DE10025512A1

DE10025512A1 - Hochdruckeinfriereinrichtung

Info

Publication number: DE10025512A1
Application number: DE10025512A
Authority: DE
Inventors: Daniel Studer
Original assignee: Leica Mikrosysteme GmbH
Current assignee: Leica Mikrosysteme GmbH
Priority date: 1999-07-06
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2001-01-11
Also published as: JP2001050876A; US6269649B1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf eine Hochdruckeinfriereinrichtung, bei der der Druckaufbau durch einen vorgespannten Pneumatikzylinder (1) erfolgt. Dadurch wird ein besonders rascher Druckanstieg in dem Probenbehälter (4) erreicht.

Description

Die Erfindung betrifft eine Hochdruckeinfriereinrichtung gemäss dem Oberbegriff des Anspruches 1. Unter Hochdruckeinfriereinrichtung im Sinne der Erfindung versteht man eine Gefrieranlage für das schnelle Einfrieren (Vitrifizieren) wasserhaltiger Proben unter hohem Druck.

Die DE-PS-18 06 741 und die EP-A-853238 geben Auskunft über die physikalischen Grundlagen eines solchen Einfrierverfahrens.

Die Fachwelt verwendet z. B. eine solche bekannte Einrichtung der Anmelderin, die unter dem Namen "Leica EM HPF" erfolgreich vertrieben wird und in der Druckschrift "LEICA EM HPF, High Pressure Freezer, 1.K.-LEICA EM HPF-E-6/94, Juni 1994" dargestellt ist.

Die "Leica EM HPF" erlaubt es, herkömmliche Proben unter einem Druck von etwa 2000 bar mit einer Abkühlungsrate von 10³-10⁵ K/s zu vitrivizieren. Die entscheidende Abkühlungsphase von Raumtemperatur auf -100°C dauert bei diesem bekannten Gerät an der Oberfläche der Probe (Abkühlrate 10⁴ K/s) etwa 10 ms. Die ganzen Proben mit einer Dicke von ca. 200 µm werden somit in etwa 50 ms auf -100°C abgekühlt.

Aus der bekannten Technik des Abkühlens und der physikalischen Abläufe wird grundsätzlich klar: Die Applikation einer unendlich hohen Abkühlrate an die Oberfläche einer biologischen Probe bestimmt die Abkühlgeschwindigkeit in deren Mitte nur bedingt. Eine z. B. 200 µm dicke Probe weist im Zentrum eine Abkühlrate von ca. 6000 K/s auf, unabhängig davon, ob an der Oberfläche mit unendlicher Abkühlrate gekühlt würde oder mit einer Abkühlrate von etwa 10.000 K/s. Die Abkühlrate wird nicht durch den Druck bestimmt. Durch die Anhebung des Drucks ist eine kleinere Abkühlrate zur Vitrifizierung hinreichend. Es ist somit so, dass die Abkühlrate zur Vitrifizierung biologischer Proben unter Normaldruck etwa 10⁵-10⁶ K/s, unter 2000 bar beträgt die Abkühlrate jedoch nur 10³-10⁴ K/s; d. h. mit hundert mal geringeren Abkühlraten können unter hohem Druck biologische Proben immer noch vitrifiziert werden.

Der Erfinder wies in dem im Internet unter der Adresse "www- mem.unibe.ch/~danis/abstract HPF" veröffentlichten Artikel "A NEW CONCEPT AND MACHINE FOR HIGH PRESSURE FREEZING" vom 15.3.1999 auf diesen und andere Aspekte des Hochdruckeinfrierens hin. Er schlug vor, den Druckanstieg von 1 bar auf 2000 bar innert 10 ms durchzuführen und sich dabei eines Pressluftzylinders - anstelle der bekannten sehr voluminösen und schweren Einrichtungen - zu bedienen.

Druckluftzylinder sind grundsätzlich für verschiedenste Anwendungen schon bekannt. Um damit schnell grosse Drücke aufbauen zu können, sind jedoch gerade wieder grosse und schwere Pumpen erforderlich.

Der Erfindung liegt somit als erstes Problem die Aufgabe nach der Errichtung einer Hochdruckeinfriereinrichtung vor, die leichter als bisher bekannte Einrichtungen ist und trotzdem einen schnelleren Druckaufbau erlaubt.

Die Kombination der Merkmale des Anspruches 1 löst die Hauptaufgabe einer nach Baugrössenreduktion und dennoch beschleunigtem Druckaufbau.

Verbesserte Lösungen mit weitergehender Integration und weitergehenden Vorteilen gegenüber dem Stand der Technik ergeben sich aus den abhän gigen Ansprüchen 2-4.

Der Erfindung liegt jedoch noch eine weitere Problemstellung zugrunde: Es ist die einfache Einstellung des Druckes im Bereich von ca. 1500-2000 bar anzustreben. Dies deshalb, da aus der Fachliteratur bekannt ist, dass biologische Proben, die Drücken von mehr als 1600 bar ausgesetzt waren, irreversible Schäden aufweisen können. Erfindungsgemäss ist durch die blosse pneumatische Druckvariation am vorgespannten Pneumatikzylinder möglich; d. h., dass man durch eingangsseitige Änderung des pneumatischen Druckes am Pneumatikzylinder während der Vorspannphase ausgangs- bzw. abtriebsseitig eine unterschiedliche Antriebsleistung erzielen kann, die dann einen unterschiedlichen bzw. regelbaren Druckaufbau im Hochdruckzylinder bewirkt.

Weiters kann, da Druckaufbau und Abkühlung voneinander erfindungsgemäss getrennt sind, die Probe durch Kühlen mit flüssigem Stickstoff auf bis zu - 196°C gekühlt werden. Insbesondere in Randbereichen von ca. 200 µm bleibt mit dem erfindungsgemässen Vorgehen die Zellstruktur unbeschädigt erhalten, was bei der Wahl der Probendimensionen problemlos berücksichtigt werden kann.

Beim Vitrifizieren sind natürlich sehr tiefe Abkühltemperaturen z. B. durch die Verwendung von flüssigem und unterkühlten Stickstoff vorteilhaft, sofern der Stickstoff - wie im Stand der Technik vereinzelt schon angegeben - selbst nicht auch diesen hohen Drücken ausgesetzt wird. Würde nämlich der unterkühlte Stickstoff selbst als Druckträger verwendet, würde dies bei den hohen Drücken eine potentielle Gefahrenquelle darstellen und eine Temperatur von -196°C kann nicht erreicht werden, da unter mehr als 1500 bar Druck der Stickstoff bei -196°C bereits fest ist.

Die abhängigen Ansprüche 5 bis 10 betreffen dabei Verbesserungen, die auch unabhängig mit Vorteil bei anderen bekannten oder noch neu zu entwickelnden Hochdruckeinfriereinrichtungen eingesetzt werden können. Dabei geht es insbesondere um eine neuartige, verbesserte Haltevorrichtung für einen Probenbehälter gemäss der EP-A-853238 des Erfinders. Der bekannte Probenbehälter soll durch eine neue Haltevorrichtung einfacher gehandhabt werden können und ein schnelles Wechseln von Probenbehältern bzw. Proben erlauben. Dies soll insbesondere den Durchsatz von Proben durch eine Vitrifizieranlage beschleunigen und so eine bessere wirtschaftliche Ausnützung erlauben.

Weitere Verbesserungen und erfindungsgemässe Details ergeben sich aus der Zeichnung, die ein erfindungsgemässes symbolisches Ausführungs beispiel darstellt.

Es zeigen dabei:

Fig. 1 eine Ansicht auf eine Symbolzeichnung einer kompletten, erfindungsgemässen Hochdruckeinfriereinrichtung;

Fig. 2 ein Diagramm eines Hochdruckeinfrierablaufes bei einer erfindungsgemässen Einrichtung mit;

Fig. 3 eine neuartige Spannzangenhalterung für einen Probenbehälter in Schrägansicht;

Fig. 4 einen Schnitt durch den Spannzangenhalter nach Fig. 3 und

Fig. 5 einen Halter für den Spannzangenhalter nach Fig. 3 in Ansicht, Draufsicht und linker und rechter Seitenansicht;

Fig. 1 zeigt symbolisch den neuen erfindungsgemässen Aufbau.

Das Besondere an dem dargestellten Pneumatikzylinder 1 ist es, dass sein Kolben mittels Sperre 3 arretiert werden kann. Die Sperre 3 wirkt dabei im arretierten Zustand mit einem Gegenlager 11 zusammen. Dieser neue Aufbau ermöglicht eine Vorspannung des Pneumatikzylinders 1, indem er voll mit Druck beaufschlagt arretiert gehalten wird. Nach dem möglichst schlagartigen Lösen der Sperre 3 beschleunigt der Kolben 12 des Pneumatikzylinders explosionsartig, um einen Hochdruckkolben 13 eines Hochdruckzylinders 2 zu beaufschlagen.

Der Hochdruckzylinder 2 beinhaltet eine spezielle Druckflüssigkeit 34 zum Aufbau eines Druckes von über 2000 bar. Die Druckflüssigkeit 34 wird bei geringen Temperaturen nicht fest. Sie wird unter Druck auf die Probe 33 gepresst, die in einem Probenbehälter 4 gehalten ist. Ein praktisches Beispiel einer solchen Flüssigkeit ist Methylcyclohexan, wie z. B. in der EP-A-853238 vorgeschlagen.

Ein Nachfüllbehälter 5 erlaubt das Nachfüllen mit Druckflüssigkeit. Ein Manometer 6 dient zur Messung des Druckes. Eine Abkühlung des Probenbehälters 4 erfolgt von aussen, indem das Kühlmedium 15 von einem zweiten Pneumatikzylinder 7 unter Druck über einen Kolben 9 durch Düsen 8 auf den Probenbehälter 4 sprühgeschleudert wird. Die dabei bewirkte Abkühlung soll erfindungsgemäss hochgenau getaktet sein mit dem Druckaufbau im Probenbehälter 4. Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel ist diese Taktung durch einen Steuerzylinder 10 bewerkstelligt, der die zeitliche Aufeinanderfolge des Druckaufbaus und der Sprüh-Abühlung steuert.

Erfindungsgemäss wird zuerst schlagartig die Sperre 3 gelöst und nach einem - vorzugsweise mechanisch - einstellbaren Zeitintervall (etwa 5 ms) werden die Düsen 8 mittels Ringventilschieber 14 geöffnet und zeitgleich das Kühlmedium 15 vom Kolben 9, angetrieben durch den zweiten Pneumatikzylinder 7, druckbeaufschlagt. Bevorzugt ist der Ringventilschieber 14 dabei so ausgebildet, dass der Bereich der Düsen 8 permanent gekühlt ist, um eine Erwärmung des Kühlmediums 15 vor dem Auspressen durch die Düsen 8 möglichst zu vermeiden. Als Kühlmedium 15 wird in der Regel flüssiger Stickstoff angewendet, jedoch ist der Aufbau nicht darauf eingeschränkt. Andere Kühlmedien können ebenso zum Einsatz gelangen.

In Fig. 2 sieht man einen Druckanstieg, wie er bevorzugt für bestimmte Proben verlangt - und erstmalig durch die erfindungsgemässe Einrichtung auch erreicht wird.

Fig. 3 zeigt eine neue Spannzange 16, die den Probenbehälter 4 aufnimmt und während des Hochdruckeinfrierens hält. Um den Druck aufzubauen, ist der Probenbehälter 4 rohrförmig aufgebaut. In der Zeichnung ist das Rohr praktisch nicht durchgehend dargestellt, da es sehr dünn ist. An der mit 4 gekennzeichneten Stelle sieht man den Aussendurchmesser des Rohres, in dessen Inneren die Probe 33 liegt. Das eine Rohrende 17 (Fig. 3) wird mit dem Hochdruckanschluss des Hochdruckzylinders 2 (Fig. 1) über einen konischen Metall/Metall-Anschluss verbunden.

Das andere Ende des Rohres wird durch einen Kegelzapfen 18 (Fig. 4) druckdicht verschlossen. Zwischen den beiden Anschlüssen ist das Rohr des Probenbehälters 4 somit unter Spannung gehalten. Eine Feder 19 im Inneren der Spannzange 16 drückt den Kegelzapfen 18 auf den Probenbehälter 4. Der Probenbehälter 4 verfügt über einen Vorsprung 20, an dem er im gehaltenen Zustand von einer federnden Zange 21 - wie gezeigt - gehalten wird. Beim Lösen der Spannzange 16 öffnet die federnde Zange 21 und der Probenbehälter 4 fällt heraus. Zu diesem Zweck wird ein Druckknopf 22 relativ zum Gehäuse 23 der Spannzange 16 und gegen die Kraft der Feder 19 nach vor geschoben. Dies führt auch zu einer Relativverschiebung des Kegelzapfens 18, der an einer Zapfenstange 24 ausgebildet ist.

Praktisch erfolgt dieser Lösevorgang nach dem Vitrifizieren der Probe 33. Während des Vorganges ist die Spannzange in einem Halter 25 gemäss Fig. 5 in etwa waagrechter Position gehalten war. Der Halter 25 verfügt über ein Bett 26, das die Spannzange 16 aufnimmt. Die Wandung des Halters 25 ist durch zwei Führungsschlitze 27 durchbrochen, in denen eine Lagerachse 28 der Spannzange 16 zu liegen kommt. Die Lagerachse 28 ist mit der Zapfenstange 24 starr verbunden und in einem Längsschlitz 29 (im Gehäuse 23 der Spannzange 16 verschieblich gelagert. Die Zapfenstange 24 kann somit an der Lagerachse 28 relativ zum Gehäuse 23 nach hinten gezogen werden, um die andere Öffnung des Rohres des Probenbehälters 4 freizugeben, was durch den Druckknopf 22 bewirkt werden kann.

Durch diese Erfindung ist es somit einem Bedienpersonal möglich, den Probenbehälter aus der Spannzange 16 durch einen einzigen Handgriff bzw. Druckknopfdruck freizugeben. Dies wird durch folgenden erfindungsgemässen Aufbau und Effekt noch erleichtert.

Nach Freigabe des einen Rohrendes 17 durch den Hochdruckanschluss des Hochdruckzylinders 2 kippt die Spannzange 16 um die Lagerachse 28 nach unten, da der Halter 25 im Lagerbereich 30 keinen Boden und damit keine Stütze für die Spannzange 16 aufweist. Nach dem nach unten Schwenken drückt die Bedienperson einfach auf den Druckknopf 22 und befreit dadurch den Probenbehälter 4. Dies ist besonders vorteilhaft, da erfindungsgemäss unter dem Halter ein Behälter mit flüssigem Kühlmedium steht, so dass nach dem Vitrifizieren innert Sekunden der Probenbehälter 4 vollständig in Kühlmedium getaucht bzw. gelegt werden kann, um auf Kühltemperatur zu verbleiben.

Gemäss einer besonderen Ausgestaltung sind alle Teile im Bereich des Probenbehälters 4 und dieser selbst auch elektrisch leitend ausgebildet, so dass über eine Durchgangsmessung zwischen dem Hochdruckanschluss des Hochdruckzylinders 2 und dem Halter 25 gemessen werden kann, ob das Rohr (Probenbehälter 4) ordnungsgemäss zwischen seinen beiden Enden eingespannt ist. Dieser Kontakt bzw. die elektrische Leitung wird über einen Anschluss 31 am Halter 25 abgegriffen. An Schraubbohrungen 32 wird der Halter im Gerät gehalten, wie nicht näher dargestellt ist.

Bezugszeichenliste

1

Pneumatikzylinder

2

Hochdruckzylinder

3

Sperrvorrichtung

4

Probenbehälter

5

Nachfüllbehälter

6

Manometer

7

Weiterer Pneumatikzylinder

8

Düsen

9

Kolben

10

Steuerzylinder

11

Gegenlager

12

Kolben

13

Hochdruckkolben

14

Ringventilschieber

15

Kühlmedium

16

Spannzange

17

Rohrende

18

Kegelzapfen

19

Feder

20

Vorsprung

21

Zange

22

Druckknopf

23

Gehäuse

24

Zapfenstange

25

Halter

26

Bett

27

Führungsschlitze

28

Lagerachse

29

Längsschlitz

30

Lagerbereich

31

Anschluss

32

Schraubbohrungen

33

Probe

34

Druckflüssigkeit

Claims

1. Hochdruckeinfriereinrichtung zur Erzielung eines feinkristallinen oder amorphen Zustandes beim schnellen Einfrieren wasserhaltiger Substanzen, insbesondere von biologischen Proben (33), mit einer Druckaufbauvorrichtung mit einer Druckflüssigkeit für die Probe (33) und einer Kühlvorrichtung (7, 9, 14, 8), wobei die Druckaufbauvorrichtung einen Antriebszylinder - insbesondere einen Pneumatikzylinder (1) - und einen Hochdruckzylinder (2) umfasst, der vom Pneumatikzylinder (1) antreibbar ist und im Hochdruckbetrieb die Probe (33) mit der Druckflüssigkeit druckbeaufschlagt dadurch gekennzeichnet, dass die Druckaufbauvorrichtung eine Vorspannvorrichtung (3, 11) mit einer mechanisch betätigbaren Sperre (3) umfasst, deren getriggertes Öffnen eine besonders schnelle Expansion des Antriebszylinders (1) und damit einen besonders schnellen Druckanstieg im Hochdruckzylinder (2) erlaubt.

2. Hochdruckeinfriereinrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Kühlvorrichtung (7, 9, 14, 8) wenigstens eine Düse (8) umfasst, über die getriggert mit dem Druckaufbau im Druckzylinder (2) ein Kühlmedium (15), insbesondere Flüssiger Stickstoff oder dergleichen, auf die Probe (33) gesprüht werden kann.

3. Hochdruckeinfriereinrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass dem Antriebszylinder bzw. der Sperre (3) und gegebenenfalls der Düse (8) ein Steuerelement, vorzugsweise ein Steuerzylinder (10), zur Zeitsteuerung zugeordnet ist, wobei der Steuerzylinder (10) insbesondere als Pneumatikzylinder ausgebildet ist und über eine Steuerzeitpunkts-Einstellvorrichtung - gegebenenfalls über eine Distanzänderung an einem Auslöser verfügt.

4. Hochdruckeinfriereinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Antriebszylinder ein Pneumatikzylinder (1) ist, dessen Druckteil pneumatisch vorspannbar ist.

5. Hochdruckeinfriereinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Haltevorrichtung (16, 25) für einen Probenbehälter (4) vorgesehen ist, die den Probenbehälter (4) während des Hochdruckeinfrierens gegen die Druckausgangsseite des Hochdruckzylinders (2) gepresst hält.

6. Hochdruckeinfriereinrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Haltevorrichtung eine Spannzange (16) umfasst, die im Kühlbetriebszustand den Probenbehälter (4) lagerichtig und einseitig druckdicht verschlossen aufnimmt.

7. Hochdruckeinfriereinrichtung nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Spannzange (16) ein Halter (25) mit einem Bett (26) zur Aufnahme des ersteren zugeordnet ist, aus dem die Spannzange (1 6) um eine Achse (28) schwenken kann, so dass der Probenbehälter (4) aus einer waagrechten in eine senkrechte, untere Position geschwenkt werden kann.

8. Hochdruckeinfriereinrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass unterhalb des Halters (25) eine Sammelwanne mit Kühlflüssgkeit angeordnet ist, um nach erfolgter Vitrifizierung einer Probe (33) den Probenkörper (4) nach unten in die Kühlflüssigkeit abzulegen.

9. Hochdruckeinfriereinrichtung nach einem der Ansprüche 5-8, dadurch gekennzeichnet, dass die Spannzange (16) einen federbelasteten Auslösemechanismus (22, 19) zum Einspannen und Freigeben eines Probenbehälters (4) umfasst, aus dem im Einhandbetrieb ein Probenbehälter (4) entfernbar ist.

10. Hochdruckeinfriereinrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Kühlvorrichtung eine Ventilsteuerung (14) für das Aufsprühen der Kühlflüssigkeit (15) und einen zweiten Pneumatikzylinder (7) umfasst, der vorzugsweise ebenfalls vorspanndruckbeaufschlagbar ist.