JP6901801B2 - 物質ｐを含むしわの改善または抗炎症化粧料組成物 - Google Patents

Description

本発明は、物質Ｐ（substance P）を有効成分として含む皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物に関するもので、より具体的には、コラーゲン合成促進、コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の生成抑制及び抗炎反応を行って、しわの改善または抗炎症効果のある化粧料組成物に関する。

化粧品産業は、継続的に成長している傾向にあり、様々な化粧品関連産業の中で、特に、皮膚老化に関連した化粧品は成長率が最も高い分野だといえる。皮膚老化はさまざまな原因によって発生するが、皮膚老化に直接影響を与える要因の中で目立つ要因は、大きく皮膚内のコラーゲン減少によるしわの形成及び酸化的ストレスによる炎症反応に分けられる。

細胞外基質の主要構成成分であるコラーゲンは、皮膚繊維芽細胞（Fibroblast）で生成される主な基質タンパク質であって、皮膚の堅固性、結合組織及び皮膚組織の結合力、細胞接着の支え、細胞分割と分化の誘導などの機能をし、これを介して真皮層内の水分保有力を高めて皮膚の弾力を維持するのに大きな役割をすると知られている。これらのコラーゲンは、年齢及び紫外線の照射による光老化により減少し、この時、コラーゲンを分解するコラーゲン分解酵素（Collagenases）の活性によりコラーゲン減少が促進されるが、これは皮膚のしわの形成に関与する。

従来は、コラーゲンのしわの改善効果を用いるために、化粧品または軟膏などのような皮膚外用剤組成物にコラーゲンを配合した製品が発売されたが、これらの製品はコラーゲン自体を皮膚表面に塗布するもので、高分子物質であるコラーゲンの経皮吸収が難しくて本質的なしわの改善効果を示すことができなかった。これらの問題を解決するために、コラーゲン合成促進物質に対する関心が高まり、従来知られているコラーゲン合成促進物質としては、レチノイド（retinoid）、アデノシン（adenosine）、クロレラ抽出物（ＪＰ９−４０５２３、ＪＰ１０−３６２８３、繊維芽細胞の増殖促進作用）、ビタミンＣ、形質転換成長因子（transforming growth factor、ＴＧＦ）、動物胎盤由来のタンパク質（ＪＰ８−２３１３７０）、ベツリン酸（betulinic acid、ＪＰ８−２０８４２４）などがある。

この中で最も広く知られているレチノールは、コラーゲン合成を促進するが、化粧料として使用時に皮膚に刺激、発赤などを誘発させ、光に不安定であるため、その使用に制限があり、クロレラ抽出物は効果がわずかで皮膚しわの改善効果を期待するのは難しい。このように、前記物質は、皮膚に適用時の刺激と発赤などの安全性の問題で使用量に制限があるか、その効果がわずかで実質的にしわの改善効果を期待できないという問題点がある。したがって、従来のしわ改善用組成物より生体に安全でしわの改善効果が高い、新しいしわの改善組成物の開発が切実に求められている。

一方、炎症は人体の病気や傷に対抗する免疫反応の一環であって、炎症反応の際にはさまざまな炎症誘発因子に加えて、様々なフリーラジカル（free radical）が生成される。正常のフリーラジカルは、細胞の恒常性維持に関与して細胞の分化、成長、生存、老化に影響を与える。これらのフリーラジカルの中で活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）は、細胞内のミトコンドリアで呼吸と免疫反応による酸素の酸化と還元過程を介して絶えず生成される。このようなフリーラジカルの生成と消去のバランスが崩れると、酸化的ストレス（oxidative stress）が発症することになり、これによる炎症性因子の活性化は細胞を損傷させて、皮膚の老化につながることになる。

炎症反応は、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ＩＬ−６など）の増加と抗炎症性サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０など）の減少が特徴的である。また、強力な炎症媒介物である一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）は、ＮＯ合成酵素（ＮＯＳ）によって生成され、光老化ストレスまたはサイトカインによって多くの種類の細胞から発生する。

皮膚老化に役立つ抗炎症原料としては、非ステロイド系統のフルフェナム酸（Flufenamic acid）、ベンジダミン（Benzydamine）、ステロイド系統のプレドニゾロン（Prednisolone）及びデキサメタゾン（Dexamethasone）などがある。しかし、これらも皮膚に対する安全性が低く、抗炎症の効果がわずかであるという短所がある。

一方、物質Ｐ（Substance P）は、１１個のアミノ酸からなる神経伝達ペプチドであって、様々な細胞及び肉芽組織で発現されることが報告されている。いくつかの研究によると、物質Ｐは人間のハムストリング腱細胞（Primary human hamstering tenocyes）でコラーゲンリモデリング（Collagen remodeling）を著しく増加させ、人工皮膚組織の経皮水分蒸発を抑制し、角質層の水分損失を防ぎ、角質層が水分を維持させると知られている。また、物質Ｐは炎症関連白血球、好中球及び造血幹細胞を血液内で減少させて、抗炎症関連サイトカイン、調節Ｔリンパ球及び抗炎症性マクロファージなどを増加させ、炎症反応を早期に終了させる効果も有すると知られている（特許文献１）。これは物質Ｐがしわ及び炎症反応改善組成物として十分に使用できるということを示す。ただし、物質Ｐの不安定によるしわ及び炎症改善効果の減少は、これをしわ改善または抗炎症化粧品として使用するために必ず克服しなければならない問題である。

前記のような背景下で、本発明者らは物質Ｐの安定性を増加させるために鋭意努力した結果、本発明者らが既存の開発した組成物であって、物質Ｐ、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む組成物が、物質Ｐ自体に比べて皮膚繊維芽細胞の成長培地内で安定し、同時に、より優れたしわ改善または抗炎症効果があることを確認して、本発明を完成した。

韓国登録特許公報１０-１２９２４５１Ｂ１

本発明の目的は、物質Ｐ（substance P）を含む皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物、前記組成物を個体の皮膚に塗布する段階を含む、皮膚のしわまたは炎症改善方法、及び前記組成物の用途を提供することにある。

本発明者らは、前記物質Ｐ（substance P）を含有する組成物が皮膚繊維芽細胞の成長培地内で安定的であり、コラーゲン合成促進、コラーゲン分解酵素の生成抑制及び抗炎反応を行うことにより、しわの改善または抗炎症効果があることを確認し、本発明を完成した。

本発明の物質Ｐ（substance P）、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む化粧料組成物は、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物として広く用いることができる。

抗酸化剤及び界面活性剤の含量に応じた物質Ｐの安定性を示したグラフである。 物質Ｐを含有した組成物の皮膚繊維芽細胞の培養培地内の安定性を示したグラフである。 物質Ｐを含有した組成物のコラーゲン合成効果を示したグラフである。 物質Ｐを含有した組成物のコラーゲン分解酵素（Collagenase）の抑制程度を示すグラフである。 物質Ｐを含有した組成物（ａ）及び物質Ｐ（ｂ）の炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果を示したグラフである。 物質Ｐを含有した組成物（ａ）及び物質Ｐ（ｂ）の一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）の減少効果を示したグラフである。

前記目的を達成するための一つの様態として、本発明は、物質Ｐ（substance P）、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を提供する。

本発明は、従来の物質Ｐの不安定によるしわの改善または抗炎症効能のわずかな効果を改善するための新規な化粧料組成物に関する。本発明者らは、物質Ｐを適用したときに最適のしわの改善または抗炎症効果が表れるようにする組成物の成分及び含量を開発した。

具体的には、本発明は、物質Ｐ、チオ硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０及びヒドロキシエチルセルロースを含む、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を提供する。

本発明者らは、前記物質Ｐ（substance P）を含有する組成物が皮膚繊維芽細胞の成長培地内で安定的であり、コラーゲン合成の促進、コラーゲン分解酵素の生成抑制及び抗炎反応を行うことにより、しわの改善または抗炎症効果があることを確認し、本発明を完成した。

本発明の組成物において、前記物質Ｐ（substance P）は、配列番号１の 「Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−ＮＨ_２」のアミノ酸からなる神経ペプチドを意味する。前記物質Ｐは、脳脊髄などの中枢神経系及び腸管などの末梢に広く分布し、１次知覚神経から痛覚を伝達する役割を実行することが知られている。

本発明の化粧料組成物に含まれる物質Ｐの濃度は、１〜１０μｇ／ｍｌであってもよく、具体的には、５〜１０μｇ／ｍｌであってもよい。

本発明の一実施例では、濃度が１〜１０μｇ／ｍｌの物質Ｐを含む組成物でコラーゲン合成効果及びコラーゲン分解酵素の抑制効果が優れていることを証明し、特に５〜１０μｇ／ｍｌの範囲で前記効果が最も優れていることを証明した（図３及び図４）。

したがって、本発明の化粧料組成物において、前記物質Ｐの濃度が１〜１０μｇ／ｍｌで含まれる場合、本発明の化粧料組成物が優れたしわの改善効能を発揮できることを確認した。

本発明の組成物において、前記抗酸化剤は空気中の酸素による活性成分の酸化過程で生じる遊離基や過酸化物に作用して酸化の連鎖反応を停止し、酸化の進行を防止して、活性成分の変質を防止する目的で添加される物質を意味する。

本発明において、前記抗酸化剤は、物質Ｐを含む化粧料組成物のしわの改善または抗炎症効果の変質を防止することができる。

前記抗酸化剤は、当業界で用いられてもよい通常の抗酸化剤を制限なく用いてもよいが、具体的には、β−メルカプトエタノール（β-mercaptoethanol、β−ＭＥ）、グルタチオン（Glutathione、ＧＳＨ）、アスコルビン酸（ascorbic acid）、ビタミンＥ、ベータカロチン、リコピン、コエンザイムＱ−１０（coenzyme Q-10）、セレン、クロム、マグネシウム、タウリン（taurine）、ハイポタウリン（hypotaurine）またはトレハロース（trehalose）などを用いてもよいが、これに制限されるものではない。具体的には、本発明で、前記抗酸化剤は、チオ硫酸ナトリウム（sodium thiosulfate）であってもよい。

前記抗酸化剤の含量は、化粧料組成物のしわの改善または抗炎症効果の変質を防止することができる限り、特に制限されないが、本発明の組成物の総重量に対して０．０１〜１重量％であってもよく、具体的には、０．１ 〜１重量％であってもよい。

本発明の一実施例では、抗酸化剤としてチオ硫酸ナトリウムを含む化粧料組成物が物質Ｐに比べて、コラーゲン合成効果、コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の抑制効果（図３及び図４）及び炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果、一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）の減少効果（図５及び図６）が優れていることを確認した。

したがって、本発明の化粧料組成物が抗酸化剤としてチオ硫酸ナトリウムを含む場合、優れたしわの改善または抗炎症効果を示すことができる。

本発明の組成物において、前記界面活性剤は親油性の油成分を用いて、均一な液組成を維持させる物質を意味する。

前記界面活性剤は、陰イオン系、陽イオン系、非イオン系または両性界面活性剤などの化粧料組成物の製造時に用いられる一般的な界面活性剤であってもよい。具体的には、本発明で前記界面活性剤は、ポリソルベート８０（polysorbate 80）であってもよい。

前記界面活性剤の含量は、本発明の組成物の総重量に対して０．００１〜０．１重量％であってもよく、具体的には、０．００６〜０．１重量％であってもよい。本発明の一実施例では、界面活性剤としてポリソルベート８０を含む化粧料組成物が、物質Ｐに比べて、コラーゲン合成効果、コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の抑制効果（図３及び図４）及び炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果、一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）の減少効果（図５及び図６）が優れていることを確認した。

したがって、本発明の化粧料組成物が界面活性剤としてポリソルベート８０を含む場合、優れたしわの改善または抗炎症効果を示すことができる。

本発明の組成物において、前記粘増剤は、粘性を付与するために添加される添加剤を意味するもので、増粘剤または増粘安定剤とも呼ばれる。具体的には、本発明の粘増剤はヒドロキシエチルセルロース（hydroxyethylcellulose）であってもよい。

前記粘増剤の含量は、本発明の組成物の総重量に対して１〜５重量％であってもよい。前記粘増剤の含量が組成物の総重量に対して１重量％以下の場合、化粧料組成物の安定性に問題が生じることがあり、５重量％以上である場合、化粧料組成物の粘性が高くなりすぎて塗布に適してない組成物になることがある。

本発明の一実施例では、粘増剤としてヒドロキシエチルセルロースを含む化粧料組成物が、物質Ｐに比べて、コラーゲン合成効果、コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の抑制効果（図３及び図４）及び炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果、一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）の減少効果（図５及び図６）が優れていることを確認した。

したがって、本発明の化粧料組成物が粘増剤としてヒドロキシエチルセルロースを含む場合、優れたしわの改善または抗炎症効果を示すことができる。

具体的には、本発明は、物質Ｐに、抗酸化剤としてチオ硫酸ナトリウム（sodium thiosulfate）、界面活性剤としてポリソルベート８０（polysorbate 80）及び粘増剤としてヒドロキシエチルセルロース（hydroxyethylcellulose）を含む、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を提供する。

具体的には、物質Ｐ、抗酸化剤０．０１〜１重量％、界面活性剤０．００１〜０．１重量％及び粘増剤１〜５重量％を含む、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を提供する。より具体的には、抗酸化剤は０．１〜１重量％及び界面活性剤は０．００６〜０．１重量％で含む、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を提供する。

また具体的には、物質Ｐ、抗酸化剤としてチオ硫酸ナトリウム０．０１〜１重量％、界面活性剤としてポリソルベート８０ ０．００１〜０．１重量％及び粘増剤としてヒドロキシエチルセルロース１〜５重量％を含む、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を提供する。より具体的には、物質Ｐ、抗酸化剤としてチオ硫酸ナトリウム０．１〜１重量％、界面活性剤としてポリソルベート８０ ０．００６〜０．１重量％を含む、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を提供する。

本発明の一実施例では、物質Ｐ、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む化粧料組成物が、物質Ｐに比べて、コラーゲン合成効果（図３）及びコラーゲン分解酵素の抑制効果（図４）が優れていることを証明することにより、物質Ｐを単独で適用することに比べ、皮膚のしわの改善効果がより優れていることを確認した。

また、本発明の一実施例では、物質Ｐ、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む化粧料組成物が、物質Ｐに比べて、炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果（図５）及び一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）の減少効果（図６）がより優れていることを証明することにより、物質Ｐを単独で適用することに比べ、炎症の改善効果がより優れていることを確認した。

したがって、本発明の化粧料組成物は、皮膚のしわまたは炎症改善用化粧品に有用に用いてもよい。

本発明の用語、「化粧料組成物」は、一般的な乳化剤形及び可溶化剤形の形態で製造してもよい。前記乳化剤形としては、栄養化粧水、クリーム、エッセンスなどがあり、前記可溶化剤形としては、柔軟化粧水などがある。前記化粧料組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション及びスプレーで構成された群から選択される剤形で製造してもよいが、これに制限されたものではない。具体的には、低刺激性化粧料皮膚保護剤、柔軟化粧水、栄養化粧水、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、セラム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、パック、クリーム、エッセンス、スプレーまたはパウダーの剤形で製造してもよい。

また、前記化粧料組成物は、一般的な皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んでもよく、通常の成分として、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを適切に配合してもよいが、これに制限されるものではない。

前記化粧料組成物に含まれる化粧品学的に許容可能な担体は、剤形に応じて様々である。

前記化粧料組成物の剤形が軟膏、ペースト、クリーム、またはゲルである場合には、担体成分として動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛またはこれらの混合物が用いられてもよい。

前記化粧料組成物の剤形がパウダーまたはスプレーである場合には、担体成分としてラクトース、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミドパウダー、またはこれらの混合物が用いられてもよく、特にスプレーの場合には、さらにクロロフルオロ炭化水素、プロパン／ブタンまたはジメチルエーテルのような推進剤を含んでもよい。

前記化粧料組成物の剤形が溶液または乳濁液である場合には、担体成分として溶媒、溶解化剤または油濁化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１,３−ブチルグリコールオイルが用いられてもよく、特に、綿実油、ピーナッツ油、トウモロコシ胚種オイル、オリーブオイル、ヒマシ油及びごま油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコールまたはソルビタンの脂肪酸エステルが用いられてもよい。

前記化粧料組成物の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノールまたはプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、アガーまたはトラカントなどが用いられてもよい。

前記化粧料組成物の剤形が石鹸である場合には、担体成分として脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオン酸塩、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物性油、グリセロール、糖などが用いられてもよい。

本発明において、用語、「しわの改善」とは、皮膚にしわが生じるのを抑制または阻害したり、すでに生成されたしわを緩和させることを意味する。

本発明において、用語、「炎症の改善または抗炎症」とは、炎症を抑制する作用を意味し、前記炎症は外部からの刺激に対する生体内の防御機構の一つであり、具体的には、炎症は先天性免疫反応の一部として、外部からの刺激、特に病原体の表面に特異的に存在するパターンを認識する。生体内の炎症細胞はそのような表面の特異的パターンを非自己として認識し、病原体を攻撃する。この時、病原体が生体内の物理的な障壁を破って侵入すると炎症反応が勃発する。炎症反応時の初期段階に免疫反応を担う白血球が炎症性サイトカインを発現する。したがって、細胞内の炎症性サイトカインの発現量は炎症反応の活性化の指標となる。また、強力な炎症媒介物である一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）もサイトカインによって多くの種類の細胞から発生されるため、炎症反応のさらなる指標だといえる。

本発明の他の一つの態様は、物質Ｐ、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物を、皮膚のしわまたは炎症が誘発された個体に投与する段階を含む、皮膚のしわまたは炎症の改善方法を提供する。

本発明の用語「個体」とは、皮膚のしわまたは炎症が生成される可能性のある人間を含むすべての動物を意味してもよい。前記動物は人間だけではなく、同様の症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、カモシカ、犬及び猫などの哺乳動物であってもよいが、これに制限されない。

本発明の用語、「物質Ｐ」、「抗酸化剤」、「界面活性剤」及び「粘増剤」は、前記で前述した通りである。

本発明の化粧料組成物を毎日または間欠的に投与してもよく、皮膚のしわまたは炎症の改善のために、単独で、または他の組成物と併用して用いてもよい。前記要素のすべてを考慮して、副作用のない最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定できる。

別の様態として、本発明は、前記化粧料組成物を個体の皮膚に塗布する段階を含む、皮膚のしわまたは炎症の改善方法を提供する。

前記化粧料組成物、皮膚のしわまたは炎症の改善については、前記説明した通りである。

本発明の一実施例では、本発明の物質Ｐ、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む化粧料組成物が、物質Ｐに比べて、コラーゲン合成効果（図３）及びコラーゲン分解酵素の抑制効果（図４）が優れていることを確認し、物質Ｐに比べて、炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果（図５）及び一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）の減少効果（図６）がより優れていることを確認した。したがって、本発明の物質Ｐを含む化粧料組成物を皮膚に塗布する段階を含む、皮膚のしわまたは炎症の改善方法を提供できることを確認した。

別の様態として、本発明は皮膚のしわまたは炎症改善のための化粧品を生産するための、前記化粧料組成物の用途を提供する。

前記化粧料組成物、皮膚のしわまたは炎症の改善については、前記説明した通りである。

本発明の一実施例では、本発明の物質Ｐ、抗酸化剤、界面活性剤及び粘増剤を含む化粧料組成物が、物質Ｐに比べて、コラーゲン合成効果（図３）及びコラーゲン分解酵素抑制効果（図４）が優れていることを確認し、物質Ｐに比べて、炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果（図５）及び一酸化窒素（Nitric oxide、ＮＯ）の減少効果（図６）がより優れていることを確認した。したがって、本発明の物質Ｐを含む化粧料組成物を皮膚のしわまたは炎症改善のための化粧品を生産する用途として提供できることを確認した。

以下、実施例を介して本発明の構成及び効果をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。

実施例１：抗酸化剤及び界面活性剤の含量に応じた物質Ｐの安定性の評価
本発明者らは物質Ｐを含む皮膚のしわまたは炎症改善用組成物の製造の前に、抗酸化剤及び界面活性剤の含量に応じた物質Ｐの安定性の評価実験を介して、前記化粧料組成物の適用に適合な抗酸化剤及び界面活性剤の最適含量を確認した。

物質Ｐの抗酸化剤としてチオ硫酸ナトリウムの含量比をそれぞれ別にして（０．０５％、０．１％、０．５％及び１％）添加し、界面活性剤としてポリソルベート８０の含量比を別にして（０．００３％、０．００６％、０．０１％、０．０５％及び０．１％）添加して組成物を製造し、チオ硫酸ナトリウム及びポリソルベート８０を異なる量で含まれている各剤形での物質Ｐの安定性を測定した。

図１に示すように、チオ硫酸ナトリウムが０．１％以上含まれる組成物で物質Ｐの安定性が全体的に増加することを確認した。また、ポリソルベート８０の含量比が０．００６％以上である組成物で物質Ｐの安定性が増加し、ポリソルベート８０の含量によるこれらの効果は、チオ硫酸ナトリウムが０．１％以上の時、さらに明確に示されることが確認できた。

実施例２：物質Ｐを含む皮膚のしわまたは炎症改善用組成物の製造
物質Ｐに抗酸化剤としてチオ硫酸ナトリウム、界面活性剤としてポリソルベート８０及び粘増剤としてヒドロキシエチルセルロースを追加した新規な剤形を製造した。物質Ｐは、ペプチド合成技術であるＦｍｏｃケミストリー（Fmoc-chemistry）を用いた固相／液相の段階（Solid/ Solution phase）を介して合成し、高速液体クロマトグラフィーを介して精製して、最終的に純度８５％以上のものを用いた。

実施例３：物質Ｐを含む組成物の皮膚繊維芽細胞の培養培地内の安定性の確認
物質Ｐを含有した組成物の安定性を皮膚繊維芽細胞の培養培地で確認した。前記表１のように製造した物質Ｐを含有した組成物（物質Ｐ、５μｇ／ｍｌ）または比較例としてリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解した物質Ｐ（物質Ｐ、５μｇ／ｍｌ）を皮膚繊維芽細胞の培養培地（ＦＧＭ、Lonza、USA）に０、３、６、１２及び２４時間まで適用した後、時間の経過に応じて培地内に残っている物質Ｐの含量を測定した。物質Ｐの含量は、Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ Ｐ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（Abcam、USA）を用いて、ＥＬＩＳＡ法で定量した。このとき、対照群としては０時間を適用したサンプルを用い、対照群を１００％にして、時間の経過に応じて培地内に残っている物質Ｐの含量をパーセント（％）で計算した。

その結果、培養３時間後、リン酸緩衝溶液に溶解した物質Ｐを処理したグループで物質Ｐの含量が最大４６％まで減少し、６時間が過ぎた後は１１％まで含量が減少することを確認した。一方、本発明の物質Ｐを含有した組成物の場合、培養して２４時間が経過した後も、培地内の物質Ｐの含量が約１００％を維持することを確認した（図２）。

このような結果は、本発明の物質Ｐを含む組成物が、物質Ｐそのものに比べて、皮膚繊維芽細胞の培地内でさらに安定して存在することを証明するものである。

実施例４：物質Ｐを含有した組成物のコラーゲン合成効果の確認
物質Ｐを含有した組成物のコラーゲン合成効果を皮膚繊維芽細胞で確認した。９６個の穴がある平板培養プレート（96-well plate）に３×１０^４ ＣＦＵ／ウェルの人間の皮膚繊維芽細胞を入れて、３７℃で２４時間培養した。培地を（ＦＧＭ、Lonza、USA）除去した後、新しい培地１８０μｌを各ウェルに分注し、物質Ｐを含有した組成物またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解した物質Ｐを２０μｌずつ入れた後、３７℃で２４時間培養した。このとき、添加された組成物及び物質Ｐの濃度は、全体の培地量を考慮して、最終濃度が所望の濃度になるように計算して添加した。２４時間培養した後、上澄み液を集めてＰｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ１−Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｐ１Ｐ）ＥＩＡ Ｋｉｔ（TaKaRa、Japan）を用い、培地のコラーゲン量を測定した。

その結果、培養２４時間後、リン酸緩衝溶液に溶解した物質Ｐを処理したグループでは、コラーゲン合成が最大約２５％まで増加した。一方、本発明の物質Ｐを含有した組成物を処理したグループの場合、コラーゲン合成が最大約７０％まで増加した（図３）。

これらの差は、統計学上で有意だった。統計は、スチューデントのt検定を用い、対照群（リン酸緩衝溶液の処理群）に対する各実験群の効果の比較（^*p＜０．０５、^**ｐ＜０．０１）及びリン酸緩衝溶液に溶解した物質Ｐと本発明の組成物の効果の比較（^#ｐ＜０．０５、^##ｐ＜０．０１）をそれぞれ行った。

このような結果は、物質Ｐに比べて、本発明の物質Ｐを含む組成物のコラーゲン合成効果がさらに優れていることを示す。

実施例５：物質Ｐを含有した組成物のコラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の抑制効果の確認
物質Ｐを含む組成物のコラーゲン分解酵素（Collagenase、ＭＭＰ−１）の抑制効果を皮膚繊維芽細胞で確認した。９６個の穴がある平板培養プレート（96-well plate）に３×１０^４ ＣＦＵ／ウェルの人間の皮膚繊維芽細胞を入れて、３７℃で２４時間培養した。培地を（ＦＧＭ、Lonza、USA）除去した後、新しい培地１８０μｌを各ウェルに分注し、物質Ｐを含有した組成物及びリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解した物質Ｐを２０μｌずつ入れた後、３７℃で２４時間培養した。このとき、添加された組成物または物質Ｐの濃度は、全体培地量を考慮して、最終濃度が所望の濃度になるように計算して添加した。２４時間培養した後、上澄み液を集めてＨｕｍａｎ ｔｏｔａｌ ＭＭＰ−１ Ｋｉｔ（R＆D systems、USA）を用い、培地にあるコラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の量を測定した。

その結果、培養２４時間後、リン酸緩衝溶液に溶解した物質Ｐを処理したグループで、コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の形成が最大約２０％程度減少した。一方、本発明の物質Ｐを含有した組成物を処理したグループの場合、コラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の形成が最大約４０％程度減少することを確認した（図４）。

これらの差は、統計学上で有意だった。統計は、スチューデントのt検定を用い、対照群（リン酸緩衝溶液の処理群）に対する各実験群のＭＭＰ−１形成の比較（^*p＜０．０５、^**ｐ＜０．０１）及びリン酸緩衝溶液に溶解した物質Ｐと本発明の組成物のＭＭＰ−１形成の比較（^#ｐ＜０．０５、^##ｐ＜０．０１）をそれぞれ行った。

このような結果は、物質Ｐに比べて、本発明の物質Ｐを含む組成物によるコラーゲン分解酵素（ＭＭＰ−１）の抑制効果が優れていることを示す。

実施例６：物質Ｐを含有した組成物の炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果の確認
物質Ｐを含有した組成物の炎症性サイトカインＩＬ−６の減少効果をマウスのマクロファージであるＲａｗ ２６４．７細胞で確認した。２４個の穴がある平板培養プレート（24-well plate）に４×１０^５ ＣＦＵ／ウェルの人間の皮膚繊維芽細胞を入れて、３７℃で２４時間培養した。Ｒａｗ ２６４．７細胞の成長用培地は、ＤＭＥＭ（Welgene、Korea）に２００ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco、USA）を混ぜた培地を用いた。２４時間培養した後、培地を除去した後に新しい培地１ｍｌを各ウェルに分注した。細胞内の炎症反応の誘導のためにＬＰＳ（Sigma、USA）を１００ｎｇ／ｍｌ処理すると同時に、物質Ｐを含有した組成物またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解した物質Ｐを分注して、全体培地量が２ｍｌ／ウェルになるようにした後、３７℃で２４時間追加培養した。このとき、添加された組成物及び物質Ｐの濃度は、全体培地量を考慮して、最終濃度が所望の濃度になるように計算して添加した。２４時間培養した後、上澄み液を集めてＭｏｕｓｅ ＩＬ−６ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（R＆D systems、USA）を用い、培地の炎症性サイトカインＩＬ−６の量を測定した。

ＩＬ−６量の減少の有意さはスチューデントのt検定を用いてＬＰＳを処理したグループに対する実験群のＩＬ−６実測量の比較（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）を行うことにより確認した。

その結果、培養２４時間後、リン酸緩衝溶液に溶解した物質Ｐを処理したグループで、炎症誘発物質ＬＰＳにより誘発されたＩＬ−６の量が最大約２０％程度減少したことを確認した（図５ｂ）。一方、本発明の物質Ｐを含有した組成物を処理したグループの場合、炎症誘発物質ＬＰＳにより誘発されたＩＬ−６の量が最大約５０％程度減少したことを確認した（図５ａ）。

このような結果を介して、物質Ｐに比べて、本発明の物質Ｐを含む組成物による炎症性サイトカインＩＬ−６の抑制効果が優れていることを確認した。

実施例7：物質Ｐを含有した組成物の一酸化窒素（ＮＯ）の減少効果の確認
物質Ｐを含む組成物の炎症環境内の一酸化窒素（ＮＯ）の減少効果をマウスのマクロファージであるＲａｗ ２６４．７細胞で確認した。２４個の穴がある平板培養プレート（24-well plate）に４×１０^５ ＣＦＵ／ウェルの人間の皮膚繊維芽細胞を入れて、３７℃で２４時間培養した。Ｒａｗ ２６４．７細胞の成長用培地は、ＤＭＥＭ（Welgene、Korea）に２００ｍＭのＬ−グルタミン（Gibco、USA）を混ぜた培地を用いた。２４時間培養した後、培地を除去した後に新しい培地１ｍｌを各ウェルに分注した。細胞内の炎症反応の誘導のためにＬＰＳ（Sigma、USA）を１００ｎｇ／ｍｌ処理すると同時に、物質Ｐを含有した組成物またはリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）に溶解した物質Ｐを分注して、全体培地量が２ｍｌ／ウェルになるようにした後、３７℃で２４時間追加培養した。このとき、添加された組成物及び物質Ｐの濃度は、全体培地量を考慮して、最終濃度が所望の濃度になるように計算して添加した。

２４時間培養した後、上澄み液を回収し、９６個の穴がある平板培養プレート（96-well plate）に１００μｌずつ入れて、Ｇｒｉｅｓｓ ｒｅａｇｅｎｔ（Sigma、USA）を同量添加し、常温で１５分間保管した後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。亜硝酸ナトリウム（Sigma、USA）を標準品として検量線を作成し、ＬＰＳのみを処理した群の一酸化窒素（ＮＯ）の生成量を１００％として、培地内の一酸化窒素（ＮＯ）の量を測定した。

ＮＯ量減少の有意さはスチューデントのt検定を用いてＬＰＳ処理したグループに対する実験群のＮＯ実測量の比較（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１）を行うことにより確認した。

その結果、培養２４時間後、リン酸緩衝溶液に溶解した物質Ｐを処理したグループで、炎症誘発物質ＬＰＳにより誘発されたＮＯの量が最大約１０％程度減少したことを確認した（図６ｂ）。一方、本発明の物質Ｐを含有した組成物の場合、炎症誘発物質ＬＰＳにより誘発されたＮＯの量が最大約７０％程度減少したことを確認した（図６ａ）。

このような結果を介して、物質Ｐに比べて、本発明の物質Ｐを含む組成物によるＮＯの抑制効果が優れていることを確認した。

Claims (7)

1. 配列番号１のアミノ酸配列からなる物質Ｐ（substance P）、チオ硫酸ナトリウム、ポリソルベート８０、及びヒドロキシエチルセルロースを含む皮膚のしわまたは炎症改善用化粧料組成物。
2. 前記物質Ｐの濃度が、１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の化粧料組成物。
3. 前記物質Ｐの濃度が、５μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌである、請求項１に記載の化粧料組成物。
4. 前記チオ硫酸ナトリウムの含量が、全体組成物の総重量に対して０．０１重量％〜１重量％である、請求項１〜３のいずれかに記載の化粧料組成物。
5. 前記ポリソルベート８０の含量が、組成物の総重量に対して０．００１重量％〜０．１重量％である、請求項１〜４のいずれかに記載の化粧料組成物。
6. 前記ヒドロキシエチルセルロースの含量が、組成物の総重量に対して１重量％〜５重量％である、請求項１〜５のいずれかに記載の化粧料組成物。
7. 皮膚のしわまたは炎症改善のための化粧品を生産するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化粧料組成物の用途。
   

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