KR20080087148A - 저온보호 조성물 및 그 이용방법 - Google Patents

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Abstract

나노구조, 액체 및 최소 하나 이상의 저온보호제를 포함하는 저온보호제가 제공된다.
저온보호, 저온보존, 세포, 체액, 정자

Description

저온보호 조성물 및 그 이용방법{CRYOPROTECTIVE COMPOSITIONS AND METHODS OF USING SAME}
본 발명은 신규의 저온보호 조성물 및 그 이용방법에 관한 것이다.
생물학적 물질은 부패 및 소멸되는 것이 자연의 이치이다. 반면에 냉장기술은 부패성 물질의 부패속도를 지연시키는 수단을 제공한다. 극저온은 장기간 동안 생명체를 활동 정지상태로 보관하는 수단임이 입증되었다. 저온생물과학 분야는 50 여년 전 글리세롤을 유효 보호제로서 사용하여 0도 이하의 온도에서 장기간에 걸쳐 살아있는 정자가 보존되는 것이 최초로 발견된 후에 공식적으로 시작되었다[Polge C, Smith AU and Parkes AS (1949), Nature, 164, 666]. 이것은 개선된 기술의 발견을 가능하게 하였다. 적절히 제어되지 않은 저온보존은 세포의 파괴 및 세포의 생존능력의 저감으로 이어질 수 있다.
저온생물학은 광범위하게 적용되고, 많은 종류의 생물학적 물질을 장기 보존하기 위한 해결책을 제공할 가능성이 있다.
세포 이식 및 조직 이식은 빠르게 당뇨병[Janjic et ah, Pancreas 13: 166-172, 1996], 심장판막치환술[Feng et ah, Eur J Cardiothorac Surg 6: 251- 255, 1992], 백내장[Taylor Cryobiology 23: 323-353, 1986], 피부치환술[De Luca et ah, Burns 15: 303-309, 1989], 성형수술 및 재건수술[Hibino et ah, J Craniomaxillofac Surg 24: 346-351, 1996]을 포함한 그러나 이들에 한정되지 않는 다수의 질병 및 질환의 중요한 치료방법이 되어가고 있다.
세포 이식 및 조직 이식은 광범위한 승인되고 사용되고 있으므로, 세포 및 조직의 장기 보관방법을 개선할 필요성도 증대되었다.
세포 저온보존법은 특히 건강한 사람 및 건강하지 않은 사람의 모두의 체외 수정 분야에 관련이 있다. 예를 들면, 건강한 남성은 특히 직업상의 위험(예, 방사선 조사)에 노출되므로 보존해야될 정자를 제공하기를 원할 수 있다. 화학요법, 방사선 조사 또는 고환 생검을 받는 남성도 자신들의 생식능력을 보존하기 위해 치료 전에 자신들의 정자를 보존하기를 원할 수 있다.
전세계 인구의 20%는 저생식능력(sub-fertility) 질환을 가지고 있고, 그 중에서 60%는 남성인 것으로 평가된다. 지난 50년 동안, 평균 정자의 수 및 정자의 질은 꾸준히 감퇴 되어왔다(세계보건기구, 2005년). 정자 생산력이 극히 낮은 저생식능력의 남성(심각한 올리고테라토스테노주스퍼미아; oligoteratoasthenozoospermia, O.T.A.)은 젊은 나이에 정자를 보존하면 아이를 가질 수 있는 기회가 증대될 것이다.
거세되지 않은 숫소 및 거세되지 않은 숫퇴지와 같은 가축의 정자를 보존하면 우유 및 식용육 시장에 공헌하는 유전자 개량에 도움이 된다.
여성의 생식 세포를 보존하고 기증자 난자은행을 설립하면 자신의 난모세포를 생성할 수 없는 여성을 위한 난모세포의 기증이 촉진되고 비용이 절감될 수 있 을 것이다. 난자의 생존 보관 방법은 생식 활동을 지연시키기를 원하는 여성에게 유익할 것이다. 또, 난소 조직의 보존은 생식 능력이 손상될 우려가 있는 치료를 받으려는 여성에게 유익할 것이다.
다수의 배아 저온보관법은 확립되어 있고, 통상 체외 수정(IVF)을 받은 여성의 배아를 보존하는데 이용된다. 이것은 여성이 아이를 가지기를 원할 때마다 난소를 자극하기 위해 실시하는 지속적인 호르몬 치료의 해로운 부작용의 가능성을 방지해 준다. 또, 체외 수정 치료법은 스트레스를 주고 비용이 고가이다. 저온보관법은 체외 수정시 여성이 겪어야 하는 난자 회수의 횟수를 줄여주는 한편 임신이 될 가능성을 복수회 제공함으로써 체외 수정의 불편, 불쾌 및 비용을 저감시키는데 도움이 된다. 그러나, 상기 기법은 여전히 기술적으로 매우 복잡하고, 냉동 배아의 많은 비율(50-60 %)이 해동 처리 후에 생존하지 못하는 문제점이 있다.
정자, 난자 및 배아의 보존은 또한 멸종위기의 동물의 보존 및 창시 유전자이식 동물의 보존에도 관련이 있다.
전체 장기의 장기간의 보존은 저온생물과학에 주어진 특별한 과제이다. 대부분의 장기 이식은 기증자의 사망 직후에 수행된다. 장기가 생체 외에서 유지하는 시간은 무산소 손상 및 허혈성 손상을 감소시키기 위해 최소화된다. 따라서 이식된 장기는 장기의 회복이나 장기의 치료를 위한 시간 없이 즉각 장기이식자가 생명유지장치로부터 제거된 직후에 기능 해야만 한다. 또, 조직 적합검사 및 교차 적합검사의 상당한 개선에도 불구하고 기증자로부터의 적출과 이식 사이에 조직 적합검사 및 교차 적합 검사를 실시할 시간도 없다.
적출된 장기를 상당한 시간 동안 보존하는 것은 위의 문제점들 중의 많은 문제점을 극복하도록 도와준다. 장기 은행은 필요한 장기이식의 총수에 대한 장기의 입수가능성의 부족분인 이식 의약품의 문제점을 해결하는데도 도움을 준다.
그러나, 세포의 냉동 과정은 세포에 가해지는 열 충격, 삼투 충격, 및/또는 기계적 충격, 및 세포의 조직, 특히 원형질막을 손상시킬 수 있는 결정의 형성에 기인된 가혹한 과정이 될 수 있다. 또, 냉동 과정 및 해동 과정은 세포를 손상시킬 수 있는 세포의 탈수의 원인이 된다. 저온보호제(cryoprotectant)를 사용하면 이들 문제들 중의 일부를 완화시키는데 도움이 된다. 일반적으로 사용되는 저온보호제는 글리세롤, 히드록시에틸 전분(HES) 에틸렌 글리콜 및 DMSO를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 저온보존과정은 낮은 세포 생존가능성으로 인해 방해를 받고 있고, 많은 조직의 종류 및 장기는 손상되고 기능이 약화된다.
예를 들면, 정액을 위한 허용 가능한 최상의 저온보호제는 TRIS 완충액, 난황 및 글리세롤(TES 완충액)으로 구성된 아커만 매체(Ackerman's medium)이다. 그러나, 글리세롤은 정자의 생존 및 기능에 유독한 작용을 가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일반적으로 실행되기는 하지만 정자의 저온보관 방법은 냉동 및 해동 과정 후에 단지 25-30 % 세포만이 생존성에 관련된다. 소수의 정자만이 난자를 수정시킬 수 있고, 더 적은 수의 정자는 저온보관 후에 생존 배아로 된다[Thomas CA et al, 1998, Bio. Reprod., 58:786-793].
현재 포유류 난모세포를 용이하게 생식할 수 있는 상태로 저온보존하는 능력은 개발되어 있지 않고, 산발적으로 성공되는 사례가 있다. 성숙 난모세포의 냉동 및 해동에 의해 감수분열 방추체가 분열되고, 그 결과 상기 난자로부터 발생하는 배아 내의 이수성의 가능성이 증대되는지의 여부는 지속적인 관심 사항이 되었다. 기증된 난모세포의 저온보관에 관련하여 성공된 사례를 보여주는 다수의 보고가 있다(Polak de Fried et al, 1998; Tucker et al, 1998a; Yang et al, 1998). 이 보고서에 따르면 저온보관된 기증자 난모세포로부터 6회의 임신을 통해 10명의 아기가 태어났다. 또, 난세포질 이동(ooplasmic transfer)을 위한 냉동된 기증자 난모세포를 사용하여 해동된 난세포질 기증 후에 트윈(twin)을 성공적으로 이동시킨 것이 보고되었다. 생쥐의 난모세포를 저온보존하는 연구의 결과, 매우 다른 생존율 및 수정율이 보고되었다[Carroll et al, 1993; Carroll et al, 1990; Cohen et al, 1988; George et al, 1994; Glenister et al, 1990; Gook et al, 1993; Whittingham et al., 1977].
일부의 식물 조직, 미세조류(microalgae) 및 원생동물은 보호를 목적으로 하는 저온보관에 성공했으나, 많은 종(species)들은 저온보관에 실패하였다[Methods in Molecular biology, 14, Cryopreservation and Freeze- Drying Protocols, Humana Press, 1995].
세포의 저온보관에 관련된 문제점들은 조직의 저온보관의 경우는 더 악화되어 나타나고, 전체 장기의 저온보관의 경우는 더욱 심하게 악화되어 나타난다. 많은 상이한 세포의 종류가 존재하고, 각각의 세포는 최적의 저온보존을 위한 고유의 필요조건을 가지고 있으므로, 단일의 열적 프로토콜(thermal protocol)이 모든 세포들에게 가해졌을 때 각각 세포는 회복이 제한을 받는다. 세포외의 얼음은 조직 이나 장기, 특히 얼음이 형성될 가능성이 있는 혈관 구성요소의 구조적인 일체성에 기계적 손상을 가하는 원인이 될 수 있다. 기계적 파괴는 저온의 열적 스트레스가 발생했을 때 얼음의 결정들 사이에 존재하는 유리질 고체에 의해 발생한다. 이 기계적 파괴에 의해 장기는 다수의 부분으로 분리된다. 세포들 사이에 형성된 부착부 및 세포와 그 기저막 사이에 형성된 부착부가 붕괴된다. 침입수(interstitial water)의 삼투성 이동에 의해 유발되는 기계적 스트레스가 존재한다. 이들 각각은 손상을 유발하는 중요한 추가의 근원이 된다.
따라서, 전술한 한계들을 회피하는 개선된 저온보호를 위한 방법 및 조성이 필요하고, 그 방법 및 조성이 매우 유리하다는 인식이 광범위하게 존재한다.
발명의 요약
본 발명의 일 관점에 따르면, 나노구조, 액체 및 최소 하나 이상의 저온보호제를 포함하는 저온보호 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 상기 세포 물질을 나노구조 및 액체를 포함하는 조성물에 접촉시키는 단계; 및 상기 세포 물질을 저온보존 온도의 지배 하에 두고, 그 결과 상기 세포 물질을 저온보존하는 단계를 포함하는 세포 물질을 저온보존하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 상기 세포 물질을 나노구조 및 액체를 포함하는 조성물에 접촉시키는 단계 및 상기 세포 물질을 저온보존 온도의 지배 하에 두는 단계; 상기 저온보존된 세포 물질을 해동하는 단계; 및 상기 조성물을 제거하고, 그 결과 저온보존된 세포 물질을 회복하는 단계를 포함하는 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 나노구조, 액체 및 최소 하나 이상의 저온보호제를 포함하는 저온보호 조성물을 포함하는 저온보존 용기가 제공된다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 나노구조들 및 하나의 액체를 포함하는 저온보존 용기가 제공된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 저온보호 조성물은 최소 하나 이상의 저온보호제를 더 포함한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 상기 액체의 규칙 유체 분자에 의해 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하고, 상기 코어 물질 및 상기 규칙 유체 분자들의 외피는 정상 물리적 상태에 있다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 히드록시아파타이트(hydroxyapatite)로부터 제조된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 유체 분자들은 최소 2개 이상의 균질 유체 조성을 포함하는 비균질 유체 조성물을 포함하고, 상기 유체는 상기 최소 2개 이상의 균질 유체 조성물의 최소 하나 이상과 동일하다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 유체 분자들 중 최소 하나 이상의 부분은 기체 상태이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조의 농도는 1020/리터 미만이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조의 농도는 1015/리터 미만이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 집단을 형성할 수 있다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조는 상호 장거리 상호작용을 유지할 수 있다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 조성물은 물에 비해 향상된 초음파 속도를 특징으로 한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 코어 물질은 강유전 물질, 강자성 물질, 및 압전 물질로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 코어 물질은 결정질 코어 물질이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 액체는 물이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조의 각각은 상기 액체의 비중과 동일하거나 낮은 비중을 특징으로 한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 나노구조 및 액체는 물의 완충 능력보다 큰 완충 능력을 포함한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 저온보호 조성물은 10 체적% 미만의 글리세롤을 포함한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 저온보호 조성물은 글리세롤이 없다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 최소 하나 이상의 저온보호제는 아세트아미드, 아가로스, 알기네이트, 1-아날린, 알부민, 암모늄 아세테이트, 부탄디올, 콘드로인틴 설페이트, 클로로포름, 콜린, 덱스트란, 디에틸렌 글리콜, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에리스리톨, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 글루코스, 글리세롤, 알파-글리세로포스페이트, 글리세롤 모노아세테이트, 글리신, 히드록시에틸 전분, 이노시톨, 락토스, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 말토스, 마니톨, 마노스, 메탄올, 메틸 아세트아미드, 메틸포름아미드, 메틸 요소, 페놀, 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 프롤린, 프로필렌 글리콜, 피리딘 N-옥사이드, 리보스, 세린, 소디움 브로마이드, 소디움 클로라이드, 소디움 아이오다이드, 소디움 나이트레이트, 소디움 설페이트, 소르비톨, 스크로스, 트레할로스, 트리에틸렌 글리콜, 트리메틸아민 아세테이트, 요소, 발린 및 키시로스로부터 구성된 그룹으로부터 선택된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 저온보호 조성물은 안정제를 더 포함한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 안정제는 2가의 양이온, 유리기 포착제, 항산화제, 에틸렌 억제제 또는 열충격 단백질이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 에틸렌 억제제는 에틸렌 생합성 억제제 또는 에틸렌 작용 억제제이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 저온보호 조성물은 완충액 또는 매체를 더 포함한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 완충액은 Tris 완충액 또는 포스페이트 완충액이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포 물질은 체액, 세포 배양액, 세포 현탁액, 세포 매트릭스, 조직, 장기 및 유기체를 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 체액은 정액이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 정액은 올리고스퍼믹 남성, 테라토스퍼믹 남성, 어센부주스퍼믹 남성으로부터 추출된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포 물질은 식물 세포 물질이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 식물 세포 물질은 그로스 니이들, 잎사귀, 뿌리, 수피, 줄기, 지하경, 캘러스 세포, 원형질체, 세포 현탁액, 장기, 분열조직, 씨 및 배아로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포 물질은 미생물 세포 물질이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포 물질은 포유류 세포 물질이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 포유류 세포 물질은 줄기 세포, 정자, 난자 및 배아로 구성된 그룹으로부터 선택된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포 물질은 유전자 조작된 것이다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 세포 물질을 저온보존하는 방법은 (a) 단계 전에 세포 물질을 상태조절하는 단계를 더 포함한다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 상태조절단계는 안정제 처리, 저온 적응, 열충격 처리 및/또는 동결건조에 의해 실행된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 단계 (a) 및 단계 (b)는 동시에 수행된다.
후술하는 본 발명의 바람직한 실시예의 추가의 특징에 따르면, 상기 저온보존 온도는 약 80 ℃미만이다.
본 발명은 새로운 저온보호 조성물 및 저온보존 방법을 제공함으로써 공지의 구성의 단점을 성공적으로 극복한다.
다르게 정의되지 않는 한 본 명세서에 사용된 기술용어 및 과학용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 전문가가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 실시 및 시험 시에 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 등가의 방법 및 물질들을 사용할 수 있으나, 적합한 방법 및 물질들은 후술되는 것이다. 본 명세서에 기재되어 있는 모든 특허공개, 특허출원, 특허등록, 및 기타 문헌들은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 도입된 것이다. 본 명세서(정의를 포함)의 내용과 불일치되는 경우, 본 명세서가 우선한다. 또, 물질들, 방법들, 및 실시예들은 설명을 위한 예시일 뿐이고, 이것이 본 발명을 제한하지 않는다.
본 명세서에는 첨부한 도면을 참조로 하여 본 발명의 예시가 기술되어 있다. 특히, 도면에 도시된 특정의 사항은 예시적인 것이고 본 발명의 바람직한 실시예의 도식적인 설명을 위한 것일 뿐이고, 본 발명의 원리 및 개념을 용이하게 이해하는데 가장 유용한 것으로 생각되는 것을 제공한 것이다. 이러한 점에서, 본 발명의 기본적인 이해를 위해 필요한 것보다 상세하게 발명의 세부 사항을 도면에 도시하려는 시도는 하지 않았고, 본 기술 분야의 전문가는 도면을 참조한 발명의 상세한 설명을 통해 본 발명의 다수의 형태를 구현할 수 있는 방법을 이해할 수 있을 것이다.
도 1A 내지 도 1D는 표준 저온보호 완충액 TES에 가해졌을 때의 나노구조를 포함하는 액체의 저온보호 효과를 도시한 막대 그래프이다.
도 1A는 나노구조를 포함하는 액체의 존재 하에서 정자의 활력에 미치는 저온보존의 영향을 도시한 막대 그래프이다.
도 1B는 나노구조를 포함하는 액체의 존재 하에서 정자의 운동성에 미치는 저온보존의 영향을 도시한 막대 그래프이다.
도 1C는 나노구조를 포함하는 액체의 존재 하에서 정자의 수정 능력에 미치는 저온보존의 영향을 도시한 막대 그래프이다.
도 1D는 나노구조를 포함하는 액체의 존재 하에서 정자의 DNA 단편화(fragmentation)에 미치는 저온보존의 영향을 도시한 막대 그래프이다.
도 2는 본 발명의 액체 조성물 내에서의 절대 초음파 속도의 등온 측정 결과를 도시한 도면이다.
도 3은 557 nm의 흡광도에 의해 측정된 다양한 수 조성물(water compositions)의 소디움 히드록사이드 적정을 도시한 그래프이다.
도 4A 내지 도 4C는 3회의 실험에서 pH에 의해 측정된 나노구조를 포함한 물 및 RO수(RO water)의 소디움 히드록사이드 적정을 도시한 그래프이다.
도 5A 내지 도 5C는 3회의 실험에서 pH에 의해 측정된 나노구조를 포함한 물 및 RO수의 소디움 히드록사이드 적정을 도시한 그래프이다.
도 6A 내지 도 6C는 3회의 실험에서 pH에 의해 측정된 나노구조를 포함한 물 및 RO수의 염화수소산 적정을 도시한 그래프이다.
도 7은 3회의 실험에서 pH에 의해 측정된 나노구조를 포함한 물 및 RO수의 염화수소산 적정을 도시한 그래프이다.
도 8A 내지 도 8C는 557 nm의 흡광도에 의해 측정된 나노구조를 포함한 물 및 RO수의 소디움 히드록사이드 적정(도 8B 및 도 8C)을 도시한 그래프이다.
도 9A 및 도 9B는 RO수(도 9A) 및 나노구조를 포함한 물(도 9B)의 염화수소산 적정 후의 큐벳의 사진이다. 도시된 큐벳에는 1 μl의 염화수소산이 첨가된 것이다.
도 10A 내지 도 10C는 RF수(도 10A), RF2수(도 10B), 및 RO수(도 10C)의 염화수수산 적정을 도시한 그래프이다. 도면상의 화살표들은 제2방사를 지적한다.
도 11은 RO수에 비교된 FR2수의 염화수소산 적정을 도시한 그래프이다. 실험은 3회 반복 실시되었다. RO수에 대해 3회 실시한 실험의 평균치가 작도되었다.
도 12A 및 도 12B는 2종류의 상이한 Taq 폴리머라제를 이용하여 도 7에 도시된 프로토콜에 따라 가열 후 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 존재 하 및 비존재 하에 얻어진 PCR 생성물을 도시한 에티디움 브로마이드로 염색된 DNA 겔의 사진이다.
도 13은 2종의 상이한 Taq 폴리머라제를 사용하여 실시예 8에 설명된 프로토콜에 따른 가열 후에 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 존재하 및 비존재하에서 얻어진 PCR 생성물을 보여주는 에티디움 브로마이드로 염색된 DNA 겔의 사진이다.
바람직한 실시예의 설명
본 발명은 새로운 저온보호 조성물 및 그 이용 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 세포 물질을 저온보존하기 위해 사용되어 그 세포 물질의 보관, 수송 및 취급을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 실시예를 상세히 설명하기 전에, 본 발명은 후술하는 설명이나 실시예들에 의해 예시된 구체적인 내용에 제한되지 않음을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시예들이 가능하고, 다양한 방법으로 실행될 수 있다. 또, 본 명세서에 사용된 전문용어 및 기술용어는 설명을 목적으로 한 것으로서, 이들 용어가 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다.
저온생물학은 광범위하게 적용되고, 많은 종류의 생물학적 물질의 장기 보관을 위한 해결책을 제공할 가능성이 있다. 그러나, 저온보존은 적절히 제어되지 않은 경우 세포의 손상을 유발할 수 있고, 열 충격, 삼투 충격, 및/또는 기계적 충격, 및 세포의 조직, 특히 원형질막을 손상시킬 수 있는 결정의 형성에 기인되어 세포의 생존능력을 감소시킬 수 있다. 또, 냉동 과정 및 해동 과정은 세포를 손상시킬 수 있는 세포의 탈수의 원인이 된다. 저온보호제(즉, 저온보호제)를 사용하면 이들 문제들 중의 일부를 완화시키는데 도움이 된다. 일반적으로 사용되는 저온보호제는 글리세롤, 히드록시에틸 전분(HES) 에틸렌 글리콜 및 DMSO를 포함한다. 이들 저온보호제는 냉동 및 해동시에 세포의 손상을 감소시키기 위해 필수적이기는 하지만, 세포에 유독한 것이기도 하다. 예를 들면, 정자 세포에 미치는 글리세롤의 유독성 효과는 2 % 미만의 농도에서도 보고되어 있다(Tulandi and Mclnnes, 1984). 또, 정자의 운동성은 글리세롤의 농도가 증가함에 따라 감소되는 것으로 밝혀졌다(Weidel and Prins, 1987, J Androl., Jan-Feb;8(l):41-7; Critser et al, 1988, Fertil Steril. Aug; 50(2):314-20). 또, 저온보호제의 존재는 삼투 스트 레스에 기인된 정자 세포의 손상을 유발하는 것으로 밝혀졌다(Critser et al, 1988, Fertil Steril. Aug; 50(2):314- 20).
따라서, 전술한 결점들을 극복한 새로운 저온보호 조성물을 얻는 것이 매우 바람직하다.
본 발명자는 본 발명의 연구 중에 나노구조(예를 들면, 미국특허출원 US60/545,955 및 US10/865,955, 및 국제특허공개 WO2005/079153에 기재된 나노구조)를 포함하는 조성물을 사용하여 세포 물질을 효과적으로 저온보호할 수 있음을 밝혀냈다.
후술하는 설명 및 실시예에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명자는 나노구조 및 저온보호제(글리세롤)를 포함하는 완충액의 존재하의 액체는 저온보호처리 후의 정자 세포의 보호 및 해동처리 후의 정자의 질을 증대시키는데 있어서 완충액만을 사용하는 것에 비해 효과가 있다는 것을 증명하였다. 따라서, 본 발명의 조성물은 저온보호를 위해 필요한 독성의 저온보호제(예, 글리세롤)의 사용량을 감소시킴으로써 저온보호제의 악영향을 제한하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 관점에 따르면, 나노구조, 액체 및 필요에 따라 적어도 하나의 저온보호제를 포함하는 저온보호 조성물이 제공된다.
본 명세서에 사용된 "저온보호 조성물(cryoprotective composition)"이라는 용어는 냉동 및 해동 중에 세포의 손상(예, 세포내의 얼음 결정 형성 및 세포외의 얼음 결정 형성에 기인된 기계적 손상; 및 세포외의 얼음의 형성에 의한 용질의 상태 변화에 의해 발생된 삼투력에 의한 손상)을 감소시키는 액상의 조성물을 의미한 다.
본 명세서에 사용된 "저온보호제(cryoprotective agent)"라는 용어는 냉동 및 해동 중의 세포의 손상을 감소시킴에 의해 저온보호 과정을 촉진시키는 화학물질 또는 화학용액을 의미한다. 저온보호제는 이것이 사용되는 조건(즉, 특정의 노출 시간 동안의 특정의 농도 및 특정의 오스몰농도(osmolarity)의 매체 내의 세포) 하에서 세포 물질에 비독성을 가지는 것이 바람직하다. 본 발명의 이 관점에 따라, 저온보호제는 세포 침투성을 가지거나 세포 비침투성을 가질 수 있다. 저온보호제의 예는 탈수제, 삼투제 및 유리화 용질(즉, 저온에 노출되었을 때 용액을 결정성 고체로 변태시키기 보다는 유리로 변태시키는 용질)을 포함한다. 그러나, 이들 물질에 한정되지 않는다.
이론에 구애됨이 없이, 비침투성 저온보호제는 세포내 수의 유출을 억제함으로써 세포의 수축이 최소 임계 체적을 초과하지 않도록 방지하는 것으로 생각된다. 세포의 수축을 감소시킴으로써, 저온보호제는 세포내 유체의 과도농축을 감쇄하고, 그 결과 단백질의 석출(precipitation)을 억제한다. 저온보호제의 침투에 의해 내부에서 형성되는 얼음의 양이 감소되고, 그 결과 세포막 및 세포소기관들이 물리적으로 손상되는 양이 감소된다.
각 세포는 그 종류 및 환경에 따라 특수한 방식으로 개개의 저온보호제에 대해 반응하게 되므로 저온보호제 및 그 농도는 실험에 기초하여 선택되는 것이 바람직하다. 통상, 조직은 세포 현탁액에 비해 투과성이 우수한 저온보호제를 필요로 한다. 반대로, 소 세포의 저온보호는 세포막을 투과하는 저온보호제가 불필요할 수 있다. 또, 저온보호제 및 그 농도는 후술하는 바와 같이 저온보호 방법 및 저온보호 단계에 따라 선택된다.
본 발명의 상기 관점에 따라 사용될 수 있는 저온보호제의 예(그러나, 이 예에 한정되지 않음)는 아세트아미드, 아가로스, 알기네이트, 1-아날린, 알부민, 암모늄 아세테이트, 부탄디올, 콘드로인틴 설페이트, 클로로포름, 콜린, 덱스트란, 디에틸렌 글리콜, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에리스리톨, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 글루코스, 글리세롤, 알파-글리세로포스페이트, 글리세롤 모노아세테이트, 글리신, 히드록시에틸 전분, 이노시톨, 락토스, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 말토스, 마니톨, 마노스, 메탄올, 메틸 아세트아미드, 메틸포름아미드, 메틸 요소, 페놀, 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 프롤린, 프로필렌 글리콜, 피리딘 N-옥사이드, 리보스, 세린, 소디움 브로마이드, 소디움 클로라이드, 소디움 아이오다이드, 소디움 나이트레이트, 소디움 설페이트, 소르비톨, 스크로스, 트레할로스, 트리에틸렌 글리콜, 트리메틸아민 아세테이트, 요소, 발린 및 키시로스를 포함한다.
본 발명의 저온보호 조성물은 20% 미만의 글리세롤을 포함하는 것이 바람직하고, 글리세롤을 전혀 포함하지 않는 것이 더욱 바람직하다(그 이유에 대해서는 후술함).
전술한 바와 같이 본 발명의 상기 관점의 저온보호 조성물은 나노구조 및 액체를 더 포함한다.
본 명세서에 사용된 "나노구조(nanostructure)"라는 용어는 각각 나노미터나 나노미터 이하의 치수를 가지므로 통상 "나노입자(nanoparticle)"라고 부르는 하나 이상의 입자를 포함하는 마이크로미터 이하의 치수를 가지는 구조를 의미한다. 이 구조의 상이한 원소들(예, 나노입자들, 분자들) 사이의 간격은 수십 피코미터(picometer) 이하 이거나(이 경우, 상기 나노구조는 "연속 나노구조(continuous nanostructure)"라고 부른다), 수백 피코미터 내지 수백 나노미터의 범위를 가질 수 있다(이 경우, 상기 나노구조는 "불연속 나노구조(discontinuous nanostructure)"라고 부른다). 따라서, 본 실시예들의 나노구조는 하나의 나노입자를 포함하거나, 다수의 나노입자의 배열을 포함하거나, 하나 이상의 나노입자 및 하나 이상의 분자의 배열을 포함할 수 있다.
전술한 조성물의 액체는 수성 액체(예, 물)인 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 관점의 바람직한 일실시예에 따르면, 본 발명의 저온보호 조성물의 나노구조는 나노미터 치수의 코어 물질을 포함하고, 그 외측에 규칙 유체 분자(ordered fluid molecules)가 상호 정상 물리적 상태로 감싸고 있다.
코어 물질의 예는 강유전 물질(ferroelectric material), 강자성 물질, 및 압전 물질이 포함된다(그러나, 이들 물질에 한정되지 않는다).
강유전 물질은 일정한 온도 범위에 걸쳐 전기장을 가하면 역전 또는 재배열될 수 있는 영구적 전기 분극을 유지하는 물질이다. 강자성 물질은 자기장을 가하면 역전될 수 있는 영구적 자성을 유지하는 물질이다. 상기 나노구조는 코어 물질의 강유전 특성 또는 강자성 특성을 유지함으로써 나노 치수의 환경 내에 마이크로 치수의 물리적 특성을 부여하는 특수한 특징을 결합시킨다.
상기 코어 물질은 또 결정질 구조를 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 "규칙 유체 분자(ordered fluid molecules)"라는 용어는 상호 관련된, 예를 들면 분자들 사이에 상관관계를 가지는 유체 분자들의 조직적 배열을 의미한다. 예를 들면, 하나의 유체 분자의 순간 변위는 코어 물질을 둘러싸고 있는 하나 이상의 다른 유체 분자들의 순간 변위와 상관성을 가질 수 있다.
본 명세서에 사용된 "정상 물리적 상태(steady physical state)"라는 용어는 대상물 또는 분자들이 적어도 하나의 극소치(local minimum)를 가지는 임의의 포텐셜에 의해 구속되는 상태를 의미한다. 상기 포텐셜의 대표적인 예에는 반데르발스 포텐셜, 유카와 포텐셜, 레나르드-존스 포텐셜 등이 포함된다(그러나, 이들 포텐셜에 한정되지 않는다). 다른 형태의 포텐셜도 고려될 수 있다.
상기 외피의 규칙 유체 분자들는 저온보호 조성물의 액체 분자와 동일한 것이 바람직하다. 상기 외피의 유체 분자들은 저온보호 조성물의 액체 분자와 동일하지 않은 추가의 액체를 포함할 수 있고, 그 결과 외피는 불균질 유체 조성물을 포함할 수 있다.
규칙 유체 분자의 외피의 형성에 기인되어, 본 실시예의 나노구조는 액체의 비중 이하의 비중을 가지는 것이 바람직하다.
상기 유체 분자는 액체 상태, 기체 상태, 또는 이들 두 상태가 혼합된 상태를 가질 수 있다.
나노구조의 바람직한 농도는 1020개의 나노구조/리터이고, 더 바람직한 농도는 1015개의 나노구조/리터이다. 나노구조의 농도는 후술하는 저온보호의 특정의 단계 및 저온보호 방법에 따라 선택되는 것이 바람직하다.
액체 내의 나노구조는 이들 나노구조 사이의 정전인력에 의해 집단(clustering)을 형성할 수 있는 것이 바람직하다. 나노구조들 사이의 거리(약 0.5-0 μm)가 집단의 형성을 방해하는 거리인 경우에도, 나노구조들은 장거리 상호작용을 유지할 수 있는 것이 바람직하다.
나노구조들 사이의 장거리 상호작용은 본 발명자에 의해 입증되었다(후술하는 실시예란의 실시예 2 참조). 본 실시예의 조성물은 온도 변화에 노출되었고, 그 온도 변화가 초음파 속도에 미치는 효과가 조사되었다. 본 기술분야의 통상 전문가에 의해 이해되는 바와 같이, 초음파 속도는 조성물 내의 나노구조들 사이의 상호작용에 관련성이 있다. 후술하는 실시예란에서 입증되는 바와 같이, 본 발명의 조성물은 물에 비해 향상된 초음파 속도를 특징으로 한다.
이론에 구애됨이 없이, 나노구조들 사이의 장거리 상호작용은 저온보호 조성물의 독특한 특성을 부여하는 것으로 생각된다. 이러한 특성 중의 하나는 후술하는 실시예란에서 입증되는 바와 같이 나노구조들과 액체는 글리세롤과 같은 다른 저온보호제의 저온보호 특성을 향상시킬 수 있다는 것이다. 이것에 의해 글리세롤을 저농도로 첨가할 수 있으므로(또는 전혀 첨가하지 않을 수 있으므로), 잠재적인 독성 부작용이 감소될 수 있다는 이점이 있다. 다른 특징은 나노구조들과 액체는 안정된 환경을 제공함으로써 저온보호 특성을 향상시킬 수 있다는 것이다. 예를 들면, 담체 조성물(carrier composition)은 단백질을 열로부터 보호할 수 있다는 것을 알 수 있다(도 50 A-B 및 도 51 참조).
본 발명자는 본 발명의 조성물은 본 발명의 저온보호 특성에도 영향을 주는 향상된 완충 능력(즉, 물의 완충 능력보다 큰 완충 능력(도 17-25 참조)을 포함하는 것을 밝혀냈다.
본 명세서에 사용된 "완충 능력(buffering capacity)"이라는 용어는 산 또는 염기가 첨가될 때 안정한 pH를 안정하게 유지할 수 있는 조성물의 능력을 의미한다.
본 발명의 상기 관점에 따른 나노구조들은 "톱-다운(top-down)" 공정을 이용하여 생성될 수 있다. 이 공정은 고체 분말(예, 광물질, 세라믹 분말, 유리 분말, 또는 합성 고분자)이 충분히 높은 온도, 바람직하게는 약 700℃ 보다 높은 온도로 가열되는 단계를 포함한 다수의 공정단계를 포함한다. 고려되는 고체 분말의 예는 BaTiO3, WO3 and Ba2F9O12를 포함한다(그러나, 이들 분말에 한정되지 않는다).
고려되는 고체 분말의 예는 BaTiO3, WO3 and Ba2F9O12를 포함한다(그러나, 이들 분말에 한정되지 않는다). 놀랍게도, 본 발명자는 히드록시아파타이트(HA)도 가열하면 본 발명의 액체 조성물을 생성한다는 것을 밝혀냈다.
히드록시아파타이트는 특히 무독성이고 FDA에 의해 인체 치료용으로 승인된 물질이므로 바람직하다.
많은 히드록시아파타이트는 시그마 알드리치사(Sigma Aldrich) 및 크라리온 파머슈티컬즈사(Clarion Pharmaceuticals)(예, 카탈로그 번호 1306-06-5)와 같은 다수의 제조사로부터 입수할 수 있음을 알 수 있을 것이다.
표 2에 나타나 있는 바와 같이, HA를 주성분으로 하는 액체 조성물은 모두 물에 비해 향상된 완충 능력을 가진다.
다음에, 가열된 분말을 밀도 변칙 온도(예, 3℃ 또는 2℃) 미만의 온도의 냉각 액체 내에 침지시킨다. 이와 동시에, 냉각 액체 및 분말은 전자기 RF파(RF radiation)에 의해 조사된다. 이 전자기 RF파는 500 MHz를 초과하는 것이 바람직하고, 연속 RF파 또는 변조 RF파로 구성할 수 있다.
본 발명의 저온보호 조성물은 하나 이상의 안정제를 더 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된 "안정제(stabilizing agent)"는 세포의 생존능력을 증대시키는 제제를 의미한다. 본 발명의 저온보호 조성물의 안정제 및 그 농도는 세포의 종류 및 세포의 환경에 따라 선택된다. 안정된 농도는 일반적으로 약 1 μM 내지 약 1 mM, 또는 바람직하게는 약 10 μM 내지 약 100 μM의 범위이다.
일실시예에서, 안정제는 배지로부터 해로운 물질을 제거함으로써 세포의 생존능력을 증대시킨다. 안정제는 자연 발생 물질(즉, 세포의 성장 및 사망 중에 세포에 의해 분비된 물질) 및 배지에 인공적으로 도입된 물질의 양 물질을 모두 제거할 수 있다. 예를 들면, 안정제는 유리기 포착(radical scavenger) 화학물질로 구성하거나, 활성 산소 종 및 기타 유리기의 존재에 기인하는 악영향을 중화하는 항산화물질로 구성할 수 있다. 이와 같은 물질들은 세포막(세포내막 및 세포외막)을 손상시킬 수 있고, 그 결과 세포 물질의 저온보호 및 회복은 심각하게 손상된다. 만일 이들 물질이 제거되지 않거나 무능화되지 않으면, 이들 물질이 생존능력에 미치는 영향은 시간이 경과함에 따라 누적되어 실제 보존 수명을 심각하게 제한하게 된다. 더욱, 세포가 사망하거나 스트레스를 받게 됨에 따라 추가의 해로운 물질이 분비됨으로써 인접 세포들의 손상 및 사망을 증대시킨다.
본 발명의 상기 관점에 따라 사용될 수 있는 산소 유리기 포착물질 및 항산화물질의 예(그러나, 이 예에 한정되지 않음)는 환원 글루타티온, 1,1,3,3-테트라메틸우레아, 1,1,3,3-테트라메틸-2-티오우레아, 소디움 티오설페이트, 실버 티오설페이트, 베타인, N,N-디메틸포름아미드, N-(2-메르캅토프로피오닐)글리신, 베타-메르캅토에틸아민, 셀레노메티오닌, 티오우레아, 프로필갈레이트, 디메르캅토프로판올, 아스코르빈 산, 시스테인, 소디움 디에틸 디티오카르보메이트(dithiocarbomate), 스페르민, 스페르미딘, 퍼루릭 산(ferulic acid), 세사몰, 레조르시놀, 프로필갈레이트, MDL-71,897, 카다베린, 프트레신, 1,3- 및 1,2-디아미노프로판, 디옥시글루코스, 요산, 살리실산, 3- 및 4-아미노-1,2,4-트리아졸, 벤조 산, 히드록실아민, 및 이들 물질의 합성물 및 유도체를 포함한다.
식물 세포의 저온보호에 유용할 수 있는 안정제는 에틸렌 생합성 및/또는 에틸렌 작용을 지연시키거나 실질적으로 방지하는 제제를 포함할 수 있다. 식물 세포는 스트레스를 받았을 때 독성 에틸렌을 방출하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 에틸렌의 생성 또는 에틸렌의 작용을 방지하면 세포의 생존능력 및 저온보호 과정으로부터의 세포 회복능력이 더 향상된다.
본 발명에 사용될 수 있는 에틸렌 생합성 억제제의 예(그러나, 이 예에 한정되지 않음)는 리조비톡신(Rhizobitoxin), 메톡실라민(Methoxylamine) 염화수소산, 히드록실아민 아날로그(Hydroxylamine Analogs), 알파-카날린(alpha-Canaline), DNP (2,4-SDS(소디움 라우릴 설페이트)디니트로페놀), 트리톤(Triton) X-100, 트윈(Tween) 20, 스페르민, 스페르미딘, ACC 아날로그(Analogs), 알파-아미노이소부티릭 산, n-프로필 갈레이트, 벤조 산, 벤조 산 유도체, 퍼루릭 산, 살리실 산, 살리실 산 유도체, 세사몰, 카다바린(Cadavarine), 히드로퀴논, 알라(Alar) AMO-1618, BHA (부틸레이티드 히드록시아니솔), 페닐에틸렌아민, 브라시노스테로이드, P-클로로머큐리벤조에이트, N-에틸말레이미드, 로도아세테이트, 코발트, 클로라이드 및 기타 염, 비피리딜 아미노(옥시아세틱) 머큐릭 클로라이드 및 기타 산성 염, 살리실 알코올, 살리신, 니켈, 클로라이드 및 기타 염, 카테콜(Catechol), 플로로글루시놀(Pffloroglucinol), 1,2-디아미노프로판, 데스페록사민 인도메타신(Desferoxamine Indomethacin) 1,3-디아미노프로판을 포함한다.
에틸렌 작용의 억제제의 예(그러나, 이 예에 한정되지 않음)는 은염, 벤질이소티오시아네이트, 8-히드록시퀴놀린 설페이트, 8-히드록시퀴놀린 시트레이트, 2,5-노르보르나디엔, N-에톡시카보닐-2-에톡시-1,2-히드로퀴놀린, 트랜스-사이클로오텐(Trans-cyclootene), 7-브로모-5-클로로-8-히드록시퀴놀린, 시스-프로페닐포스폰 산, 디아조시클로펜타디엔(Diazocyclopentadiene), 메틸시클로프로판(Methylcyclopropane), 2-메틸시클로프로판, 카르복실 산, 메틸시클로프로판 카르복실레이트, 시클로옥타디엔, 시클로옥토딘(클로로메틸) 및 시클로프로판을 포함 한다.
은 이온은 또한 다양한 식물에서 항에틸렌제의 효능이 있고, 식물의 조직 및 세포 배양의 수명을 개선하는 것으로 알려졌다. 본 발명의 상기 관점에 따라 사용될 수 있는 은 염의 예는 실버 티오설프트(Silver Thiosulfte), 실버 나이트레이트, 실버 클로라이드, 실버 아세테이트, 실버 포스페이스, 시트릭 산 트리-실버 염, 실버 벤조에이트, 실버 설페이트, 실버 옥사이드, 실버 나이트라이트, 실버 시아네이트, 유산 은염(Lactic Acid Silver Salt) 및 펜타플루오로프로피오네이트 헥사플루오로포스페이트(Pentafluoropropionate Hexafluorophosphate)의 은염 및 톨루엔설폰 산의 은염을 포함한다.
타 실시예에서, 상기 안정제는 예를 들면 지질 이중층(예, 스테롤, 포스포리피드, 글리코리피드, 글리코프로테인) 내에 삽입되거나 막 단백질(예, 2가 양이온)을 안정화시킴에 의해 세포막을 안정화함으로써 세포의 생존능력을 증대시킨다. 본 발명의 저온보호 조성물에 이용될 수 있는 2가 양이온의 예(그러나, 이 예에 한정되지 않음)는 CaCl2, MnCl2 및 MgCl2를 포함한다. 소디움은 그 독성에 기인되어 미량 농도를 초과하지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 농도 범위는 약 1 mM 내지 약 30 mM, 더 바람직한 농도 범위는 약 5 mM 내지 약 20 Mm, 더 바람직한 농도는 약 10 mM 또는 15 mM이다. 2가 양이온은 또 냉동 온도를 감소시고, 세포가 응고점(freezing point)을 더욱 신속하게 통과할 수 있게 한다.
또 다른 실시예에서, 안정제는 열충격을 방지하거나 최소화함으로써 세포의 생존능력을 증대시킨다. 따라서, 안정제는 열충격 단백질 또는 열충격 단백질 안정제(예, 전술한 2가 양이온)로 구성할 수 있다.
본 발명의 저온보호 조성물은 성장 인자, 난황, 혈청(예, 소의 태아 혈청) 및 복합항생물질(예, 티로신, 겐타미신, 린코스펙틴, 및/또는 스펙티노미신)과 같은 안정제를 더 포함할 수 있다.
또, 본 발명의 저온보호 조성물은 성장 배지 또는 완충액을 포함할 수 있다. 선택되는 성장 배지 또는 완충액은 저온보호 대상의 세포의 종류에 따라 달라지는 것으로서, 그 예는 본 기술분야에 공지되어 있다. 허용되는 세포 완충액의 적합한 예는 PBS와 같은 포스페이트를 주성분으로 하는 완충액 및 트리스(Tris) EDTA와 같은 트리스를 주성분으로 하는 완충액을 포함한다. 본 발명의 저온보호 조성물에 첨가될 수 있는 성장 배지의 일례는 DMEM이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 저온보호 특성을 특징으로 하므로, 세포 물질의 저온보존용으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 관점에 따르면, (a) 세포 물질을 나노구조 및 액체를 포함하는 조성물에 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 세포 물질을 저온보존 온도에 방치하는 단계를 포함하는 세포 물질의 저온보존 방법이 제공된다.
본 명세서에 사용된 "저온보존(cryopreserving)"이라는 용어는 세포 물질을 극저온에 보관함으로써 세포 물질의 생존능력을 유지하거나 보존하는 것을 의미한다. 통상, 저온보존은 저온보호제의 존재 하에서 발효된다. 세포 물질은 본 발명의 교시에 따르면 바람직하게는 최소 5년 동안 저온보존될 수 있다.
본 명세서에 사용된 "세포 물질(cellular matter)"이라는 용어는 세포를 포함하는 생물학적 물질을 의미한다.
본 발명의 상기 관점에 따라 저온보존될 수 있는 세포 물질의 예(그러나, 이 예에 한정되지 않음)는 원핵생물 세포 물질 및 진핵성 세포 물질(예, 포유류, 식물, 효모), 세포 체액(예, 척수액, 혈액, 양수, 타액, 활액(synovial fluid), 질분비액 및 정액), 분리 세포, 세포 배지(예, 세포주(cell-line), 초대 세포 배지, 효모 또는 박테리아 배지), 세포 현탁액, 고정화 세포(immobilized cells), (예, 골결 결합된 세포), 조직, 장기 또는 유기체를 포함한다.
식물 세포 물질의 예(그러나, 이 예에 한정되지 않음)는 그로스 니이들(growth needles), 잎사귀, 뿌리, 수피(barks), 줄기, 지하경, 캘러스(callus) 세포, 원형질체, 세포 현탁액, 장기, 분열조직(meristems), 씨 및 배아, 이들의 일부분을 포함한다.
특정의 실시예에서, 세포 물질은 줄기 세포, 정자 세포 또는 난자(즉, 난모세포)를 포함할 수 있다.
다른 특정의 실시예에서, 세포 물질은 순수 한 것이거나 유전자 조작된 것일 수 있다.
세포 물질은 살아있는 유기체 또는 해부용 사체로부터 얻을 수 있다. 예를 들면, 세포 물질은 외과수술(예, 생검) 또는 사정(ejaculate)에 의해 얻을 수 있다. 또는, 세포 물질은 실험실의 세포 배지로부터 얻을 수 있다.
다음은 예시적인 세포 물질을 위한 전형적인 저온보존 과정을 요약한 것이 다.
정액
정액은 정상의 남성, 올리고스퍼믹(oligospermic) 남성, 테라토스퍼믹(teratospermic) 남성, 어센부주스퍼믹(asthenozoospermic) 남성으로부터의 기증에 의해 얻을 수 있고, 또 외과수술법에 의해서도 얻을 수 있다. 재생된 후 현실적인 수정의 기회가 존재하는 경우, 정자는 저온보존에 요구되는 샘플의 양을 측정하기 위해 통상 기능 실험을 거친다. 정액 샘플은 통상 본 발명의 저온보호 조성물과 1:1의 비율로 혼합된 다음, 정적 기체상 냉각법(static vapour phase cooling )을 이용하여 스트로(straws) 내에서 0.5 ml의 분할량을 냉동된다.
배아
배아는 통상 착상 전단계(예, 배반포 단계)에서 저온보존된 후 인공수정된다. 배아는 성공적인 저온보존을 최적화하기 위해 일련의 기준(예, 1. 배반포 성장속도 - 5일째의 성장속도가 6일째의 성장속도에 비해 더 커야 하고, 이 6일째의 성장속도는 7일째의 성장속도에 비해 더 커야 한다; 2. 총 세포의 수 - 세포의 수는 (성장 일수에 의존하여) 60개 이상이어야 한다; 3. 영양외배엽에 대한 세포의 상대적 배치: 세포내 질량; 4. 할구의 규칙성; 5. 단일핵생성(mononucleation); 6. DNA 단편화)에 따라 선택된다.
표준 배아 저온보존 방법은 본 발명의 저온보호 조성물을 단체의 소디움(si ℃mple sodium)을 주성분으로 하는 염 용액으로 희석한 것에 배아를 5 - 15 분간 노출시켜 흡수시키는 단계를 포함한다. 다음에 배아는 파종(seeded)될 수 있는 약 7 ℃의 온도까지 급냉(-2 ℃/min)될 수 있고, 약 -30 ℃이하의 온도까지 서냉(-0.3 ℃ to -0.5 ℃/min)될 수 있고, 다음에 액체 질소 내에 직접 투입될 수 있다. 제어된 냉각속도를 위해 통상 프로그램이 가능한 냉각장치가 필요하다. 배아는 급속한 해동법을 이용하여 해동될 수 있다. 또, 배아는 수분 이상 노출되면 세포에 유해한 극히 높은 저온보존 농도(2M 내지 6M)를 이용하는 경우에만 급속 냉동 또는 급속 유리화될 수 있다.
난모세포
저온보존을 위해 사용되는 난모세포는 성숙 난모세포인 것이 바람직하다. 성숙 난모세포는 외과수술에 의해 제거될 수 있다. 난모세포의 제거 전에 난모세포 자극(Oocyte stimulation)이 필요할 수도 있다. 통상 저온보존을 위한 난모세포는 반투명, 제1극체의 형상 및 압출과 같은 기준에 기초하여 선택된다. 난모세포의 저온보존을 위한 통상적인 프로토콜은 미국특허 US6,500,608 및 US5,985,538에 기술되어 있다.
줄기 세포
다능성 줄기 세포(pluripotent stem cell)의 저온보존은 세포는, 생존능력을 유지해야 할 뿐 아니라 분화 능력(즉, 비분화 상태에 유지되는 것)도 유지해야 하 므로, 저온생물학의 추가의 과제이다. 따라서, 특정의 신호 형질도입 경로는 정위치에 유지되어야 하고, 냉동 및 건조에 관련된 스트레스에 의해 조숙 또는 분화 오류(erroneous differentiation)가 유도되어서는 안 된다. 해동 직후의 세포의 무분화 표현형(differentiationless phenotype)을 유지하는 안정제가 포함될 수 있다.
통상, 줄기 세포 저온보존 프로토콜은 (1) 접착(adherent) 줄기 세포 군체에 적용된 종래의 서냉 프로토콜 및 (2) 접착 줄기 세포 군체(cell colonies) 및 자유롭게 현수된 줄기 세포 군체(clumps)의 양자를 위한 유리화(vitrification) 프로토콜을 포함한다.
피부
피부는 통상 해부용 사체 또는 건강한 개인으로부터 제거된다. 동물 피부 조직도 이식용으로 사용하기 위해 저온보존될 수 있다. 피부는 통상 저온보전 전 또는 해동 후에 조직의 형(tissue-typed)으로 되어 있다. 피부 세포는 저온보전 전에 배양되거나 시험관 내에서 증식될 수 있다. 저온보존은 통상 급속 해동 프로토콜을 필요로 한다. 이 프로토콜의 성패는 환자에 대한 이식에 의해서나 세포 생존능력의 시험에 의해 측정된다.
난소 조직
난소 조직(전체 난소 또는 그 일부분)은 건강한 여성 또는 건강하지 않은 여 성으로부터 제거될 수 있다. 난소 조직의 저온보존에 유리한 질병의 예는 암, 지중해빈혈(thalassemia)와 같은 악성 질병, 및 특정의 자기면역 질환을 포함한다. 조기폐경의 병력을 가지는 건강한 여성도 난소 조직 저온보존을 희망할 수 있다. 제거 및 해동 후, 난소 조직은 악성 세포를 체분리(screen)할 수 있고, 추후의 자기이식(autografting)에 대한 안전성이 평가될 수 있다.
세포 물질은 저온보존 과정을 촉진하는데 적절한 상태로 조절되거나, 본 발명의 조성물에 직접 접촉될 수 있다. 본 명세서에 사용된 "상태조절(conditioning)"이라는 용어는 세포 물질을 나노구조 및/또는 저온보호제의 악영향 및/또는 저온의 악영향으로부터 보호하는 것을 의미한다. 예를 들면, 세포 물질은 안정제를 이용하여 상태조절된 후 본 발명의 조성물의 존재하에서 배양될 수 있다. 또는 본 발명의 조성물이 세포에 가해진 후에 안정제 또는 기타 저온보호제가 추가로 첨가될 수 있다.
이하, 안정제의 예를 설명한다.
추가적으로 또는 선택적으로, 세포 물질은 저온보호 전에 저온에 순응시킬 수 있다. 이 순응 단계는 안정제에 의한 상태조절과 동시에 또는 상태조절 후에 실시될 수 있고, 본 발명의 조성물을 이용한 배양 단계의 이전 또는 배양 단계와 동시에 실시될 수 있다. 이 순응 단계는 세포의 대사작용을 상당히 지연시킴과 동시에 임계 온도 변화들 중의 일부를 통한 급속한 온도 변화의 충격을 감소시키는 세포의 저온보존 과정을 위한 예비단계이다. 임계 온도 변화는 세포가 손상될 위험이 최고조에 달하는 온도 범위, 예를 들면 얼음의 결정이 형성되는 임계 온도 부 근의 온도 범위이다. 본 기술분야의 통상의 전문가에게 공지된 바와 같이, 이들 온도는 용액의 조성에 의존하여 다소 변화한다. (대부분의 세포 배지의 주성분인 물의 경우, 얼음 결정의 형성 및 재형성은 약 0 ℃ 내지 약 -50℃의 온도 범위에서 발생한다.
순응에 의해 임의의 주어진 삼투 포텐셜에서 세포의 탈수 정도를 감소시키는 내생 용질(endogenous solutes)이 축적되고, 극단의 탈수시 단백질과 막이 안정화된다. 순응은 단계적으로 또는 점진적(gradually)으로 실행될 수 있다. 순응의 단계들은 세포가 손상되지 않는 상태로 세포를 저온에 순응시킬 수 있는 충분한 시간 간격에 대해 약 0.5 ℃ 내지 약 10 ℃의 감소 증분을 가질 수 있다. 점진적 단계이거나 단계적 단계이거나 온도 구배는 세포가 응고점을 가능한 신속하게 통과할 수 있는 척도로 한다. 순응 온도는 바람직하게는 약 1 ℃ 내지 약 15 ℃의 범위, 더 바람직하게는 약 2 ℃ 내지 약 10 ℃의 범위, 더 바람직하게는 약 4 ℃이다.. 세포는 점진적으로, 또는 단계적으로, 또는 연속적으로, 또는 급속하게 저온에 순응될 수 있다. 순응 방법은 본 기술분야의 통상적인 전문가에게 공지되어 있고, 순응제는 시판되고 있다. 점진적 순응은 목표 온도에 도달할 때까지 시간당 약 1 ℃씩 배양 온도를 감소시키는 단계를 포함한다. 점진적 순응은 민감도가 크고 저온보호가 곤란한 것으로 생각되는 세포의 순응에 유용하다. 단계적 순응은 세포를 일정한 시간 동안 저온에 방치한 다음, 다른 일정한 시간 동안 더 낮은 저온에 유지하는 단계를 포함한다. 이들 단계는 필요에 따라 반복 실시될 수 있다.
세포 물질의 동결건조도 저온보호 전에 수행될 수 있다. 동결건조는 진공 증발에 의해 세포의 수분 함량을 감소시키도록 하는 것이다. 진공 증발은 저기압의 환경 내에 세포를 위치시키는 단계를 포함한다. 원하는 수분 제거율에 따라, 저기압은 약 -30 ℃ 내지 -50 ℃의 온도 범위에서 100 토르, 1 토르, 0.01 토르 이하로 할 수 있다. 저기압 조건 하에서, 수분의 증발 속도는 세포 내 수분의 최대 65%가 하룻밤 사이에 제거될 수 있는 정도가 된다. 최적의 조건 하에서, 수분 제거는 수 시간 내에 완료될 수 있다. 증발 중에 발생하는 열 손실에 의해 세포는 냉각된 상태를 유지한다. 진공도를 면밀하게 조절함으로써, 세포는 진공 증발 과정 동안에 저온의 순응 온도에 유지될 수 있다. 진공이 강력하면 수분 제거 속도가 빨라질 수 있으나 세포는 냉동될 위험에 노출된다.
냉동 단계는 세포에 직접 열을 가하거나 진공도를 조절함에 의해 제어될 수 있다. 세포가 증발 체임버 내에 장입된 초기에는 세포 내의 잔열(residue heat)이 냉동을 방해하기 때문에 고진공이 가해질 수 있다. 탈수가 진행되고, 세포의 온도가 강하함에 따라, 진공 정도를 감소시키거나 열을 가하여 냉동을 방지할 수 있다. 반건조 세포는 증발 체임버 내에서 비산(scatter)되는 경향을 가질 수 있다. 이와 같은 경향은 증발 처리의 말기에 공기류가 체임버 내로 역류할 수 있는 경우에 특히 높게 나타난다. 공기류가 반건조 세포에 접근하면, 공기류는 세포들을 부양시킴으로써 샘플의 2차 오염의 원인이 된다. 이와 같은 혼란을 방지하기 위해, 증발 냉각은 건조 중의 세포들이 원심력에 의해 튜브 내에 구속되는 진공 원심분리기 내에서 실시될 수 있다. 처리 중에 제거되는 수분의 양은 세포의 건조 중량 측정에 의해 주기적으로 감시될 수 있다.
열 충격 처리는 또한 저온보호 전에 순응 처리의 대체로서 실행될 수 있다. 열 충격 처리는 스트레스에 적응하는 것에 관련되도록 된 특정 단백질(열 충격 단백질)의 데 노보 합성(de novo synthesis)을 유발하는 것으로 알려져 있다. 또, 열 충격 처리는 막 및 단백질의 안정화 작용을 한다. 열 충격 처리는 저온보존 후의 세포의 생존능력을 약 20 % 내지 약 40 % 만큼 향상시키는 경향이 있다. 이 과정에서 세포 물질(상태조절되거나 상태조절되지 않은 상태의 세포 물질)은 온도가 약 31 ℃ 내지 약 45 ℃, 바람직하게는 약 33 ℃ 내지 약 40 ℃, 더 바람직하게는 약 37 ℃인 수조 쉐이커(water-bath shaker) 내에서 배양된다. 배양 시간은 수분 내지 수시간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 6시간, 더 바람직하게는 약 2시간 내지 약 4시간이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 전술한 관점의 방법은 세포 물질을 본 발명의 조성물에 접촉(배양)시킴에 의해 발효된다. 상기 접촉은 나노구조의 세포내 농도 및/또는 세포외 농도를 평형시키는 작용을 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 관점의 조성물은 세포 물질에 직접 첨가되거나 상기 세포 물질이 배양되고 있는 배지 내에 첨가되어 희석될 수 있다. 평형에 요하는 시간을 최소화하기 위해, 접촉은 대략 실온에서 실행될 수 있다. 그러나, 최적의 온도 및 기타 부하(loading) 조건들은 배지, 빛의 세기 및 세포의 생존능력을 유지하는 산소 농도와 같은 조건들에 부합하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물은 세포 물질에 직접 가해지거나 배지와 같은 세포 물질 배양 매체 내에 첨가되어 희석될 수 있다. 또 단계적 배양(접촉)도 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 나노구조의 농도가 점차로 증대되는 상태 하에서 세포 물질이 배양될 수 있도록 단계적 접촉이 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 세포 물질은 초기에 리터 당 1010개의 나노구조를 포함하는 조성물과 접촉되고, 후기에 리터 당 1015개의 나노구조를 포함하는 조성물과 접촉될 수 있다.
단계적 접촉은 세포에 단일량 부하(single dose loading)에 비해 다소 완만하게 이루어지므로 나노구조의 전송을 촉진하고자 하는 경우에 가끔 사용된다. 단계적 부하를 위한 첨가 사이의 시간 간격은 수분 내지 수시간 이상의 범위, 바람직하게는 약 1분 내지 약 10분의 범위, 더 바람직하게는 약 1분 내지 약 5분, 더 바람직하게는 약 1분 또는 약 2분이다. 단계적 접촉 과정의 첨가의 횟수는 통상 얼마의 횟수라도 되고, 극히 작은 횟수로부터 다수회까지 가능하다. 첨가 횟수는 바람직하게는 약 20회 미만, 더 바람직하게는 약 10회 미만, 더 바람직하게는 약 5회 미만이다. 특정 종류의 세포 및 부하 제제(loading agent)에 대한 첨가 시간 간격 및 간격의 수는 본 기술분야의 통상의 전문가에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 실제의 배양 시간은 수분 내지 수시간의 범위이다.
본 발명의 조성물 내의 저온보호제 또는 나노구조는 세포 물질과의 접촉시 세포 물질의 유리화(vitrification)를 촉발시킬 수 있는 정도로 충분히 고농도로 구성할 수 있다.
유리화 과정은 농축 용액에 세포 물질을 직접 노출시킴으로써 점진적 또는 단계적 삼투성 탈수를 일으키는 것으로서, 그 후 세포 물질은 액체 질소 내에서 급 냉(quenching)된다.
유리화 전단계에서, 세포 물질은 농도가 유리화를 유발할 정도로 높지는 않은 본 발명의 조성물에 의해 배양될 수 있다. 이것은 일차적으로 세포막 및 단백질의 탈수에 기인된 불안정화를 방지하는 역할을 한다. 이들 조성물은 필요에 따라 유리화의 전에 제거될 수 있다. 상기 조성물이 유지되어 있는 경우, 나노구조의 농도는 유리화를 촉진하기 위해 점진적으로 또는 단계적으로 증대시킬 수 있다. 전술한 바와 같은 단계적 또는 점진적 방법으로 초기에 세포 물질을 접촉하기 위해 사용된 것과 다른 저온보호제 또는 더욱 고농도의 동일한 저온보호제가 첨가될 수 있다. 저온보호제의 농도는 약 4 M 내지 약 10 M, 또는 약 25 중량% 내지 약 60 중량%의 범위로 형성할 수 있다. 이 농도는 샘플 세포를 극단적으로 탈수시킨다. 농도가 7 M을 초과하는 용액은 통상 세포의 삼투 작용 수분의 90% 이상을 제거한다. 그러나, 각 제제의 정확한 농도는 실험에 의해 결정될 수 있다. 유리화를 위해 사용될 수 있는 저온보호제는 DMSO, 프로필렌 글리콜, 마니톨, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 부탄디올, 포름아미드, 프로판디올 및 이들 물질의 혼합물을 포함한다.
고농도의 저온보호제 또는 나노구조에 노출에 의한 유해한 결과를 최소화하기 위해, 탈수는 가능한 단시간의 노출 상태에서 약 0 ℃ 내지 약 4 ℃의 온도에서 실행될 수 있다. 이 조건 하에서, 물과 용질의 투과 계수의 차이로 인해 저온보호제는 세포 물질 내로 상당량이 추가 유입되지 않는다. 그 결과, 세포 물질은 수축된 상태에 유지되고, 유리화를 위해 필요한 세포질 농도가 탈수에 의해 얻어진다.
본 발명의 조성물과 접촉된 세포 물질은 저온보존 온도까지 냉동됨으로써 저온보존된다. 냉동 속도는 급속 냉동 시에 기계적인 힘에 의해 세포에 유발되는 손상과 저속 냉동 시에 삼투력에 의해 세포에 유발되는 손상 사이에 균형을 유지하는 속도로 해야 한다. 종래 다른 세포에 대한 다른 최적의 냉각 속도가 개시되어 있다. 종래, 최적의 냉각 속도는 상이한 세포의 빙핵 형성상수(ice nucleation constants)의 차이 및 상이한 세포의 상변태 온도의 차이에 기인되어 달라진다는 것이 제안되었다(참조: WO 98/14058; Karlsson et al, Biophysical J 65: 2524-2536, 1993). 본 기술분야의 냉각속도는 -1 ℃/분 내지 -10 ℃/분의 범위가 바람직하다(Karlsson et al, Biophysical J 65: 2524-2536, 1993). 냉동 속도는 결정의 형성을 억제하기에 충분한 속도가 되어야 한다. 냉동 시간은 약 5분, 4분, 3분, 2분, 1분, 또는 1분 이하의 시간으로 해야 한다. 임계 냉동 시간은 단일 세포의 관점에서 측정되어야 한다. 예를 들면, 액체 질소 내에 대량의 세포 샘플을 장입하는데 10분이 소요될 수 있으나, 이 방법에 의해 개개의 세포는 급속 냉동된다.
전술한 바와 같이, 세포 물질은 유리화될 수 있다. 이 조건 하에서, 세포 물질은 세포내 얼음이나 세포외 얼음이 형성되지 않은 상태로 급속 냉각(과냉각)될 수 있다. 급속 냉각은 얼음의 형성에 영향을 주는 모든 인자들을 미연에 방지함과 동시에 일부의 세포 물질의 냉각 민감성의 문제들을 회피한다.
세포 물질은 직접 냉동될 수 있다. 직접 냉동 방법은 세포를 액체 질소나 액체 헬륨과 같은 극저온 유체 내에 직접 적하(dripping), 직접 분사(spraying), 직접 주입(injecting), 또는 직접 유입(pouring)하는 단계를 포함한다. 세포 물질 은 또 액체 질소에 의해 냉동된 강철 블록과 같은 냉각 고체에 직접 접촉될 수 있다. 상기 극저온 유체는 세포 물질 상에 직접 부을 수도 있다. 상기 직접 방법은 공기를 포함하는 극저온 상태의 기체와 세포를 접촉시키는 것도 포함한다. 극저온의 질소 기체류 또는 헬륨 기체류는 세포 현탁액 상에 직접 송풍되거나 세포 현탁액 내에 기포 형태로 주입될 수 있다. 간접 방법은 용기 내에 세포를 위치시키는 단계 및 상기 용기를 극저온의 고체, 액체 또는 기체에 접촉시키는 단계를 포함한다. 용기의 예는 극저온에 견딜 수 있도록 설계된 플라스틱 바이얼, 글래스 바이얼, 앰플을 포함한다. 간접 냉동 방법을 위한 용기는 공기 또는 액체에 대해 불침투성을 가질 필요는 없다. 예를 들면, 플라스틱 백이나 알루미늄 포일이 적합하다. 또, 상기 용기는 극저온에서 견딜 수 있는 능력을 가질 필요는 없다. 극저온 하에서 균열이 발생하였으나 실질적으로 원형을 유지하는 플라스틱 바이얼도 사용될 수 있다. 또한 세포의 샘플을 금속 포일(foil)의 일면 상에 위치시키는 한편 상기 금속 포일의 타면은 극저온의 기체, 고체, 또는 액체에 접촉시킴으로써 냉동시킬 수도 있다.
본 발명의 조성물은 저온보존에 적합한 용기 내에 포함될 수 있다. 상기 용기는 후술하는 바와 같이 예를 들면 나노구조 및 추가의 저온보호제를 억제하도록 구성된 화학물질에 대해 불투성인 것이 바람직하다. 용기는 극저온에 견딜 수 있는 재료로 제작되는 것이 바람직하다. 상기 용기는 냉동 사이클/해동 사이클 중에 다양한 성분들의 체적 변화를 흡수할 수 있도록 가요성인 것이 바람직하다. 본 발명의 상기 관점의 용기는 개방형 튜브를 포함하는 것이 더 바람직하다.
저온보존된 세포 물질은 저온보관에 적합한 온도에 유지될 수 있다. 최종 보관 온도는 세포의 종류에 따라 달라지지만 일반적으로 본 기술분야에 공지된 온도는 각각 드라이아이스 냉동장치 및 액체 질소 냉동장치에 의해 달성되는 약 -80 ℃ 내지 -196 ℃이다. 세포는 액체 질소(약 -196 ℃), 액체 아르곤, 액체 헬륨, 또는 액체 수소 내에 유지되는 것이 바람직하다. 이들 온도는 세포의 장기 보존에 가장 적합하고, 또 온도 변화도 최소화될 수 있다. 장기 보존 기간은 회복시 세포의 생존능력에 상당한 정도의 손상이 발생하지 않은 상태로 수개월, 바람직하게는 수년이 될 수 있다. 단기 보존 기간은 -150 ℃, -100 ℃ 또는 심지어 -50 ℃의 보관 온도가 사용되는 것이 바람직한 수개월 미만이 될 수도 있다. 이 같은 온도를 유지하는데는 드라이아이스(이산화탄소) 및 상업적 냉동장치가 사용될 수 있다.
적합한 해동 및 회복은 초기 냉동시의 상태와 실질적으로 동일한 상태로 세포를 생존 및 회복시키는데 필수적이다. 저온보호된 세포 물질은 해동 중에 온도가 증대됨에 따라 소형의 얼음 결정들이 응집되어 치수가 증대된다. 치수가 큰 세포내 얼음 결정은 세포의 생존에 일반적으로 유해하다. 이것이 형성되는 것을 방지하기 위해, 저온보호된 세포 물질은 가능한 신속하게 해동되어야 한다. 가열 속도는 최소 약 30 ℃/분 내지 60 ℃/분의 속도로 할 수 있다. 90 ℃/분, 140 ℃/분 내지 200 ℃/분의 더욱 빠른 가열속도가 사용될 수도 있다 신속한 가열이 바람직하지만, 대부분의 세포는 실온의 크게 초과하는 배양 온도에서의 생존능력이 낮다. 과열을 방지하기 위해, 세포의 온도를 감시하는 것이 바람직하다. 전도, 대류, 복사, 전자기 대류, 또는 이들의 조합을 포함하는 임의의 가열 방법이 사용 가능하 다. 전도 가열 방법은 수조 내에 침지하는 방법, 가열 블록 내에 위치시키는 방법, 직화 내에 직접 위치시키는 방법을 포함한다. 대류 가열 방법은 히이트 건(heat gun)이나 오븐을 사용하는 방법을 포함한다. 복사 가열 방법은 예를 들면 가열 램프 또는 대류 오븐이나 복사 오븐과 같은 오븐을 사용하는 방법을 포함한다. 전자기 복사 가열 방법은 마이크로웨이브 오븐이나 유사한 장치를 사용하는 방법을 포함한다. 일부의 장치는 이들 가열 방법을 조합하여 가열할 수 있다. 예를 들면, 오븐은 대류 및 복사에 의해 가열한다. 가열은 셀 및 주변의 용액이 0 ℃를 초과하는 온도에서 액체 상태가 되자마자 종료하는 것이 바람직하다. 저온보호된 세포 물질은 나노구조 및 응고점을 강하시키는 기타 제제의 존재 하에서 냉동되므로, 냉동된 세포는 0 ℃ 미만의 온도, 예를 들면 -10 ℃, -20 ℃, -30 ℃ 또는 -40 ℃의 온도에서 액화될 수 있다. 저온보호된 세포의 해동은 상기 온도들 중의 임의의 온도에서 종료되거나 0 ℃를 초과하는 온도에서 종료될 수 있다.
나노구조 및 액체를 포함하는 조성물의 희석 및 그 후 그 조성물의 제거는 통상 가능한 신속하게 그리고 저온보호된 세포 물질의 해동 후에 가능한 신속하게 실행된다. 조성물 내에 고농도의 나노구조 및 저온보호제가 존재하는 경우, 현탁 매질을 희석시키는 한편 삼투성 팽창을 최소화하는 것이 바람직하다. 따라서, 현탁 매질의 희석 및 세포 물질 내로부터의 나노구조 또는 저온보호제의 유출은 고삼투압 배지 내에서의 희석이나 단계적 희석에 의해 달성될 수 있다.
해동된 세포는 세포의 기능을 정상화시킬 수 있는 조건 또는 세포 물질이 해동 후에 성장되어야 하는 경우에는 그 성장을 촉진시키는 조건에 점진적으로 적응 될 수 있다. 저온보호제는 세포상해성, 세포증식억제성, 또는 변이유발성을 가질 수 있으므로 해동된 세포 물질로부터 세포에 해를 주지 않는 속도로 제거되는 것이 바람직하다. 재현탁법 및 원심분리법, 투석법, 연속 세척법, 바이오레미디에이션(bioremediation), 및 화학물질을 이용한 중화법, 또는 전자기 복사법과 같은 다수의 제거 방법이 사용될 수 있다. 나노구조 및 저온보호제를 급속하게 제거하면 세포의 스트레스 및 사망이 증대될 가능성이 있으므로 제거 단계는 점진적으로 실시되어야 한다. 제거 속도는 나노구조 및 저온보호제가 함량이 적은 용액을 이용하여 연속 세척시킴에 의해 제어될 수 있다.
생존능력을 확보함과 동시에 유전자 손상 및 세포 손상을 최소화하기 위해 해동 처리 및 해동 후처리는 안정제(전술한 안정제)의 존재 하에서 실시될 수 있다. 2가 양이온 또는 에틸렌 억제제와 같은 안정제는 저온보존의 결과 형성된 손상제(damaging agent)를 감소시키거나, 제거하거나 또는 중화시켜 준다. 상기 손상제는 유리기, 산화제 및 에틸렌을 포함한다.
세포 물질을 해동 후 생존하는 세포의 백분율을 증대시키기 위해 완전히 기능하는 세포(fully-functioning cell)를 포함하는 것이 바람직하다. 후술하는 실시예란에 기재되어 있는 바와 같이, 임신의 가능성이 낮은 비정상 정자 세포는 정상 정자 세포에 비해 본 발명의 저온보호 조성물의 존재 하에서 냉동 스트레스를 받은 후 생존율이 저하되었다. 따라서, 본 발명의 조성물 내에서 기능하는 정자 세포 물질과 기능하지 않는 정자 세포 물질의 혼합물을 저온보호하면 기능 세포:비기능 세포의 비가 증대되고, 그 결과 해동 후 수정의 가능성이 향상된다.
세포 물질 내의 세포의 적어도 10 %, 더 바람직하게는 20 %, 더 바람직하게는 30 %, 더 바람직하게는 40 %, 더 바람직하게는 50 %, 더 바람직하게는 60 %, 더 바람직하게는 70 %, 더 바람직하게는 80 %, 더 바람직하게는 90 %는 완전 기능성 및 생존성을 가지는 것(예를 들면, 정자 세포는 운동성, 난모세포의 수정가능성을 가져야 하고, 단편화 DNA를 포함해서는 안 된다.)이 바람직하다.
해동 후, 세포 물질은 필요에 따라 생존능력이 분석되거나, 해동 직후에 이식에 이용될 수 있다. 생존능력은 조직학적 방법 및 기능적 방법에 의해 판정될 수 있다. 세포는 예를 들면 형태학적 지수법(morphological index), 생체 염색 배제법(exclusion of vital stains), 및 세포내 pH법(intracellular pH)을 포함하는 본 기술분야에 공지된 조직학적 방법에 의해 분석될 수 있다.
세포 물질의 기능성을 입증하기 위해 하나 이상의 시험관 분석법을 사용하는 것이 바람직하다. 이를 위해 본 기술분야에 공지된 분석법 또는 진단학적 검사가 사용될 수 있다. (참조예: METHODS IN ENZYMOLOGY, (Abelson, Ed.), Academic Press, 1993.) 예를 들면, ELISA(효소면역측정법), 크로마토그래픽 분석법이나 효소분석법, 또는 분비 생성물에 특별히 적용되는 생물학적 분석법이 사용될 수 있다.
특히, 세포 물질이 정자를 함유하는 경우, 그 세포 물질의 상태는 파동해석법, 운동해석법, 및 생존능력 총수에 의해 해석될 수 있다. 예를 들면, 정액의 그로스(gross) 현미경 분석은 저배율(예, 10배율) 하에서 파동을 분석하고, 0에서 5까지의 점수(0은 파동이 없는 상태이고, 5는 와류가 있는 신속한 파동 상태)를 부 여함으로써 실행될 수 있다. 둘째, 고배율(예, 40배율) 하에서 운동성 정자의 수는 계수가 가능하고, 총 정자수에 대한 백분율로 표시될 수 있다. 후에 이 백분율에 농도/정자수를 곱하여 육안에 의한 생존 정자의 수를 산정한다. 정자 농도는 여러가지 과정을 통해 산정될 수 있다. 즉, 0.9%의 생리식염수에 의해 1:10의 비율로 희석된 정액을 수용하는 마이크로큐벳을 슈퍼매큐 광도계(Spermacue photometer)로 분석하거나 일련의 정자의 희석물을 제조한 다음 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 정자수를 계수할 수 있다.
생존 정자의 비율의 백분율은 15 일리드롭(lilldrop)의 생체/사체 염색을 이용하여 현미경 슬라이드 상에 15 μl의 적하분량(drop)의 정자 샘플을 확장시켜 놓고 측정할 수 있다. 2개의 적하분량(drop)을 혼합한 후 1개의 도포 표본이 제조된다. 샘플은 공기 건조된 후, 100 배율의 유침렌즈(oil immersion lens)를 구비한 현미경 하에서 생체 염색 색소를 이용하여 염색함으로써 200개의 정자가 계수된다.
마지막으로, 스퍼맥 염색제(Spermac stain)를 이용하여 정자의 선체모(acrosomal cap) 및 꼬리의 형상을 관찰함으로써 정자의 완전성이 분석된다. 15 μl의 적하분량의 정자를 가지는 다른 현미경 슬라이드가 제조되고, 공기 건조 후, 제조회사의 설명서에 따라 스퍼맥으로 염색된다. 샘플의 전체적인 품질 및 형태는 무손상 상태의 선체모 및 손상 상태의 선체모에 점수를 부여하고, 200개의 정자 당 정상 꼬리의 수를 계수함으로써 측정된다.
본 명세서에 사용된 "약(about)"이라는 용어는 ±20 %를 의미한다.
본 발명의 추가의 목적, 장점, 및 새로운 특징은 본 기술분야의 통상 전문가 가 다음의 실시예를 검토함으로써 명확히 이해할 것이다. 하기의 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 않는다. 또, 다수의 실시예 각각 및 전술된 그리고 청구범위란에 기재된 본 발명의 다수의 관점은 다음의 실시예에 의해 실험적으로 뒷받침된다.
실시예
이하, 다수의 실시예에 대하여 기술한다. 이들 실시예는 전술한 설명과 함께 본 발명을 제한하지 않는 형식으로 본 발명을 설명하는 것이다.
일반적으로, 본 명세서에 사용된 용어 및 본 발명에 사용된 실험과정은 분자, 생화학, 미생물학 및 유전자재조합 DNA 기술을 포함한다. 이들 기술은 문헌에 상세히 설명되어 있다. 예를 들면, 다음의 문헌을 참조할 수 있다. "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", VoIs. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); methodologies as set forth in U.S. Pat. Nos. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 and 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition; "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980); available immunoassays are extensively described in the patent and scientific literature, see, for example, U.S. Pat. Nos. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 and 5,281,521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. L, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996). 이들 모든 문헌은 참조문헌으로서 본 명세서에 도입되었다. 기타 일반적 참조문헌들은 이 문헌을 통해 제공되어 있다. 이들 참조문헌 내의 다수의 과정들은 본 기술분야에 공지된 것으로서, 독자의 편의를 위해 제공된 것으로 생각된다. 이들 문헌 내의 모든 정보들은 본 명세서에 도입되었다.
실시예 1
표준 저온보호 용액을 구비한 나노구조를 포함한 희석 액체가 냉동 후 및 해동 후의 정자의 질에 미치는 효과
나노구조를 포함한 액체를 표준 저온보호 완충액에 첨가하는 것이 저온보호 능력을 향상시키는지의 여부를 확인하기 위해, 정자 샘플을 나노구조를 포함한 액체의 존재 하 및 비존재 하에서 냉동시키고, 해동 후에 정자의 특성을 분석하였다.
재료 및 방법
정자 운동성의 측정: 광학 현미경 하에서 헬버(Helber) 소형 카메라를 이용하여 운동성을 가지는 정자 세포의 수를 계수함으로써 정자의 운동성이 측정되었다.
정자 생존능력의 측정: 에오신 니그로진(Eosine Nigrozine) 염색법을 이용하여 정자의 생존능력이 측정되었다.
정자의 DNA 단편화의 측정: 정자의 DNA 단편화가 SCSA (정자 염색질 구조 분 석법;Sperm Chromatin Structural Assay)을 이용하여 측정되었다.
정자의 난자 수정 능력의 측정: 난자를 수정시키는 정자의 능력이 MSOM (운동성 정자의 세포기관 형태 조사법; motile sperm organelle morphology examination)를 이용하여 측정되었다. 이 조사법은 특정의 정상적 형태 및 점진적 운동성을 가지는 정자 세포의 수를 조사하는 것으로서, 각각은 문헌 상에 수정 세포를 위한 지표(marker)의 기능을 하는 것으로 설명되어 있다.
물질: 어바인 사이언티픽사(Irvine scientific; Santa Anna, California)로부터 TRIS 완충액을 포함하는 표준 저온보호 완충액(TES 완충액), 난황, 및 글리세롤을 구입하였다.
실험 과정: 저생식능력의 남성(남성 생식 클리닉에 참여하고 있는 남성)으로부터 정자 샘플을 기증받아서 PLANER KRYO-10 장치 내에서 점진적 온도 강하 프로그램을 이용하여 냉동시켰다. 샘플은 TES (50 % 정액, 50 % TES)의 존재 하에서 또는 신규의 저온보호 완충액(50 % 정액, 25 % TES 및 25 % NeowaterTM (Do Coop technologies, Israel))의 존재 하에서 냉동되었다. 냉동된 정액은 2일 후 분석을 위해 해동되었다. 냉동 후 2종의 완충액의 정액에 미치는 보호 효과가 냉동되지 않은 자연 상태의 동일한 정액과 비교되었다. 실험은 3회 반복 실시되었다.
결과 및 결론
실험 결과는 아래의 표 1에 요약되어 있다.
표 1
자연상태 표준 보존상태 나노구조 저온보호를 포함하는 액체
운동성(%) 34.5±0.7 3.7±0.4 5.6±1.6
생존능력(%) 76.5±4.9 47.0±2.3 49.5±4.9
정상 세포(%) 1.8±1.4 2.5±3.5 6.8±2.5
정자 DNA 단편화(%) 5.4±3.4 14.6±1.6 12.0±0.7
수치들은 평균 ± 표준편차, n=3이다
상기 표 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 그리고 도 1A 내지 도 1D에 도시된 바와 같이, 냉동 혼합물이 나노구조를 포함하는 경우 정자 운동성, 생존능력, 및 DNA 단편화가 개선되고, 정상 세포의 생존 비율이 높아진다.
따라서, 낮은 임신 가능성을 가지는 비정상 정자 세포는 나노구조를 포함한 액체의 존재 하에서 냉동 스트레스로부터 살아남지 못한다고 결론지을 수 있다.
실시예 2
초음파 시험
본 발명의 조성물에 대해 초음파 공진기 내에서 일련의 초음파 시험이 실시되었다.
방법
ResoScan® 조사 장치(Heidelberg, Germany)을 이용하여 본 발명의 조성물(본 실시예에서는 NeowaterTM) 및 재증류수(double distilled water) 내에서 초음파 속도가 측정되었다.
검정: ResoScan® 조사 장치의 양 세포 내에 0.005 % Tween 20이 첨가된 표준수(demin. Water Roth. Art.3175.2 Charge:03569036)를 충전시킨 다음 20 ℃의 온도에서 등온측정되었다.
양 세포의 초음파 속도 차는 이하에서 더 자세히 설명되는 바와 같이 등온 측정 및 온도 주사(temperatures scans)의 0 값으로 사용되었다.
등온 측정: ResoScan® 조사 장치의 세포 1이 기준으로 사용되었고, 증류수(Roth Art. 34781 lot#48362077)로 충전되었다. 세포 2는 본 발명의 담체 조성물로 충전되었다. 20 ℃의 온도에서 절대 초음파 속도가 측정되었다. 실험치의 비교가 가능하도록 상기 초음파 속도들은 20.000 ℃의 온도까지 수정되었다.
결과
도 2는 본 발명의 담체 조성물(U2) 및 증류수(U1)에 대해 20.051 ℃의 온도에서 측정된 관찰 시간의 함수로서 표시된 절대 초음파 속도(U)를 도시한 것이다. 양 샘플은 시간 관찰창 내에서 안정된 등온 속도를 표시하였다(35 분).
하기 표 2는 측정된 초음파 속도(U1, U2) 및 그들의 20 ℃의 온도까지의 수정치를 요약한 것이다. 수정치는 증류수에 대한 1℃ 당 3 m/s의 온도-속도 상관관 계를 이용하여 산출되었다.
표 2
샘플 온도 U
증류수 20.051℃ 1482.4851
NeowaterTM 1482.6419
증류수 20℃ 1482.6381
NeowaterTM 1482.7949
도 2 및 표 2에 표시된 바와 같이, 증류수와 본 발명의 담체 조성물 사이의 차이는 등온 측정에 의해 관찰되었다. 초음파 속도차 ΔU = U 2 - U 1 는 20.051 ℃의 온도에서 15.68 cm/초이고, 20 ℃의 온도에서 13.61 cm/초였다. ΔU의 값은 ResoScan® 조사 장치의 임의의 잡음 신호보다 상당이 높다. 이들 결과는 제2의 ResoScan® 장치상에서 1회 재현되었다.
실시예 3
나노구조를 포함한 조성물의 완충 능력
나노구조를 포함하는 조성물의 완충 능력에 미치는 효과가 조사되었다.
물질 및 방법
페놀 레드 용액(Phenol red solution; 20mg/25ml)이 제조되었다. 13 ml의 RO 수 또는 나노구조를 포함하는 다양한 배치(batches)의 수(NeowaterTM - Do-Coop technologies, Israel)에 290 μl의 페놀 레드 용액이 첨가되었다. 각 수의 출발 pH는 상이하였으나 페놀 레드 용액의 첨가 후에 황색 또는 밝은 오렌지색을 띄는 것으로 보아 모두 산성이었다. 상기 각 수+페놀 레드 용액의 혼합물 2.5 ml를 큐벳에 넣었다. 각 큐벳에 소디움 히드록사이드를 체적이 증대되도록 첨가되었고, 분광광도계에 의해 흡수 스펙트럼이 독출되었다. 산성 용액은 430 nm에서 피이크를 나타내고, 알칼리성 용액은 557 nm에서 피이크를 나타낸다. 파장 범위는 200-800 nm이지만 그래프는 0.02M의 소디움 히드록사이드의 첨가에 관련되는 557 nm의 파장만을 나타내고 있다.
결과
표 3은 소디움 히드록사이드 적정 후의 각 수용액의 557 nm에서의 흡광도를 요약한 것이다.
표 3
NW1 HAP NW2 AB1 -2-3 NW3 HA 18 NW4 Alexander NW5 HA -99-X NW6 RO 0.02M의 소디움 히드록사이드의 첨가량(μl)
0.026 0.033 0.028 0.093 0.011 0.118 0.011 0
0.132 0.17 0.14 0.284 0.095 0.318 0.022 4
0.192 0.308 0.185 0.375 0.158 0.571 0.091 6
0.367 0.391 0.34 0.627 0.408 0.811 0.375 8
0.621 0.661 0.635 1.036 0.945 1.373 0.851 10
1.074 1.321 1.076 1.433 1.584 1.659 1.491 12
도 3 및 표 2에 나타나 있는 바와 같이, RO 수는 소디움 히드록사이드의 첨가시 pH가 크게 변화한다. RO 수는 약한 완충 효과를 가지지만, 흡광도가 0.09 A에 도달하면 완충 효과는 중단되고, 소디움 히드록사이드가 추가로 첨가된 후 pH 변화가 증대한다. HA-99 수는 RO수와 유사하다. NW (#150905-106) (NeowaterTM), AB 수 Alexander (AB 1-22-1 HA Alexander)는 부분적인 완충 효과를 가진다. HAP 및 HA-18은 NeowaterTM에 비해 큰 완충 효과를 나타낸다.
요약하면, 본 실험으로부터 HA-99-X 이외의 나노구조를 포함하는 새로운 종류의 물(HAP, AB 1-2-3, HA-18, Alexander)는 Neo waterTM와 유사한 특성을 보인다.
실시예 4
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 완충 능력
완충 능력에 미치는 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 효과가 조사되었다.
물질 및 방법
소디움 히드록사이드 및 염화수소산이 50 ml의 RO 수 또는 나노구조를 포함하는 수(NeowaterTM - Do-Coop technologies, Israel) 내에 첨가되었고, pH가 측정 되었다. 모든 실험은 3회 반복 실시되었다.
소디움 히드록사이드 적정: 1μl 내지 15 μl의 1M의 소디움 히드록사이드가 첨가되었다.
염화수소산 적정: 1μl 내지 15 μl의 1M의 염화수소산이 첨가되었다.
결과
소디움 히드록사이드 적정의 결과는 도 4A 내지 도 4C 및 도 5A 내지 도 5C에 도시되어 있다. 염화수소산 적정의 결과는 도 6A 내지 도 6C 및 도 7에 도시되어 있다.
나노구조를 포함하는 수는 RO 수를 위해 필요한 것과 동일한 pH에 이르기 위해 더 많은 양의 소디움 히드록사이드가 필요하므로 완충 능력을 가진다. 이와 같은 특성은 -7.6 - 10.5의 pH 범위 내에서 더욱 중요하다. 또, 나노구조를 포함하는 수는 RO 수를 위해 필요한 것과 동일한 pH에 이르기 위해 더 많은 양의 염화수소산이 필요하다. 이와 같은 효과는 알칼리성 pH 범위에서보다 산성의 pH 범위 내에서 더 크게 나타난다. 예를 들면, 10 μl의 1M의 소디움 히드록사이드(총량)을 첨가하면 RO 수의 pH는 7.56에서 10.3까지 증가된다. 나노구조를 포함하는 수의 pH는 7.62에서 9.33까지 증가된다. 10 μl의 1M의 염화수소산(총량)을 첨가하면 RO 수의 pH는 7.52에서 4.31까지 증가된다. 나노구조를 포함하는 수의 pH는 7.71에서 6.65까지 증가된다. 이 특성은 -7.7- 3의 pH 범위에서 더욱 중요하다.
실시예 5
나노구조를 포함한 액체 조성물의 완충 능력
완충 능력에 미치는 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 효과가 조사되었다.
물질 및 방법
페놀 레드 용액(20mg/25ml)이 제조되었다. 45 ml의 RO 수 또는 나노구조를 포함하는 수(NeowaterTM - Do-Coop technologies, Israel)에 1 ml 의 페놀 레드 용액이 첨가되었다. pH가 측정되고 필요한 경우 적정되었다. 각 수+페놀 레드 용액의 혼합물 3ml를 큐벳에 넣었다. 각 큐벳에 소디움 히드록사이드 또는 염화수소산을 체적이 증대되도록 첨가되었고, 분광광도계에 의해 흡수 스펙트럼이 독출되었다. 산성 용액은 430 nm에서 피이크를 나타내고, 알칼리성 용액은 557 nm에서 피이크를 나타낸다. 파장 범위는 200-800 nm이지만 그래프는 0.02M의 소디움 히드록사이드의 첨가에 관련되는 557 nm의 파장만을 나타내고 있다.
염화수소산 적정:
RO: 45ml pH 5.8
1 mI의 페놀 레드 용액과 5 μl의 소디움 히드록사이드 1M 이 첨가되었다. 새로운 pH = 7.85 NeowaterTM (# 150905-106): 45 ml pH 6.3.
1 mI의 페놀 레드 용액과 4 μl의 소디움 히드록사이드 1M이 첨가되었다. 새로운 pH = 7.19.
소디움 히드록사이드 적정:
I. RO: 45ml pH 5.78
1 mI의 페놀 레드 용액, 6 μl의 염화수소산 0.25M 및 4 μl의 소디움 히드록사이드 0.5M이 첨가되었다. 새로운 pH = 4.43
NeowaterTM (# 150604-109): 45 ml pH 8.8
1 mI의 페놀 레드 용액과 45 μl의 염화수소산 0.25M이 첨가되었다. 새로운 pH = 4.43
II. RO: 45ml pH 5.78
1 mI의 페놀 레드 용액과 5 μl의 소디움 히드록사이드 0.5M이 첨가되었다. 새로운 pH = 6.46
NeowaterTM (# 120104-107): 45 ml pH 8.68
1 mI의 페놀 레드 용액과 5 μl의 염화수소산 0.5M이 첨가되었다. 새로운 pH = 6.91
결과
도 8A 내지 도 8C 및 도 9A 내지 도 9B에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 수의 완충 능력은 RO 수의 완충 능력에 비해 더 우수하다.
실시예 6
RF 수의 완충 능력
완충 능력에 미치는 RF 수의 효과가 조사되었다.
물질 및 방법
150 ml의 RO 수(pH= 5.8)의 pH를 증가시키기 위해 수 μl의 1M의 소디움 히드록사이드 액적이 첨가되었다. 50 ml의 상기 RO 수를 3개의 병에 나누어 담았다. 3회의 처리가 수행되었다.
병 1: 무처리(RO 수)
병 2: 30W로 30분 동안 조사된 RO 수. 병 2는 적정을 개시하기 전(RF 수)에 10분간 작업대(bench) 상에 정치시켰다.
병 3: pH가 5에 도달했을 때 2차 조사(radiation)된 RF 수. 조사 후, 병 3은 적정을 실행하기 전에 10분간 작업대에 정치시켰다.
1 μl의 0.5M의 염화수소산을 50 ml의 수에 첨가하여 적정을 실행하였다. 상기 적정은 pH 값이 4.2 미만에 도달했을 때 종료되었다.
실험은 3회 반복 실시되었다.
결과
도 10A 내지 도 10C 및 도 11로부터 알 수 있는 바와 같이, RF 수 및 RF2 수는 나노구조를 포함한 담체 조성물의 것과 유사한 완충 특성을 포함한다.
실시예 7
나노구조를 포함한 액체 조성물의 안정화 효과
다음의 실험은 나노구조를 포함한 액체 조성물이 단백질의 안정화에 효과가 있는지의 여부를 확인하기 위해 수행되었다.
물질 및 방법
ddH2O (RO) 및 나노구조를 포함하는 담체(NeowaterTM - Do-Coop technologies, Israel) 내에서의 활성도를 측정하기 위해 시판되는 2종의 Taq 폴리머라제 효소(Peq-lab 및 Bio-lab)의 PCR 반응이 조사되었다. 상기 효소는 1시간 내지 2.5시간 사이의 상이한 시간 동안 95 ℃까지 가열되었다. 2종류의 반응이 실행되었다.
수(Water)- 효소 및 수만 비등하였다.
올 인사이드-모든 반응 성분들(효소, 물, 완충액, dNTPs, 게놈 DNA 및 프라이머(primer))이 비등하였다.
비등 후, PCR 튜브 내에 필요한 추가의 반응 성분이 첨가되었고, 통상 PCR 프로그램은 30 사이클로 세팅되었다.
결과
도 12A 및 도 12B에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함한 담체 조성물은 모든 성분들이 가열 스트레스 하에 처해 있을 경우 및 효소만이 가열 스트레스 하에 처해 있을 경우의 양 경우에 효소의 비등을 방지하였다. 반면, RO 수(water)는 모든 성분들이 가열 스트레스 하에 처해 있는 조건 하에서 효소의 가열만을 방지하였다.
실시예 8
나노구조를 포함한 담체의 안정화 효과의 추가의 입증
다음의 실험은 나노구조를 포함하는 담체가 시판되는 2종류의 Taq 폴리머라제 효소(Peq-lab and Bio-lab)가 안정화 효과를 발휘하는지의 여부를 확인하기 위 해 실행되었다.
물질 및 방법
PCR 반응이 다음과 같이 세팅되었다.
Peq - lab 샘플: 20.4 μl의 나노구조를 포함하는 담체 조성물(NeowaterTM - Do-Coop technologies, Israel) 또는 증류수(역삼투수;Reverse Osmosis= RO).
0.1 μl의 Taq 폴리머라제(Peq-lab, Taq DNA 폴리머라제, 5 U/μl)
3개의 샘플이 준비되고, 95 ℃의 일정한 온도에 유지되는 PCR 장치 내에 설치되었다. 배양 시간은 60분, 75분 및 90분으로 하였다.
Taq 효소의 비등 후, 다음의 성분들이 첨가되었다.
2.5 μl 10X 반응 완충액 Y (Peq-lab)
0.5 μl의 dNTPs 10mM (Bio-lab)
1 μl의 프라이머 GAPDH 혼합물 10 pmol/μl
0.5 μl의 게놈 DNA 35 μg/μl
Biolab 샘플
18.9 μl의 나노구조를 포함하는 담체 조성물(NeowaterTM - Do-Coop technologies, Israel) 또는 증류수(역삼투수;Reverse Osmosis= RO).
0.1 μl의 Taq 폴리머라제(Bio-lab, Taq 폴리머라제, 5U/μl)
5개의 샘플이 준비되고, 95 ℃의 일정한 온도에 유지되는 PCR 장치 내에 설치되었다. 배양 시간은 60분, 75분, 90분, 120분 및 150분으로 하였다.
Taq 효소의 비등 후, 다음의 성분들이 첨가되었다.
2.5 μl의 TAQ 10X 완충액 Mg없음 (Bio-lab)
1.5 μl의 MgCl2 25 mM (Bio-lab)
0.5 μl의 dNTPs 10mM (Bio-lab)
1 μl의 프라이머 GAPDH 혼합물 (10 pmol/μl )
0.5 μl의 게놈 DNA (35 μg/μl )
각 처리(Neowater 또는 RO)에 대해 양의 비교예 및 음의 비교예가 제조되었다. 양의 비교예는 효소의 비등이 없었다. 음의 비교예는 효소의 비등 및 반응 내에 DNA가 없었다. 비등된 Tag 분석 및 비교 반응을 위해 PCR 혼합물이 제조되었다.
샘플들은 PCR 장치 내에 설치되고 다음과 같은 작업이 수행되었다.
PCR 프로그램:
1. 94 ℃에서 2 분간 변성(denaturation)
2. 94 ℃에서 30 초간 변성
3. 60 ℃에서 30 초간 어닐링
4. 72 ℃에서 30 초간 신장, 2-4단계를 30 회 반복실행
5. 72 ℃에서 10 분간 신장
결과
도 13에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 액체 조성물은 양 효소를 가열 스트레스로부터 최대 1.5시간까지 보호하였다.
명확화를 위해 별개의 실시예로 나누어 기술한 본 발명의 특정의 특징은 단일의 실시예로 조합하여 제공될 수 있다. 반대로, 단순화를 위해 단일의 실시예에 기술된 본 발명의 다양한 특징들은 별개의 실시예들로 나누어 기술되거나 임의의 적합한 하위 실시예로 나누어 기술될 수 있다.
이상 본 발명은 특정의 실시예들에 관련하여 기술되었으나, 본 기술분야의 전문가에게는 다양한 대안, 개조 및 변경이 가능함이 명백하다. 따라서, 본 발명은 첨부한 청구범위의 사상 및 범위 내에 속하는 상기 모든 대안, 개조 및 변경을 모두 포함한다. 본 명세서에 언급된 모든 특허공개, 특허등록, 특허출원은 그 전체가 본 명세서에 참조문헌으로서 도입되었다. 또, 본 출원에서 참조문헌을 인용 또는 확인하는 것이 상기 참조문헌을 본 발명의 종래기술로서 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims (41)

  1. 나노구조, 액체, 및 최소 하나 이상의 저온보호제를 포함하는 저온보호 조성물.
  2. 세포 물질을 저온보존하는 방법으로서,
    (a) 상기 세포 물질을 나노구조 및 액체를 포함하는 조성물에 접촉시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포 물질을 저온보존 온도의 지배하에 두고, 그 결과 상기 세포 물질을 저온보존하는 단계를 포함하는 세포 물질을 저온보존하는 방법
  3. 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법으로서,
    (a) 청구항 2의 방법에 따라 세포 물질을 저온보존하는 단계;
    (b) 상기 저온보존된 세포 물질을 해동하는 단계; 및
    (c) 상기 조성물을 제거하고, 그 결과 저온보존된 세포 물질을 회복하는 단 계를 포함하는 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  4. 청구항 1의 저온보호 조성물을 포함하는 저온보존 용기.
  5. 나노구조 및 액체를 포함하는 저온보존 용기.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 저온보호 조성물은 최소 하나 이상의 저온보호제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법
  7. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 중 한 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 나노구조는 상기 액체의 규칙 유체 분자에 의해 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하고, 상기 코어 물질 및 상기 규칙 유체 분자들의 외피는 정상 물리적 상태에 있는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  8. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 유체 분자들은 최소 2개 이상의 균질 유체 조성을 포함하는 비균질 유체 조성물을 포함하고, 상기 유체는 상기 최소 2개 이상의 균질 유체 조성물의 최소 하나 이상과 동일한 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용 기.
  9. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 유체 분자들 중 최소 하나 이상의 부분은 기체 상태인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  10. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 나노구조의 농도는 1020/리터 미만인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  11. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 나노구조의 농도는 1015/리터 미만인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  12. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 나노구조는 집단을 형성할 수 있는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  13. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상 기 나노구조는 상호 장거리 상호작용을 유지할 수 있는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항의 저온보호 조성물 및 방법에 있어서, 상기 조성물은 물에 비해 향상된 초음파 속도를 특징으로 하는 저온보호 조성물 및 저온보존방법.
  15. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 코어 물질은 강유전 물질, 강자성 물질, 및 압전 물질로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  16. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 코어 물질은 결정질 코어 물질인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  17. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 액체는 물인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  18. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 나노구조의 각각은 상기 액체의 비중과 동일하거나 낮은 비중을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  19. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 나노구조 및 액체는 물의 완충 능력보다 큰 완충 능력을 포함하는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  20. 제 7 항의 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기에 있어서, 상기 나노구조는 히드록시아파타이트로부터 제조되는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  21. 제 1 항에 있어서, 10 체적% 미만의 글리세롤을 포함하는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물, 저온보존 방법 및 저온보존 용기.
  22. 글리세롤이 없는 청구항 1의 저온보호 조성물.
  23. 제 1 항 또는 제 6 항의 저온보호 조성물 및 저온보호 방법에 있어서, 상기 최소 하나 이상의 저온보호제는 아세트아미드, 아가로스, 알기네이트, 1-아날린, 알부민, 암모늄 아세테이트, 부탄디올, 콘드로인틴 설페이트, 클로로포름, 콜린, 덱스트란, 디에틸렌 글리콜, 디메틸 아세트아미드, 디메틸 포름아미드, 디메틸 설폭사이드(DMSO), 에리스리톨, 에탄올, 에틸렌 글리콜, 포름아미드, 글루코스, 글리 세롤, 알파-글리세로포스페이트, 글리세롤 모노아세테이트, 글리신, 히드록시에틸 전분, 이노시톨, 락토스, 마그네슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 말토스, 마니톨, 마노스, 메탄올, 메틸 아세트아미드, 메틸포름아미드, 메틸 요소, 페놀, 플루로닉 폴리올(pluronic polyols), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 프롤린, 프로필렌 글리콜, 피리딘 N-옥사이드, 리보스, 세린, 소디움 브로마이드, 소디움 클로라이드, 소디움 아이오다이드, 소디움 나이트레이트, 소디움 설페이트, 소르비톨, 스크로스, 트레할로스, 트리에틸렌 글리콜, 트리메틸아민 아세테이트, 요소, 발린 및 키시로스로부터 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물 및 저온보호 방법.
  24. 제 1 항에 있어서, 안정제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 안정제는 2가의 양이온, 유리기 포착제, 항산화제, 에틸렌 억제제 또는 열충격 단백질인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 에틸렌 억제제는 에틸렌 생합성 억제제 또는 에틸렌 작용 억제제인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물.
  27. 제 1 항에 있어서, 완충액 또는 매체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 저 온보호 조성물.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 완충액은 Tris 완충액 또는 포스페이트 완충액인 것을 특징으로 하는 저온보호 조성물.
  29. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 세포 물질은 체액, 세포 배양액, 세포 현탁액, 세포 매트릭스, 조직, 장기 및 유기체를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 체액은 정액인 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 정액은 올리고스퍼믹 남성, 테라토스퍼믹 남성, 어센부주스퍼믹 남성으로부터 추출되는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  32. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 세포 물질은 식물 세포 물질인 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하 는 방법.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 식물 세포 물질은 그로스 니이들, 잎사귀, 뿌리, 수피, 줄기, 지하경, 캘러스 세포, 원형질체, 세포 현탁액, 장기, 분열조직, 씨 및 배아로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  34. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 세포 물질은 미생물 세포 물질인 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  35. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 세포 물질은 포유류 세포 물질인 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 포유류 세포 물질은 줄기 세포, 정자, 난자 및 배아로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  37. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 상기 세포 물질은 유전자 조작된 것임을 특 징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법 및 저온보존된 세포 물질을 회복하는 방법.
  38. 제 2 항에 있어서, (a) 단계 전에 세포 물질을 상태조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법.
  39. 제 38 항에 있어서, 상기 상태조절단계는 안정제 처리, 저온 적응, 열충격 처리 및/또는 동결건조에 의해 실행되는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법.
  40. 제 2 항에 있어서, 상기 단계 (a) 및 단계 (b)는 동시에 수행되는 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법.
  41. 제 3 항에 있어서, 상기 저온보존 온도는 약 80 ℃ 미만인 것을 특징으로 하는 세포 물질을 저온보존하는 방법.
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