DE102004041965B4

DE102004041965B4 - Vorrichtung und Verfahren zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben

Info

Publication number: DE102004041965B4
Application number: DE102004041965A
Authority: DE
Inventors: Ludwig Dr. Edelmann
Original assignee: Leica Mikrosysteme GmbH
Current assignee: Leica Mikrosysteme GmbH
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2004-08-31
Publication date: 2009-08-13
Anticipated expiration: 2024-09-01
Also published as: US7591981B2; DE102004041965A1; US20060045813A1

Abstract

Vorrichtung zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben, umfassend einen Behälter (6) zur Aufnahme mindestens eines Probenträgers (2) mit einer Probe (4), wobei der Behälter (6) die Form eines einseitig offenen Zylinders besitzt, der einen Boden (16) und eine Seitenwand (8) aufweist und gegenüber dem Boden eine Öffnung (9) ausgebildet hat, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Mulden (12) im Behälter (6) zur Aufnahme jeweils eines Probenträgers (2) ausgebildet sind, dass jede der Mulden (12) ein sich verjüngendes Ende (18) ausgeformt hat, wobei das verjüngte Ende (18) der Mulden (12) gegenüber der Seitenwand (8) des offenen Zylinders angeordnet ist, wobei am verjüngten Ende (18) einer jeden Mulde (12) eine Stufe (20) ausgeformt ist, an der die Probenträger (4) anliegen, und dass jede der Mulden (12) mit einer Zuleitung versehen ist, so dass eine Verbindung der Mulden (12) untereinander besteht.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben. Im besonderen betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben, die einen Behälter zur Aufnahme mindestens eines Probenträgers mit einer Probe umfasst.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben.
Das Leica EM AFS offenbart ein Gerät gemäß dem Stand der Technik. Ein Dewargefäß ist mit flüssigem Stickstoff gefüllt, wobei der Dewarhals eine Kammer aufweist, die auf eine bestimmte Temperatur gekühlt wird. Die gewünschte Temperatureinstellung erfolgt über einen Regelkreis und eingebaute Heizelemente. Der Substitutionsprozess beginnt bei etwa –80°C. Die gefrorene Probe wird in die Kammer transferiert, wozu mehere verschiedene Behälter vorgesehen sein können, mit denen die Proben in ein Substitutionsmittel, üblicherweise Aceton oder Methanol, getaucht werden. Bei dieser tiefen Temperatur beginnt der langsame Prozess der Substitution, in dem das gefrorene Wasser der Probe durch das Lösungsmittel ersetzt wird, ohne dass es zu Rekristallisationen kommt. Während dieses Prozesses wird nun die Temperatur langsam erhöht, das Medium ausgetauscht und schließlich durch ein Tieftemperatureinbettmedium ersetzt. Zur Polymerisation des Tieftemperatureinbettmediums wird eine UV-Lampe auf die Kammer aufgesetzt. Die verschiedenen Behälter für die Gefriersubstitution und Einbettung sind in dem Katalog zur Leica EM AFS offenbart. Alle hier offenbarten Behälter haben den Nachteil, dass es während des Prozesses der Gefriersubstitution und/oder Einbettung zu einem Verlust der Proben kommen kann.
Es gibt verschiedene Verfahren und Geräte, um Proben gut zu frieren. Die Hochdruckgefriermethode liefert zur Zeit die besten Resultate. Die gefrorenen Präparate befinden sich nach dem Einfrieren in Probenträgern. Im Katalog der Leica EM PACT sind diese Probenträger auf Seite 6 abgebildet. Das Herauslösen von den kleinen Proben (Dicke: meist 0,2 mm, Durchmesser: 1,2 mm) aus der Halterung, die Manipulation dieser Proben im Substitutionsmedium, der Transfer in eine Einbettform, sind kritische Schritte, die oft zum Verlust eines Präparats führen.
Das U.S.-Patent 6,516,620 offenbart eine Vorrichtung zum Hochdruckgefrieren von Proben. Der Probenträger ist dabei in einen Halter allseitig eingespannt und wird von einer Seite her mit dem entsprechenden Druck beaufschlagt. Allseitig wird auf den Probenhalter von außen ein Kühlmedium aufgesprüht, um die notwendige tiefe Temperatur zu erreichen.
Das U.S.-Patent 6,536,219 offenbart eine Vorrichtung und ein Verfahren zur präzisen Gefriersubstitution von Gewebeproben. Die Vorrichtung besitzt mehrere Vertiefungen unterschiedlicher Größe und Form für die Einbettung. Dennoch kann mit dieser Vorrichtung nicht ausgeschlossen werden, dass es ebenfalls zu einem Verlust der Proben kommen kann.
Die Patentschrift DE 3425 744 C2 beschreibt einen Vorrichtung zur Entwässerung und Polymerisationseinbettung biologischer Proben bei tiefen Temperaturen, bei der mehrere Mulden in einem Behälter zur Aufnahme jeweils eines Probenträgers ausgebildet sind. Allerdings besteht keine Verbindung der Mulden untereinander, so dass die Gefahr besteht, dass die kleinen Proben aus den Vertiefungen beziehungsweise den Probenbehältern herausgespült werden.
Die DE 198 52 835 A1 offenbart einen Probenträger zur Durchführung von Reihenanalysen mit einer Vielzahl von Mulden zur Aufnahme einer Probe, bei dem jede der Mulden mit einer Zuleitung versehen sind, so dass eine Verbindung der Mulden zu einer zentralen Aufgabeöffnung besteht. Allerdings ist der Probenträger nicht für die Durchführung von einer Gefriersubstitution geeignet.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung zur Gefriersubstitution und Einbettung biologischer Proben zur Verfügung zu stellen, mit der ein möglicher Probenverlust sowohl während des Transfers der Probe in die Vorrichtung zur Einbettung als auch während des Prozesses der Gefriersubstitution und der Einbettung erheblich reduziert, wenn nicht gar ausgeschlossen ist. Die obige Aufgabe wird durch eine Vorrichtung zur Gefriersubsitution und Einbettung gelöst, die die Merkmale des Anspruchs 1 umfasst.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben zu schaffen, mit dem ein Probenverlust annähernd ausgeschlossen ist.
Die Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, das die Merkmale des Anspruchs 13 umfasst.
Die Vorrichtung zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben umfasst einen Behälter zur Aufnahme mindestens eines Probenträgers mit einer Probe. Im Behälter sind mehrere Mulden zur Aufnahme jeweils eines Probenträgers ausgebildet. Jede der Mulden ist mit einer Zuleitung versehen, so dass eine Verbindung der Mulden untereinander besteht.
Durch die Zuleitung bzw. die Verbindung der Mulden untereinander ist ein Austausch der verschiedenen Medien möglich, die für die Gefriersubstitution und Einbettung benötigt werden. Der Behälter umfasst eine Einfüll- und Absaugöffnung für das Medium. Die Einfüll- und Absaugöffnung steht mit den Zuleitungen in Verbindung, so dass über die Zuleitungen die einzelnen Mulden mit dem gerade benötigten bzw. verwendeten Medium versorgt werden.
Es ist der Behälter besitzt die Form eines einseitig offenen Zylinders. Der Behälter besteht aus einem Boden und einer Seitenwand. Gegenüber dem Boden ist der Zylinder offen ausgebildet bzw. besitzt dort die bereits erwähnte Öffnung. Im Inneren des Zylinders ist die mindestens eine Mulde und die Einfüll- und Absaugöffnung ausgebildet.
Die Einfüll- und Absaugöffnung ist zentral angeordnet. Die mehreren Mulden sind radial um die Einfüll- und Absaugöffnung herum angeordnet. Jede der Mulden besitzt ein sich verjüngendes Ende. Das verjüngte Ende der Mulden ist gegenüber der Seitenwand des offenen Zylinders angeordnet.
Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Mulden in einer separaten Muldenplatte ausgebildet sind. Die Muldenplatte ist dann in den als oben offenen Zylinder ausgeformten Behälter einsetzbar. Die Muldenplatte hat am verjüngten Ende einer jeden Mulde eine Stufe ausgebildet, an der die Probenträger anliegen.
Das Verfahren zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben gestaltet sich dadurch besonders vorteilhaft, dass mindestens ein eine Probe tragender Probenträger in einen Behälter eingelegt wird, der mehrere Mulden zur Aufnahme jeweils eines Probenträgers umfasst. Nachdem die Probenträger in den jeweiligen Mulden abgelegt worden sind, erfolgt die Gefriersubstitution und Einbettung durch Zuführen entsprechender Medien durch die Einfüll- und Absaugöffnung. Dabei ist jede der Mulden mit einer Zuleitung versehen, so dass eine Verbindung der Mulden mit der Einfüll- und Absaugöffnung besteht. Ist die Gefriersubstitution abgeschlossen, erfolgt das Polymerisieren eines den Mulden zugeführten Einbettmittels. Nach dem Polymerisieren erfolgt das Ausstoßen einer jeden in den Mulden befindlichen polymerisierten Form. Die polymerisierte Form trägt die Probe.
Die Probe ist auf einer Erhebung der polymerisierten Form angeordnet. Der Probenträger wird beim Ausstoßen der polymerisierten Form aus der Mulde abgesprengt. Dies ist von besonderem Vorteil, da nach dem Polymerisieren eine automatische Trennung der Probe vom Probenträger erfolgt. Hinzu kommt, dass die in der Muldeplatte ausgeformte Stufe für eine Fixierung des Probenträgers während der Gefriersubstitution und Einbettung sorgt, so dass nach der Polymerisierung der Form eine definierte Lage der Probe vorgefunden wird.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung können den Unteransprüchen entnommen werden und sind Gegenstand der nachfolgenden Figuren sowie deren Beschreibungen.
Es zeigen im einzelnen:
1 eine perspektivische Ansicht des Probenträgers für die Gefriersubstitution und Einbettung;
2 eine perspektivische Ansicht des Behälters zur Gefriersubstitution und Einbettung, wobei mehrere Probenträger in den Behälter eingesetzt sind;
3 einen Querschnitt durch den Behälter entlang der in 2 dargestellten Linie a-a;
4 eine Detailansicht des Behälters zur Gefriersubstitution und Einbettung, die die Lage des Probenträgers im Behälter zeigt;
5 eine perspektivische Darstellung des Behälters zur Gefriersubstitution;
6 eine UV-durchlässige, ringförmige Scheibe, die in den Behälter zur Gefriersubstitution und Einbettung vor der Polymerisation des Einbettmittels eingelegt wird;
7 eine perspektivische Darstellung des Behälters zur Gefriersubstitution und Einbettung, wobei die UV-durchlässige, ringförmige Scheibe in den Behälter eingelegt ist;
8 eine schematische Darstellung eines Ausstoßmittels, mit dem die polymerisierten Teile in den Mulden aus dem Behälter ausgestoßen werden; und
9 eine perspektivische Ansicht des aus der Mulde ausgestoßenen polymerisierten Einbettmittels, das an einem Ende die Probe trägt.
1 zeigt eine perspektivische Ansicht eines Probenträgers 2, der eine Probe 4 trägt. Der Probenträger 2 ist ringförmig ausgebildet und trägt in einer Vertiefung 3 die Probe 4. Die Probe 4 besitzt in etwa einen Durchmesser von 1,2 mm und eine Dicke von etwa 0,2 mm.
2 zeigt eine perspektivische Ansicht eines Behälters 6 für die Gefriersubstitution und Einbettung. Der Behälter 6 ist zylinderförmig ausgebildet und besitzt eine Seitenwand 8 und einen Boden 16. Der Behälter ist an der dem Boden 16 abgewandten Seite offen. Im Inneren des Behälters 6 sind mehrere Mulden 12 ausgebildet. Es ist besonders vorteilhaft, wenn die Mulden 12 in einer aus dem Innenbereich des Behälters 6 entnehmbaren Muldenplatte 10 ausgebildet sind. In der hier dargestellten Ausführungsform besitzt die Muldenplatte 10 eine zentrale Einfüll- und Absaugöffnung 14, durch die die für die Gefriersubstitution und Einbettung erforderlichen Chemikalien bzw. Medien zugeführt und abgesaugt werden können. Die Mulden 12 sind in dieser Ausführungsform radial um die Einfüll-/Absaugöffnung 14 angeordnet. Gegenüber der Seitenwand 8 des Behälters 6 besitzen die Mulden 12 ein verjüngtes Ende 18. Das verjüngte Ende 18 hat eine Stufe 20 ausgeformt, durch die die Probenträger in der Mulde gehalten werden. Jeweils ein Probenträger 4 wird in eine Mulde 12 eingelegt und auf das sich verjüngende Ende 18 hingeschoben, bis er an der Stufe 20 anliegt.
3 zeigt einen Querschnitt durch den Behälter 6 entlang der in 2 eingezeichneten Linie a-a. Der Behälter 6 ist rotationssymmetrisch um eine Achse 23 ausgebildet. Um die Achse 23 ist die Einfüll-/Absaugöffnung 14 angeordnet. Unterhalb der Einfüll-/Absaugöffnung 14 besitzt der Boden 16 des Behälters 6 eine Vertiefung 25. Ebenso reicht die Muldenplatte 10 im Bereich der Einfüll-/Absaugöffnung 14 nicht ganz auf den Boden 16 des Behälters 6, wodurch durch das Zusammenwirken der Vertiefung 25 und der nicht ganz auf den Boden des Behälters 6 reichenden Muldenplatte 10 eine Zuleitung 22 zu den einzelnen Mulden 12 ausgebildet wird.
4 zeigt eine vergrößerte Ansicht des Behälters 6, um die Sicherung des Probenträgers 2 in der Mulde 12 zu verdeutlichen. Wie bereits in der Beschreibung zu 3 erwähnt, reicht die Muldenplatte 10 im Bereich der Einfüll-/Absaugöffnung 14 nicht ganz auf den Boden 16 des Behälters 6. Dadurch ist eine Zuleitung 22 von der Einfüll-/Absaugöffnung 14 zur Mulde 12 ausgebildet. Die Mulde endet gegenüber der Seitenwand 8 des Behälters 6 in einem verjüngenden Ende 18. Im Bereich des verjüngenden Endes 18 ist die Stufe 20 ausgebildet, die den Probenträger 2 teilweise radial umgreift.
5 zeigt eine perspektivische Ansicht des Behälters 6, in dessen Öffnung 9 die Muldenplatte 10 eingesetzt ist. Mehrere Probenträger 2 sind in die Mulden 12 eingesetzt.
6 zeigt eine UV-durchlässige, ringförmige Folie 30, die auf die Muldenplatte 10 gelegt werden kann. Die ringförmige Folie 30 besitzt eine zentrale Öffnung 32, die einen größeren Durchmesser als die Einfüll-/Absaugöffnung 14 besitzt. Die Öffnung 32 der ringförmigen Folie 30 ist derart bemessen, dass neben dem Zugang zu der Einfüll-/Absaugöffnung 14 weiterhin ein Zugang zu jeder Mulde 12 in der Muldenplatte 10 verbleibt. In einem letzten Schritt, also vor der Polymerisation, wird die UV-durchlässige Folie 30 aufgelegt. Eine UV-Lampe (nicht dargestellt) wird auf den Behälter 6 aufgesetzt, um die Polymerisation des Einbettmittels zu starten. Würde die Folie 30 nicht auf die Muldenplatte 10 aufgelegt, polymerisiert das Einbettmittel ungleichmäßiger und langsamer. Da sich das Einbettmittel bei der Polymerisation kontrahiert, ist der Zugang zu jeder Mulde 12 weiterhin notwendig.
7 zeigt eine perspektivische Darstellung des Behälters 6 mit der eingesetzten UV-durchlässigen, ringförmigen Folie 30. Die Öffnung 32 der ringförmigen Folie 30 lässt einen Zugang zu der Einfüll-/Absaugöffnung 14 und einen teilweisen Zugang zu jeder der Mulden 12 zu.
8 zeigt ein Ausstoßmittel 34, das zum Ausstoßen der auspolymerisierten Formen in der Mulde 12 dient. Das Ausstoßmittel greift durch den Boden 16 des Behälters 6 hindurch und wirkt unmittelbar auf die in den einzelnen Mulden 12 vorhandenen auspolymerisierten Formen aus Einbettmitteln.
9 zeigt eine perspektivische Ansicht des polymerisierten Körpers 40 aus Einbettmittel. Der polymerisierte Körper 40 aus Einbettmittel ist im wesentlichen der Negativabdruck der Mulde 12 in der Muldenplatte 10, in der das Einbettmittel polymerisiert wurde. Der polymerisierte Körper besteht aus einem länglichen ovalen Teil 42, der im wesentlichen der Mulde 12 entspricht. An den länglichen ovalen Teil 42 schließt sich ein runder Teil 44 an, der der Verjüngung 18 der Mulde 12 entspricht. Der runde Teil 44 trägt die Probe 4. Die im länglichen Teil 42 ausgeformte Stufe 46 besitzt die Form eines Kreissektors. Die Stufe 46 entsteht beim Ausstoßen des Körpers 40 aus der Mulde 12. Das Ausstoßen bewirkt ein Absprengen des Präparatträgers 2 von dem auspolymerisierten Körper 40. Somit bleibt die Probe 4 auf dem runden Teil 44 des polymerisierten Körpers 40 zurück.

Claims

Vorrichtung zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben, umfassend einen Behälter (6) zur Aufnahme mindestens eines Probenträgers (2) mit einer Probe (4), wobei der Behälter (6) die Form eines einseitig offenen Zylinders besitzt, der einen Boden (16) und eine Seitenwand (8) aufweist und gegenüber dem Boden eine Öffnung (9) ausgebildet hat, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Mulden (12) im Behälter (6) zur Aufnahme jeweils eines Probenträgers (2) ausgebildet sind, dass jede der Mulden (12) ein sich verjüngendes Ende (18) ausgeformt hat, wobei das verjüngte Ende (18) der Mulden (12) gegenüber der Seitenwand (8) des offenen Zylinders angeordnet ist, wobei am verjüngten Ende (18) einer jeden Mulde (12) eine Stufe (20) ausgeformt ist, an der die Probenträger (4) anliegen, und dass jede der Mulden (12) mit einer Zuleitung versehen ist, so dass eine Verbindung der Mulden (12) untereinander besteht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass über die Zuleitung zu den Mulden (12) ein Austausch von mindestes einem Medium stattfindet.
Vorrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter (6) eine Einfüll- und Absaugöffnung (14) für das Medium besitzt, und dass die Einfüll- und Absaugöffnung (14) mit den Zuleitungen in Verbindung steht.
Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass im Inneren des Zylinders die mindestens eine Mulde (12) und die Einfüll- und Absaugöffnung (14) ausgebildet ist, und dass die Einfüll- und Absaugöffnung (14) einen Zugang zu der mindestens einen Mulde (12) besitzt.
Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Einfüll- und Absaugöffnung (14) zentral angeordnet ist.
Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren Mulden (12) radial um die Einfüll- und Absaugöffnung (14) herum angeordnet sind.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mulden (12) in einer separaten Muldenplatte (10) ausgebildet sind, und dass die Muldenplatte (10) in den als offenen Zylinder ausgeformten Behälter (6) einsetzbar ist.
Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass eine UV- durchlässige, ringförmige Folie (30) auf die Muldenplatte (10) gelegt ist, wobei die ringförmige Folie (30) derart bemessen ist, dass weiterhin ein Zugang zu jeder Mulde (12) verbleibt.
Verfahren zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben mit den folgenden Schritten: • Einlegen mindestens eines eine Probe (4) tragenden Probenträgers (2) in einen Behälter (6), der mehrere Mulden (12) zur Aufnahme jeweils eines Probenträgers (2) aufweist, • Anlegen des Probenträgers (2) an eine Stufe (20), die in jeder der Mulden (12) an einem sich verjüngenden Ende (18) der Mulden (12) ausgeformt ist, • Zuführen und Absaugen von mindestens einem Medium für die Gefriersubstitution und Einbettung über eine Einfüll- und Absaugöffnung (14), wobei jede der Mulden (12) mit einer Zuleitung (22) versehen ist, so dass eine Verbindung der Mulden (12) mit der Einfüll- und Absaugöffnung (14) besteht, • Polymerisieren eines den Mulden (12) zugeführten Einbettmittels; und • Ausstoßen einer jeden in den Mulden (12) befindlichen polymerisierten Form, • Wobei die polymerisierte Form die Probe (4) trägt.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe (4) auf einer Erhebung der polymerisierten Form angeordnet ist, und dass der Präparatträger (2) beim Ausstoßen der polymerisierten Form aus der Mulde (12) abgesprengt wird.
Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass beim Anlegen der Probenträger (2) unter die Stufe (20) geschoben wird, und dass die Stufe (20) den Probenträger (2) teilweise am Rand umgreift.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass vor der Polymerisation des Einbettmittels eine UV-durchlässige, ringförmige Folie (30) auf die Muldenplatte (10) gelegt wird, wobei die ringförmige Folie (30) derart bemessen ist, dass weiterhin ein teilweiser Zugang zu jeder Mulde (12) verbleibt.
Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die ringförmige Folie (30) als Abdeckung für die Muldenplatte (10) verwendet wird, und dass durch die Abdeckung mit der ringförmigen Folie (30) das Einbettmittel gleichmäßig und schneller polymerisiert.
Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass eine UV-Lampe zur Polymerisation verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zum Entfernen der polymerisierten Form aus der Mulde ein Ausstoßwerkzeug verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Gefriersubstitution, die Einbettung und die Polymerisation in einem Gerät für die Gefriersubstitution durchgeführt werden.
Verwendung einer Vorrichtung zur Gefriersubstitution und Einbettung von biologischen Proben in einem Gerät zur Gefriersubstitution, wobei die Vorrichtung einen Behälter (6) zur Aufnahme mindestens eines Probenträgers (2) mit einer Probe (4) umfasst, wobei der Behälter (6) die Form eines einseitig offenen Zylinders besitzt, der einen Boden (16) und eine Seitenwand (8) aufweist und gegenüber dem Boden eine Öffnung (9) ausgebildet hat, dadurch gekennzeichnet, dass mehrere Mulden (12) im Behälter (6) zur Aufnahme jeweils eines Probenträgers (2) ausgebildet sind, dass jede der Mulden (12) ein sich verjüngendes Ende (18) ausgeformt hat, wobei das verjüngte Ende (18) der Mulden (12) gegenüber der Seitenwand (8) des offenen Zylinders angeordnet ist, wobei am verjüngten Ende (18) einer jeden Mulde (12) eine Stufe (20) ausgeformt ist, an der Stufe die Probenträger (4) anliegen, und dass jede der Mulden (12) mit einer Zuleitung versehen ist, so dass eine Verbindung der Mulden (12) untereinander besteht.