeabfluß aus dem Behälter in den LN₂-Raum ohne ein Öffnen des Deckels reproduzierbar verändert werden kann. Hierzu ist die genannte Verbindung als dünnwandiges Rohr ausgebildet, in welchem ein gut wärmeleitender Körper mit zylindrischer Oberfläche mittels eines Zwischengliedes verschiebbar angeordnet ist. Eine automatisch geregelte Verschiebung, beispielsweise durch einen Steuermotor, kann den LN₂-Verbrauch im gesamten Temperaturbereich des Systems zwischen -150 und -30° C dadurch minimal halten, daß der Wärmeabfluß für jede Temperatur durch eine entsprechende Rückkopplung minimiert wird.

Zum Einfüllen der Medien kann in weiterer Ausgestaltung die Füllvorrichtung ein Molekularsieb enthalten, durch welches vor dem Kontakt mit den Proben evtl. noch im Medium enthaltene Wasserspuren restlos entfernt werden, was im Hinblick auf jede nachfolgende Elementanalyse von größter Bedeutung ist.

Schließlich ist es mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtung möglich, eine Tieftemperatur-Einbettung direkt in dem Raum durchzuführen, der zwischen der Oberseite des Behälters und der Unterseite des Deckels im Dewarhals geschaffen ist. Die Polymerisation kann hierbei auf einfache Weise im inerten GN₂ stattfinden. Alle Manipulationen werden hierbei durch eingespiegeltes Kaltlicht erleichtert. Ein für die Polymerisation erforderlicher UV-Strahler wird anstelle des Deckels auf den Dewarhals aufgesetzt, und die Polymerisation findet auf oder in einer Einlage statt, welche auf die Behälteroberfläche aufgelegt werden kann.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt

Fig. 1A, 1B rein schematische Schnittansichten von zwei unterschiedlichen Ausführungsformen einer Vorrichtung mit einem LN₂-GN₂-Kühlsystem zur Entwässerung und/oder Einbettung bei tiefen Temperaturen nach dem Stand der Technik;

Fig. 1C einen Querschnitt durch den Behälter der Vorrichtung gemäß Fig. 1B, geschnitten längs der Linie 1C-1C;

Fig. 1D einen Axialschnitt durch einen Stapel von Probenbehältern der Vorrichtung gemäß Fig. 1B in vergrößertem Maßstab;

Fig. 2 eine zu Fig. 1 analoge Darstellung einer ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 3 eine zu Fig. 1 analoge Darstellung einer zweiten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 4 eine zu Fig. 1 analoge Darstellung einer dritten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung;

Fig. 4A einen Teilschnitt eines im Kühlsystem gemäß Fig. 4 verwendeten Einsatzkörpers;

Fig. 5A, 5B Draufsicht bzw. Axialschnitt, jeweils abgebrochen dargestellt, eines für eine vierte Ausführungsform der Erfindung verwendbaren Behälters in vergrößertem Maßstab;

Fig. 6 einen Längsschnitt durch eine fünfte Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung im Bereich des Dewarhalses;

Fig. 6A Draufsicht und Längsschnitt, geschnitten längs der Linie 6A-6A, eines Rührers und eines zugeordneten Probenbehälters, und

Fig. 7 einen zu Fig. 6 analogen Teilschnitt im Bereich des Dewarhalses, gemäß dem über dem Behälter eine Vorrichtung zur Polymerisationseinbettung angeordnet ist.

Bei der in Fig. 1A im Querschnitt dargestellten Vorrichtung zur Entwässerung und/oder Einbettung kleiner biologischer Proben befindet sich im Hals 1 eines mit LN₂ 2 gefüllten Dewargefäßes 3 ein metallischer Behälter 4 mit einer Ausnehmung zur Aufnahme der Proben 5 und des flüssigen Mediums 6 für ihre Entwässerung und/oder Einbettung. Die Proben 5 liegen auf einem Netz 7 im Behälter 4, so daß sie bei einer Bewegung des Mediums 6 mittels eines durch einen Motor 8 über eine Welle 9 betriebenen Rührers 10 von allen Seiten dauernd von dem Medium umspült werden. Der Behälter 4 ist während der Entwässerung bzw. Einbettung durch einen Deckel 11 verschlossen, welcher bei dem Einbringen der Proben 5 bzw. der Medien 6 sowie beim Wechsel der Medien 6 vorübergehend geöffnet wird.

Der Behälter 4 erreicht im GN₂ ohne direkten Kontakt mit dem darunter befindlichen LN₂ im Gleichgewichtszustand eine Minimaltemperatur im Bereich um -80° C, welche mit der Höhe H des LN₂-Spiegels im Dewargefäß 3 variiert und mittels einer Heizpatrone 12 und eines Temperaturfühlers 13 einer Regelvorrichtung 14 auf jedem Wert über diesem Gleichgewichtswert ("steady state") konstant gehalten oder im Sinn einer Temperatur-Zeitsteuerung reproduzierbar variiert werden kann. Soweit höhere Temperaturen im Bereich über -50° C realisiert werden, verhindert ein Strahlungsschutzschild 15 ein stärkeres Sieden des LN₂. Tiefere Temperaturen können durch Herstellen einer metallisch-leitenden Verbindung zwischen dem Behälter 4 und dem LN₂, beispielsweise durch Einschieben eines zylindrischen Stabes 16 aus Aluminium, realisiert werden. Auch hierbei schwankt jedoch die erreichbare Minimaltemperatur erheblich mit dem von der Füllhöhe H abhängigen Abstand A zwischen dem LN₂-Spiegel und dem Boden des Behälters 4, was sehr störend ist.

Soweit mehrere unterschiedliche Proben 5 gleichzeitig inkubiert werden müssen, kann dies gemäß Fig. 1B durch einen abgeänderten Aufbau und eine zusätzliche Ausgestaltung des Behälters 4′ realisiert werden, dessen Probenkammer durch einen Einsatz in mehrere Röhren 17 unterteilt ist, in denen zahlreiche kleinere Probenbehälter 18 gestapelt werden können. Der Boden der Probenbehälter 18 besteht jeweils aus einem Netz 7′, auf dem sich die Proben 5 befinden. Jeder Stapel ist durch einen Deckel 19 mit einem Netz 7′ verschlossen, so daß die Objekte 5 aus dem obersten Probenbehälter 18 auch bei rascher Drehung des Rührwerks 8, 9, 10 nicht aus dem Behälter 4′ gespült werden können.

Die Fig. 2 bis 7 zeigen Ausführungsformen der Vorrichtung nach der Erfindung. Soweit nicht abweichend beschrieben, sind diese Ausführungsformen von einem Aufbau entsprechend der Fig. 1 und es sind demzufolge, soweit übereinstimmende Teile und Komponenten vorhanden sind, übereinstimmende Bezugszeichen verwendet.

Die Vorrichtung gemäß Fig. 2 weist einen Behälter 20 auf, der ebenso wie die Behälter 4, 4′ bei der Vorrichtung nach den Fig. 1A und 1B im Hals 1 eines mit LN₂ gefüllten Dewargefäßes 3 angeordnet ist und eine zylindrische Probenkammer 24 bildet. Ein entscheidender Unterschied zu der bekannten Vorrichtung besteht zunächst darin, daß die Oberseite 21 des Behälters 20 mindestens 30 mm unterhalb des oberen Randes des Dewarhalses 1 angeordnet ist und von einem dünnwandigen Rohr 22, z. B. aus rostfreiem Stahl, im Dewarhals 1 gehalten wird. Das Rohr 22 weist oberhalb des Behälters 20 einen Kranz von Öffnungen 23 auf. Seitlich von der Probenkammer 24 ist im Behälter 20 eine Bohrung 27 vorgesehen, deren oberer Rand einen Überlauf zur Probenkammer 24 bildet. Auf der gegenüberliegenden Seite ist eine weitere Bohrung 31 im Behälter 20 ausgebildet, die an ihrer Unterseite mit der Probenkammer in Verbindung steht. Der Dewarhals 1 ist durch einen Deckel 11′ verschlossen, in dem eine mit der Bohrung 27 fluchtende Öffnung 26 sowie eine mit der Bohrung 31 fluchtende Öffnung 32 vorgesehen ist.

Die Vorrichtung wird dadurch in Betrieb genommen, daß man nach Abnahme des Deckels 11′ in den Dewarhals 1 LN₂ eingießt, der zunächst den Behälter 20 und das Rohr 22 abkühlt und danach durch die Öffnungen 23 in den Dewarbehälter 3 abfließt. Der Behälter 20 und das Rohr 22 bleiben hierbei zunächst bis zu den Öffnungen 23 mit LN₂ gefüllt, in den die gefrorenen Proben 5 für die Entwässerung ohne Risiko mittels eines kleinen Behälters (nicht gezeigt) eingebracht werden können. Die Proben 5 befinden sich danach auf dem Netz 7 innerhalb der zylindrischen Probenkammer 24 unter dem LN₂-Spiegel. Nach dem Schließen des Deckels 11′ kann mittels des Regelsystems 13, 14 und der daran angeschlossenen Heizpatrone 12 der LN₂ aus dem Behälter 20 und dem Rohr 22 verdampft und der Behälter 20 auf die für die Entwässerung vorgewählte Temperatur erwärmt werden. Nach Erreichen dieser Temperatur wird ein Entwässerungsmedium 6 über eine Füllvorrichtung, bestehend aus einem Zylinder 25 a und einer Kanüle 25 b, eingefüllt. Das Entwässerungsmedium 6 befindet sich hierbei auf Raumtemperatur und wird in den Zylinder 25 a gegossen, während die dünne Kanüle 25 b durch die Öffnung 26 im Deckel 11′ eingesteckt ist und auf diese Weise in die korrespondierende Bohrung 27 des Behälters 20 bis nahe zu deren Boden hineinragt. Die lichte Weite der Kanüle 25 b und diejenige der Bohrung 27 sind so bemessen, daß das Medium 6 so langsam einfließt, daß es sich bei der Gegenstrombewegung innerhalb der Bohrung 27 auf die vorgewählte Temperatur des Behälters 20 abkühlt und erst nach Erreichen dieser Temperatur in die Probenkammer 24 überfließt. Da die Wärmekapazität der gesamten Flüssigkeitsmenge weniger als 5% der Wärmekapazität des vorgekühlten Behälters 20 beträgt, erwärmt sich der Behälter 20 beim Abkühlen des Mediums 6 nur unwesentlich.

Soweit für eine nachfolgende Elementanalyse absolute Wasserfreiheit des Mediums 6 gefordert wird, wird diese auf einfache Weise durch die Anforderung eines Molekularsiebes 28 in dem Zylinder 25 A erreicht, das auf einem eingeschalteten Filter 29 liegt.

Bei einem Austausch des Mediums 6 kann das bereits verwendete Medium durch eine zweite Kanüle 30 über die Bohrung 31 im Behälter 20 sowie die Öffnung 32 im Deckel 11′ wieder abgesaugt werden, ohne daß der Deckel 11′ geöffnet werden muß. Bei einer normalen Kryosubstitution in Azeton/OsO₄ oder Methanol/OsO₄/Uranylacetat mit nachfolgender Lowicryl-Monomer-Inkubation können hierbei alle Schritte der Inkubation und Imprägnation ohne ein Öffnen des Deckels 11′ vollzogen werden und ohne das bei den herkömmlichen Vorrichtungen nach Fig. 1 bestehende Risiko eines Wasserniederschlages und/oder einer unreproduzierbaren Erwärmung der Proben 5. Von dem LN₂ abgedampfter GN₂ tritt durch die Öffnungen 23 in das Innere des Rohres 22 ein und hält somit auch den Raum über dem Behälter 20 auf niedriger Temperatur.

Die Ausführungsform gemäß Fig. 3 erlaubt ein routinemäßiges und wiederholtes Öffnen der Vorrichtung zur jeweils erforderlichen Entnahme der entwässerten Proben 5 und zur Beschickung mit neuen gefrorenen Proben 5. Da eine Substitution in Methanol/OsO₄ binnen 6 Stunden vollzogen werden kann, kommt diese Ausführungsform dem Bedarf der täglichen Routine in besonderer Weise entgegen. Sie erlaubt es, den über dem Behälter 20 befindlichen Totraum durch einen Stopfen 33 aus thermisch isolierendem Material ohne das Risiko auszufüllen, daß beim Öffnen des Deckels 11′ feuchte Raumluft in den Dewarhals 1 gelangt und zu Frostniederschlag am Behälter 20 und am Rohr 22 führt. Der Stopfen 33 ist auf beliebige Weise mit dem Deckel 11′ verbunden und mit diesem zusammen betätigbar. In dem LN₂ ist eine Heizpatrone 34 als Verdampfer angeordnet.

Um die vorstehend beschriebene Funktion zu erhalten, wird vor dem Öffnen des Deckels 11′ und dem Herausziehen des Stopfens 33 aus dem Dewarhals 1 die Heizpatrone 34 eingeschaltet, so daß LN₂ in größeren Mengen verdampft. Der durch die Öffnungen 23 des Rohres 22 hindurchströmende GN₂ füllt den durch den Stopfen 33 beim Abheben des Deckels 11′ freigegebenen Raum sofort aus und verhindert den Eintritt feuchter Raumluft. Zusätzlich gewährleistet dies beim Beschicken des Behälters 20 mit gefrorenen Proben 5 eine inerte, trockene und kalte Gasatmosphäre.

Die Betätigung des Deckels 11′ kann von Hand erfolgen. Vorgezogen wird jedoch eine mechanische Betätigung, durch die der Deckel 11′ automatisch mit minimaler Geschwindigkeit angehoben wird. Dies kann beispielsweise durch einen Steuermotor realisiert werden; vorgezogen wird jedoch die in Fig. 3 hierzu dargestellte Vorrichtung. Diese weist eine Hohlsäule 35 auf, die neben dem Dewargefäß 3 auf nicht näher gezeigte Weise befestigt ist. Die Hohlsäule 35 nimmt abgedichtet verschiebbar einen Schaft 36 auf und bildet mit diesem eine Art "Kolben", der mit dem Deckel 11′ durch ein Joch 36 a verbunden ist und durch eine vorgespannte Druckfeder 38 nach oben beaufschlagt wird. Durch eine Sperrklinke 37 ist der "Kolben" in einer Stellung gehalten, der dem geschlossenen Zustand des Deckels 11′ entspricht. Im Boden der Hohlräume 35 ist ein Ventil 39 angeordnet, das ein Einströmen von Luft in das Innere nur durch eine Drosselöffnung erlaubt.

Nach Lösen der Sperrklinke 37 wird der "Kolben" durch die Feder 38 angehoben. Das Ventil 39 bewirkt einen langsamen Lufteinlaß in das Innere der Hohlsäule 35 beim Hub des "Kolbens", wodurch der Deckel 11′ nur langsam hochgehoben wird. Das Ventil 39 läßt beim risikofreien Absenken des Deckels 11′ die Luft wieder rasch aus der Hohlsäule 35 austreten.

Eine weitere Ausgestaltung dieses Hubmechanismus kann darin bestehen, daß über eine Elektronik 40 beim Drücken eines Öffnungstasters 41 zunächst die Heizpatrone 34 eingeschaltet wird und daß erst danach mit zeitlicher Verzögerung die Sperrklinke 37 elektrisch ausgelöst wird, so daß der Hub ohne weiteres Zutun mit der erforderlichen Verzögerung automatisch erfolgt.

Wie aus Fig. 3 weiterhin hervorgeht, erstrecken sich die Öffnungen 26 und 32 in dem Deckel 11′ auch durch den Stopfen 33 hindurch, um das Einfüllen und den Austausch des Mediums 6 in der gleichen Weise zu bewerkstelligen wie das zuvor bereits beschrieben worden ist.

Durch eine weitere Ausgestaltung der Vorrichtung nach Fig. 4 kann dem häufig geäußerten Wunsch nach besonders niedrigen oder hohen Inkubationstemperaturen entsprochen werden, welche oftmals im Zuge eines einzigen Arbeitsganges bei einer Kryosubstitution bei -120° C mit nachfolgender Tieftemperatur-Inkubation bei -30° C notwendig sind. Im Hinblick auf die gewünschten tiefen Temperaturen um -120° C ist hierbei ein metallischer Kontakt zur LN₂-Phase, im Hinblick auf die hohen Temperaturen um -30° C eine möglichst perfekte thermische Isolation zwischen dem Behälter 20′ und der LN₂-Phase 2 erforderlich.

Um dieser Forderung zu entsprechen, ist der Behälter 20′ zumindest in seiner unteren Hälfte gegen die LN₂-Phase 2 durch eine Isolationsschicht 42, beispielsweise aus Polyurethan- Hartschaum, thermisch isoliert. Durch die Isolationsschicht hindurch ragt eine dünnwandige metallische Hülse 43, die in einer Bohrung des Behälters 20′ gehalten ist, in eine entsprechende Bohrung eines massiven Metallkörpers 44 hinein und stellt einen metallischen Kontakt zwischen dem Behälter 20′ und dem massiven Metallkörper 44 her. Dieser besteht aus einem Material mit gutem Wärmeleitvermögen (z. B. Aluminium) und weist daher unabhängig vom LN₂-Füllstand im Dewargefäß 3 stets zur Gänze eine Temperatur auf, die praktisch dem Siedepunkt des LN₂ entspricht. Die Minimaltemperatur des Behälters 20′ stellt sich demnach bei jeder vorgewählten Betriebstemperatur auf einen Wert ein, der ausschließlich durch den Querschnitt, die Länge L und das Wärmeleitvermögen der Hülse 43 vorgegeben ist. Der Wärmeabfluß aus dem Behälter 20′ kann durch röhrenförmige Einsatzkörper (nicht dargestellt) in einfacher Weise variiert werden, die von oben her in die Hülse 43 eingeschoben werden können. Damit kann das Kühlsystem ohne großen Aufwand unterschiedlichen Betriebsbedingungen angepaßt werden.

Die Fig. 4 zeigt auch eine Ausgestaltung, die im Zuge der Entwässerung und Einbettung unterschiedliche Betriebstemperaturen ohne Öffnen der Vorrichtung zu realisieren gestattet. Hierzu ist ein zylindrischer Einsatzkörper 45 in der Hülse 43 verschiebbar und mit engem metallischem Wandkontakt zur Hülse 43 angeordnet und gegen den Druck einer Druckfeder 43 mittels eines Stabes oder Rohres 47 auf- und abbewegbar. Die Fig. 4A zeigt eine zylindrische Ausnehmung 48 in einem derartigen Einsatzkörper 45, durch die eine sehr präzise Veränderung des Wärmeabflusses vom Behälter 20′ zum Metallkörper 44 ermöglicht wird.

Die Auf- und Abbewegung des Einsatzkörpers 45 kann manuell erfolgen; vorteilhafter ist die Ausgestaltung durch einen Motor 49 und einen Zahnstangentrieb 50, 51′, so daß durch eine über eine Regeleinheit 52′ gesteuerte Bewegung des Einsatzkörpers 45 der LN₂-Verbrauch durch eine Regelung des Wärmeabflusses minimiert werden kann. Die Auf- und Abbewegung, gesteuert durch die Regeleinheit 52′, erfolgt dabei in Abhängigkeit von der durch den Temperaturfühler 13 gemessenen Temperatur des Behälters 20′.

Eine weitere Ausgestaltung der Erfindung kann gemäß Fig. 5 dem Zweck dienen, ein und dieselbe Apparatur auf einfache Weise ohne Umrüstung an unterschiedliche Probenzahlen anpassen zu können. Wie bereits eingangs festgestellt, werden im Rahmen einer Entwässerung oder Einbettung bei tiefer Temperatur in aller Regel kleine Proben mit einem Volumen unter 10 mm³ in kleiner Zahl bearbeitet. Zumeist werden hierbei nur wenige Blöcke in einem Arbeitsgang entwässert und eingebettet. Es besteht demnach im Hinblick auf das meistens als Zusatz zum Entwässerungsmedium in hohen Konzentrationen verwendete teure OsO₄ der Wunsch, mit möglichst kleinen Flüssigkeitsmengen zu substituieren. Andererseits können von Fall zu Fall aber auch größere Probenzahlen zur Entwässerung und Einbettung anstehen.

Diesen Anforderungen wird bei der Ausführungsform gemäß Fig. 5 dadurch entsprochen, daß der Behälter 52 zylindrisch ausgebildet und um eine vertikale Achse A-A drehbar in einem metallischen Aufnahmeteil 51 angeordnet ist, wobei die Achse A-A des Behälters 52 zu der Mittelachse B-B des Aufnahmeteils 51 parallel und um den Betrag E dazu exzentrisch liegt. Der (hier nicht gezeigte) Deckel zur Abdeckung des Behälters 52 und des Dewarhalses weist die in Zusammenhang beispielsweise mit Fig. 2 besprochenen Öffnungen zum Einbrigen des Mediums 6 und zur Durchführung der Rührwelle auf. Der Behälter 52 besitzt als Probenkammer ein Aufnahmerohr 53, das mit der Einfüll-Bohrung 27 wieder über einen Überlauf in Verbindung steht und dessen Achse im Abstand E von der Drehachse A-A des Behälters 52 angeordnet ist. Auf der bezüglich der Drehachse A-A gegenüberliegenden Seite, ebenfalls im Abstand E von der Achse A-A, ist das mittlere Rohr 55 eines aus drei miteinander kommunizierenden Röhren 54, 55 und 56 bestehenden Röhrensystems angeordnet (s. Fig. 5A). Das Röhrensystem 65, 55, 56 ist über eine Einfüll-Bohrung 27′ mit Medium 6 beschickbar. Das Medium 6 kann aus dem Aufnahmerohr 53 über die Bohrung 31 und aus dem Röhrensystem 54, 55, 56 über die Bohrung 31′ ohne Abheben des Deckels wieder entfernt werden, wie dies in Zusammenhang mit den vorhergehenden Ausführungsformen schon erläutert ist.

In der unteren Stirnseite des Behälters 52 sind zwei einander gegenüberliegende Bohrungen vorgesehen, von denen jeweils eine zur Fixierung der Drehlage des Behälters 52 mit einem in den Boden des Aufnahmeteils 51 eingelassenen Bolzen 57 zusammenwirkt.

Bei einer Drehung des Behälters 52 um die Achse A-A um 180° (nach einem leichten Anheben über den Bolzen 57) wird das Aufnahmerohr 53 aus der in Fig. 5A gezeigten Stellung herausbewegt und gelangt das Rohr 55 des Röhrensystems 54, 55, 56 in das Zentrum (Achse B-B) des Aufnahmeteils 51. Somit kann der ursprünglich in das einzige Aufnahmerohr 53 eintauchende Rührer 10 mit der Rührwelle 9 nunmehr in die mittlere Röhre 55 des Röhrensystems eintauchen. Ebenso treten an die Stelle der bis dahin mit den entsprechenden Öffnungen im Deckel korrespondierenden Einfüllbohrung 27 bzw. Entnahmebohrung 31 die entsprechenden Bohrungen 27′ bzw. 31′, welche zu den Bohrungen 27 und 31 spiegelsymmetrisch angeordnet und an das Röhrensystem 54, 55, 56 angeschlossen sind. Die Füllung und Entsorgung des Röhrensystems 54, 55, 56 kann nach der 180°-Drehung um die Achse A somit durch die gleichen Öffnungen im Deckel vorgenommen werden wie das Befüllen und Entsorgen des Aufnahmerohres 53 vor der 180°-Drehung des Behälters 52. Für die jeweils korrekte Position des Behälters 52 sorgt der Eingriff des Bolzens 57 in die entsprechende Bohrung des Behälters 52. Durch Verwendung allein des Aufnahmerohres 53 kann somit eine geringere Anzahl von Proben bearbeitet werden, während die Verwendung des Röhrensystems 54, 55, 56 die Bearbeitung einer größeren Anzahl von Proben zuläßt.

Aus Fig. 5 ist eine weitere Ausgestaltung der Erfindung ersichtlich. Diese besteht darin, daß durch den Deckel (nicht gezeigt) mit dem Stopfen 33′ aus thermisch isolierendem Material, den metallischen Aufnahmeteil 51 und die diesen umgebende thermische Isolationsschicht 42′ hindurch eine - vorzugsweise durch Metalltuben armierte - durchgehende vertikale Bohrung 58 verläuft, die an der Deckeloberfläche mit einem thermisch isolierenden Stopfen (nicht gezeigt) verschlossen ist. Nach Öffnen dieses Stopfens kann durch die Bohrung 58 ein Rohr 59 zum Nachfüllen von LN₂ eingeführt werden, durch das ohne Unterbrechung des laufenden Substitutions- oder Einbettungsprozesses jederzeit bei Bedarf LN₂ in das Dewargefäß 3 nachgefüllt werden kann. Diese Nachfüllung ist insbesondere in jenen Fällen entscheidend, in denen mit apolaren hydrophoben Medien (z. B. Äther, Chloroform) zum Zweck einer nachfolgenden Elementanalyse (EDX) wasserlöslicher Alkali- oder Erdalkali-Ionen substituiert wird. Infolge der geringen Affinität zwischen diesen Medien und dem H₂O-Molekül erfordern derartige Substitutionsprozesse oftmals mehrere Wochen und können daher ohne das durch die vorstehend beschriebene Gestaltung mögliche zwischenzeitliche Nachfüllen von LN₂ nicht ohne weiteres zu Ende geführt werden.

Soweit nur wenige Proben 5 substituiert werden, ist es wünschenswert, daß die Menge des OsO₄-haltigen Mediums 6 aus Kostengründen möglichst gering gehalten wird. Hierzu bietet die Ausführungsform gemäß Fig. 6, die im wesentlichen eine Weiterbildung der Ausführungsform nach Fig. 5 vorsieht, eine Lösung. Hierbei ist es möglich, die Höhe der Flüssigkeitssäule H im Aufnahmerohr 53 des Behälters 52 möglichst gering zu halten bzw. genau der Zahl bzw. Höhe der gestapelten Behälter 18 einschließlich Deckel 19 anzupassen. Entscheidend ist hierbei, daß die Höhenlage des Rührers 10′ variabel und von außen ohne ein Öffnen des Deckels einstellbar ist und daß die geometrische Form des Rührers 10′ den nicht direkt für die Substitution notwendigen Totraum gering hält. Zu diesem Zweck ist die Rührwelle 9′ in einem Aufnahmeteil, beispielsweise in einer Hülse 73, vertikal auf und ab verschiebbar und in jeder beliebigen Höhenlage mittels einer Klemmvorrichtung, beispielsweise mittels einer Spannzange 74, fixierbar. Die Rührwelle 9′ ist über eine an der Hülse 73 angreifende Transmission von einem Motor 8′ angetrieben (vgl. im einzelnen die Darstellung in Fig. 6). Wie aus Fig. 6A hervorgeht, ist der Rührer 10′ zur Reduktion des Totraumes und zur Erhöhung seiner Stabilität nicht in der üblichen Weise als Propeller, sondern als Drehteil mit geschlossenem Umfang ausgebildet, dessen Durchmesser d₁, d₂ auf die korrespondierenden Durchmesser D₁, D₂ der Probenbehälter 18 bzw. der Deckel 19 für die Probenbehälter 18 abgestimmt sind. Ebenso ist die Höhe h eines von dem Rührer 10′ nach unten vorspringenden Ansatzes nach Fig. 6 so bemessen, daß der Rührer 10′ über die Welle 9′ von außen bei gelöster Spannzange 74 ohne Risiko bis zum mechanischen Anschlag an dem Rand des Deckels 19 nach unten geschoben werden kann. Nach diesem Anschlag kann die Welle 9′ unter Sicht (z. B. nach Augenmaß) um jenen kleinen Betrag angehoben werden, der gerade den in Fig. 6 dargestellten freien Lauf innerhalb des Mediums 6 gewährleistet. Soweit nur wenige Proben 5 in einem einzigen Behälter 18 substituiert werden und die geometrische Form des Behälters 18 und des Rührers 10′ entsprechend einander angepaßt und optimiert sind, genügt für eine Substitution in dieser Ausführungsform im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen Vorrichtungen eine Flüssigkeitsmenge von rund 2 ml.

Wie aus Fig. 6a weiterhin hervorgeht, wird die Konvektion des Mediums 8 durch Schrägbohrungen 75 in der den Rührer 10′ bildenden Scheibe bewirkt, deren Achse in der in Fig. 6 dargestellten Weise unter einem Winkel α zur Achse der Rührwelle 9′ verläuft.

Bei der Ausführungsform der Fig. 5 und 6 ist zur Ermöglichung einer Zirkulation des Mediums 6 seitlich an dem Aufnahmerohr 53 eine über dessen Höhe verlaufende Nut mit der Tiefe b eingefräst.

Oftmals soll an eine Tieftemperatur-Entwässerung eine Tieftemperatur-Einbettung (z. B. in LOWICRYL) direkt angeschlossen werden. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann, wie sich aus Fig. 7 ergibt, hierfür unmittelbar ausgestaltet und angepaßt werden, indem man in den von dem Behälter 20′ und dem Rohr 22′ umgrenzten Raum einen z. B. metallischen Einsatz 60 einsetzt, der mit der Oberfläche des Behälters 20′ einen guten thermischen Kontakt bildet und daher dessen vorgewählte Temperatur weitgehend annimmt. In dem tassenförmigen Einsatz 60 ist ein weiterer Einsatz 61 aufgenommen, der an seiner Oberfläche Ausnehmungen 63 aufweist, welche entweder direkt zur Aufnahme von Proben 5 oder zur Aufnahme der üblicherweise verwendeten Einbettungsbehälter 64 (z. B. Gelatine- oder Polyäthylen-Kapseln) dienen, in welche die Proben 5 eingebracht sind. Das monomere Ausgangsprodukt (Monomeransatz) 6′ für die Tieftemperatur-Einbettung wird entweder direkt in die Ausnehmungen 63 oder in die Einbettungsbehälter 64 über die Proben 5 eingefüllt. Beide Einsätze 60 und 61 weisen, wie aus der zeichnerischen Darstellung in Fig. 7 hervorgeht, mittig einen Durchgang auf, der den Zugang zu der Probenkammer 24 des Behälters 24 ermöglicht, so daß die Entnahme der inkubierten Proben 5 aus der Probenkammer 24 sowie deren Transfer in die Vertiefungen 63 bzw. in die Einbettungsbehälter 64 innerhalb des Dewarhalses 1 möglich ist. Alle diese Manipulationen bereiten erfahrungsgemäß in der Tiefe des Dewarhalses 1 gewisse Schwierigkeiten, da die relativ enge Öffnung des Dewarhalses 1 keine hinreichende Beleuchtung ermöglicht. Die erfindungsgemäße Ausführungsform sieht daher eine Beleuchtung durch eine Lichtquelle 65 vor, die in nicht näher gezeigter Weise außerhalb des Dewarhalses 1 befestigt oder angeordnet ist. Das Rohr 22′ ist an seinem oberen Ende mit einem Ringaufsatz verbunden, in welchem eine Öffnung und in dieser ein um eine Horizontalachse schwenkbarer Spiegel 66 vorgesehen sind. Außerhalb des Spiegels 66 ist ein Wärmesperrfilter 67 zur weitgehenden Ausschaltung der Ultrarot-Komponente der Lichtquelle 65 angeordnet. Der Spiegel 66 erlaubt eine gebündelte Einstrahlung des Lichtes der Lichtquelle 65 in den Arbeitsraum über dem Einsatz 60, 61. Dabei behindert der Spiegel 66 die Präparationsarbeiten, beispielsweise das Einbringen der gefrorenen Proben 5 in die Probenkammer 24, das Einfüllen der Proben 5 in die Behälter 18 (vgl. Fig. 5) oder den Transfer der Proben 5 in die Ausnehmungen 63 oder die Einbettungsbehälter 64 in keiner Weise. Beim Schließen des Deckels 11, 11′ mit dem daran befestigten thermisch isolierenden Stopfen 33, 33′ (in Fig. 7 nicht dargestellt) wird der Spiegel 66 automatisch in die gestrichelt angedeutete Ruhestellung 66′ zurückgeschwenkt. Ein Mikrokontakt 68 kann hierbei vorgesehen sein, um selbsttätig die Beleuchtung abzuschalten.

Nach dem Einbringen der Proben 5 und des Monomeransatzes 6′ bzw. der Einbettungsbehälter 64 kann zur anschließenden UV-Polymerisation anstelle des Deckels 11, 11′ ein Aufsatz 69 mit einem UV-Strahler 70 auf den Dewarhals 1 bzw. auf das obere Ende des Rohres 22′ aufgesetzt werden. Durch den Deckel, das Rohr 22′ und den Einsatz 60, 61 wird die Polymerisationskammer umgrenzt. Soweit erforderlich, kann die Polymerisationskammer jedoch nach oben hin auch durch eine Quarzglasplatte 71 abgeschlossen sein, die einen Temperaturfühler 72 aufweist. Durch diesen und in Verbindung mit einer (nicht gezeigten) Temperaturregelungseinrichtung kann die Polymerisationstemperatur in der unterhalb der Quarzglasplatte befindlichen Polymerisationskammer konstant gehalten werden. Der Temperaturfühler 72 tritt dabei an die Stelle des Temperaturfühlers 13, der die Temperatur des Behälters 20 mißt, so daß die hierfür vorgesehene Regelungseinrichtung entsprechend umgeschaltet werden muß.

Der Einsatz 60 besteht aus einem gut wärmeleitenden Metall, während der Einsatz 61 aus einem anti-adhäsiven Kunststoff, z. B. Siliconkautschuk oder Teflon, besteht und dem jeweils gegebenen Bedarf leicht angepaßt werden kann.

Die anhand der Fig. 2 bis 7 beschriebene Vorrichtung kann im Rahmen der Erfindung in verschiedenen Variationen und Kombinationen verwirklicht werden, ohne hierbei ihre erfindungsgemäßen Kennzeichen einzubüßen. So ist es beispielsweise unerheblich, welche Heizelemente 12 oder Temperaturfühler 13 verwendet werden und an welchem Ort sie bedarfsgemäß installiert werden. Ebenso bleibt die Auswahl der Materialien und die geometrische Form der Teile 20, 42, 43, 51, 52, 60, 62 - um nur einige Teile beispielsweise zu nennen - ohne Belang, solange sie den angeführten kennzeichnenden Eigenschaften entsprechen. Gleiches gilt für die Steuer- und Regelelemente zur direkten oder indirekten Temperaturregelung, für die Art und Ausführung des Rührwerks und für die Anordnung der Einzelteile im Gesamtsystem. Schließlich kann das in Fig. 5 beispielsweise dargestellte Grundprinzip in unterschiedlicher Weise verwirklicht werden. So kann anstelle einer Drehung um 180° der Behälter 52 bei anders gewählten Symmetrien der Einfüll- und Entnahmebohrungen 27, 31 bereits nach einer Drehung um 120° oder um 90° ein zur Aufnahme der Proben geeignetes Röhrensystem in die zentrale Achse B-B bringen, welche der Achse der Rührwelle 9 entspricht. Schließlich haben Art und Ausführung der Objektbehälter 18 sowie der zur Manipulation der Objektbehälter im Kaltbereich vorzusehenden Hilfsmittel keinen Einfluß auf die Tragweite der Erfindung und können in jeweils zweckmäßiger Weise dem Bedarf angepaßt werden.

Es versteht sich auch, daß das Volumen aller derjenigen Räume des Behälters 20, 20′ oder 52, die einerseits mit Medium 6 gefüllt werden, andererseits jedoch nicht unmittelbar dem Inkubationsvorgang dienen, möglichst gering gehalten ist. Dies gilt z. B. für die Einfüllbohrung 27 bzw. 27′, deren Durchmesser a (vgl. Fig. 6) gerade so gering ist, daß der in Zusammenhang mit Fig. 2 beschriebene Gegenstrom-Wärmeaustauscheffekt sich einstellt. Das gilt aber auch für die Nut mit der Tiefe b (vgl. Fig. 5A, 6), die nur so groß gewählt wird, daß eine hinreichende Zirkulation erfolgt.

Claims (21)

1. Vorrichtung zur Entwässerung und/oder Polymerisationseinbettung biologischer Proben bei tiefen Temperaturen für eine nachfolgende mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchung, mit einem im Hals eines flüssigen Stickstoff enthaltenden Dewargefäßes angeordneten Behälter zur Aufnahme der Proben und eines Mediums zur Entwässerung bzw. Einbettung, der mit seiner Oberseite in einem Abstand von dem obersten Rand des Dewarhalses angeordnet ist und eine Probenkammer bildet, mit einem gegenüber der Umgebung isolierenden Deckel über dem Behälter und der Halsöffnung, mit einem in den Behälter hineinragenden Rührer und mit einer Temperatur- Regeleinrichtung zur Regelung der Temperatur des Behälters, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberseite (21) des Behälters (20, 20′, 52) in einem Abstand von mindestens 30 mm unterhalb des obersten Randes des Dewarhalses (1) liegt, daß seitlich von der Probenkammer (24, 53) im Behälter eine Einfüllausnehmung (27, 27′) ausgebildet ist, die nur über einen Überlauf mit der Probenkammer in Verbindung steht, daß zum Einfüllen des Mediums in den Behälter in dem Deckel (11, 11′) eine mit der Einfüllausnehmung (27, 27′) korrespondierende Einfüllöffnung (26) sowie zur Entnahme des Mediums aus dem Behälter eine Entnahmeöffnung (32) vorgesehen sind, und daß eine Füllvorrichtung (25 a) mit einer Kanüle (25 b) derart über dem Deckel (11, 11′) montierbar ist, daß die Kanüle durch die Einfüllöffnung (26) hindurch und in die Einfüllausnehmung (27, 27′) des Behälters bis nahe zu deren Boden hineinragt, wodurch sich beim Einfüllen des Mediums zwischen dem im Inneren und dem auf der Außenseite der Kanüle (25 b) strömenden Medium ein Gegenstrom-Wärmeaustausch bis zur Abkühlung des Mediums auf eine vorgewählte Temperatur des Behälters (20, 20′, 52) einstellt.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß an dem Deckel (11, 11′) ein Stopfen (33, 33′) aus thermisch isolierendem Material befestigt ist, der den zwischen der Unterseite des Deckels (11, 11′) und der Oberseite (21) des Behälters (20, 20′, 52) befindlichen Raum weitgehend ausfüllt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß unter dem Spiegel des in dem Dewargefäß (3) befindlichen flüssigen Stickstoffes ein Heizkörper (34) angeordnet ist, und daß dem Vermeiden von Wasserniederschlägen an dem Behälter (20, 20′, 52) beim Öffnen des Deckels der Heizkörper (34) beheizbar ist, wobei eine zusätzliche Verdampfung von Stickstoff und hierdurch ein Strom von kaltem trockenem Stickstoffgas bewirkt wird, der den Behälter (20, 20′, 52) umspült und den Zutritt feuchter Luft in den Dewarhals (1) verhindert.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zum Anheben des Deckels (11, 11′) eine Vorrichtung (35, 36) vorgesehen ist, und daß die Vorrichtung (35, 36) erst mit zeitlicher Verzögerung nach dem Einschalten des Heizkörpers (34) betätigbar ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (35, 36) ein durch eine Feder (38) belasteter Hubkolben ist, dessen Bewegung durch eine elektrisch betätigte Sperrklinke (37) auslösbar ist und dessen Bewegungsgeschwindigkeit durch ein Ventil (39) steuerbar ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (20′; 51, 52) auf seiner Unterseite durch eine thermische Isolationsschicht (42, 42′) abgeschirmt ist und daß in den flüssigen Stickstoff ein massiver Metallkörper (44) mit gutem Wärmeleitvermögen eintaucht, mit dem der Behälter (20′; 51, 52) durch eine metallische Verbindung (43), die durch die Isolationsschicht (42, 42′) hindurch verläuft, verbunden ist.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die metallische Verbindung (43) zwischen dem Behälter (20′) und dem Metallkörper (44) durch eine vertikal angeordnete zylindrische Röhre gebildet ist, in deren Inneres ein zylindrischer oder hohlzylindrischer Einsatzkörper (45) einschiebbar ist, welcher mit der Wandung der Röhre in gutem thermischen Kontakt steht und durch den der Querschnitt der metallischen Verbindung (43) in der gesamten Ausdehnung der Röhre oder einem Teilbereich davon veränderbar ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß der zylindrische oder hohlzylindrische Einsatzkörper (45) in der zylindrischen Röhre (43) gegen den Druck einer Feder (46) über eine Betätigungsstange (47) od. dgl. von außen in seiner Höhenlage zum Zweck einer Veränderung des Wärmeflusses verstellbar ist.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Betätigungsstange (47) so ausgebildet, z. B. lösbar angeordnet ist, daß ein Öffnen des Deckels (11, 11′) möglich ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Betätigungsstange (47) über einen Regelkreis (12, 13, 52′) mittels eines Steuermotors und geeigneter Übertragungselemente (50, 51′) so steuerbar ist, daß das Ausmaß der Gegenheizung durch eine Heizpatrone (12) und damit der Stickstoffverbrauch minimal gehalten werden.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Füllvorrichtung (25 a) ein Einfüllelement mit größerer Öffnung ist, an welchem die Kanüle (25 b) befestigt ist und das vor dem Eintritt in die Kanüle (25 b) ein dem Medium (6) Wasser entziehendes Filter (28) enthält.

12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (52) mehrere Probenkammern (53, 54 bis 56) sowie Füll- und Entnahmebohrungen (27, 31; 27′, 31′) zur Inkubation unterschiedlicher Probenmengen in entsprechend angepaßten Flüssigkeitsmengen aufweist und drehbar in einem Aufnahmeteil (51) derart angeordnet ist, daß bei seiner Drehung um einen vorgegebenen Winkel jeweils ein Paar der Füll- bzw. Entnahmebohrungen (27, 31; 27′, 31′) sowie mindestens eine Probenkammer (53; 54 bis 56) mit Öffnungen (26, 32) für das Einfüllen bzw. Entnehmen des Mediums (6) bzw. mit einer Durchtrittsöffnung für das Rührwerk (9, 10; 9′, 10′) in dem Deckel (11, 11′) zur Deckung bringbar sind.

13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Deckel (11, 11′), ggf. in dem damit verbundenen thermisch isolierenden Stopfen (33, 33′) und in dem Behälter (51, 52) sowie ggf. in dessen Isolierschicht (42, 42′) eine durchgehende Bohrung zum Nachfüllen von flüssigem Stickstoff in das Dewargefäß (3) ausgebildet ist, die mittels eines thermisch isolierenden Stopfens an dem deckelseitigen Ende verschließbar ist.

14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Welle (9′) mit dem Rührer (10′) von außen höhenverstellbar an dem Deckel (11, 11′) angeordnet ist.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Rührer (10′) als zu der Welle (9′) koaxiales Drehteil mit geschlossenem Umfang ausgebildet ist und mindestens eine von seiner Oberseite bis zur Unterseite durchgehende Bohrung (75) aufweist, deren Achse schräg zur Achse der Welle (9′) verläuft, und daß der Rührer (10′) in seinen Abmessungen und seiner Form an Abmessungen und Form der Probenkammer (53) oder der Probenbehälter (18) bzw. des Probenbehälter-Deckels (19) derart angepaßt ist, daß die benötigte Menge an Medium (6) minimal ist.

16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß zum Zweck der Tieftemperatur-Einbettung über den Behälter (20, 20′, 52) ein Einsatz (60, 61) in den Dewarhals (1) einsetzbar ist, der Vertiefungen (63) zur Aufnahme der Proben (5) oder von Einbettungsbehältern (64) für die Proben (5) aufweist und einen Durchgang zu der Probenkammer (24, 53) des Behälters (20, 20′, 52) zum Transfer der inkubierten Proben in die Vertiefungen (63) bzw. in die Einbettungsbehälter (64) aufweist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Einsatz (60, 61) mit Siliconkautschuk, Teflon oder einem anderen kälteresistenten, anti-adhäsiven Kunststoff bedeckt ist oder daraus besteht.

18. Vorrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß auf den Dewarhals (1) anstelle des Deckels (11, 11′) ein Aufsatz (69) aufsetzbar ist, auf dessen Unterseite ein UV-Strahler (70) angeordnet ist.

19. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß der Einsatz (60, 61) durch eine für UV-Strahlung durchlässige Platte (71) abdeckbar ist, und daß in der zwischen der Platte (71) und dem Einsatz (60, 61) gebildeten Polymerisationskammer ein Temperaturfühler zur Messung und ggf. Regelung der Temperatur in der Polymerisationskammer angeordnet ist.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß eine Auflicht-Beleuchtung des Behälters (20, 20′, 52) bzw. des Einsatzes (60, 61) durch eine außerhalb des Dewarhalses (1) angeordnete Lampe (65) über einen in einer rohrförmigen Halterung (22, 22′) für den Behälter (20, 20′, 52) angeordneten schwenkbaren Spiegel (66) vorgesehen ist.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß in der Ruhe-Schwenkstellung des Spiegels (66) ein Schaltelement (68) für die Lampe (65) angeordnet ist, das im Sinne eines Ausschaltens der Lampe (65) beim Einschwenken des Spiegels betätigbar ist.