DE3042578A1

DE3042578A1 - Inkubationseinrichtung zur fixation, entwaesserung und einbettung biologischer objekte fuer mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische untersuchungen

Info

Publication number: DE3042578A1
Application number: DE19803042578
Authority: DE
Inventors: Hellmuth Prof. Dr. Seefeld Tirol Sitte
Original assignee: C Reichert Optische Werke AG
Current assignee: Leica AG Austria
Priority date: 1980-11-12
Filing date: 1980-11-12
Publication date: 1982-06-24
Also published as: DE3042578C2; GB2093211B; JPS57108755A; US4363783A; HK70185A; GB2093211A

Description

C. Reichert, Optische Werke AG

Wien

Österreich

19 975/6 2o/h . f

Inkubationseinrichtung zur Fixation, Entwässerung und Ein- \ bettung biologischer Objekte für mikroskopische, insbe- . f sondere elektronenmikroskopische Untersuchungen - . [

Die Erfindung betrifft eine Inkubationseinrichtung zur ; Fixation, Entwässerung und Einbettung biologischer

Objekte mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des ■■-Patentanspruches 1.

Biologische Objekte können in den meisten Fällen nicht

unmittelbar im Mikroskop, insbesondere Elektronenmikros- I

kop untersucht werden, sondern bedürfen hierzu einer vor- I

bereitenden Präparation. Diese Vorbehandlung besteht in der |.

Regel zunächst in einer Stabilisierung der vitalen ;/

Strukturen durch geeignete Chemikalien (Fixation, z.B. |

durch Aldehyde und/oder Schwermetallverbindungen in I

wässriger Lösung) oder durch ein rapides Einfrieren (Kryo- -

fixation) , in einer anschließenden Entwässerung in organischen \.

Solvention (z.B. Azeton oder Aldehyd, u.U. mit Zusatz von ■ _$

Schwermetallverbindungen zum Erhöhen des Kontrastes im f

elektronenmikroskopischen Bild bzw. zur Stabilisierung der ^F Strukturen nach einer Kryofixation) sowie schließlich in einer Impragnation mit Stoffen, welche das Objekt abschließend in eine zum Herstellen dünner oder ultradünner Schnitte mit einem Mikrotom oder Ultramikrotom

geeignete Konsistenz überführen (Einbettung, z.B. in ^

Wachs oder Kunststoff) . Dieser Arbeitsgang erfordert in '■

der Regel einerseits einen mehrfachen Wechsel verschie- I

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^· 7 —

dener flüssiger Medien. Andererseits muß man dafür Sorge tragen, daß die Objektoberflächen stets mit frischer

■ ^; Flüssigkeit in Kontakt treten, da ansonsten der gewünschte

Austausch der im Inneren der biologischen Objekte befindlichen Zeil- bzw. Gewebeflüssigkeiten gegen die verschie-.; denen Inkubationsmedien zu langsam verläuft. In vielen

Fällen wird die Inkubation zudem bei reduzierter Temperatur (Reduktion autolytischer Reaktionen während der Fixation bzw. Reduktion der Auslösung objekteigener Strukturen während der Entwässerung) oder bei erhöhter Temperatur (Reduktion der Viskosität der Einbettungsmedien bzw. Schmelzen der ι ^: zum Einbetten teilweise verwendeten Wachse) durchgeführt.

Der aufgezeigte Präparationsgang kann demnach zwar von Hand '·■' ausgeführt werden, erfordert dabei aber durch das manuelle

Füllen, Umfüllen, Schütteln bzw. zusätzlich durch das

■ . Einbringen der Behälter in Kühl- oder Heizvorrichtungen

eine laufende Betreuung und einen insgesamt sehr hohen Arbeitsaufwand. Angesichts der ständig steigenden Lohn-

.1 kosten wie im Hinblick auf eine optimale Reproduzierbarkeit

der Resultate hat man daher Automaten ("Tissueprozessoren") entwickelt, welche den gesamten Präparationsgang automatisch und stets reproduzierbar durchführen. Derartige Automaten j sind in zahlreichen unterschiedlichen Ausführungen für

^! Belange der Licht- wie Elektronenmikroskopie am Markt

erhältlich und vor allem in grösseren Laboratorien oder ; für Routinearbeiten in Gebrauch. Eines dieser bekannten

j Geräte weist eine Inkubationskammer auf, in der Behälter

• ' für die zu behandelnden biologischen Objekte säulen-

• förmig übereinander stapelbar sind. Die Behälter sind durch Gittereinsätze an Boden und Deckel für Flüssigkeit durchlässig und das Gerät weist eine Einrichtung zur Erzeugung einer periodischen Hebung und Senkung der in der Inkubationskammer befindlichen Flüssigkeitssäule auf, so daß hierdurch die in den Behältern befindlichen Objekte

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umspült werden. Angesichts der hohen Anschaffungskosten wie ^f des teilweise relativ hohen laufenden Verbrauchs an Fixations-, Entwässerungs- und Einbettungssubstanzen haben sich diese Automaten jedoch nur in begrenzten Bereichen durchgesetzt. In allen anderen Sektorerarbeitet man, wenn man von den Drehscheiben zum Realisieren einer laufenden schwachen Konvektion der Inkubationsmedien absieht, weitest- ' gehend manuell. Diese manuelle Arbeit, welche zumindest in einem laufenden, in kleinen Zeitintervallen von jeweils 1o

bis 3o min notwendigen Wechsel der verschiedenen Medien, ^:

häufig in einem zusätzlichen Schütteln und nicht zuletzt in einem Reinigen der verschiedenen Gefässe besteht, ist

dadurch nicht unbedenklich, daß die meisten verwendeten ;

Medien (Fixationslösungen, Entwässerungs- und Zwischen- · ] medien sowie Einbettungssubstanzen) gesundheitsschädlich sind ■ und weder mit der Haut (allergische Reaktionen) in Kontakt kommen noch eingeatmet werden sollen (Allgemeinschädigungen). i

Dieser Aspekt zwingt zu zusätzlichen Vbrsorgemaßnahmen, '

welche die Arbeit weiter komplizieren. - ,

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Inkubationseinrichtung zu schaffen, die relativ einfach L

aufgebaut ist und daher in ihrem Anschaffungspreis er-

T heblich unter den Kosten der vorstehend erwähnten Automaten liegt, deren Verbrauch an Fixations-, Entwässerungs- und Einbettungsmedien den Verbrauch beim rein manuellen Flüssigkeitswechsel nicht überschreitet, die aber den Hautkontakt mit den verwendeten Flüssigkeiten sowie das Risiko eines Einatmens schädlicher Dämpfe auf ein Mindestmaß be- <

schränkt oder ausschließt. Dabei soll .diese Inkubations-- £

einrichtung aber die beschriebenen Präparationsgänge in ' I

i· vergleichbarem Ausmaß wie die automatischen Geräte ver- ι

einfachen und außerdem funktionell, d.h. bezüglich der . «'

Präparationswirkung, zumindest gleichwertig sein. Trotz des einfachen Aufbaues soll die Inkubationseinrichtung aber die Möglichkeit eröffnen, zusätzliche komfortablere Steuergeräte anzuschließen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch eine Inkubationseinrichtung gelöst, deren Merkmale im Kennzeichenteil des Patentanspruches 1 angegeben sind.

Die erfindungsgemässe Einrichtung entspricht den gestellten Anforderungen dadurch in hohem Ausmaß, daß die zur Aufnahme der einzelnen Objekte oder Objektchargen vorgesehenen Objektbehälter mit teildurchlässigem Boden und Deckel in zwei oder mehreren Aufnahmeröhren oder -schachten übereinander gestapelt werden, wobei in einem weiteren mit den Aufnahmeröhren kommunizierenden Raum, z.B. ebenfalls einem Schacht, ein mechanisches Element bekannter Art (Schraube, Schnecke, Propeller, Membran, Kolben od.dgl.) einen Flüssigkeitsstrom erzeugt, welcher die Objekte laufend im Kreislauf umspült.

Nach einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung können dabei ver- ' schiedene -Aufnahmeröhre verschiedene Durchmesser aufweisen, so daß Aufnahmebehälter unterschiedlicher Durchmesser und damit innerhalb weiter Grenzen variabler Volumina eingesetzt werden können. Hierbei können jeweils nicht benutzte Aufnahmerohre durch z.B. massive Blindkörper gefüllt werden, welche das Totvolum auf Null reduzieren. In ähnlicher Weise kann. . der Raum in den Aufnahmerohren, welcher nicht durch Objektbehälter besetzt wird, in bekannter Weise durch Verdrängungskörper besetzt werden, welche nur jene Öffnung aufweisen, welche zum Erhalten des gewünschten Flüssigkeitsuxnlaufes erforderlich ist.

yii-oK .·.:- i

Eine vorteilhafte Weiterbildung der Erfindung kann darin bestehen, daß die mechanischen Elemente zum Erzeugen der Flüssigkeitsbewegung so ·. geschaltet und geregelt werden, daß sowohl die Bewegungsrichtung umgekehrt wie die Geschwindigkeit des Flüssigkeitsstromes verändert werden _ _ . .-kann. Hierbei liefert erfahrungsgemäß eine periodische Umkehr der Bewegungsrichtung die besten Resultate. Darüber hinaus können in. Weiterbildung der Erfindung Heiz-» oder Kühlvorrichtungen sowie Temperaturanzeigeelemente die Arbeit bei unterschiedlichen, u. U. vorwählbaren und thermostatisch koastant gehaltenen Temperaturen ermöglichen sowie eine Füllstandsanzeige u. U. als Überfüllsicherung in Wirkverbindung mit einem Füllventil ·/ das Überprüfen des jeweiligen Füllstandes und das Einfüllen dosierter Flüssigkoitsmengen erleichtern sowie ein Schlauchanschluß am Ablaßventil einen Flüssigkeitswechsel ohne Kontakt mit den bereits verwendeten Flüssigkeiten erlauben, welche direkt in einen Abfallbehälter ("Sumpf") abgeleitet werden. Schließlich kann die Verwendung entsprechender Überzüge üher den entscheidenden Funktionselementen bzw. entsprechender Einsatz teile und Dichtungen den Dauereinsatz agressiver Medien wie eine einfache Reinigung des Systemes ermöglichen.

Ein praktisch vollkommener Schutz gegen schädliche Hautkontakte oder Dämpfe kann in einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung letztlich dadurch erreicht werden, daß die Inkubationseinrichtung wie das Füllsystem dadurch komplett gegen die Raumatmosphäre abgeschlossen sind, daß die Flüssigkeiten direkt aus Vorratsbehältern über geeignete Ventile und Schlauchverbindungen in die bis aui die Ablaßöffnung und eine zusätzliche Belüftungsöffnung vollkommen gekapselte Einrichtung laufen. Hierbei können die Flüssigkeiten mit einer Pumpe in bekannter Weise aus der· Inkubations einrichtung nach oben in einen "Sumpfbehälter" abgesaugt werden. Beim Nachfüllen wird das verdrängte Gas über einen an eine Belüftungsöffnung angeschlossenen Schlauch in den Abzug oder auf andere Weise aus dem Raum abgeleitet. Ebenso ermöglicht diese Belüftungsöffnung das Einfüllen hautschädlicher Medien, insbesondere aktivierter Monomeransätze zur Polymerisationseinbettung aus flexiblen Einweg-Plastikflaschen, wobei diese meist viskosen Flüssigkeiten in bekannter Weise durch Zusammenpressen des Behälters über-einen Injektor in das Röhrensystem der Inkubations einrichtung entleert und der Einweg-Plastikbehälter nach der Entleerung verworfen wird. Für die Inkubation bei sehr tiefen Temperaturen unter -20°C, wie sie für das Entwässern gefrorener Proben im Rahmen einer Kryosubstitution erforderlich sind, kann die gesamte Inkubations-

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einrichtung schließlich in den Gasraum eines teilweise gefüllten Dewargefässes eingehängt werden, wobei das aus dem flüssigen Kryogen laufend abdampfende Gas die Kühlung bewirkt.

Weitere Vorteile und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele im Vergleich zu einer bekannten Vorrichtung zum Herstellen der erforderlichen Flüssigkeitskonvektion anhand der beiliegenden Zeichnungen. In den Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Drehscheibe bekannter Art zum Erzeugen einer Flüssigkeitskonvektion während der Inkubation mit einer einfachen Heiz- und Kühleinrichtung zur Inkubation bei reduzierter bzw. erhöhter Temperatur;

Fig. 2 einen Längsschnitt durch eine Inkubationseinrichtung nach der Erfindung mit an derselben Einrichtung gezeigten, jedoch alternativ einsetzbaren Zusatzeinrichtungen im Verein mit einer Kühlung bzw. Heizung durch eine umlaufende Flüssigkeit bzw. ein umlaufendes Gas;

Fig. 2a einen Querschnitt längs der Linie Ha-IIa in Fig. 2; Fig. 2b einen Längsschnitt durch einen Objektbehälter;

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer modifizierten Ausführung der Inkubationseinrichtung mit einer Kühlung bzw. Heizung anderer Art;

Fig. 3a einen Querschnitt längs der Linie Illa'-IIIa in Fig. 3;

Fig. 3b einen zu Fig. 3a analogen Querschnitt mit einem modifizierten Einsatz; .

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Weiterbildung der erfindungsgemässen Inkubationseinrichtung nach den Figuren 2 und-3 mit Entlüftungs- und Füllvorrichtungen, welche einen Hautkontakt wie das Einatmen schädlicher Dämpfe weitgehend ausschalten;

Fig. 4a eine Einwegflasche zur Verwendung bei der Einrichtung gem. Fig. 4, und

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer Anordnung der erfindungsgemässen Inkubationseinrichtung in Verbindung mit einem teilweise mit flüssigem Kryogen gefüllten Dewargefäß zur Entwässerung gefrorener biologischer Objekte bei Temperaturen unter -2o C.

Fig. 1 stellt eine herkömmliche Einrichtung dar, welche durch langsame, bei Bedarf reversierende Drehung der mit den Flüssigkeiten 1 zur Fixation, Entwässerung und Einbettung der Objekte 2 sukzessive gefüllten Behälter 3 auf einer Drehscheibe 4 eine stetige, schonende und reproduzierbare Konvektion der Flüssigkeiten 1 um die ebenfalls langsam bewegten Objekte bewirkt. Die an einem Stativ gelagerte Drehscheibe 4, deren ' Kippwinkel ex' verändert werden kann, wird hierbei durch einen Antriebsmotor 5 mit Untersetzungsgetriebe bewegt. Für eine Inkubation bei reduzierter Temperatur kann die gesamte Einrichtung in einen Kühlschrank, für eine Inkubation bei erhöhter Temperatur in einen Brutschrank gestellt werden. ■ Alternativ besteht die in Fig. 1 dargestellte Möglichkeit, die als Behälter ausgebildete Drehscheibe 4 mit kaltem Wasser

zu füllen, welches durch

Eiswürfel 7 auf die gewünschte und an einem Thermometer 8 ablesbare Apparatur reduziert wurden kann. In ähnlicher Weise kc;n.o dieses Wasserbad 6 durch einen unmittelbar darüber angeordneten Wärmestrahler, beispielsweise eine Bürolampe 9 erwärmt werden, wobei durch die laufende Drehung der Scheibe eine äußerst gleichmäßige Temperaturverteilung im Wasserbad 6 erreicht "wird. Insgesamt ermöglicht dieses einfache System eine sehr schonende und reproduzierbare Konvektion der Flüssigkeiten 1 und damit eine optimale Penetration der Inkubaüonsflüssigkeiten 1 in die Objekte 2.' Der übrige Bedienungsaufwand für den oben beschriebenen Präparationsgang bleibt jedoch unverändert^ wie bei der konventionellen Technik und wird bei der Arbeit im Wasserbad^:6 sogar erheblich erhöht. In diesem Fall müssen nicht nur sämtliche Behälter 3 in den jeweils vorgeschriebenen Zeitabständen entleert und neu gefüllt werden, sondern sie müssen darüber hinaus sorgfältig ·*·· -von Wasser befreit werdenf, da noch anhaftendes Wasser den Prozess der Entwässerung wie der Einbettung empfindlich stören kann. Man hat daher ver-. schiedentlich versucht, die 'bekannte Technik und Arbeitsweise von Einbettungs- ■ automaten für die Bedürfnisse kleinerer Laboratorien, insbesondere aber für ■■ die Inkubation elektronenmikroskopischer. Objekte mit kleinsten Abmessungen bzw. für die Inkubation weniger Objekte für lichtoptische Forschungsarbeiten und Einzeluntersuchungen zu adaptieren. Die Erfolge dieser Bemühungen waren ■ -indes gering, so daß heute.für diese Zwecke, in denen die Anschaffung teurer Einbettungs auto mat en nicht sinnvoll erscheint, außer der in Fig. 1 dargestellten Apparatur kaum mechanische Hilfen zur Verfügung stehen. . "

Die erfindungsgemäße Einrichtung, welche aus den Fign. 2 bis 5 in verschiedenen schematisch dargestellten Varianten und Kombinationen mit technisch bekannten Geräten hervorgeht, vereinfacht demgegenüber mit einem technischen Aufwand, welcher den Aufwand des. Drehtellers nach.Fig. 1 nicht übersteifrt. die Präparation ganz wesentliche

Gemeinsam ist den nachfolgend beschriebenen Ausführungen die Anordnung von Objektbehältern 1o, welche zumindest einen · , ' · teildurchlässigen, beispielsweise durch ein Netz 11 gebildeten. ^₁ Boden aufweisen und stapelbar sind', wobei der Boden des jeweils, oben aufgesetzten nächsten Behälters den Raum des darunter lie-'' genden Behälters verschließt und damit einen Verlust

• ι * *

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von Objekten 2a ausschließt. Hierzu fügt sich der jeweils obere Objektsbehälter 1o mit einem Bund seines unteren Endes in den nächstunteren Objektbehälter ein (vgl. hierzu bereits Fig. 2). Ein Verlust von Objekten aus den jeweils

oben offenen obersten Behältern 1oa kann hierbei in unter- \

f schiedlicher/ technisch bekannter Art/ beispielsweise durch ^; einen aufschraubbaren teildurchlässigen Deckel 11a (s. Fig. 2) oder einen mit Bund 12 versehenen durchlässigen Deckel (Fig. 2b) oder entsprechende Elemente der Inkubationseinrichtung ausgeschaltet werden. Unter Verwendung der Objektbehälter 1o, 1oa wird nach Fig. 2 in einfacher Weise zur Inkubation ein Behälter 13a mit einem austauschbaren Einsatz 13b verwendet, welcher zumindest zwei zylindrische Schächte oder Aufnahmerohre 14a, 14b für die Behälter 1o sowie einen weiteren Schacht 14c zur Aufnahme eines mechanischen Elementes 15 zum Erzeugen einer Strömung der eingefüllten Inkubationsflüssigkeit 16 aufweist. Der Einsatz 13b weist am unteren J Ende einen umlaufenden Rand auf/ so daß hierdurch ein von Flüssigkeit durchströmter Spalt zum Boden des Behälters 13a gebildet wird (s. Fig. 2). Die Schächte oder Rohre 14a, 14b, 14c sind zu dem Spalt hin offen. Fig. 2 zeigt eine Schraube bzw. eine Schnecke 15, welche durch einen Elektromotor 17 über eine Welle 18 gedreht wird. Sowohl der Drehsinn ,.

wie die Drehzahl können hierbei, z.B. durch einen vorge- ;

schalteten Widerstand und Kommutator, -bei Bedarf automatisch . vorwählbar innerhalb bestimmter Zeitabiläufe, geändert werden. Die Drehung des Elementes 15 erzeugt in der dargestellten Weise (Pfeile) einen Umlauf der Flüssigkeit 16 und"damit ;

eine gleichermassen effiziente wie schonende Inkubation ;

der Objekte 2a. Die hierfür erforderliche Flüssigkeits- j

menge kann dadurch praktisch auf das Volum der jeweils j

benützten Aufnahmerohre sowie des weiteren Rohres 14c mit dem mechanischen Element 15 reduziert werden, daß alle nicht . j genutzten Aufnahmerohre 14a, 14b erfindungsgemäß durch

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j —15 —

«Γ

Verdrängungskörper 19 gefüllt werden. Das "Totvolum", d.h. das Volum der nicht unbedingt benötigten Flüssigkeit kann dadurch auf wenige ml. beschränkt werden, daß der Spalt unterhalb des Einsatzes 13$ in mm-Grössenordnung liegt, daß ein Ableitungsrohr 2o fjür die Flüssigkeit einen Durchmesser im mm-Bereich aufweinst und daß man die Flüssigkeit nur bis zur Marke "MIN" der sjkala 21 in den Behälterraum oberhalb des

f
Einsatzes 13b eingießt. Soweit nicht die gesamte Hohe H eines Aufnahmerohres 14>a mit Behältern 1o gefüllt wird, kann der restliche Raum rnijt Blindkörpern 1ob (s. Fig. 3) gefüllt werden, welche nur eine Bohrung desjenigen Durchmessers aufweisen, welcher eben noch| einen hinreichenden Flüssigkeitsstrom gewährleistet. |

If

Weitere erfindungjsgemässe Kennzeichen sind nach Fig. 2 die bereits erwähnte JAblaßöffnung 2o^l)^n<eine obere öffnung des Behälters 13a, weiche im einfachsten Fall dadurch freigegeben wird, daßj man den Deckel 22 mit dem daran montierten Motor 17 einschließlich der Welle 18 und dem Element 15 nach oben abzieht?. Hierbei wird eine Skala 21 sichtbar, welche das reproduzierbare Füllen der Inkubationseinrichtung ermöglicht und zudem die minimale und maximale Höhe des Flüssigkeitsspiegel ("MIN" ... "MAX") angeben kann. Alternativ kann dsas Einfüllen der Flüssigkeit durch eine während des Betriebes verschließbare öffnung 23 im Deckel mittels eines Trifahters 24 oder einer geeigneten anderen Vorrichtung (vgl.? Fig. 3 und 4) ohne Abnahme des Deckels 22 erfolgen. Die Höhe des Flüssigkeitsspiegels kann dabei durch ein Schauglas 25 in der Wand der Behälters 13a, welches eine Skalierung ahalog 21 aufweisen kann oder durch einen. Anzeigestab 26 milt einem Schwimmer 27 (z.B. Styropor® ) mittels der Skala! 21a kontrolliert·werden.■·

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Weitere Ausgestaltungen der Einrichtung können nach Fig. 2 darin bestehen, daß ein gesondertes Steuergerät - !

28 vorgesehen wird, welches neben einem EIN-AUS-Schalter

29 und einer Betriebsanzeige 3o Einstellknöpfe 31 und 32 , zum Variieren der Drehzahl des Motors 17 sowie zum Ein- ^: ; stellen des Zeitintervalls aufweist, nach dem der Motor ; seinen Drehsinn umkehrt und damit die Richtung des i t Flüssigkeitsstromes ändert. ' · .

Das Ablassen der Flüssigkeiten kann in einfachster und ;

vollkommen hinreichender Weise durch einen Schlauch 33 erfolgen, der auf einen Ablaßstutzen 2oa aufgesteckt und mittels einer Schlauchklemme 34 verschlossen ist bzw. geöffnet werden kann. Die Ableitung der benützten Flüssig- β keit kann hierbei ohne jede Gefahr eines Hautkontaktes direkt in einen groß volumigen Vorratsbehälter 35 ("Sumpf") =. . \

erfolgen, der einen einfachen Abtransport schädlicher ^

Reagentien ermöglicht. . j,.

Die erfindungsgemässe Einrichtung kann im Gegensatz zur Drehscheibe nach Fig. 1 in.einfachster Weise mittels eines Durchlaufsystemes 36 durch gekühlte bzw. erwärmte Flüssig- ^: I keiten oder Gase im Umlaufverfahren abgekühlt oder erwärmt werden. Hierzu kann das System 36 beispielsweise \ ·_ an einen handelsüblichen Kälte- und/oder Wärmethermostaten mit Flüssigkeitsumlauf angeschlossen werden. Eine alter- . i native Ausgestaltung der Erfindung besteht nach Fig. 2 ■■

darin, daß die Inkubationseinrichtung einen Temperaturfühler 37 sowie eine Heizpatrone 38 enthält, welche an das Steuergerät 28 angeschlossen sind.und an diesem eine ; Temperaturablesung am Anzeigeinstrument 39 sowie eine '

Variation der Heizleistung mittels eines Drehknopfes 4o ermöglichen. In weiterer Ausgestaltung kann schließlich ' *' in ebenfalls bekannter Weise eine Wirkverbindung zwischen

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den Elementen 37, 39 und einem an das Durchlaufsystem 36 angeschlossenen Thermostaten oder Heiz- bzw. Kühlgerät eine thermostatische Temperaturregelung bewirken.

Vergleicht man die erfindungsgemässe Einrichtung mit dem Drehteller nach Fig. 1, so ergeben sich sofort die entscheidenden technischen Vorteile des Systems nach Fig. 2: Am erfxndungsgemässen System nach Fig. 2 können unabhängig von der Zahl unterschiedlicher Objekte 2a eine Vielzahl gesonderter Behälter Io in einem Arbeitsgang gefüllt und entleert werden, wogegen es die Einrichtung nach Fig. notwendig macht, jedes der Gefässe gesondert zu füllen und zu entleeren. Bei einer vollkommen äquivalenten Konvektion der Flüssigkeit wird das Füllen und Entleeren zudem durch entsprechende Öffnungen und Anzeigen erleichtert. Die kompakte Bauweise sowie die Beschränkung der Bewegung auf die Elemente 15/ 17, 18 bzw. äquivalente bekannte mechanische Elemente (nicht dargestellt) erleichtern zudem den Einsatz in unbehinderter Verbindung mit handelsüblichen Kühl- und Heizvorrichtungen, beispielsweise Kühlschränken und Thermostaten sowie Wasserbädern. Die Ableitung und Entfernung gesundheitsschädlicher Reagentien ist schließlich durch das direkte Abführen der verwendeten Chemikalien in einen Transportbehälter 35 ("Sumpf") ohne jeden weiteren Kontakt der Bedienungsperson mit diesen Substanzen' in einfacher Weise möglich. Gleiches gilt für eine Reinigung der Apparatur nach dem Gebrauch, welche· nach dem Einfüllen eines geeigneten Lösungsmittels weitgehend automatisch erfolgt und nach dem Ablassen der Spülflüssigkeit in den Sumpf 35 beendet ist.

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Alternativen zur Ausführung und Weiterbildung der Er- '■-.,.

findung zeigt Fig. 3. Bei der dargestellten Ausführungs- ^:

form besteht der Behälter 13c aus einem Metall guten

Wärmeleitvermögens, der Einsatz 13d jedoch aus einem

inerten Kunststoff, welcher mit den verwendeten Flüssig- f

keiten 16 weder reagiert,-noch von ihnen angegriffen wird >

und aufgrund seiner Oberflächenbeschaffenheit leicht zu ^;

reinigen ist. Durch die Verwendung einer dünnen Folie

41 als Boden des im wesentlichen vom Kunststoffeinsatz 13d

gebildeten und durch die zwischen den Elementen 13d ^

und 41 liegende Dichtung 42 gegen den Metallmantel

des Behälters 13c abgeschlossenen Inkubationsraumes ' ,'

wird ein guter Wärmeaustausch zwischen der zirkulierenden ■ j.

Inkubationsflüssigkeit 16 und dem Metallmantel gewähr- ί

leistet. Der in Fig. 3 dargestellte Einsatz 13d ermöglicht " - ,·>

durch Aufnahmeröhren 14d und 14e mit unterschiedlichen '

Durchmessern A und B die Aufnahme schmälerer Behälter 1o

sowie breiterer Behälter 1oa für größere Objekte 2b, · I

Bei Bedarf kann der Einsatz 13d gegen einen im Querschnitt

in Fig. 3b dargestellten Einsatz 13e ausgetauscht werden,

welcher bei identischer Anordnung des Rohres 14c für das , !

Element 15 ausschließlich Aufnahmerohre 14e mit dem j."

geringeren Durchmesser B aufweist. Damit kann das Gerät

mit dem Einsatz 13d zur Inkubation grosser und/oder kleinerer

Blöcke, sowie alternativ mit dem Einsatz 13e zur Inkubation · ' einer erheblich grösseren Zahl kleiner Blöcke eingesetzt · ] werden. Die Zahl möglicher Modifikationen kann bei entsprechend | gewählten Abmessungen der Einsätze 13c, 13d beliebig variiert ; und damit jedem spezifischen Bedarf angepasst werden. Neben \ den bereits beschriebenen Verdrängungskörpern 9 können hier-

bei nicht benützte Plätze für Objekthalter Io bzw. Io a ;

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- 19 durch Blindkörper lob besetzt werden.

In weiterer Ausgestaltung der Erfindung kann der Wechsel der Flüssigkeit nach Fig. 3 dadurch vollzogen werden, daß ein Ableitungsrohr 2ob nach oben durch den beispielsweise mit einem Überwurfring 43 befestigten Deckel 22a ausgeführt wird und daß die Flüssigkeit in einen großvolumigen Vorratsbehälter 35a mittels einer Pumpe 4 4 abgesaugt wird, wobei eventuell entstehende schädliche Dämpfe von der Pumpe durch den Schlauch 45 aus dem Arbeitsraum abgeleitet werden.

Einen kompletten Abschluß des Inkubationsraumes gegen die Raumatmosphäre kann man schließlich durch einen zweiten Dichtungsring 46 zwischen dem Einsatz 13d und dem Deckel 22a erreichen. Hierbei sorgt die Be- und Entlüftungsöffnung 47 mit einer Schlauchverbindung 48 dafür, daß sich der abgedichtete Inkubationsraum stets im Druckausgleich mit der Atmosphäre . befindet ohne daß beim Einfüllen neuer . Flüssigkeiten schädliche Dämpfe in die Raumatmosphäre gelangen können. .

Schließlich wird in Weiterbildung der Ausführung nach Fig. 3 durch eine Wirkverbindung zwischen der Füllstandsanzeige 26a, 27a und der Einfüllvorrichtung 24a ein überfüllen der Inkubationseinrichtung dadurch vermieden, daß ein austausch-¹K barer Stopfen 49 die Einfüllöffnung verschließt, sowie der

=; jeweils gewünschte Sollstand bzw. der Maximalstand der

Flüssigkeit erreicht ist. Ein eventuell bereits eingegossener geringer Überschuß kann hierbei durch einen leichten Druck ■:'''. auf den Bolzen 26b noch in den Inkubationsraum eingelassen

werden, wobei sich die Einfüllöffnung danach durch die Auftriebskraft des Schwimmers 27a wieder automatisch schließt.

-2ο-

Die in Fig. 3 dargestellte Anordnung bietet schließlich die . ; einfache Möglichkeit einer Temperaturregelung mittels eines ' · handelsüblichen Laboratoriums-Wasserbades 5o mit einer Regelung 5oa der Wassertemperatur durch einen Thermostaten.

Der Inkubationsbehälter 13c wird auf Füssen 5ob in dieses · i-

Wasserbad eingestellt und gleichmässig vom Wasser um- Γ

spült. . s>

Fig. 4 zeigt eine Weiterbildung der Inkubationseinrichtung . \

nach den Fig. 2 und 3 für die Routinearbeit mit Flüssig- _;

keiten 16 sowie mit viskosen Flüssigkeiten 16a, z.B. aktivier- V

ten Monomeransätzen, welche praktisch jeden Hautkontakt eben- ^

so wie das Einatmen schädlicher Dämpfe ausschließt. ^

si Die komplett abgedichtete Inkubationseinrichtung 13f, z.B.

gemäß Fig. 3,deren Details einfachheitshalber in Fig. 4 f

nicht vollständig dargestellt sind (vgl. hierzu Fig. 2 |-

t. und 3) wird nach dem Beschicken mit den Objektbehältern Io, ΐ

1oa mit dem Deckel 22b durch Anziehen der überwurfmutter ';

43a dicht verschlossen. Von diesem Augenblick an ist jeder ■ das Bedienungspersonal gefährdende Kontakt mit den Inkubations- '. medien 16, 16a unterbunden. Flüssigkeiten 16 mit geringer Viskosität werden aus Vorratsflaschen 51 über Schläuche 52 und Schlauchquetschhähne 53 sowie ein Sammelstück 54 mit ' ^f Vielfachanschluß oder vergleichbare Elemente in den Inkubationsraum gefüllt. Hierbei werden nicht benutzte An- ■, Schlüsse am Sammelstück 54 durch Kappen 55 verschlossen. Die Vermischung von Flüssigkeiten aus den verschiedenen Vorratsflaschen 51 kann durch sehr geringe lichte Durchmesser der Leitungen im Sammelstück sowie durch ein Ablassen eines Vorlaufes in bekannter Weise einfach minimiert werden. [_

Viskose Flüssigkeiten 16a können nach dem Ansetzen in Ein- . | wegflaschen 56 aus flexiblem Plastik mit angeschraubter An- · schlußkanüle 57 abgefüllt, bei tiefer Temperatur gelagert und j vor Benutzung wieder auf Raumtemperatur erwärmt werden,

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Das Abfüllen der Flüssigkeit 16a erfolgt in bekannter Weise (z.B. Durchstechen einer elastischen Membran) durch Ausquetschen des Plastikbehälters 56, der nach dem Entleeren abgezogen und verworfen wird. Wie aus der klinischen Praxis (Vorratsflaschen mit Injektionslösung) bekannt ist, kann eine derartige Membran 58 mehrfach durchstochen werden, bevor ein Austausch notwendig wird/ der ebenfalls problemlos möglich ist. Die verwendeten Flüssigkeiten werden nach öffnen der Schlauchklemme 34a durch den Schlauch 33a in den Vorratsbehälter 35b abgeleitet, der gemeinsam mit dem Inkubator über die Schläuche 48a, 48b entlüftet wird. Die Entlüftung der Vorratsflaschen 51 findet, soweit erforderlich, in bekannter Weise über Röhrchen 59 statt, welche mit geeigneten Adsorbentien 6o gefüllt sind.

Ein Beispiel für einen möglichen Einsatz der erfindungsgemässen Inkubationseinrichtung bei tiefen Temperaturen in Kombination mit einer technisch bekannten Kühlanordnung zeigt Fig. 5. Infolge der geringen Abmessungen kann die erfindungsgemässe Inkubationseinrichtung hierbei zur Entwässerung kryofixierter, gefrorener biologischer Objekte bei Temperaturen im Bereich zwischen -8o und -Io C in genauer Analogie zur Entwässerung chemisch fixierter biologischer Objekte in vorteilhafter WEise in Kombination mit einer Kühlung durch Einbringen des Behälters 13h in den Hals eines teilweise mit flüssigem Kryogen 61 gefüllten Dewargefässes 62 verwendet werden. Hierbei kühlt das laufend aus dem Kryogen 61 abdampfende Gas 63, welches durch den engen Spalt zwischen dem Behälter 13h und dem Hals des Dewargefässes 62 (Pfeile) entweicht, den Behälter bei Verwendung einer isolierenden Zwischenlage 64 hinreichend tief ab, ohne daß die Abdampfrate des Kryogens hierdurch spürbar gesteigert wird. Nach Abschluß der Entwässerung kann die mit den Elementen 37, in bereits beschriebener Weise gemessene Temperatur des

Behälters 13 h durch die Heizpatrone 38 angehoben werden. Die Objekte kön- ι

nen ohne Ortswechsel des Behälters 13h nach Absaugen des Ent wasser ungsniediums in das Einbettungsmedium überführt und mit diesem imprägniert werden. Eine störende Steigerung der Abdampfrate des Kryogens 61 wird hierbei durch einen an der Unterseite des Behälters 13h angeschlossenen ■-

Thermoisolationschild 64 mit reflektierendem Belag verhindert. Der über mehrere Tage bis Wochen laufende Prozess kann in technisch bekannter Weise durch einen an das Steuergerät 28 direkt angeschlossenen Prozessrechner 66 ;

mittels eines Magnetbandes gesteuert werden. Auch die in Fig. 5 unvollständig _;;

dargestellte Inkubationseinrichtung mit dem am Dewardeckel 67 über die Isolation 65'befestigten Behälter 13 h entspricht in ihrem inneren Aufbau wie in. .-.

ihrer Funktion vollständig einer der Auaführungsformen"gemäß den Fig. 2

bis 4- - ■

Die an Hand der Fig. 2 bis 5 beschriebenen konstruktiven Varianten und Ein- *

satzmöglichkeiten zeigen die Einsatzbreite und Anpassungsfähigkeit des er- " . findungsgemäßen Systems an den unterschiedlichen Bedarf von Forschung und. ^....... " Routine. Die Erfindung kann darüber hinaus in zahlreichen nicht dargestellten und/oder beschriebenen Kombinationen und Varianten ver wirklichtwerden. ' . '*

So ist es beispielsweise möglich, den gleichen Effekt einer umkehrbaren und in ihrer Stärke variablen Flüssigkeitsströmung mit anderen als den dargestellten mechanischen Elementen zu bewirken. Es ist unerheblich, in welcher Weise • und aus welchen Teilen die Inkubationseinrichtung zusammengesetzt wird und ' ob beispielsweise der Boden vom Gehäuse getrennt oder in der dargestellten · Weise -einem einzigen Teil 13 a bzw. 13 c, 13 f oder 13h gebildet wird. Form, Durchmesser und Anordnung der Rohrsysteme können in einem mit den Aufnahmebehältern dem jeweiligen Zweck angepaßt und daher in verschiedenster Weise ausgebildet werden, ohne dadurch die kennzeichnenden Eigenschaften der erfindungsgemäßen Einrichtung einzubüßen. Ebenso ist es unerheblich für den Erfindungsgegenstand, welche Materialien in sachgerechter Anpassung an die jeweils verwendeten Objekte und Inkubationsmedien verwendet werden. ..:.....-~ , Hoiz-jKühl- und Absaugvorrichtungen stellen zwar ebenso wie Ventile, Ein- - :

füllvorrichtungen und Anzeigen integrierende· Elemente der Erfindung- dar, . '

können aber in unterschiedlicher Weise realisiert werden. Gleiches gilt für die gesamte elektrische Anlage. _ .'"'..·.·■

BAD ORIG/NAL

In den Ausführungsbeispielen sind die Aufnahmezylinder oder -schächte für die Objektbehälter als zueinander parallele Ausnehmungen des Einsatzes gezeigt. Diese Parallelität ist aber keineswegs zwingend; auch die vertikale Ausrichtung der Aufnahmezylinder ist nicht wesentlich. Vielmehr ist auch eine gegen die Vertikale geneigte Anordnung möglich.

Weiterhin kann der Einsatz, in welchem die Aufnahmezylinder in Form von Schächten ausgebildet sind, auch eine andere Gestaltung aufweisen, z.B. in der Form, daß in einem Gestell die Aufnahmezylinder in Form von separaten Röhren angeordnet sind, deren obere und untere Enden getrennt für sich in einen Überströmraum münden.

Claims

PATENTANWALT Dr. rc:, ι,.,;, ρ 11. ϊ ;■R LCUi.. D^I.-H-ys. CLhIJS »OKIAU Dipl. Inc.. FH AMZ I.O-;REN:7

C. Reichert, Optische Werke AG, - ^Dif>i-^-Wolfgangs-Ga,!

FEROINAND-fviARIA-STR _ü

Wien 813OSTARNBERu

Österreich 19 975/6 2o/h

Ansprüche

Inkubationseinrichtung zur Fixation, Entwässerung und Einbettung biologischer Objekte für mikroskopische, insbesondere elektronenmikroskopische Untersuchungen

.J Inkubationseinrichtung zur Fixation, Entwässerung und Einbettung biologischer Objekte für mikroskopische, insbesondere elektroneninikroskopische Untersuchungen, mit einem Inkubationsraum, in dem mehrere für Flüssigkeit durchlässige Objektbehälter säulenförmig übereinander gehalten sind, der mit einer Vorrichtung zur Erzeugung von Flüssig- _keitsbewegungen in Verbindung steht und der einen Anschluß zum Zuführen und Ablassen an Behandlungsflüssigkeit aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß der Inkubationsraum durch mehrere röhrenförmige Aufnahmezylinder (14a, 14b, 14d, 14e) für die Objektbehälter (1o, 1oa) gebildet ist, deren eines Ende jeweils mit der Saugseite und deren anderes Ende jeweils mit der Druckseite eines den Aufnahmezylindern (14a, 14b, 14d, 14e) benachbarten, ein Umwälzelement (15) enthaltenden Raumes (14c) in Verbindung steht, derart, daß ein Flüssigkeitskreislauf durch den das Umwälzelement (15) enthaltenden Raum (14c) und jeden der Aufnahmezylinder (14a, 14b, 14d, 14e) einstellbar ist.
2. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmezylinder (14a, 14b, 14d, 14e) und der das Umwälzelement (15) enthaltende Raum (14c)

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in einem einheitlichen Körper (13b) ausgebildet sind.
3. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Aufnahmezylinder (14a, 14b, 14d, 14e) und der das Umwälzelement (15) enthaltende Raum (14c) als zueinander parallele hohlzylindrische durchgehende, axial gerichtete Ausnehmungen in einem vorzugsweise zylindrischen Einsatz (13b, 13d, 13e, 13g) eines Behälters (13a, 13c, 13f, 13h) ausgebildet sind· und daß oberhalb und unterhalb des Einsatzes in dem Behälter Überströmräume für die Behandlungsflüssigkeit ausgebildet sind.
4. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Einsatz (13b, 13d, 13e, 13g) austauschbar ist und mehrere Einsätze mit Aufnahmezylindern (14a, 14b, 14d, 14e) verschiedener Durchmesser zur Aufnahme von Objektbehältern (1o, 1oa) unterschiedlicher Grosse zur Verfügung stehen.
5. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zum Auffüllen nicht benutzter Aufnahmezylinder (14a, 14b, 14d, 14e) oder Teilen.davon entsprechend angepasste Verdrängungskörper (1ob, 19) vorgesehen sind.
Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das vorzugsweise reversierbare Umwälzelement (15) eine motorbetriebene Schraube oder Schnecke, eine Membran oder ein Kolben·ist.
7. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwälzgeschwindigkeit der Behandlungsflüssigkeit veränderbar ist..

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8. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß dem Inkubationsraum eine in der Wandung der Aufnahmezylinder bzw. des Behälters (13a) eingebaute oder damit in Kontakt stehende Heiz- und/oder Kühlvorrichtung für die Behandlungsflüssigkeit zugeordnet ist.
9. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Heiz- und/oder Kühlvorrichtung ein elektrisch steuerbares Element (38) ist.
10. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Heiz- und/oder Kühlvorrichtung ein zumindest einen Teil der Wandung des Inkubationsraumes durchsetzendes oder umgebendes Rohrleitungssystem (36) für ein strömendes Medium umfasst.
11. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 1o, dadurch gekennzeichnet, daß ein die Temperatur der Behandlungsflüssigkeit anzeigendes Meßgerät (37, 39) vorgesehen ist.
12. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Temperatur der Behandlungsflüssigkeit einstellbar und thermostatisch regelbar ist.
13. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß zur Einsteuerung eines vorgegebenen Temperaturverlaufes der Behandlungsflüssigkeit in Abhängigkeit von der Zeit die Heiz- und/oder Kühlvorrichtung z.B. durch einen Prozeßrechner (66) steuerbar ist.
14.Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis _;

13, dadurch gekennzeichnet, daß zur Anzeige des Flüssigkeitsstandes im Inkubationsraum eine Skala (21, 21a, 21b), ein Schauglas (25) oder ein Schwimmkörper mit Anzeige (26, 26a, 27, 27a) in dem über dem Einsatz (13b, 13d, 13e, 13g) befindlichen Überströmraum vorgesehen ist.
15. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis

14, dadurch gekennzeichnet, daß der Anschluß (2o, 2oa) zum Ablassen der Behandlungsflüssigkeit durch ein Ablaßventil (34, 34a) verschließbar ist und über eine Schlauchleitung (2ob, 33, 33a) mit einem Sammelbehälter (35, 35a, 35b) verbunden ist.
16. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis

15, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Behälter (13a, : 13c, 13f, 13h) zumindest eine verschließbare Einfüll-

öffnung (24, 24a) vergesehen ist. . .
17. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekenn- izeichnet, daß der Einfüllöffnung ein durch die Flüssigkeitsstandanzeige gesteuertes Füllventil (4 9) zugeordnet ist, das bei Erreichen eines Soll- oder Maximalflüssigkeitsstandes in die Schließstellung steuerbar ist.
18.-Inkubationseinrichtung nach Anspruch 16 oder 17, dadurch » gekennzeichnet, daß die Einfüllöffnung einen Anschluß

für Schlauchleitungen (52) zur Zufuhr unterschiedlicher j

Behandlungsflüssigkeiten aus mehreren Vorratsbehältern [

(51) aufweist, wobei die Schlauchleitungen (52) jeweils ^.

getrennt in die Einfüllöffnung münden oder zu einer einzigen Sammelleitung (54) zusammengefasst mit der

Einfüllöffnung verbunden sind. " ;

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19. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 18/ dadurch gekennzeichnet, daß der Inkubationsraum einen Entlüftungsanschluß (48, 48a) mit einer Absaugleitung (48b) aufweist.
20. Inkubationseinrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß eine Einfüllöffnung mit einer selbstschließenden, z.B. durchstechbaren Membran (58) bedeckt ist und daß insbesondere aggressive Behandlungsflüssigkeit mittels eines flexiblen Vorratsbehälters (56) und durch ein daran vorgesehenes Injektionsröhrchen (57) in den Inkubationsraum injizierbar ist.
21.-Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis

20, dadurch gekennzeichnet, daß die mit der Behandlungsflüssigkeit in Berührung kommenden Flächen aus Materialien

■ gebildet sind, die gegen die Behandlungsflüssigkeit beständig sind.
22. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis

21, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (13a, 13c, 13f, 13h) aus Metall besteht und daß der aus einem Kunststoffblock gebildete Einsatz (13d, 13e, 13g) sich über ein den jeweiligen Überströmraum umgebendes Dichtelement (42, 46) auf einer den Behälterboden abdeckenden Kunststoffolie (41) bzw. am Deckel (22a) des Behälters abstützt.
23. Inkubationseinrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis

22, dadurch gekennzeichnet, daß der Behälter (13h) in ein mit flüssigem Kryogen gefülltes Dewar-Gefäß (62) einpassbar ist, derart, daß das abrauchende Kryogen zumindest den grössten Teil der Behälteraußenwände überstreichen kann.

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