AT505427A1 - Verfahren zum gefrierkonservieren von proben - Google Patents

Verfahren zum gefrierkonservieren von proben Download PDF

Info

Publication number
AT505427A1
AT505427A1 AT0104707A AT10472007A AT505427A1 AT 505427 A1 AT505427 A1 AT 505427A1 AT 0104707 A AT0104707 A AT 0104707A AT 10472007 A AT10472007 A AT 10472007A AT 505427 A1 AT505427 A1 AT 505427A1
Authority
AT
Austria
Prior art keywords
container
sample
cooling
liquid
cooled
Prior art date
Application number
AT0104707A
Other languages
English (en)
Other versions
AT505427B1 (de
Inventor
Johannes Leunissen
Original Assignee
Leica Mikrosysteme Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Leica Mikrosysteme Gmbh filed Critical Leica Mikrosysteme Gmbh
Priority to AT0104707A priority Critical patent/AT505427B1/de
Priority to US12/166,148 priority patent/US20090011505A1/en
Publication of AT505427A1 publication Critical patent/AT505427A1/de
Application granted granted Critical
Publication of AT505427B1 publication Critical patent/AT505427B1/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0236—Mechanical aspects
    • A01N1/0263—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving, e.g. cool boxes, blood bags or "straws" for cryopreservation
    • A01N1/0268—Carriers for immersion in cryogenic fluid, both for slow-freezing and vitrification, e.g. open or closed "straws" for embryos, oocytes or semen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0278—Physical preservation processes
    • A01N1/0289—Pressure processes, i.e. using a designated change in pressure over time
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/42—Low-temperature sample treatment, e.g. cryofixation
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/508—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes rigid containers not provided for above

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mechanical Engineering (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Description

··· • · • · • · • ·
• ··· • ♦ PI0669
Verfahren zum Gefrierkonservieren von Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gefrierkonservieren einer wasserhaltigen Probe, insbesondere biologischen Probe, bei welchem in einem Schritt a) die Probe in einen Hohlraum eines Behälters eingebracht wird, in einem Schritt b) der Hohlraum flüssigkeitsdicht verschlossen wird, und sodann in einem Schritte) der Behälter mit der Probe auf eine Temperatur unter 251 K, vorzugsweise unter 173 K, (-22 bzw. -100°C) abgekühlt wird; sowie eine unterstützende Vorrichtung zum Halten eines Behälters während eines solchen Gefrierkonserviervorganges.
Die präparative Fixierung einer biologischen Probe dient dazu, die Ultrastruktur, molekulare Funktionalität und Identifizierbarkeit der Probenstruktur sowie die Elektrolyt-Verteilung zu konservieren. Die hierfür entwickelten Verfahrensansätze, die auf Kühlung des Präparats beruhen, lassen sich im Allgemeinen einteilen in 1) Gefrierkonservierung (engl.: cryo-conservation) unter Anwesenheit penetrativer oder nicht-penetrativer Gefrierschutzmittel, 2) ultra-schnelle Wärmeextraktion und 3) Gefrieren unter Hochdruckbedingungen.
Alle diese Ansätze haben gemeinsam, dass sie auf ein möglichst schnelles Durchschreiten des Temperaturbereiches zwischen dem Schmelzpunkt und Unterkühlungspunkt - oder alternativ dem Übergangspunkt der Rekristallisierung zwischen der kubischen und der hexagonalen Struktur - des Wassers (Eises) abzielen, das in der Probe vorliegt, z.B. als Hauptbestandteil von Zellflüssigkeiten. Dadurch soll verhindert werden, dass die Schmelzwärme des Übergangs von Wasser in Eis Ij, die Beschaffenheit der Probe beeinträchtigt Die Situation ist für reines Wasser sehr gut bekannt; jedoch weisen biologische Proben naturgemäß individuelle Abweichungen auf. Glücklicherweise beeinflussen im Wasser gelöste Bestandteile, wie z.B. Ionen, Kohlenhydrate und Proteine, die Fixierung zumeist positiv und erleichtern eine Gefrierkonservierung der Probe in der gewünschten Art.
Je nach angewandtem Ablauf geht das Wasser in der Probe in Wasserglas, amorphes Eis oder kristallines Eis über. Unter Wasserglas wird hierbei die glasartig erstarrte Form des Wassers (eigentlich eine Form des Wassers mit sehr hoher Viskosität) mit im Wesentlichen der gleichen Dichte wie Wasser verstanden - diese Form ähnelt dem flüssigen Zustand am meisten. Die anderen festen Formen des Wassers - sowohl amorph als auch kristallin - haben eine Dichte, die sich um ca. 10% oder mehr von der des flüssigen Wassers unterscheidet, PI0669 ·· ·· ·»·# ···· ···· · ···· · · · · • · · · · · ··· · f • · · · · · · ···· ····· · · · ·· ·· ♦ · ··· t -2- was zu Artefakten aufgrund der Auswirkung der Eis-Ausdehnung oder Schrumpfung führen kann.
Bei ungeschützten Proben findet die Glasbildung gewöhnlich nur in Oberflächenschichten mit einer Dicke von höchstens einigen wenigen um statt. Für praktische Zwecke ist natürlich eine dickere Schicht wünschenswert, in der die Probe gut konserviert ist. Dies kann beispielsweise durch die Anwendung von Kryo-Schutzstoffen erreicht werden. Eine solche Behandlung entspricht jedoch zumeist nicht den natürlichen Bedingungen und kann daher zu Verfälschungen führen.
Das als 'High Pressure Freezing' (Hochdruck-Frieren) bezeichnete Verfahren, kurz FIPF, wurde von Riehle 1968 präsentiert. Die Probe wird unter einem Druck, typischerweise bei ca. 200 MPa, eingespannt und dann rasch abgekühlt. Diese Methode gestattet es durch die Verwendung flüssigen Stickstoffs als Kühlmittel, eine Probendicke von 100 bis 300 um ohne messbaren Schaden durch Eis-Kristallisation einzufrieren. Wegen seiner chemischen Trägheit eignet sich flüssiger Stickstoff zum sicheren Kühlmittel. Die behauptete hohe Viskosität von Wasser bei ca. 200 MPa macht in der Theorie ultra-hohe Abkühlraten nicht zu einem Haupterfordemis. HPF nützt das Prinzip von Le Chatelier aus: Wird ein System, das sich im Gleichgewicht befindet, einer thermodynamischen Änderung eines physikalischen Parameters unterworfen, weicht das System entsprechend aus, um die Änderung zu verringern. Beim Gefrieren unter hohem Druck von ca. 200 MPa (also nahe dem Tripelpunkt Wasser-Eis Ih-Eis ΙΠ) wird die Tendenz des Wassers unterdrückt, eine Eisform niedriger Dichte auszubilden. HPF hat sich als zuverlässige Methode zum physikalischen Immobilisieren von Wassermolekülen in pro- und eukaryotischen Einzelzellen sowie Geweben erwiesen und gestattet die weitere Behandlung mit z.B. Kryo-Substitution, Gefrierbruch und/oder Kryo-Ultra-mikrotomie. Bekannte HPF-Ausrüstungen liefern Proben mit einer Gefriertiefe von bis zu 300 pm an der Oberfläche. Häufig wird HPF mit der Verwendung von normalerweise nicht-penetrativen Kryo-Schutzstoffen kombiniert, wie z.B. Dextranen, um eine optimale Kryo-Konservierung zu erzielen.
Der Druck, unter dem das Verfahren des HPF angewendet wird, wird durch Maschinen, z.B. hydraulische oder pneumatische Pressen erzeugt Diese Maschinen sind aufwendig, nehmen viel Platz ein und führen zu laufenden Servicekosten. Zudem besteht die Gefahr, dass die hydraulische Flüssigkeit mit der empfindlichen Probe in Kontakt kommt.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen Weg aufzuzeigen, biologische Proben über ein Gefrierverfahren zu konservieren, ohne dass aufwändige Maschinen zur Anwendung eines äußeren Drucks gebraucht werden.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren der eingangs genannten Art gelöst, bei welchem erfindungsgemäß in Schritt a) gegebenenfalls frei bleibende Teile des Hohlraums mit einer wasserhaltigen Flüssigkeit aufgefüllt werden und als Ergebnis die Probe und gegebenenfalls die wasserhaltige Flüssigkeit gemeinsam den gesamten Hohlraum ausfüllen, und bei der Abkühlung in Schritt c) der Behälter eine VolumsausdehnUng des Hohlraums unterbindet.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem an sich bekannten Umstand, dass sich (unter Normaldruckbedingungen) das Wasser beim Gefrieren zu Eis I ausdehnt, und kehrt diesen unter Ausnutzung des bereits erwähnten Gesetzes von Le Chatelier um. Es ergibt sich ein beträchtlicher Druck, wenn das Wasser beim Abkühlen eingeschlossen und folglich die Ausdehnung behindert ist. Daher wurde die Erfindung auch als 'Self-Pressurized Rapid Freezing' (SPRF, in Deutsch etwa: Schnellgefrieren unter selbst-erzeugtem Druck) bezeichnet. Umgekehrt bewirkt der Druck eine Verringerung des Schmelzpunktes unter den Werte bei Normaldruck (273 K für reines Wasser; ca. 271K in vielen biologischen Proben). Der auf diese Weise beim Gefrieren zustande kommende Druck stellt eine effiziente Alternative zur Anwendung eines äußeren Drucks wie beim HPF-Verfahren dar. Zudem kann der Kühlmittelverbrauch (z.B. flüssiger Stickstoff) deutlich gegenüber herkömmlichen Anwendungen reduziert werden, da lediglich ein Probenbehälter gekühlt werden muss und die Kälte nicht durch zusätzlich Apparaturen abgeleitet wird.
In offenen Proben, wie dies bei herkömmlichen Verfahren der Fall ist, kann sich das Wasser beim Gefrieren mehr oder weniger frei ausdehnen und geht in einer Mischung von glasförmigem Wasser oder amorphem Eis (ca. 5%) und kubischem und hexagonalem Eis (Eis Ic+Ih, ca. 95%). Bei Umgebungsdruck (ca. 100 kPa) ist somit davon auszugehen, dass in einem Behälter wie den oben dargestellten der überwiegende Teil des Wassers in der Probe die Konfiguration des Eis I annimmt, wenn die Probe abgekühlt wird, auch bei schockartiger Abkühlung, wie z.B. durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff. In einem geschlossenen Behälter jedoch kann dies wegen der Behinderung der Volumszunahme nicht imgehindert stattfinden; es entsteht ein innerer Druck. Die Druckzunahme entspricht einer Verringerung des Schmelzpunktes des Wassers. Dies ist der wesentliche Grundgedanke der Erfindung.
Ein Druck von 200 MPa verringert den Schmelzpunkt des (reinen) Wassers um 22 K. Umgekehrt ist zu erwarten, dass eine Abkühlung eines eingeschlossenen Volumens um 22 K auf 251 K einen Druck von 200 MPa erzeugt. Elastische Effekte in der Wandung der metallischen P10669 ·♦ ·· ·«·· ···· tM« · • · · · · t · · • · · » · · ·♦· « « « · · · · · · ···« ····· · « · ·· ·· · · ··♦ · -4-
Behälter können den Effekt nur in vemachlässigbarem Ausmaß abschwächen. Es kann jedoch auch nicht ausgeschlossen werden, dass das Eis in der Probe einem Druckaufbau zumindest zum Teil dadurch ausweicht, dass es in eine glasförmige Konformation übergeht, bei der nur eine geringe Dichteänderung eintritt. Ein Übergang zu glasförmigem Wasser stellt jedoch ebenfalls ein akzeptables Ergebnis der Präparation dar.
Das Gefrieren unter festgehaltenem Volumen kann mit Kühlen mittels Propan oder Ethan kombiniert werden. Zusätzlich kann zur nachfolgenden Stabilisierung der gefrierpräparierten Proben für Normaltemperaturen eine Kryo-Substitution bei der Auswertung der so erhaltenen Konservierung vorgenommen werden, wobei die Kryo-Substitution typischerweise bei einer Temperatur oberhalb 183 K (-90°C), beispielsweise bei -80°C oder zwischen -40 und -30°C durchgeführt wird.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung wird die Abkühlungsgeschwindigkeit ausreichend groß gewählt, dass eine Kristallbildung des gefrierenden Wassers zugunsten einer Glasbildung unterdrückt wird.
In einer einfachen Ausführungsform kann als Behälter ein Röhrchen verwendet werden, dessen Enden durch Zusammenpressen verschlossen werden, beispielsweise mittels einer Flachzange.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung kann vor Schritte) ein Vorkühlungsschritt erfolgen, bei welchem der Behälter auf eine Vorkühltemperatur abgekühlt wird, und sodann in Schritte) der Behälter schockartig abgekühlt werden. Der Vorkühlungsschritt verbessert das Durchkühlen der Probe und sorgt zudem für eine gleichmäßige thermische Ausgangssituation vor Beginn des eigentlichen Gefriervorgangs. Ein günstiger Wert der Vorkühltemperatur ist knapp oberhalb der Gefriertemperatur der Probe. Beispielsweise kann die Vorkühltemperatur bei 254 K liegen, insbesondere zwischen 253 K und 255 K.
Vorteilhafter Weise erfolgt die Abkühlung in Schritt c) schockartig unter Verwendung einer kryogenen Flüssigkeit, insbesondere mit flüssigem Stickstoff, Flüssiggas, Propan oder Ethan. Auch andere kryogene Flüssigkeiten oder Feststoffe, z.B. Isopentan, Ethanol, Methanol oder Aceton, können eingesetzt werden, und zwar je nach Verwendungszweck und gewünschter Temperatur knapp über dem Festpunkt (schmelzend), nahe dem Siedepunkt (siedend) oder an einer einstellbaren Temperatur dazwischen. Hierbei kann die Abkühlung durch Eintauchen in die kryogene Flüssigkeit geschehen, wobei der Behälter vorzugsweise parallel zur Oberfläche der Flüssigkeit ausgerichtet wird. P10669 • » · * · ·· ♦ • · · · · · ♦·· ♦ · • · · · · · · ···· ····· ♦ ♦· ·· ·« « · ··· · -5-
Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass es möglich ist, dass während des Abkühlungsvorgangs auf den Behälter von außen kein oder lediglich geringfügiger äußerer Druck (insbesondere lediglich zum mechanischen Fixieren des Proberibehälters) aufgebracht wird. In dem besonderen Fall, dass vor dem Abkühlvorgang der Behälter in eine Haltevorrichtung eingespannt und der Behälter zusammen mit der Haltevorrichtung abgekühlt wird, ist es ausreichend, dass die Haltevorrichtung auf den Behälter keinen oder lediglich geringfügigen äußeren Druck ausübt. Hierbei bedeutet geringfügiger Druck, dass dieser um zumindest eine Größenordnung geringer ist als der Druck, der sich in dem Behälterhohlraum durch die Wirkung des gefrierenden Eises aufbaut. Der Behälter kann zudem in die Haltevorrichtung mittels Haltemitteln eingespannt werden, deren Wärmeausdehnungskoeffizient geringer ist als jener des übrigen Materials der Haltevorrichtung, um bei gleichzeitiger Abkühlung der Haltevorrichtung mit dem Probenbehälter eine zusätzliche Kompressionswirkung zu erzielen. Für das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zudem eine Vorrichtung zum Halten eines Behälters während eines Gefrierkonserviervorganges für eine in dem Behälter eingebrachte Probe, insbesondere biologische Probe, mit einem Rahmen und in diesem vorgesehenen Haltemitteln, in denen der Probenbehälter während des Abkühlungsvorganges einzuspannen ist. Die Haltemittel können wie bereits erwähnt einen Wärmeausdehnungskoeffizienten aufweisen, der geringer ist als jener des Rahmens der Haltevorrichtung. Zudem kann zur Verbesserung der Wärmeleitung von der Probe weg das Material eines Haltemittels zumindest zum Teil Diamant sein. Außerdem kann ein zusätzlicher interner Druck dadurch aufgebaut werden, dass ein Haltemittel eine Vertiefung zur Aufnahme einer wässrigen Flüssigkeit auf weist, die bei Abkühlung eine Eissäule bildet, welche den Behälter gegen ein anderes Haltemittel drückt.
Die Erfindung samt weitere Vorzüge und Weiterbildungen wird im Folgenden anhand von nicht einschränkenden Ausführungsbeispielen näher erläutert, die die Anwendung der Erfindung unter Einsatz von beispielhaften Probenbehältem und -halterungen demonstrieren und in den beigefügten Zeichnungen dargestellt sind. Die Zeichnungen zeigen
Fig. 1 einen röhrenförmigen Probenbehälter;
Fig. 2 einen scheibenförmigen Proberibehälter mit einer Vertiefung zur Aufnahme der Probe;
Fig. 3 den Probenbehälter der Fig. 2 in verschlossenem Zustand;
Fig. 4 eine Probenhalterung für den Behälter der Fig. 2; • P106691
• · · » ·♦· · · • ♦··
-6-
Fig. 5 die Probenhalterung der Fig. 4 mit einem Probenbehälter; und
Fig. 6 eine Variante einer Probenhalterung mit einem wasserfüllbaren Stempel.
Bezugnehmend auf Fig. 1 ist ein Probenbehälter 1 für Einzelzellen oder Kleinorganismen wie Nematoden aus einem Kapillarrohr geformt. Das zugrunde liegende Kapillarrohr ist beispielsweise 16 mm lang mit einem Außendurchmesser von 0,6 mm und einem Innendurchmesser von 0,3 mm.
Das Kapillarrohr wird nach bekannter Art gereinigt, um die innere Oberfläche fettfrei und hydrophil zu machen. Außerdem soll ausgeschlossen werden, dass bei der folgenden Befüllung Luftblasen im Inneren eingeschlossen werden. Dann wird die biologische Probe in das Innere 2 des Kapillarrohrs eingebracht und ein etwaiger verbleibender Freiraum im Hohlraum 2 mit Wasser (oder wässriger Lösung) aufgefüllt. Ehe Enden 3 des Kapillarrohrs werden dann fest verschlossen, beispielsweise mit einer Flachzange über eine Länge von ca. 1 mm.
Bei dem Befüllen und Verschließen des Probenbehälters 1 ist darauf zu achten, dass keine Luftblasen oder andere kompressiblen Hohlräume im Hohlraum 2 verbleiben, da diese eine unerwünschte Ausdehnungsmöglichkeit für sich bildendes Eis bieten können. Hier bei kann es günstig sein, wenn der Probenbehälter so befällt wird, das eine kleine Menge des Probenmaterials über das Ende des Kapillarrohr übersteht (diese wir dann beim Verschließen abgetrennt).
Das Material des Kapillarrohrs 1 ist z.B. Kupfer oder Silber; jedoch kann jegliches Material verwendet werden, das es ermöglicht, dass die Enden des Rohres durch Zusammendrücken oder -klammem verschlossen werden können und dabei die so zusammengebrachten Oberflächen sich miteinander verbinden und den Innenraum nach außen abdichten. In einer alternativen Ausführungsform können zum Verschließen des Kapillarrohrs konische Stopfen verwendet werden. Die Stopfen können beispielsweise mittels einer Haltevorrichtung, wie z.B. einer Klammer, an ihrem Ort gehalten werden.
Eine andere Probenträgerform ist in Fig. 2 und 3 gezeigt Es handelt sich um ein sogenanntes 'freezer hat7 (Fa. Prosdtech, Australien), nämlich eine Messingscheibe 4 mit einer Vertiefung 5 mit einem Aufnahmevolumen von 100 μπι. Die Vertiefung 5 einer Messingscheibe dieser Art wird mit der Probe befüllt und mit der flachen Seite einer weiteren Scheibe 4a abgedeckt; die Deckscheibe 4a kann z.B. wie gezeigt ein anderes 'freezer hat7 sein. Der sich so ergebende Probenbehälter 6 ist in Fig. 3 gezeigt. • P10669 • · · • · · • # · ·· ·· • · • • ··♦ • · • · ···« • « • • M« • -7-
Fig. 4 zeigt eine Probenhalterung 10 in Ladestellung. Zwei Stempel 11,12 werden von einem Rahmen 13 gehalten. Der untere Stempel ist fest im Rahmen montiert, während der obere Stempel 12 gegenüber dem unteren Stempel verstellbar ist, beispielsweise durch Verschrauben. Die Probenhalterung kann im Zwischenraum zwischen den Stempeln einen offenen Probenbehälter 4 oder einen verschlossenen Probenbehälter 6 aufnehmen. Der Stempel 12 trägt außerdem einen Diamantkappe 14, die eine gute Wärmeleitung zur Verbesserung der Kühlleistung am Probenort beim Abkühlvorgang gewährleistet.
Wie in Fig. 5 gezeigt kann auch eine Endfläche eines Stempels, hier die plane Endfläche der Diamantkappe 14, zum flüssigkeitsdichten Abdecken einer Probe im Behälter 4 dienen. Beim Einspannen der Probe 4 in die Halterung 10 wird der Stempel 14 so zugeschraubt, dass die Probe gut gehalten ist und nicht seitlich ausweichen kann. Der dabei ausgeübte Druck auf die Probe dient lediglich dem mechanischen Einspannen und ist geringfügig (um zumindest eine Größenordnung kleiner) im Vergleich zu den enormen Drücken, die beim Gefriervorgang zustande kommen (letztere liegen um 200 MPa = 2 kbar).
Der derart vorbereitete Probenbehälter wird mm in eine kryogene Flüssigkeit eingetaucht, wie z.B. in flüssigen siedenden Stickstoff (77 K), flüssiges Propan (ab 86 K; Siedepunkt 231 IQ oder Flüssiggas, das auf einer Temperatur zwischen dem Schmelzpunkt und dem Siedepunkt eingestellt wurde, z.B. ca. 90 K oder 153 K. Auch andere Substanzen wie z.B. schmelzendes Isopentan (113 K) sind einsetzbar. Bei Verwendung einer Probenhalterung 10 wird die Seite mit der Diamantkappe 14 voran eingetaucht. Die Proben werden dann ausreichend lange in der Flüssigkeit belassen, beispielsweise mindestens 15 Sekunden lang. Sie können dann bei Bedarf in ein Kühlbehältnis mit z.B. flüssigem Stickstoff transferiert werden.
Als Kühlmittel kann im Allgemeinen ein Kühlmittel, insbesondere eine kryogene Flüssigkeit, verwendet werden, das eine ausreichend rasche Abkühlung auf eine zu erreichende Kühltemperatur ermöglicht. Das Kühlmittel bzw. seine Temperatur wird im Allgemeinen im Hinblick auf eine Kühltemperatur, die unter 251K (-22°C = Temperatur des Tripelpunkts Wasser-Eis Ih-Eis III), vorzugsweise unter 173 K (-100°C), ausgewählt. Um eine mit Sicherheit stabile Gefrierkonservierung zu erreichen, wird häufig eine Kühltemperatur unter 193 K (-80°C), z.B. bei 133 K (-140°C) oder darunter angestrebt, z.B. 123 K (-150°C). Diese Temperaturen erscheinen auch in Zusammenhang mit der Erfindung erstrebenswert, jedoch wurde in den Experimenten auch bei höheren Kühltemperaturen, wie bereits erwähnt, insbesondere bei 153 K, eine ausreichend stabile Gefrierkonservierung festgestellt.
Der Abkühlvorgang kann zweistufig ablaufen, um bessere thermische Bedingungen des Gefriervorgangs zu erzielen. Zuerst, in einem Vorkühlschritt, wird ein Probenbehälter in ein PI0669 • · · · • · · · • · · · • ♦ · · ·♦ ·· ♦ • · · • ··· · · • ··· « ···« • · 8
Vorkühlbad in einem Kühlgerät getaucht, in dem eine Flüssigkeit (z.B. Ethanol oder Ethanol/Methanol-Gemisch) auf einer Temperatur gehalten wird, die zwischen 273 K und 251 K eingestellt ist. Ein bevorzugter Wert ist knapp oberhalb der Temperatur des Tripelpunkts Wasser-Eis Ih-Eis III (251K). Nachdem sich in der Probe thermisches Gleichgewicht eingestellt hat - was je nach Probe und Behälter verschieden lang, z.B. einige Minuten bis eine Stunde, dauern kann - wird der Probenbehälter aus dem Vorkühlbad genommen und wie oben beschrieben rasch mittels einer kryogenen Flüssigkeit abgekühlt.
Zum Vorkühlen kann auch eine Eis-Salz-Mischung verwendet werden. Der Vorkiihl-Vorgang kann auch auf zwei Teilschritte mit verschiedenen Temperaturen aufgeteilt werden, z.B. einen ersten Teilschritt, in dem mit einer Eis-Salz-Mischung auf eine Temperatur wenige K unter 0°C abgekühlt wird, und einen zweiten Teilschritt mit einem Vorkühlbad bei einer Temperatur von z.B. 251 K.
Der Vorkühlschritt dient dazu, einen gekühlten Zustand der Probe zu erreichen, bei dem die Probe gleichmäßig gekühlt ist, aber noch nicht gefroren. Deshalb kann hierfür eine geringe Abkühlgeschwindigkeit gewählt werden. Der dann folgende eigentliche Gefrierschritt soll so schnell erfolgen (geeignete Abkühlgeschwindigkeiten liegen über 100 K/ s, typischerweise bei 103 bis 105 K/s), dass das Wasser in der Probe eine Glasbildung oder zumindest Mikrokristallbildung durchläuft.
Nach dem Gefrierkonservieren können die Proben nach bekannter Art weiter behandelt werden. Beispielsweise können die Proben mit einem Mikrotom bekannter Art geschnitten und/oder geschliffen werden. Die Proben können ohne Weiteres geöffnet werden, da die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelten Proben unter den niedrigen Temperaturen auch unter Umgebungsdruck stabil sind.
Geöffnete gefrorene Proben können auch einer Substitution unterworfen werden. Hierfür können bekannte Substitutionen unter niedrigen Temperaturen eingesetzt werden, wie z.B. mittels Azeton.
Kryo-SEM-Messungen an Kapillarrohr-Behältem, die gemäß der Erfindung behandelt und gekühlt wurden, haben keine nennenswerte Dehnung der Behälter aufgezeigt.
Wenn die Abkühlung ausreichend schnell und gleichmäßig ist - was dadurch erreicht werden kann, dass der Behälter beim Eintauchen parallel zur Flüssigkeitsoberfläche orientiert ist - kann der erzeugte Druck den Behälter nicht zum Bersten bringen oder leck werden lassen. Behälter der oben beschriebenen Art wurden mit einer blauen Toluidin-Lösung * PI0669* • · · · · ♦ ♦ » • ♦ · · · · ··· * » # · · · · # ···« ····· · ·· «· tl · + ··· · -9- gefüllt und wie oben beschrieben abgekühlt; die Behälter wurden dann wieder aufgetaut und zeigten keinerlei Lecks oder andere Beschädigungen, auch nicht an den zugeklemmten Enden, die anhand austretender Flüssigkeit leicht festgestellt hätten werden können.
Experimente seitens des Erfinders und der Anmelderin zeigten, dass die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren präparierten biologischen Proben eine sehr gute bis ausgezeichnet erhaltene Ultrastruktur aufweisen. Beispielsweise konnten Organellen von Bierhefe oder die Morphologie von Kleinorganismen, wie z.B. Strukturen der Darmwand und von Mitochond-rien in C. elegans, zuverlässig konserviert und in Schnittpräparaten reproduziert werden.
Fig. 6 zeigt eine Variante einer Probenhalterung. In dem unteren Stempel 11' ist eine Vertiefung 15 vorgesehen, die mit Wasser gefüllt werden kann. Wenn die gesamte Vorrichtung abgekühlt wird, gefriert das Wasser in der Vertiefung 15 zu Eis, das sich ausdehnt und zusätzlich auf die eingespannte Probe drückt. Die dünne Wand der Probenhalterung 4 überträgt den ausgeübten Druck mit geringem Verlust auf die Probe.
Um weiteren Druck auf die Probe während des Abkühlvorgangs zu erzeugen, kann das Material der Stempel 11,12 so gewählt werden, dass es einen deutlich geringeren Wärmeausdehnungskoeffizienten aufweist als der Rahmen 13. Beim gemeinsamen Abkühlen schrumpft daher der Rahmen stärker als die Stempel, die auf diese Weise die Probenhalterung zusammendrücken. Auf diese Weise kann ein zusätzlicher Druck auf die Probe ausgeübt werden, ohne dass aufwendige äußere Pressen notwendig sind.

Claims (16)

  1. ; #106691 » ♦ · I ♦ ♦ ► · · » · · ·· ·· • · · » ··· · ♦ # ··#« -10-
    Ansprüche 1. Verfahren zum Gefrierkonservieren einer wasserhaltigen Probe, insbesondere biologischen Probe, bei welchem a) die Probe in einen Hohlraum (2,5) eines Behälters (1,4) eingebracht wird, b) der Hohlraum fltissigkeitsdicht verschlossen wird, und c) der Behälter (1, 6) mit der Probe auf eine Temperatur unter 251 K, vorzugsweise 173 K, abgekühlt wird, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt a) gegebenenfalls frei bleibende Teile des Hohlraums (2, 5) mit einer wasserhaltigen Flüssigkeit aufgefüllt werden und als Ergebnis die Probe und gegebenenfalls die wasserhaltige Flüssigkeit gemeinsam den gesamten Hohlraum ausfüllen, und bei der Abkühlung in Schritt c) der Behälter (1,6) eine Volumsausdehnung des Hohlraums unterbindet.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Abkühlungsgeschwindigkeit ausreichend groß ist, dass eine Kristallbildung des gefrierenden Wassers zugunsten einer Glasbildung unterdrückt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Behälter ein Röhrchen (1) verwendet wird, dessen Enden durch Zusammenpressen verschlossen werden.
  4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt c) ein Vorkühlungsschritt erfolgt, bei welchem der Behälter auf eine Vorkühltemperatur abgekühlt wird, und sodann in Schritt c) der Behälter schockartig abgekühlt wird.
  5. 5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorkühltemperatur knapp oberhalb der Gefriertemperatur der Probe liegt.
  6. 6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorkühltemperatur bei 254 K liegt, insbesondere zwischen 253 K und 255 K.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Abkühlung in Schritt c) schockartig unter Verwendung einer kryogenen Flüssigkeit, insbesondere mit flüssigem Stickstoff, Flüssiggas, Propan oder Ethan, erfolgt
  8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Abkühlung durch Eintauchen in die kryogene Flüssigkeit erfolgt, wobei der Behälter parallel zur Oberfläche der Flüssigkeit ausgerichtet wird.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass während des Abkühlungsvorgangs in Schritt c) auf den Behälter von außen kein oder lediglich geringfügiger äußerer Druck aufgebracht wird.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt c) der Behälter in eine Haltevorrichtung (10) eingespannt wird, wobei die Haltevorrichtung auf den Behälter keinen oder lediglich geringfügigen äußeren Druck ausübt, und der Behälter zusammen mit der Haltevorrichtung abgekühlt wird.
  11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Behälter in die Haltevorrichtung mittels Haltemitteln eingespannt wird, deren Wärmeausdehnungskoeffizient geringer ist als jener des übrigen Materials der Haltevorrichtung.
  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Abkühlung auf eine Temperatur unter 193 K, bevorzugt unter 173 K, vorzugsweise unter 133 K, noch bevorzugter 123 K, erfolgt.
  13. 13. Vorrichtung zum Halten eines Behälters während eines Gefrierkonserviervorganges für eine in dem Behälter eingebrachte Probe, insbesondere biologische Probe, gemäß dem Verfahren nach Anspruch 10, mit einem Rahmen und in diesem vorgesehenen Haltemitteln, in denen der Probenbehälter während des Abkühlungsvorganges einspannbar ist
  14. 14. Vorrichtung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Haltemittel einen Wärmeausdehnungskoeffizienten aufweisen, der geringer ist als jener des Rahmens der Haltevorrichtung.
  15. 15. Vorrichtung nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Material eines Haltemittels zumindest teilweise Diamant ist.
  16. 16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Haltemittel eine Vertiefung zur Aufnahme einer wässrigen Flüssigkeit aufweist, die bei Abkühlung eine Eissäule bildet, welche den Behälter gegen ein anderes Haltemittel drückt. Wien, den ££ Juli IM?
AT0104707A 2007-07-06 2007-07-06 Verfahren zum gefrierkonservieren von proben AT505427B1 (de)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0104707A AT505427B1 (de) 2007-07-06 2007-07-06 Verfahren zum gefrierkonservieren von proben
US12/166,148 US20090011505A1 (en) 2007-07-06 2008-07-01 Method and device for the cryo-conservation of samples

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT0104707A AT505427B1 (de) 2007-07-06 2007-07-06 Verfahren zum gefrierkonservieren von proben

Publications (2)

Publication Number Publication Date
AT505427A1 true AT505427A1 (de) 2009-01-15
AT505427B1 AT505427B1 (de) 2011-05-15

Family

ID=40221770

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
AT0104707A AT505427B1 (de) 2007-07-06 2007-07-06 Verfahren zum gefrierkonservieren von proben

Country Status (2)

Country Link
US (1) US20090011505A1 (de)
AT (1) AT505427B1 (de)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2270466A2 (de) 2009-07-01 2011-01-05 Leica Mikrosysteme GmbH Präparathalter für eine hochdruck Einfriervorrichtung
DE102011115467A1 (de) * 2011-10-10 2013-04-11 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und Verfahren zur Druck-Kryokonservierung einer biologischen Probe
CN113984945A (zh) * 2021-11-23 2022-01-28 中广核工程有限公司 富集器、气相色谱分析装置及油中溶解气体的气相色谱分析方法

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BE1018983A5 (nl) * 2009-12-21 2011-12-06 Dohmeyer Scient Applic Nv Cryopreservatie middels twee cryogene stoffen.
WO2011098365A2 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Universität Zürich Cryopreservation device, methods for making the same and uses thereof
US20120210734A1 (en) * 2011-02-22 2012-08-23 Hoffman Gary A Production and use of high pressure for cryopreservation and cryofixation
WO2012138944A1 (en) * 2011-04-06 2012-10-11 Celltronix Method and scalable devices for hyper-fast cooling
EP3123143B1 (de) * 2014-03-28 2019-01-23 Board Of Trustees Of Northern Illinois University Gerät und verfahren zur ultraschnellen kryokonservierung von gewebe
FR3062284B1 (fr) * 2017-01-30 2020-10-09 Genialis Procede de refroidissement d'une matiere biologique et sa conservation
WO2019032889A1 (en) * 2017-08-11 2019-02-14 The Regents Of The University Of California METHOD AND DEVICE FOR CRYOPRESERVATION CONTROLLED IN TEMPERATURE AND PRESSURE
US10994300B2 (en) * 2018-11-27 2021-05-04 Service Support Specialties, Inc Method and/or system for coating a substrate
CN111081514A (zh) * 2020-01-06 2020-04-28 南通大学 一种用于远程寄送的透射电镜生物样品固定管
EP4090157A4 (de) * 2020-01-13 2023-07-05 The Regents of The University of California Vorrichtungen und verfahren zur hochstabilen superkühlung von wässrigen medien und biologischen materialien
WO2024019949A2 (en) * 2022-07-20 2024-01-25 BioChoric, Inc. Method and apparatus for reducing excess pressure in isochoric systems

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007018947A2 (en) * 2005-07-20 2007-02-15 The Regents Of The University Of California Isochoric method and device for reducing ice nucleation probability during cryopreservation of biological matter

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2270466A2 (de) 2009-07-01 2011-01-05 Leica Mikrosysteme GmbH Präparathalter für eine hochdruck Einfriervorrichtung
AT508582B1 (de) * 2009-07-01 2011-09-15 Leica Mikrosysteme Gmbh Verfahren zur herstellung einer in einen probenbehälter eingeschlossenen wasserhaltigen probe und probenbehälter zur durchführung des verfahrens
EP2270466A3 (de) * 2009-07-01 2016-06-01 Leica Mikrosysteme GmbH Präparathalter für eine hochdruck Einfriervorrichtung
DE102011115467A1 (de) * 2011-10-10 2013-04-11 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Vorrichtung und Verfahren zur Druck-Kryokonservierung einer biologischen Probe
CN113984945A (zh) * 2021-11-23 2022-01-28 中广核工程有限公司 富集器、气相色谱分析装置及油中溶解气体的气相色谱分析方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20090011505A1 (en) 2009-01-08
AT505427B1 (de) 2011-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AT505427B1 (de) Verfahren zum gefrierkonservieren von proben
AT508582B1 (de) Verfahren zur herstellung einer in einen probenbehälter eingeschlossenen wasserhaltigen probe und probenbehälter zur durchführung des verfahrens
DE69737109T2 (de) Vorrichtung zur eiskristallbildung fur systeme zur tiefkuhlkonservierung
DE102011115467A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Druck-Kryokonservierung einer biologischen Probe
EP0637741A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Vitrifizierung von Proben, insbesondere biologischen Proben
EP3448154B1 (de) Vorrichtung und verfahren zur temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen probe
DE102009017848A1 (de) Gefriermikrotom und Verfahren zur Herstellung mikroskopierbarer Dünnschnitte
WO2010145791A2 (de) Verfahren und vorrichtung zur konservierung von tiefsee-organismen
DE102016005070A1 (de) Vorrichtung und Verfahren zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe
EP3448151B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen probe
EP0611446B1 (de) Vorrichtung zur entwässerung und/oder einbettung von proben
DE102004055148B4 (de) Vorrichtung für die Gefrier- oder Tieftemperatursubstitution
DE69734012T2 (de) Methode zur tiefkühlkonservierung von biologischen proben
AT520285B1 (de) Verfahren zum Einfrieren einer Flüssigkeit
DE102016005076A1 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Temperaturüberwachung einer kryokonservierten biologischen Probe
US20120210734A1 (en) Production and use of high pressure for cryopreservation and cryofixation
EP2434873B1 (de) Verfahren und vorrichtung zur konservierung von zellkernen
DE102005053360B3 (de) Verfahren und Behälter zur Lagerung von Probenkörpern, insbesondere Gesteinsbohrkernen
DE2739796A1 (de) Einrichtung zur gefriertrocknung und gegebenenfalls kunstharz-impraegnation kleiner biologischer objekte fuer die elektronenmikroskopische untersuchung
DE102008048709B4 (de) Verfahren und Vorrichtung zur Temperierung von Gewebeteilen
EP1561093A1 (de) Träger für eine probenkammer, insbesondere zur kryokonservierung biologischer proben
WO2014015962A1 (de) Verfahren und vorrichtung zur hochgeschwindigkeits-temperierung einer probe
DE3142521A1 (de) "verfahren und vorrichtung zum definierten abkuehlen plattenfoermiger koerper durch waermeabgabe an siedende kaeltemittel"
DE102005021962B4 (de) Probenhalter für Proben zum Hochdruckgefrieren und Hochdruckgefriereinrichtung mit Probenhalter
DE1238618B (de) Verfahren zur Konservierung biologischer Substanzen

Legal Events

Date Code Title Description
MM01 Lapse because of not paying annual fees

Effective date: 20230706