AT512287B1 - Vorrichtung zur Lichtstimulation und Kryokonservierung biologischer Proben - Google Patents

Abstract

In einer Vorrichtung (1) zum schnellen Einfrieren unter Druck einer wasserhaltigen Probe (3), insbesondere eines biologischen Präparats, ist in eine Hochdruckkammer (11), in die eine Probenhalterung (30) mit einer darin gehaltenen Probe (3) eingebracht und druckdicht verschlossen wird, ein Kühlmittel unter hohem Druck zum Ort der darin befindlichen Probenhalterung (30) zuführbar. Zugleich weist die Hochdruckkammer (11) eine Sichtfensterkonstruktion (2) mit einem druckdichten Fenster (20) auf, durch das Licht von außen auf die in der Probenhalterung (30) befindliche Probe (3) gerichtet werden kann. Das Fenster (20) kann ein transparentes Fensterelement aus einem hochdruckfesten Material beinhalten, wobei das Fensterelement (20) von einem in der Hockdruckkammer vorgesehenen druck-und temperaturfesten Fensterlager gehalten wird.

Description

österreichisches Patentamt AT512 287B1 2013-07-15

Beschreibung

VORRICHTUNG ZUR LICHTSTIMULATION UND KRYOKONSERVIERUNG BIOLOGISCHER PROBEN

[0001] Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum schnellen Einfrieren unter Druck einer wasserhaltigen Probe, insbesondere eines biologischen Präparats, nämlich mit einer Hochdruckkammer, in die eine Probenhalterung mit der darin gehaltenen Probe eingebracht und druckdicht verschlossen werden kann, wobei in der Hochdruckkammer ein Kühlmittel zum Ort der darin befindlichen Probenhalterung zuführbar ist. Weiters betrifft die Erfindung ein der Vorrichtung korrespondierendes Verfahren zum Hockdruckgefrieren.

[0002] Eine Hockdruckgefriereinrichtung der genannten Art ist in DE 100 25 512 A1 beschrieben, worin zudem durch einen vorgespannten Pneumatikzylinder ein besonders rascher Druckanstieg erreicht wird.

[0003] Eine von der Anmelderin erzeugte Einrichtung zum Hochdruckgefrieren von biologischen und industriellen Proben wird unter der Bezeichnung „Leica EM HPM100" erfolgreich vertrieben. Mit der „Leica EM HPM100" ist es möglich, eine Probe mit flüssigem Stickstoff unter einem Druck von bis zu 2100 bar innerhalb weniger ms auf eine tiefe Temperatur, insbesondere unterhalb von -ΙΟΟ'Ό, abzukühlen (Kryokonservierung). Die Probe hat hierbei eine Dicke von bis zu 200 pm und wird bei der Kryokonservierung durch den schnellen Abkühlvorgang vitrifiziert, d.h. die Ausbildung von kristallinem Eis wird weitgehend unterbunden, da eine Kristallisation die Mikrostruktur der Probe verfälschen oder sogar zerstören könnte.

[0004] In der „Leica EM HPM100" dient eine Probenkartusche zur Halterung der Probe unter Hochdruckbedingungen während des Gefriervorgangs. Die Probenkartusche besteht aus hochfestem Kunststoff und umfasst drei Komponenten, nämlich zwei Halbzylinder mit einem Kanal, der von Kühlflüssigkeit durchströmbar ist, sowie eine Trägerplatte mit einer Öffnung zur Aufnahme der Probe. Der Druck am Ort der Probe wird durch die Kühlflüssigkeit erzeugt, die hierzu auf einen Druck von 2100 bar gebracht wird.

[0005] Fig. 8 zeigt den prinzipiellen Aufbau des Hochdruckgefriersystems 9, das der „Leica EM HPM100" zugrunde liegt und auch für Gefriersysteme gemäß der Erfindung verwendbar ist. Die Probenkartusche 89 wird in die Hochdruckkammer 90 über eine Ladeeinrichtung 95 eingebracht. Für den Gefriervorgang wird die Hochdruckkammer 90 durch Verriegelung der Ladeeinrichtung 95 mittels Verriegelungsstiften 94 verschlossen. Der Gefriervorgang wird durch die Zufuhr von flüssigem Stickstoff (LN2) unter hohem Druck erreicht, der in den Raum der Kartusche 89 schlagartig eingeleitet wird. Hierzu ist das System 9 mit einer Kühlmittelversorgung 8 ausgestattet. In der Kühlmittelversorgung 8 wird LN2 aus einem Kühlmittelspeicher 81 über eine Kühlmittelpumpe 82 mit nachgeschaltetem Rückschlagventil 83 zu einem Druckluft-betriebenen Druckübersetzer 84 geleitet. Hier wird das verwendete Kühlmittel LN2 auf den Zieldruck von z.B. 2100 bar gebracht. Der Ausgang des Druckübersetzers 84 ist durch eine Zufuhrleitung über ein Hochdruckventil 85 mit der Hochdruckkammer 90 verbunden. Das Hochdruckventil 85 ist dazu eingerichtet, beim Öffnen den unter hohem Druck stehenden LN2 schlagartig dem Inneren der Hochdruckkammer 90 zuzuführen, sodass die in der Kartusche 89 gehaltene Probe in sehr kurzer Zeit hochdruckgefroren wird. Ein Drucksensor 91 und ein Temperatursensor 92 überwachen den Gefriervorgang. Über eine Ausgangsöffnung 93 (Auslass mit Schalldämpfer) kann die Kammer 90 entspannt werden, um die Entnahme der kryokonservierten Probe zu ermöglichen.

[0006] Außerdem kann die Hochdruckkammer eine Zufuhrmöglichkeit einer weiteren Flüssigkeit („Füllflüssigkeit"), z.B. einem Alkohol (insbesondere Ethanol), aufweisen, wobei diese Füllflüssigkeit aus einem Behälter 86 über ein Pump/Dosiersystem 87 mit nachgeschaltetem Rückschlagventil 88 der Hochdruckkammer 90 zugeführt wird. Beispielsweise kann in bestimmten Anwendungen der Alkohol verwendet werden, um die Kammer vor dem Gefriervorgang zu füllen; beim Start des Gefriervorgangs verdrängt LN2 den Alkohol. In vielen Fällen bietet die 1/14 österreichisches Patentamt AT512 287B1 2013-07-15

Verwendung des Alkohols den Vorteil des schnelleren Druckaufbaus bei der Beaufschlagung mit LN2. Der Einsatz der Füllflüssigkeit ist jedoch nicht zwingend, zumal verschiedene Arten von Proben nicht mit Alkohol in Kontakt kommen sollen. Gute Abkühlungsergebnisse können mit der hier gezeigten Apparatur auch ohne die Verwendung einer Füllflüssigkeit wie insbesondere Alkohol erreicht werden.

[0007] Für spezifischer Forschungs- und Entwicklungsbereiche wird das Verhalten einer Probe aufgrund einer Stimulation mit Licht, insbesondere des sichtbaren Bereichs, untersucht, insbesondere indem der durch Photostimulation erreichte Zustand untersucht wird. Derartige Untersuchungen werden beispielsweise an biologischen Objekten wie Pflanzenzellen oder Cyanobakterien durchgeführt. Der photostimulierte Zustand ist jedoch unter normalen Bedingungen (d.h. unter Lebensbedingungen des biologischen Ausgangsmaterials, in der Regel bei Umgebungstemperatur und -druck) kurzlebig, weshalb zusätzliche Maßnahmen erforderlich werden, um den transienten stimulierten Zustand der Probe zu fixieren. Hierfür bietet sich die eingangs beschriebene Kryokonservierung an; ein rasches Gefrieren der Probe unter Hochdruck ist hierbei erwünscht, weil so bei biologischen Proben eine Vitrifizierung ohne Eiskristallbildung erreicht werden kann. Bei den bekannten Hochdruckgefriereinrichtungen ist jedoch eine Bestrahlung der Probe nur außerhalb der Hochdruckkammer möglich, da das Innere der Hochdruckkammer nicht oder völlig unzureichend für Licht zugänglich ist. Da jedoch der Ladevorgang einer Probe in die Hochdruckkammer einige Sekunden dauert und aufgrund apparativer Beschränkungen schwerlich verkürzt werden kann, liegt die Ladedauer ein Probe somit deutlich über der Lebenszeit des zu untersuchenden lichtstimulierten Zustands, weshalb es bei bekannten Vorrichtungen schwierig bis unmöglich ist, die Kryokonservierung ausreichend schnell nach der optischen Stimulation der Probe durchzuführen.

[0008] Unter „Hochdruck" wird hier ein Druckbereich verstanden, der zu einer merklichen Absenkung (d.h. um mehrere °C) des Schmelzpunktes des Wassers führt. Reines Wasser hat gemäß seinem Zustandsdiagramm bei 2045 bar die größtmögliche Absenkung des Schmelzpunktes, der bei diesem Druckwert auf -22°C erniedrigt ist. Allerdings sind Drücke die unter diesem Wert von 2045 bar liegen, in der Regel bereits ausreichend, zumal in biologischen Proben natürlich niemals reines Wasser vorliegt. Bei von den Erfindern durchgeführten Versuchen wurden gute Ergebnisse der Kryokonservierung bereits bei Druckwerten unter 2000 bar erzielt, nämlich bei ca. 1600 bar. Somit liegen die hier betrachteten Druckbereiche bei mehreren 100 bar, vorzugsweise zwischen 1000 und 2200 bar.

[0009] Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, eine Hochdruckgefriervorrichtung zu schaffen, die eine Lichtstimulation der Probe durch einen intensiven Lichtimpuls und unmittelbar darauffolgend eine Kryokonservierung der stimulierten Probe auf einfache Weise ermöglicht. Hierbei soll das Zeitintervall zwischen Stimulation und Gefriervorgang sowie die Bedingungen der Stimulation möglichst weitgehend und reproduzierbar einstellbar sein.

[0010] Diese Aufgabe wird von einer Vorrichtung der eingangs genannten Art gelöst, bei welcher erfindungsgemäß die Hochdruckkammer eine Sichtfensterkonstruktion mit einem druckdichten Fenster aufweist, durch welches Licht von außen zugeführt und auf die in der Probenhalterung befindliche Probe gerichtet werden kann bzw. einstrahlbar ist.

[0011] Die Erfindung beruht auf der Einsicht, dass die gewünschte kurze Zeitdauer zwischen der Photostimulation und dem Gefrieren unter Hochdruckbedingungen dadurch erreicht werden kann, dass die Lichtstimulation an der bereits in die Hochdruckkammer geladenen Probe erfolgt. Dadurch kann der lichtstimulierte Zustand ausreichend rasch konserviert werden, ohne dass unerwünschte Verzögerungen in Kauf genommen werden müssen. Somit macht die Erfindung eine Untersuchung der photostimulierten Probe zugänglich, beispielsweise in einem Kryo-Elektronenmikroskop, wobei vor der eigentlichen Untersuchung gegebenenfalls weitere Präparationsschritte, wie z.B. Dünnschnitt in einem Kryo-Ultramikrotom, eingeschaltet werden können.

[0012] In einer besonders vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist das Fenster mithilfe eines Fensterelements aus einem hochdruckfesten Material ausgeführt, welches zumindest 2/14 österreichisches Patentamt AT512 287B1 2013-07-15 zum Teil (besonders natürlich in den Bereichen, durch die das Licht einfällt) für das von außen der Hochdruckkammer zugeführte Licht transparent ist, wobei das Fensterelement von einem in der Hockdruckkammer vorgesehenen druck- und temperaturfesten Fensterlager gehalten ist.

[0013] Des Weiteren ist es günstig, wenn in der Hochdruckkammer eine Probenhalterung vorgesehen ist, welche aus einem Material gefertigt ist, das für das von außen der Hochdruckkammer zugeführte Licht transparent ist. Dabei kann die Probenhalterung (Probenkartusche) einen Probenträger sowie zumindest einen transparenten Schalenteil aufweisen, wobei der Probenträger eine Öffnung zum Aufnehmen der Probe aufweist. Außerdem hat der zumindest eine Schalenteil einen Kanal für ein Kühlmittel, wobei in der montierten Probehalterung der Probenträger von dem zumindest einen Schalenteil umgeben ist und der Kanal des zumindest einen Schalenteils von einer außenliegenden Mündung zum Bereich der Öffnung des Probenträgers führt. Dies ermöglicht eine Photostimulation der Probe und die darauffolgende Kryokonservierung in derselben Positionierung in der Probenhalterung und erleichtert somit die zuverlässige Konservierung des photostimulierten Zustands. Durch die Unterbringung in der Probenkartusche bleibt die Probe während des gesamten Stimulations-Konservierungs-Vorgangs stabil positioniert; zudem bildet die Probenkarrusche eine „Kammer in der Kammer", die das Kühlmittel gezielt an den Ort der Probe leitet und somit für einen verzögerungsfreien Kühlvorgang sorgt.

[0014] Insbesondere kann durch das druckdichte Fenster Licht direkt aus einer geeigneten Lichtquelle mit der erforderlichen Lichtintensität eingestrahlt werden. Alternativ kann an das Sichtfenster ein Lichtleiter in Form eines Glasfaserkabels von außen zugeführt werden, wobei sein Ende an das Sichtfenster gepresst werden kann. Auf diese Weise kann über den Lichtleiter Licht mit wählbarer Wellenlänge und/oder Intensität und/oder Pulsdauer zur Probe geleitet werden. Zu diesem Zweck kann die Sichtfensterkonstruktion günstigerWeise eine als Lichtgang dienende Öffnung aufweisen, deren Achse zum Ort der Probe fluchtet und in den ein an eine Lichtquelle anschließbarer Lichtleiter an das Fenster heranführbar ist.

[0015] Um eine zeitlich festgelegte Abfolge des Stimulations-Konservierungs-Vorgangs sicherzustellen, ist eine der Vorrichtung zugeordnete Steuerungseinrichtung, die zum Ansteuern einer Lichtquelle des der Probe zuzuführenden Lichts eingerichtet ist, zweckmäßig, wobei an die Steuerungseinrichtung ein Ausgang eines Sensors oder Schaltmittels des Kühlmittelkreises anschließbar ist und die Lichtquelle in einem einstellbaren zeitlichen Abstand zu dem Triggersignal des Sensors ansteuerbar ist.

[0016] Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum schnellen Einfrieren einer wasserhaltigen Probe, insbesondere eines biologischen Präparats, in einer Hochdruckkammer, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: [0017] - Bestrahlen der Probe mit Licht durch ein druckdichtes Fenster der Hochdruckkam mer, [0018] - Beaufschlagen der Probe mit einer kryogenen Flüssigkeit - insbesondere flüssigem

Stickstoff - unter Druck (insbesondere Hochdruckbedingungen), [0019] wobei das Einstrahlen von Licht gemäß einer vorgebbaren zeitlichen Korrelation aufgrund eines Auslösesignals für das Beaufschlagen der Probe mit der kryogenen Flüssigkeit erfolgt.

[0020] Hierbei ist es günstig, wenn die Probe in eine Probenhalterung aufgenommen wird, die (zumindest in jenen Bereichen, durch die Licht hindurchtreten soll) für das bei dem Bestrahlen verwendete Licht transparent ist, die die Probe enthaltende Probenhalterung in die Hochdruckkammer eingesetzt und verriegelt wird. Außerdem kann das Auslösesignal von einem Schaltmittel für das Beaufschlagen der Probe mit der kryogenen Flüssigkeit oder einem diesem Schaltmittel zugeordneten Schaltsignal abgeleitet werden, wobei dann das so abgeleitete Signal als Triggersignal für das Bestrahlen der Probe gegebenenfalls unter Berücksichtigung einer einstellbaren Verzögerungszeit verwendet werden kann.

[0021] Die Erfindung samt weiteren Vorzügen und Weiterbildungen wird im Folgenden anhand 3/14 österreichisches Patentamt AT 512 287 B1 2013-07-15 eines beispielhaften, nicht einschränkenden Ausführungsbeispiels näher erläutert, das in den beigefügten Zeichnungen dargestellt ist. Die Zeichnungen zeigen: [0022] Fig. 1 [0023] Fig. 2 [0024] Fig. 3 [0025] Fig. 4 [0026] Fig. 5 [0027] Fig. 6 [0028] Fig. 7 [0029] Fig. 8 eine perspektivische Ansicht der Hochdruckgefrieranlage gemäß dem Ausführungsbeispiel; eine Schnittansicht der Anlage der Fig. 1 und insbesondere des Sichtfensters darin; einen vergrößerten Ausschnitt der Schnittansicht der Fig. 2; die Probenkartusche in einer perspektivischen Ansicht; die Probenkartusche der Fig. 4 in explodierter Darstellung; die Trägerplatte der Probe im Längsschnitt in einer perspektivischen Ansicht; ein Blockschaltbild der Steuerung der Lichtstimulation; und eine schematische Darstellung des Hochdruckgefriersystems nach dem Stand der Technik.

[0030] Das Ausführungsbeispiel betrifft eine Hochdruckgefrieranlage, die auf dem Aufbau der „Leica EM HPM100" beruht und diese weiterbildet. Der prinzipielle Aufbau des Hochdruckgefriersystems, der anhand der Fig. 8 beschrieben wurde, kommt auch in der Vorrichtung des Ausführungsbeispiels zur Anwendung. Es sei jedoch hervorgehoben, dass die Erfindung weder auf dieses Ausführungsbeispiel noch auf solche Hochdruckgefrieranlagen beschränkt ist, die auf dem genannten Gerät der Leica beruhen, sondern auch andere Realisierungen des Stimu-lations-Konservierungs-Vorgangs gemäß der in den Ansprüchen beschriebenen Erfindungsidee umfasst.

[0031] Fig. 1 zeigt die gesamte Hochdruckgefrieranlage 1 gemäß dem Ausführungsbeispiel in einer perspektivischen Ansicht. Eine Hochdruckkammer 11 weist nach bekannter Art eine Hochdruck-Leitung 12 für ein Kryogen, in diesem Fall flüssigen Stickstoff (LN2), sowie eine Halterung 13 für eine Kartusche (Fig. 2 und 4) auf. Wie bereits von der „Leica EM HPM100" her bekannt, wird die Halterung 13 mit der Probenkartusche in die Kammer 11 eingeschoben und fixiert, wobei mithilfe von (nicht gezeigten) Dichtungen an der Halterung der Innenraum der Kammer dicht verschlossen wird. Die Längsachse der Kammer, längs der die Halterung eingeschoben wird, verläuft horizontal. In Fig. 1 ist auch ein an der Kammer 11 angebrachter Sensor 14 zur Messung der Temperatur im Inneren der Kammer erkennbar; gegenüber des Sensors 14 liegt, in Fig. 1 nicht sichtbar, ein Sensor zur Messung des Druckwertes im Kammerinneren. Außerdem ist mit dem Bezugszeichen 15 die Alkoholzuführung mit Rückschlagventil erkennbar.

[0032] In Fig. 1 sind auch die Gehäuse 27 der Einrichtungen zum Verriegeln beiderseits der Kammer 11 zu erkennen. In den Gehäusen 27 sind die eingangs beschriebenen Verriegelungsbolzen 94 (Fig. 8) sowie diese betätigende Pneumatikzylinder untergebracht, deren Druckluftanschlüsse 28 in Fig. 1 und 2 erkennbar sind. Die Verriegelungsbolzen bzw. Pneumatikzylinder sind mit einem Sensor (in Fig. 2 nicht gezeigt; Element 71b in Fig. 7) übenwacht, dessen Signal zur Bestätigung der erfolgten Verriegelung dient. Dies sorgt dafür, dass ein Gefriervorgang nur bei verriegelter Kammer stattfinden kann. Hierzu kann beispielsweise der Kolben eines der Pneumatikzylinder mit einem Magnet versehen sein, der bei Betätigung des Kolbens einen Reed-Kontakt des Sensors 71b auslöst. Ein solcher Sensor mit Reed-Kontakt kann problemlos an der Außenseite des Gehäuses 27 des Pneumatikzylinders (z.B. in einer Außenrille) an einer geeigneten Stelle angebracht und positioniert werden. In der gezeigten Ausführungsform ist ein fester Zeitablauf konfiguriert, bei dem durch das Bestätigungssignal der erfolgten Verriegelung durch den Sensor 71b der Start des Gefriervorgangs erfolgt, gegebenenfalls nach einer apparativ bedingten und/oder einer zusätzlichen einstellbaren Verzögerungszeit.

[0033] Gemäß der Erfindung (und im Gegensatz zur „Leica EM HPM100") ist die Hochdruckkammer 11 mit einer Sichtfensterkonstruktion 2 ausgestattet, um eine Bestrahlung der in der Kammer 11 eingesetzten Probe an Ort und Stelle mit von außen eingestrahltem Licht, z.B. 4/14 österreichisches Patentamt AT512 287B1 2013-07-15 weißem Licht oder blauem Licht (Maximum bei einer Wellenlänge von 460 nm), zu ermöglichen.

[0034] Die Schnittansichten der Fig. 2 und 3 verdeutlichen die Sichtfensterkonstruktion 2. Die Schnittebene verläuft hierbei vertikal, durch die Mittelachse des Sichtfensters und quer zur Längsachse der Kammer. Die Sichtfensterkonstruktion 2 ist in einer Fensteröffnung 19 der Kammer 11 untergebracht und durch eine Schraubverbindung fixiert. Ein Sichtfenster 20 wird durch einen Einsatz 22 gehalten, der eine rohrartige Grundform mit einer mittigen Öffnung 21 aufweist, die deren Achse mit der Mittelachse des Fensters 20 zusammenfällt. Der Einsatz 22 bildet zusammen mit der Fensteröffnung 19 ein Fensterlager des Fensters 20.

[0035] In die längs der Achse des Einsatzes verlaufende Öffnung 21, die als Lichtgang dient, ist ein Ende eines Lichtleiters 23 aufgenommen, vorzugsweise bis zum Fenster 20 anschlagend. Die Achse des Lichtgangs, die somit die Einstrahlrichtung des Lichtes durch den Lichtleiter 23 festlegt, ist auf die in der Kartusche 30 gehaltenen Probe 3 gerichtet und kann wie in diesem Ausführungsbeispiel gezeigt senkrecht zur Längsachse der Kammer 11.

[0036] Zu dem Einsatz 22 gehört eine Fensterhalterung 24, die an der Außenseite der rohrförmigen Grundform eine Schulter 25 aufweist, und eine mit dieser zusammenwirkende Überwurfschraube 26. Letztere ist in einem Innengewinde der Öffnung der Kammer eingeschraubt und drückt auf die Schulter 25, was für die druckfeste Fixierung des Fensters 20 sorgt.

[0037] Als Sichtfenster 20 kann z.B. eine sogenannte Sichtzelle verwendet werden, wie z.B. die Sichtzelle Sitec 740.01 (Sitec-Sieber Engineering AG, Aschbach, Schweiz) mit einem farblosen Saphir als Fensterelement. Diese Sichtzellen erfüllen die Anforderungen der Erfindung an Dichtheit, Druck- und Temperaturfestigkeit des Sichtfensters, bei einer optischen Weite des Fensters von 6 bis 28 mm.

[0038] Alternativ kann als Sichtfenster auch ein Block aus industriellem transparentem Diamant verwendet werden. Der Diamantblock kann beispielsweise an einer druckdichten Verschraubung angelötet sein; Hartlöten des Diamantmaterials ist unter Vakuum möglich und ergibt eine zuverlässige Verbindung. Diese Einheit aus Verschraubung und Diamantblock kann als Sichtfenster 20 gemäß der Erfindung eingesetzt werden. Anstelle eines transparenten Diamanten kann jegliches hochfestes Material verwendet werden, dass den Anforderungen der Druckfestigkeit und Transparenz in dem verwendeten Lichtbereich genügt, wie insbesondere Diamant, Saphir usw.

[0039] Es sei angemerkt, dass im Gegensatz zum Sichtfenster 20 und dem Lichtgang 21 die übrige Konstruktion der Kammer 11 lichtundurchlässig ist, weil diese aus Bauteilen aus z.B. Stahl bzw. Aluminium besteht und eventuell verwendete Kunststoffteile (wie z.B. Dichtungen) ebenfalls aus lichtundurchlässigem Kunststoff bzw. Gummi gefertigt sind. Dies unterbindet eine unerwünschte Beeinflussung der Probe durch störendes Licht abseits der Photostimulation.

[0040] Fig. 4 zeigt die Probenkartusche 30, die in dem Endstück 16 der Halterung 13 gehalten ist. Fig. 5 zeigt die Kartusche 30 in explodierter Darstellung. Das Endstück 16 besteht z.B. aus Edelstahl; es ist becherartig gestaltet (wobei der Becher parallel zur Längsachse orientiert ist, im Ausführungsbeispiel somit horizontal) und weist an der Seite, die dem Ort des Sichtfensters 20 entspricht, eine Ausnehmung 17 auf. Zu dem Endstück 16 gehören zwei gegenüber liegende Einsatzteile 18 (ebenfalls aus Stahl) mit plankonkaver Form. Die Einsatzteile 18 dienen als Federzungen und erfüllen eine Federwirkung, um die Teile der Probenkartusche zusammenzuhalten. Die Einsatzteile 18 sind aus Gründen des Platzbedarfes für das Sichtfenster seitlich versetzt; in anderen Ausführungsformen können diese Elemente in vertikaler Richtung angebracht sein.

[0041] Die Kartusche 30 besteht aus einem Deckelteil 31 und einem Bodenteil 32. Zwischen den Teilen 31, 32 der Kartusche wird eine Trägerplatte 33 gehalten. Der Deckelteil 31 ist in Fig. 4 nur angedeutet dargestellt, was die Sicht auf die Trägerplatte 33 verbessert. Der Deckelteil 31 und der Bodenteil 32 haben eine im Wesentlichen halbzylindrische Grundform, wobei an der inneren ebenen Fläche des Bodenteils 32 sowie gegebenenfalls auch des Deckelteils 31 entlang der Längsrichtung ein Kanal 34 vorgesehen ist, durch den Kühlmittel zur Probe geleitet 5/14 österreichisches Patentamt AT512 287B1 2013-07-15 werden kann. Auf diese Weise kann LN2 von beiden Seiten zur Probe 3 strömen, was das rasche Abkühlen fördert. In der gezeigten Ausführungsform ist, um die Zufuhr des LN2 zusätzlich zu verbessern, von beiden Stirnflächen her jeweils ein Kanal 34 vorgesehen. Dies ermöglicht dem LN2, durch die Kartusche 30 zu strömen, nämlich im Wesentlichen entlang der Längsachse der Kartusche, entsprechend der Richtung des punktierten Pfeils L in Fig. 5. In der Halterung 13 (innerhalb des Bechers, nahe oder in der „Bodenfläche") ist eine Öffnung vorgesehen, die zu über ein außerhalb der Kammer 11 befindliche Austrittsöffnung 29 führt und somit als Auslass 93 für von dem LN2 verdrängte Gase bzw. Flüssigkeiten (einschließlich einer allfälligen Füllflüssigkeit wie Ethanol) dient. Dieser Austrittsweg zur Öffnung 29 ist so dimensioniert, dass das Durchströmen der Kartusche mit einer bestimmten Menge LN2 (0,25 I) möglich ist, ohne dass dies zu einer Druckminderung innerhalb des zur Kryokonservierung benötigten Zeitraums (etwa 300 bis 500 ms) führt; danach ergibt das Entweichen der Kammerfüllung durch die Austrittsöffnung 29 von selbst ein Entspannen des Drucks in der Kammer 11. Ohne derartige Öffnung für das Austreten verdrängter Fluide könnte bei der raschen LN2-Zufuhr zwar der gewünschte Druck erreicht werden, nicht aber eine rasche Abkühlung.

[0042] In den Teilen 31, 32 der Kartusche können seitliche Kerben 35, die z.B. paarweise gegenüber liegend geformt sind, ausgebildet sein, für ein Blockieren der Kartusche gegenüber Bewegung in Längsrichtung sowie ein Fixieren der Komponenten zueinander.

[0043] Die Komponenten 31,33 der Kartusche 30 sind aus einem transparenten Kunststoff wie z.B. Polycarbonat oder Polystyrol hergestellt. Zumindest der Deckelteil 31 ist aus transparentem Material ausgeführt; aus Gründen der einfacheren Handhabung (und auch der Verwechslungsgefahr) ist es sinnvoll, dass auch der Bodenteil 33 aus transparentem Material besteht. Die Trägerplatte 33 wird z.B. aus PEEK (Polyetheretherketon) hergestellt, was die Bearbeitung erleichtert. Die genannten Materialien weisen einerseits eine hohe Stabilität hinsichtlich Druckfestigkeit und Tieftemperaturverhalten über den zum Einsatz kommenden Druck- und Temperaturbereich auf und sind andererseits ausreichend transparent in dem für die optische Stimulation verwendeten Lichtbereich, in diesem Fall für Wellenlängen > 400 nm. Außerdem ist die Formgebung als Halbzylinder auch hinsichtlich der Optik vorteilhaft, da eine Bündelung des Lichts zur Probe hin stattfinden kann.

[0044] Fig. 6 zeigt die Trägerplatte 33 in einem Längsschnitt längs einer vertikalen Ebene, sodass der Raum zur Aufnahme einer Probe 3 aufgeschnitten dargestellt ist. Die Trägerplatte 33 hat seitlich je eine Kerbe 36, die den Kerben 35 der Deckel- und Bodenteile 31, 32 entspricht, und weist in ihrer Mitte eine kreisförmige Öffnung 37 auf, worin die Probe 3 zwischen zwei Scheibchen 38 aus z.B. Saphir gehalten wird. Der Abstand zwischen den Scheibchen kann durch Abstandsringe 39 eingestellt werden. Die Saphir-Scheibchen 38 dienen auch als Schutz der Probe 3, da der rasche Strom des LN2, der für die Abkühlung benötigt wird, die Probe sonst mitreißen würde. Die Dicke der Saphir-Scheibchen 38 ist z.B. 110 pm bei einem Durchmesser der Öffnung 36 von 6 mm. In einer Variante mit einer Öffnung von 3 mm Durchmesser kann eine geringere Dicke der Scheibchen von 50 pm ausreichend sein. Das Material Saphir wird hierbei bevorzugt, weil es sich durch hohe Stabilität auszeichnet und zudem ein gutes Substrat für Zellkulturen und Bakterien ist. Außerdem hat Saphir den zusätzlichen Vorteil hoher Wärmeleitfähigkeit, was ein rasches Abkühlen der Probe sicherstellt.

[0045] Die gesamte Kartusche 30 ist so dimensioniert, dass innerhalb eines Zeitraums von vorzugsweise 500 ms der geforderte Druck (z.B. 2000 bar = 200 MPa) aufgebaut und gehalten werden kann, wobei in demselben Zeitintervall ein rasches Gefrieren der Probe 3 erreicht wird.

[0046] Fig. 7 zeigt ein Blockschaltbild der Triggersteuerung 7 der Lichtstimulation, die eine zeitliche Kontrolle des Lichtpulses zur Stimulation und des Gefriervorgangs ermöglicht, falls gewünscht über Computer gesteuert. Mithilfe eines Sensors 71, z.B. in Form eines Reed-Kontaktes, wird das Einlassventil für den LN2 überwacht. Der Sensor wird z.B. beim Öffnen des Einlassventils zum Starten des Druckaufbaus und Abkühlvorgangs aktiviert und triggert die Lichtstimulation der Probe. Der eigentliche Druck/Abkühlvorgang beginnt eine bestimmte Zeit später als das Öffnen des Einlassventils; diese Zeitdauer kann vorab bestimmt werden (z.B. 6/14 österreichisches Patentamt AT512 287B1 2013-07-15 durch Messungen über den Temperatursensor anhand einer Oszilloskopüberwachung; hierzu muss der Temperatursensor eine entsprechende Zeitauflösung aufweisen) und beträgt im hier gezeigten Fall z.B. etwa 30 ms. Der Beginn der Lichtstimulation wird unmittelbar durch das Sensorsignal ausgelöst, es ergibt sich somit eine Bestrahlungszeit, die der genannten Zeitdauer, in diesem Fall somit 30 ms, entspricht.

[0047] Durch einen anderen Sensor 71a, der an einer anderen Schaltkomponente des Kühlsystems 8 angebracht ist, kann ein anderer Zeitabstand der Bestrahlung vor dem Gefrieren erzielt werden. In der gezeigten Ausführungsform kann auch die Betätigung der Verriegelungsbolzen 94 (genauer: das Bestätigungssignal der Verriegelung) als Zeitpunkt gewählt werden, was deshalb möglich ist, weil wie oben beschrieben die Verriegelung auch den Start eines Gefriervorgangs auslöst. Mit dem Sensor 71b, der z.B. an einem der Pneumatikzylinder 28 der Betätigung der Verriegelungsbolzen angebracht ist, ergibt sich z.B. eine Verzögerungszeit von ca. 500 ms. In dem Blockschaltbild sind die Sensoren 71, 71a, 71b als Beispiel für eine beliebige Anzahl von an schließbaren Sensoren gezeigt. Anstelle eines Sensorsignals kann natürlich auch das Schaltsignal eines elektrisch angesteuerten Ventils als Eingangssignal zum Ansteuern der Triggersteuerung 7 verwendet werden.

[0048] Der Sensor 71 ist zusammen mit gegebenenfalls weiteren Sensoren über einen Anschlussverteiler 72, der der Auswahl eines der angeschlossenen Sensoren dient, mit einem Triggereingang der programmierbaren LED-Lichtquelle 73 verbunden. Die Lichtquelle 73 strahlt, wie bereits beschrieben über einen Glasfaser-Lichtleiter, einen Lichtpuls aus, sobald das Triggersignal aktiviert wird. Hierbei kann über eine Steuerschnittstelle, die in diesem Fall z.B. ein serieller RS232-Anschluss bekannter Art ist, mittels eines Computers 74 in der programmierbaren Lichtquelle 73 eine Verzögerungszeit sowie die Dauer des Lichtpulses beliebig eingestellt werden. Die Verzögerungszeit dient dazu, die Zeitdauer zwischen der Aktivierung des Sensors und dem Beginn des Druck/Abkühlvorgangs zu verkürzen, d.h. auf einen beliebigen gewünschten Wert kleiner als 30 bzw. 500 ms.

[0049] Die Lichtquelle 73 kann vorzugsweise in Form einer LED mit hoher Lichtintensität oder Halbleiterlasers ausgeführt sein. Beispielsweise kann die Lichtquelle eine LED-Lichtquelle des Typs LZ1 (z.B. LZ1 00B200 für blaues Licht, 460 nm Wellenlänge) der LED Engin, Inc. (San Jose, CA, USA) sein. Eine geeignete programmierbare Lichtquelle ist beispielsweise die „Schott LLS" der Schott AG (Mainz, Deutschland). Eine Lichtquelle dieses Typs bietet Pulse mit einstellbarer Pulsrate und Pulsweite, hoher Lichtintensität (bis zu 275 Im) und verschiedenen Wellenlängen, ist mit allen gängigen Lichtfasertypen kompatibel und verfügt über Schnittstellen, die eine Programmierung und Steuerung über Computer ermöglicht. Die genannten Lichtquellen können für verschiedene Lichtsorten ausgewählt und eingesetzt werden - im Ausführungsbeispiel blau, daneben auch rot, dunkelrot (d.h. langwelliges rot), orange (kurzwelliges rot), gelb, grün, kurzwelliges blau, weiß, IR, UV usw.; in Abhängigkeit von dem eingesetzten Licht ist gegebenenfalls das transparente Material der Kartusche 30 geeignet anzupassen.

[0050] Der gesamte Ablauf des Präparierens einer Probe, bei dem das erfindungsgemäße Gefrieren unter Hochdruckbedingungen zum Einsatz kommt, ist somit in einem typischen Beispiel des Ausführungsbeispiels: [0051] - Positionieren der Probe in der Trägerplatte und Zusammenbau der Kartusche; [0052] - Laden der Kartusche in die Halterung; [0053] - Einführen der Halterung samt Kartusche in die Hockdruckkammer und Verriegeln der

Halterung; [0054] - Durchführen des Kryokonservierung nach Licht-Stimulation; [0055] - Entspannen des Drucks (über eine Austrittsöffnung wie oben beschrieben oder durch Öffnen eines Auslassventils); [0056] - Entnahme der Kartusche und weitere Präparation der Probe (in der Kartusche oder aus dieser entnommen). 7/14 österreichisches Patentamt AT512 287B1 2013-07-15 [0057] Die einzelnen Schritte können bei anderen Ausführungsformen je nach der gewählten

Anwendung variieren.

[0058] Die eigentliche Kryokonservierung nach Licht-Stimulation umfasst dabei die Schritte der Licht-Stimulation der Probe durch das Sichtfenster und anschließend des Hochdruckkonservierens der Probe durch Auslösen des Einströmens von Kühlmittel (LN2) in die Kammer (z.B. durch Öffnen des Einlassventils). Diese beiden Vorgänge werden zueinander gemäß einer vorbestimmbaren zeitlichen Korrelation ausgelöst.

[0059] Bei der zeitlichen Synchronisation dieser beiden Ereignisse einschließlich einer vorbestimmbaren Zeitverzögerung können die spezifischen apparativen Details der verwendeten Hockdruckgefrieranlage ausgenutzt werden. Beispielsweise kann in dem beschriebenen Ausführungsbeispiel ausgenutzt werden, dass - wie bereits erwähnt - zwischen der Betätigung des Kühlmittelsystems 8, z.B. dem Öffnen des Einlassventils 85, und dem Eintreten des Gefriervorgangs eine Verzögerungszeit besteht, die eine feste Zeitdauer hat und im Allgemeinen genügend Zeit für die Licht-Stimulation bietet. Daher wird die Licht-Stimulation durch die genannte Betätigung der Kühlmittelversorgung 8 ausgelöst. Dies ermöglicht eine Aufeinanderfolge der beiden Ereignisse innerhalb eines sehr kurzen Zeitintervalls von weniger als 500 ms.

[0060] Selbstverständlich ist eine Vielzahl von Abänderungen und Weiterbildungen der gezeigten Erfindung möglich, ohne dass der Bereich der Erfindung verlassen wird, die nicht auf das gezeigte Ausführungsbeispiel beschränkt ist, sondern durch die Ansprüche bestimmt ist. Beispielsweise kann als kryogene Flüssigkeit anstelle LN2 ebenso jegliches anderes bekanntes Kryogen verwendet werden, das für die jeweilige Anwendung geeignet ist. Die Lichtstimulation kann durch Bestrahlung mit jeglicher Art von gewünschtem Licht erfolgen, monochrom oder mit gewünschten Lichtspektren, wobei nicht nur der sichtbare Bereich, sondern je nach Bedarf auch IR- und/oder UV-Licht in Frage kommen kann. Auch kann die Einstrahlung des Stimulationslichtes von der Lichtquelle direkt (d.h. ohne Verwendung eines Lichtleiters) erfolgen, indem die Lichtquelle unmittelbar an der Öffnung des Fenstereinsatzes positioniert wird. 8/14

Claims (9)

1. österreichisches Patentamt AT512 287 B1 2013-07-15 Patentansprüche 1. Vorrichtung (1) zum schnellen Einfrieren unter Druck einer wasserhaltigen Probe (3), insbesondere eines biologischen Präparats, mit einer Hochdruckkammer (11), in die eine Probenhalterung (30) mit einer darin gehaltenen Probe (3) einbringbar und druckdicht verschließbar ist, wobei in der Hochdruckkammer (11) ein Kühlmittel zum Ort der darin befindlichen Probenhalterung (30) zuführbar ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Hochdruckkammer (11) eine Sichtfensterkonstruktion (2) mit einem druckdichten Fenster (20) aufweist, durch welches von außen zugeführtes Licht auf die in der Probenhalterung (30) befindliche Probe (3) gerichtet werden kann.
2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Fenster (20) mithilfe eines Fensterelements aus einem hochdruckfesten Material, welches für das von außen der Hochdruckkammer zugeführte Licht transparent ist, ausgeführt ist, wobei das Fensterelement (20) von einem in der Hockdruckkammer vorgesehenen druck- und temperaturfesten Fensterlager (22) gehalten ist.
3. 3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass in der Hochdruckkammer eine Probenhalterung (30) vorgesehen ist, welche zumindest zum Teil aus einem Material gefertigt ist, das für das von außen der Hochdruckkammer zugeführte Licht transparent ist.
4. 4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenhalterung (30) einen Probenträger (33) sowie zumindest einen transparenten Schalenteil (31, 32) aufweist, wobei der Probenträger (33) eine Öffnung (37) zum Aufnehmen der Probe (3) und der zumindest eine Schalenteil (31, 32) einen Kanal für ein Kühlmittel aufweist, wobei in der montierten Probehalterung (30) der Probenträger (33) von dem zumindest einen Schalenteil (31, 32) umgeben ist, wobei der Kanal des zumindest einen Schalenteils von einer außenliegenden Mündung zum Bereich der Öffnung des Probenträgers führt.
5. 5. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sichtfensterkonstruktion (2) einen Lichtgang aufweist, dessen Achse zum Ort der Probe (3) fluchtet und in den ein an eine Lichtquelle (73) anschließbarer Lichtleiter (23) an das Fenster (20) heranführbar ist.
6. 6. Vorrichtung nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine ihr zugeordnete Steuerungseinrichtung, die zum Ansteuern einer Lichtquelle (73) des der Probe zuzuführenden Lichts eingerichtet ist, wobei an die Steuerungseinrichtung ein Ausgang eines Sensors oder Schaltmittels (71, 71a) eines Kühlmittelkreises, der Kühlmittel in die Kammer speist, anschließbar ist und die Lichtquelle in einem einstellbaren zeitlichen Abstand zu dem Triggersignal des Sensors ansteuerbar ist.
7. 7. Verfahren zum schnellen Einfrieren einer wasserhaltigen Probe (3), insbesondere eines biologischen Präparats, in einer Hochdruckkammer (11) mit den Schritten: - Bestrahlen der Probe (3) mit Licht durch ein druckdichtes Fenster der Hochdruckkammer (11), - Beaufschlagen der Probe (3) mit einer kryogenen Flüssigkeit unter Druck, wobei das Einstrahlen von Licht gemäß einer vorgebbaren zeitlichen Korrelation aufgrund eines Auslösesignals für das Beaufschlagen der Probe mit der kryogenen Flüssigkeit erfolgt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, bei welchem zuvor die Probe (3) in eine Probenhalterung (30), die zumindest zum Teil für das bei dem Bestrahlen verwendete Licht transparent ist, aufgenommen wird, und die die Probe enthaltende Probenhalterung (30) in die Hochdruckkammer eingesetzt und verriegelt wird. 9/14 österreichisches Patentamt AT 512 287 B1 2013-07-15
9. 9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei welchem das Auslösesignal von einem Schaltmittel (85, 17, 17a, 17b) für das Beaufschlagen der Probe mit der kryogenen Flüssigkeit oder einem diesem Schaltmittel zugeordneten Schaltsignal abgeleitet wird, und das Auslösesignal als Triggersignal für das Bestrahlen der Probe gegebenenfalls unter Berücksichtigung einer einstellbaren Verzögerungszeit verwendet wird. Hierzu 4 Blatt Zeichnungen 10/14