BE1018983A5 - Cryopreservatie middels twee cryogene stoffen. - Google Patents

Abstract

De uitvinding betreft een werkwijze voor cryopreservatie van een biologisch materiaal omvattend de stappen: a) selecteren van een cryogene vloeistof en minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C, b) samenbrengen van de minstens één stof en de cryogene vloeistof, zodat een cryogeen mengsel wordt bekomen met een temperatuur van ten hoogste -75°C, c) het biologisch materiaal onderdompelen in, of in de nabijheid brengen van het cryogeen mengsel, d) in stand houden van een temperatuur van ten hoogste -75°C voor cryopreservatie van het biologischmateriaal.

Description

Gryopreservatie middels twee cryogene stoffen

Technisch veld

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bewaren van biologische materialen door sterke koeling. De uitvinding heeft tevens betrekking op een samenstelling van een cryogeen mengsel. Verder heeft de uitvinding betrekking op gebruiken van het cryogeen mengsel, voor bewaring van biologische materialen. Dit is van belang in cryopreservatie.

Achtergrond

De huidige bewaarmethodes voor biologische materialen, zoals micro-organismen, bloed, gameten, zijn gebaseerd op bewaring in een enkelvoudige cryogene vloeistof, in de damp van een cryogene vloeistof, in een vaste stof, of een conventionele bewaring bij ultra lage temperatuur, bijvoorbeeld in een vrieskast bij -150 °C.

Zo worden biologische materialen bijvoorbeeld opgeslagen in grote thermosflessen, ook Dewars genaamd, gevuld met gekoelde vloeibare stikstof bij atmosferische druk. Hoewel een Dewar wordt afgesloten, is er een beperkte warmte inlek. Door de warmte inlek kookt en verdampt de vloeibare stikstof. Dit heeft voor gevolg dat de Dewar wekelijks tot dagelijks dient bijgevuld om een adequate bewaring te verzekeren.

Als alternatief, kan gebruik gemaakt worden van een vrieskast, eventueel aangevuld met een cryogene module die koolstofdioxide bevat. Als door bijvoorbeeld stroomonderbreking, de conventionele koeling uitvalt, zal het koolstofdioxide, aanwezig onder de vorm van droog ijs, sublimeren en zorgen voor koeling van de vrieskast met inhoud tot een temperatuur van circa -78°C.

Hoewel er diverse elektronische methodes bestaan ter opvolging van een temperatuur in een Dewar of vrieskast, bestaat toch de kans dat een stroomonderbreking optreedt, een waarschuwingssignaal niet tijdig wordt bemerkt, kortom dat een Dewar of vriesmodule niet tijdig wordt bijgevuld.

Bij de bewaring van biologische materialen stelt zich tevens het probleem dat door het indampen van cryogene vloeistof onzuiverheden, zoals verontreinigingen, opconcentreren. Dit is microbieel erg negatief.

Omwille van cross-contaminatie gevaar worden sommige biologische materialen, denk aan HIV (Human Immunodeficiency Virus - menselijk immuundeficiëntievirus), Influenza en Ebola virussen, niet in cryogene vloeistof bewaard. Er bestaat kans dat door een (micro-) lekkage of contaminatie van de drager virussen of micro-organismen door de · stikstof naar andere materialen zwemmen.

In het licht van bovenstaande eigenschappen is er een nood aan nieuwe werkwijzen ter bewaring van biologische materialen bij cryogene temperaturen. De onderhavige uitvinding beoogt deze problemen althans gedeeltelijk op te lossen en verschaft daartoe een meer betrouwbare werkwijze die een adequate bewaring over langere termijn oplevert, de kans op cross-contaminatie reduceert én een laattijdige bijvulling minder kritisch maakt. Bovendien worden daarbij eenvoudig verkrijgbare materialen ingezet.

Samenvatting

Het doel van deze uitvinding is het voorstellen van een werkwijze ter bewaring van biologische materialen, alsook een samenstelling waarin biologische materialen kunnen worden bewaard en het gebruik ervan.

Meer bepaald, de uitvinding betreft een werkwijze voor cryopreservatie van een biologisch materiaal omvattend de stappen: a) selecteren van een cryogene vloeistof en minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C, b) samenbrengen van de minstens één stof en de cryogene vloeistof, zodat een cryogeen mengsel wordt bekomen met een temperatuur van ten hoogste -75°C, c) het biologisch materiaal onderdompelen in, of in de nabijheid brengen van het cryogeen mengsel, d) in stand houden van een temperatuur van ten hoogste -75°C voor cryopreservatie van het biologisch materiaal.

Een werkwijze volgens de uitvinding heeft als voordelen dat een cryogene bewaring zelfs bij het vervliegen van stikstof wordt verzekerd door de nog aanwezige tweede stof. Het koelen van biologisch materiaal kan verzekerd worden over een langere periode, wat de methode betrouwbaarder maakt.

Een werkwijze volgens de uitvinding is minder gevoelig aan problemen die optreden bij het opwarmen van biologische materialen in een enkelvoudig cryogene koelmiddel. Niet tijdig bijvullen van bij voorbeeld stikstof is minder kritisch.

In een tweede aspect voorziet de uitvinding een samenstelling zoals omschreven door conclusie 6. Een samenstelling volgens de uitvinding heeft als voordeel dat de groei van micro-organismen wordt geremd, gestopt of dat micro-organismen worden afgedood. Een besmetting met micro-organismen kan worden voorkomen. De kans op cross-contaminatie bij bewaring van verschillende biologische materialen in de cryogene samenstelling wordt beperkt.

Nog in een verder aspect voorziet de uitvinding het gebruik vân bovëhvérmèlde samenstelling als bewaarmiddel en/of als bacteriostatisch, bacteriocide of antiviraal middel voor een biologisch materiaal, zoals voorzien in conclusie 8. Deze gebruiken hebben als voordeel dat een bewaartijd van biologische materialen kan worden verlengd. Dit is gunstig, bijvoorbeeld voor wereldwijd transport van gekoelde biologische materialen.

Met het inzicht de kenmerken van de uitvinding beter te tonen, zijn hierna, als voorbeeld zonder enig beperkend karakter, enkele voorkeurdragende uitvoeringsvormen'beschreven.

Beschrijving van de uitvinding

Zoals verder gebruikt in deze tekst omvatten de enkelvoudsvormen “een”, “de”, “het" zowel het enkelvoud als de meervoudsvorm tenzij de context duidelijk anders is.

De termen "omvatten", “omvat” zoals verder gebruikt zijn synoniem met “inclusief', “includeren” of “bevatten, “bevat” en zijn inclusief of open en sluiten bijkomende, niet vernoemde leden, elementen of methode stappen niet uit. De termen “omvatten", “omvat” zijn inclusief de term “bevatten”.

De opsomming van numerische waarden aan hand van cijferbereiken omvat alle waarden en fracties in deze bereiken, zowel als de geciteerde eindpunten.

De term “ongeveer" zoals gebruikt wanneer gerefereerd word naar een meetbare waarde zoals een parameter, een hoeveelheid, een tijdsduur, en zo meer, is bedoeld variaties te omsluiten van +/- 10% of minder, bij voorkeur +/-5% of minder, meer bij voorkeur +/-1% of minder, en meer nóg bij voorkeur +/-0.1% of minder, van en vanaf de gespecificeerde waarde, in zo ver de variaties van toepassing zijn om te functioneren in de bekend gemaakte uitvinding. Het dient te worden verstaan dat de waarde waarnaar de term “ongeveer” refereert op zich, ook werd bekend gemaakt.

Alle documenten geciteerd in de huidige specificatie worden hierin volledig opgenomen door middel van verwijzing.

Tenzij anders gedefinieerd, hebben alle termen bekend gemaakt in de uitvinding, inclusief technische en wetenschappelijke termen, de betekenis zoals een vakman deze gewoonlijk verstaat. Als verdere leidraad, worden definities opgenomen voor verdere toelichting van termen die in de beschrijving van de uitvinding worden gebruikt.

De uitvinding betreft een werkwijze voor cryogene bewaring van biologische materialen.

Met de term “cryogeen" wordt bedoeld koudmakend. Het wordt gebruikt om aan te geven dat er gewerkt wordt bij extreem lage temperaturen. Vaak worden voor cryogene bewaring organisch en anorganische stoffen gebruikt die bij een temperatuur lager dan -75°C vloeibaar worden. Belangrijke voorbeelden hiervan zijn stikstof (kookpunt: -196 °C), kooldioxide (smeltpunt: -78 °C), argon (kookpunt: -186°C) en koolwaterstoffen, zoals bijvoorbeeld cyclopentaan.

Met de term “biologisch materiaal" of “materiaal” wordt bedoeld een deel of een geheel van menselijke, dierlijke of plantaardige oorsprong. In de onderhavige uitvinding wordt met biologische materiaal in het bijzonder bedoeld, een materiaal geschikt om door koeling beneden -75 °C te worden bewaard.

Met de term “bewaring” wordt bedoeld het conserveren, behouden, verduurzamen van een materiaal door het voorkomen van: aantasting door micro-organismen zoals bacteriën en schimmels, oxydatie, enzymatische aantasting, afsterven of ontbinden. In onderhavige uitvinding wordt met bewaring in het bijzonder bedoeld een materiaal opslaan bij een temperatuur lager dan -75 °C, met als doel op een later tijdstip de originele eigenschappen van het materiaal, bijvoorbeeld biologische activiteit, opnieuw te kunnen benutten. Bij opslag onder-75 °C zullen geen (bio)chemische reacties of fysische transities meer plaatsvinden. De benamingen cryogene bewaring en cryopreservatie zijn synoniemen.

Met de term “bacteriostatisch” wordt bedoeld dat micro-organismen belet worden zich te vermenigvuldigen of dat de groei wordt vertraagd ofdat de kans op overleving wordt geminimaliseerd.

Met de term “bacteriocide” wordt bedoeld dat micro-organismen afgedood wordt.

Met de term “antiviraal” wordt bedoeld dat de structuur van het virus in die mate beschadigd wordt dat de kans op besmetting van het gastorganisme wordt uitgesloten.

In een eerste aspect betreft de onderhavige uitvinding een werkwijze voor het cryogeen bewaren van een biologisch materiaal. Daartoe wordt een cryogeen mengsel aangemaakt op basis van een cryogene vloeistof. Bij voorkeur is de cryogene vloeistof stikstof.

Naast het selecteren van een cryogene vloeistof wordt een stof geselecteerd met een faseovergang liggend tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en lager dan -75°C. Bij voorkeur ligt de faseovergang tussen -100 °C en -75 °C, meer bij voorkeur tussen -90 °C en -75 °C, meest bij voorkeur tussen -80 °C en -75 °C.

Met de term “faseovergang” wordt een wijziging in de verschijningsvorm van een stof bedoeld. Als fasen zijn de aggregatietoestanden vast, vloeibaar en gasvormig bekend. Faseovergangen zijn bijvoorbeeld vast naar vloeibaar, vloeibaar naar gas, vast naar gas. Het sublimeren van kooldioxide van droog ijs naar gas en het stollen van vloeibare stikstof naar vaste stikstof zijn voorbeelden van faseovergangen. Overgangen tussen verschillende fasen worden weergegeven met bijvoorbeeld smeltpunt, kookpunt.

In Tabel 1 worden stoffen weergegeven met hun smeltpunt en kookpunt. Uit deze tabel kan een selectie gemaakt worden uit zowel anorganische als organische stoffen voor het maken van een cryogeen mengsel. Voorbeelden van stoffen met fasewissel in het hierboven beschreven temperatuursbereik zijn bijvoorbeeld cyclopentaan (smelten bij -93 °C), kooldioxide (sublimeren bij -78,5 °C), distikstofoxide (sublimeren bij -91 eC) en ozon (smelten bij -191 eC, koken bij -112°C).

Met de term “cryogene vloeistof’ wordt in onderhavige uitvinding bedoeld een organische of anorganische stof die door sterke afkoeling vloeibaar wordt; Het kookpunt van deze vloeistof bevindt zich beneden -75 °C, bij voorkeur beneden -80°C.

Tabel 1: Faseovergangen van cryogene stoffen, bij 1 atmosfeer.

Verder wordt in een methode volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding aan de cryogene vloeistof, minstens één stof toegevoegd waarvan de faseovergang ligt tussen het kookpunt van......

de cryogene vloeistof en -75°C, zodat een cryogeen mengsel wordt bekomen met een temperatuur van ten hoogste -75°C. In een geprefereerde methode volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt aan vloeibare stikstof minstens één andere cryogene stof gedoseerd. In een voorkeursvorm van een werkwijze volgens de uitvinding omvat het cryogeen mengsel vloeibare stikstof en een stof geselecteerd uit de lijst met kooldioxide (C02), distikstofoxide (N20), ozon (03), argon, cyclopentaan en vloeibaar aardgas (LNG).

“Kooldioxide” of koolstofdioxide, afgekort als C02, is een gas dat bij atmosferische druk als droogijs bestaat. In vaste toestand heeft C02 het uitzicht van witte sneeuwvlokken. Het is commercieel verkrijgbaar. Het is leverbaar als een vloeistof of gas bij verhoogde druk en bij een temperatuur (bijvoorbeeld -30°C) die veel hoger ligt dan de temperatuur van vloeibare stikstof.

Met verhoogde druk wordt een druk boven 1 atmosfeer bedoeld.

“Lachgas” of “distikstofoxide”, afgekort als N20, is een gas dat bij atmosferische druk als ijs bestaat. In vaste toestand heeft N20 het uitzicht van sneeuwvlokken. Het is leverbaar als een vloeistof of gas bij verhoogde druk en bij een temperatuur (bijvoorbeeld -3Ö°C) die veel hoger ligt dan de temperatuur van vloeibare stikstof.

In een voorkeursvorm van een methode volgens de uitvinding wordt een biologisch materiaal ondergedompeld in het cryogeen mengsel. Het gebruik van een minstens één stof met faseovergang tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75 °C, in het cryogeen mengsel, heeft als voordeel dat de cryogene vloeistof gebufferd wordt. Wanneer een cryogene vloeistof kookt door warmte inlek, dan zal bij vérdere temperatuurstijging een faseovergang optreden. De latente warmte die daarvoor vereist is, bijvoorbeeld latente smelt-, verdampings-of sublimatiewarmte, zorgt voor een temperatuurdaling. Een verdere opwarming wordt tijdelijk gebufferd.

Met de term “latente warmte” wordt de hoeveelheid energie in de vorm van warmte bedoeld die nodig is om een stof een faseovergang te do en ondergaan bij constante temperatuur en druk.

In een voorkeursvorm van een methode volgens de uitvinding wordt een temperatuur van ten hoogste -75°C in stand gehouden voor cryopreservatie van het biologisch materiaal.

In een voorkeursvorm van de uitvinding wordt een cryogene stof geselecteerd waarvan een poedervormige sneeuw kan worden gemaakt. Voorbeelden zijn kooldioxide en stikstofdioxide. Het voordeel van de poedervormige sneeuw, is dat deze eenvoudig aan de cryogene vloeistof kan worden toegevoegd en gemengd. Zo wordt de tweede cryogene stof homogeen verdeeld. Het hindert niet bij het inbrengen van biologische materialen. Het levert extra plaats op.

Bij voorkeur wordt kooldioxide geselecteerd. Het smeltpunt van kooldioxide ligt net onder -75 °C. Dit is zowat de bovengrens voor cryogene koeling. Bij een combinatie vloeibare stikstof/C02 zal stikstof sneller verdampen dan het C02 sublimeert. Na vervluchtiging van de stikstof, blijft nog kooldioxide achter. De aanwezigheid van kooldioxide zorgt voor een verlenging van het koeltraject in de tijd.

Bij voorkeur wordt een bewaarperiode verlengd met minstens 10%, meer bij voorkeur minstens 20%, nog meer bij voorkeur minstens 30%, meest bij voorkeur minstens 50%.

Bovendien beschermt kooldioxide tegen ongewenste groei van micro-organismen. Het verlaagt de zuurtegraad van vloeibare stikstof. Bij sublimatie wordt de atmosfeer in een recipiënt gevuld met kooldioxide. Dit onderdrukt en voorkomt groei van micro-organismen.

In een voorkeursvorm van een methode volgens de uitvinding, wordt minstens één stof naar een poedervormige sneeuw omgezet, alvorens de poedervormige sneeuw toe te voegen aan de cryogene vloeistof en te mengen.

In een geprefereerde voorkeursvorm van de uitvinding wordt een combinatie vloeibare stikstof en kooldioxide gebruikt. Bij voorkeur worden fijne C02 sneeuwvlokken of N20 sneeuwvlokken gebruikt. Fijne sneeuwvlokken of poedervormige sneeuw kan bijvoorbeeld bekomen worden door een cryogene vloeistof door een spuitkop te sturen en te laten ontspannen. Bij voorkeur wordt de sneeuw aangemaakt vooraleer deze aan de eerste stof wordt toegevoegd. Wordt het tweede cryogeen ingebracht in de cryogene vloeistof dan dient er op gelet dat bij gebruik van een spuitkop deze niet bevriest en zou worden afgeblokt.

In een voorkeursvorm van de uitvinding, omvat een werkwijze volgende stappen: b1) vullen van een recipiënt met vloeibare stikstof, b2) sneeuw van C02 en/of N20 samenbrengen met de vloeibare stikstof, b3) roeren van het mengsel bekomen onder b2).

Bij het toevoegen van brokken sneeuw (sneeuwballen) aan vloeibare stikstof, mengen deze met de stikstof. Een melkwit mengsel wordt gevormd. Er zijn geen klonters meer.

In een andere voorkeursvorm wordt in een recipiënt ijs of sneeuw aangebracht. De cryogene vloeistof wordt vervolgens op het reeds aanwezige cryogeen gegoten. In een andere voorkeursvorm wordt de tweede stof aan de cryogene vloeistof toegevoegd middels een pijp of poreus materiaal waar de tweede stof doorheen wordt geborreld. Bijvoorbeeld vloeibare stikstof doorborrelen met ozon-gas via een poreuze steen of sinterkaars. In een andere voorkeursvorm worden ijsschilfers of ijsgranulaat, met andere woorden hard samengeperste sneeuwvlokken, aan de cryogene vloeistof toegevoerd. In een andere voorkeursvorm worden stikstof en C02, beide in gasvorm, gemengd. Vervolgens worden ze afgekoeld tot beneden een temperatuur waarbij beide gassen een faseovergang hebben, bijvoorbeeld -196 °C in het geval van een stikstof en C02 mengsel.

Het hierboven omschreven cryogeen mengsel is in het bijzonder geschikt om biologische materialen te bewaren. Daartoe wordt een biologisch materiaal ondergedompeld in het cryogeen mengsel of in de nabijheid gebracht van het cryogeen mengsel. Het materiaal kan rechtstreeks in het cryogene mengsel worden gebracht. Het kan zich bevinden in een tube, rietje of zak. Het kan zich ook bevinden op een drager of in een houder in de nabijheid van het cryogeen mengsel.

De uitvinders hebben vastgesteld dat voor de bewaring van een biologisch materiaal in een cryogeen mengsel verbeterde eigenschappen werden bekomen vanaf een concentratie van 2% van een cryogene stof met faseovergang tussen het kookpunt van een cryogene vloeistof en -75°C in een cryogene vloeistof. In een voorkeursvorm van een werkwijze volgens de uitvinding, is in het cryogeen mengsel de ratio in volume procenten van de minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C ten opzichte van de cryogene vloeistof, ten minste 2 %, bij voorkeur ten minste 5 %, meer bij voorkeur ten minste 15 %, meest bij voorkeur ten minste 20 %. In een geprefereerde voorkeursvorm wordt in een werkwijze volgens de uitvinding in vloeibare stikstof kooldioxide ingebracht zodat een mengsel wordt bekomen met ten minste 2 %, bij voorkeur ten minste 10%, meer bij voorkeur ten minste 15%, meest bij voorkeur ten minste 20% C02. De combinatie van kooldioxide in vloeibare stikstof is bacteriostatisch, bacteriocide en/of antiviraal. Vermoedelijk verleent C02 aan het mengsel een zuurtegraad of osmotische druk die zorgt voor een bacteriostatisch, bacteriocide of antiviraal effect.

Een biologisch materiaal kan verschillen in afmeting, variërend van een staalhoeveelheid in micrometergrootte tot een volledig orgaan in centimetergrootte. In een voorkeursvorm van een methode volgens de uitvinding werd een biologisch materiaal geselecteerd uit de lijst met micro- - organismen, virussen, bloed, cellen, weefsel, sperma, embryo’s, gameten, DNA, RNA, organen, orgaandelen, eiwitten, vaccins en/of combinaties daarvan.

Met de term “micro-organismen” wordt bedoeld een organisme dat te klein is om met het blote oog te zien. Hieronder vallen ééncelligen zoals bacteriën, protozoa waaronder amoeben, eencellige algen en schimmels waaronder gisten en hun voortplantingsvormen zoals sporen, hun toxines (exo- en endo-) en hun enzymen.

' In een voorkeursvorm van de uitvinding zijn bovenvermelde micro-organismen gisten, bij voorkeur gisten geschikt voor brouwerijprpcessen. In een andere yoorkeursvorm van de uitvinding zijn bovenvermelde micro-organismen, melkzuurbacteriën (lactic acid bacteria, LAB), bij voorkeur een Lactobacillus geschikt voor de aanmaak van yoghurt en/of kaas. In een andere voorkeursvorm van de uitvinding zijn bovenvermelde micro-organismen probiotisch organismen, bij voorkeur geselecteerd uit de groep omvattend Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Enterococcus spp., Escherichia spp., Streptococcus spp., en Saccharomyces spp., en/of combinaties daarvan.

, Met de term “virus” wordt bedoeld een hoeveelheid erfelijk materiaal, RNA of DNA, gewoonlijk ingesloten in een omhulsel van eiwit. Een virus is wordt niet tot de levende wezens gerekend omdat het zich niet zelfstandig kan voortplanten en omdat het geen metabolische activiteit vertoont. Voor het voortplanten heeft het virus de hulp nodig van een gastheerorganisme.

In een voorkeursvorm van onderhavige uitvinding wordt een virus in het bijzonder geselecteerd uit een lijst met adenovirussen, bunyavirussen, circoviridae, filovirussen waaronder ebola en het marburgvirus, flavivirussen, herpesvirussen, nidovirussen, orthomyxovirussen waaronder het influenzavirus, norovirus, paramyxovirussen, parvovirussen, papovavirussen waaronder het papillomavirus veroorzaker van onder andere baarmoederhalskanker, picornavirussen waaronder rhinovirus en hepatitis, polyomavirussen, poxvirussen, reovirussen, retrovirussen waaronder het HIV dat AIDS veroorzaakt, en rhabdovirussen.

In een geprefereerde voorkeursvorm van onderhavige uitvinding werden virussen geselecteerd uit de lijst met Ebola virussen, HIV virussen, Influenza virussen, Hepatitis virussen, en/of combinaties daarvan.

Met de term “bloed” wordt een samenstelling bedoeld waarin in een dragende vloeistof verschillende bestanddelen opgelost zijn en waarin een aantal cellulaire bestanddelen of aantal deeltjes met een bepaalde vorm voorkomen. In onderhavige uitvinding heeft de term bloed ook betrekking op bloedbestanddelen en/of combinaties daarvan. Met bloed kan ook bedoeld ’ worden navelstrengbloed.

In een voorkeursvorm van onderhavige uitvinding wordt bloed in het bijzonder geselecteerd uit een lijst met navelstrengbloed, rode bloedcellen, witte bloedcellen (leukocyten), bloedplaatjes, plasma, serum, myeloïde progenitor cellen, lymfoïde progenitor cellen, B-cellen, T-cellen, natural killer-cellen, dendritische cellen en (embryonale) stamcellen en/of combinaties daarvan.

In een voorkeursvorm van de uitvinding zijn de bovenvermelde cellen geselecteerd uit een lijst met eicellen, zaadcellen, stamcellen, plantencellen, en/of combinaties daarvan.

In een voorkeursvorm van de uitvinding is bovenvermeld weefsel huidweefsel, cornea weefsel, vasculair weefsel, meristeemweefsel, ovariumweefsel, hoornvlies (cornea), sciera, muskulo-skeletale, amnionmembraan, keratinocyten, tympano-ossiculaire en vasculaire greffes en/of combinaties daarvan.

In een voorkeursvorm van de uitvinding is bovenvermeld orgaan een lever of hart.

In een voorkeursvorm van de uitvinding is bovenvermeld orgaandeel een hartklep.

Om bewaring van het biologisch materiaal te verzekeren wordt het cryogeen mengsel bij een temperatuur gehouden van minstens -75°C, bij voorkeur minstens -80 °C, meer bij voorkeur -150 °C, meest bij voorkeur minstens -195,8 °C.

Het cryogeen mengsel wordt bij voorkeur in een afgesloten recipiënt bewaard, bijvoorbeeld een . vrieskast, Styrofoam™ box of Dewar. Dit heeft als voordeel dat gasvormig cryogeen in het recipiënt wordt gehouden en dus de periode waarin een gewenste temperatuur wordt aangehouden, wordt verlengd. Bij cryogenen zoals stikstof en kooldioxide heeft dit als voordeel dat een atmosfeer wordt gevormd met bacteriostatische, bacteriocide en/of antivirale werking. Bederf van biologisch materiaal door micro-organismen wordt onderdrukt.

In een verder aspect, voorziet de uitvinding verder een biologisch materiaal verkregen door een werkwijze volgens de uitvinding.

In een verder aspect, voorziet de uitvinding een cryogeen mengsel voor de cryopreservatie van biologische materialen, omvattend een cryogene vloeistof en minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C; waarin de ratio, uitgedrukt in volume procenten, van de cryogene vloeistof ten opzichte van de minstens één stof, ten minste 2 %, bij voorkeur ten minste 5 %, meer bij voorkeur ten minste 15 %, meest bij voorkeur ten minste 20 % bedraagt.

In een voorkeursvorm van de uitvinding omvat bovenvermeld cryogeen mengsel vaste kooldioxide partikels gesuspendeerd in vloeibare stikstof.

In een laatste aspect, voorziet de uitvinding in gebruiken van een cryogene mengsel volgens de uitvinding. In het bijzonder voorziet de uitvinding het gebruik van een cryogeen mengsel volgens een uitvoeringsvorm van de uitvinding als bewaarmiddel, specifiek als cryogeen bewaarmiddel, voor een biologisch materiaal.

Indien in een recipiënt omvattend cryogene vloeistof en minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C,. geen cryogene vloeistof wordt bijgevuld, verdampt de cryogene vloeistof en blijft de tweede cryogene stof over. Deze zorgt voor verlengde bewaring van het biologisch materiaal.

Bij voorkeur worden biologische materialen bewaard, dit is zonder verlies van biologische activiteit na ontdooiing, gedurende een periode van minstens 10 weken, bij voorkeur minstens 100 weken, meest bij voorkeur minstens 1000 weken.

Bij voorkeur is de tweede cryogene stof kooldioxide. Kooldioxide heeft een sublimatiepunt dat hoger is dan het kookpunt van stikstof, bijvoorbeeld C02 is gestabiliseerd bij -78.5 °C., wat ook een goede temperatuur is voor bewaring. De overblijvende C02 sneeuw heeft een levensduur van enkele weken. Bijgevolg zal een bewaring met een cryogeen mengsel volgens de uitvinding, minder kritisch zijn. Bij een korte onderbreking van de aanvulling met bijvoorbeeld stikstof, zal niet het risico ontstaan op te snelle opwarming van de inhoud. Bewaring van het biologisch materiaal wordt minder snel gecompromitteerd.

In een andere voorkeursvorm wordt een cryogeen mengsel, volgens een voorkeursvorm van de uitvinding, gebruikt als bacteriostatisch, bacteriocide of antiviraal middel voor een biologisch materiaal. De kans op crosscontaminatie is verkleind tegenover gebruik van cryogene vloeistof zonder aanwezigheid van minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C,

Bij voorkeur wordt een cryogeen mengsel volgens een voorkeursvorm van de uitvinding gebruikt als bewaarmiddel en/of bacteriostatisch, bacteriocide of antivirale middel voor cellen. Meest bij voorkeur zijn de cellen daarbij geselecteerd uit de lijst met eicellen, zaadcellen, stamcellen, plantencellen, 8-cellige embryos, en/of combinaties daarvan. Dit heeft als voordeel dat materiaal langer beschikbaar blijft voor bijvoorbeeld wetenschappelijk onderzoek, kunstmatige inseminatie of transplantatie.

In een andere voorkeursvorm, word een cryogene suspensie volgens een voorkeursvorm van de uitvinding gebruikt als bewaarmiddel en/of bacteriostatisch, bacteriocide of antivirale middel voor een weefsel. Meest bij voorkeur is het weefsel daarbij geselecteerd uit een lijst met meristeemweefsel, ovariumweefsel, hoornvlies (cornea), sciera, muskulo-skeletale, amnionmembraan, keratinocyten, tympano-ossiculaire en vasculaire greffes, en/of combinaties daarvan. Dit heeft als voordeel dat staalnames in aantal kunnen worden verminderd.

Het is vanzelfsprekend dat de beschrijving van de onderhavige uitvinding binnen zijn draagwijdte ' betrekking kan hebben op alternatieve uitvoeringen van de uitvinding.

Claims (10)

1. Werkwijze voor cryopreservatie van een biologisch materiaal in een bacteriostatisch, bacteriocidaal of antiviraal cryogeen mengsel omvattend de stappen: a) selecteren van een cryogene vloeistof en minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C, b) samenbrengen van de minstens één stof en de cryogene vloeistof, zodat een cryogeen mengsel wordt bekomen met een temperatuur van ten hoogste -75°C c) het biologisch materiaal onderdompelen in, of in de nabijheid brengen van het cryogeen mengsel, d) in stand houden van een temperatuur van ten hoogste -75°C voor cryopreservatie van het biologisch materiaal.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij stap b) omvat: omzetten van de minstens één stof naar een poedervormige sneeuw, alvorens de poedervormige sneeuw toe te voegen aan de cryogene vloeistof en te mengen.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij in het cryogeen mengsel de ratio in volume procenten van de cryogene vloeistof ten opzichte van de minstens één stof, ten minste 2 %, bij voorkeur ten minste 5 %, meer bij voorkeur ten minste 15 %, meest bij voorkeur ten minste 20 % bedraagt.

4. Werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 3, waarbij het cryogeen mengsel omvat vloeibare stikstof en een stof geselecteerd uit de lijst met kooldioxide (C02), distikstofoxide (N20), ozon (03), argon, cyclopentaan en vloeibaar aardgas (LNG).

5. Werkwijze volgens één der conclusies 1 tot 4, waarbij het biologisch materiaal geselecteerd werd uit een lijst met micro-organismen, virussen, bloed, cellen, weefsel, sperma, embryo's, gameten, DNA, RNA, organen, orgaandelen, eiwitten, vaccins en/of of combinaties daarvan.

5. Gebruik van een bacteriostatisch, bacteriocide of antiviraal cryogeen mengsel voor de cryopreservatie van biologische materialen, omvattend een cryogene vloeistof en minstens één stof waarvan een faseovergang ligt tussen het kookpunt van de cryogene vloeistof en -75°C; waarin de ratio, uitgedrukt in volume procenten, van de minstens één stof ten opzichte van de cryogene vloeistof, ten minste 2 %, bij voorkeur ten minste 5 %, meer bij voorkeur ten minste 15 %, meest bij voorkeur ten minste 20 % bedraagt.

7. Gebruik volgens conclusie 6, waarbij het biologisch materiaal geselecteerd werd uit. een lijst met micro-organismen, virussen, bloed, cellen, weefsel, sperma, embryo's, gameten, DNA, RNA, organen, orgaandelen, eiwitten, vaccins en/of combinaties daarvan.

8. Gebruik volgens conclusie 7 of werkwijze volgens conclusie 5, waarbij virussen worden geselecteerd uit de lijst met Ebola virussen, HIV virussen, Influenza virussen, Hepatitis virussen en/of combinaties daarvan.

9. Gebruik volgens conclusie 7 of werkwijze volgens conclusie 5, waarbij cellen geselecteerd zijn uit de lijst met eicellen, zaadcellen, stamcellen, plantencellen en/of combinaties daarvan.

10. Gebruik volgens conclusie 7 of werkwijze volgens conclusie 5, waarbij weefsel geselecteerd is uit een lijst met meristeemweefsel, ovariumweefsel, hoornvlies (cornea), sciera, muskulo-skeletale, amnionmembraan, keratinocyten, tympano-ossiculaire en vasculaire greffes en/of combinaties daarvan.