KR20090106578A - 세포 성장 및 세포 융합을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

세포 성장 및 세포 융합을 향상시키기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

세포-융합 방법이 제공되는데, 본 방법은 액체 및 나노구조를 가지며 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 융합하는 단계를 포함한다. 단클론성 항체를 생성하고 진핵세포를 배양하기 위한 조성물 및 제조 물품이 또한 제공된다.

Description

세포 성장 및 세포 융합을 향상시키기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITION AND METHOD FOR ENHANCING CELL GROWTH AND CELL FUSION}
본 발명은 세포 성장 및 세포 융합을 향상시키기 위한 신규한 조성물에 관한 것이다.
포유동물의 생체는, 특히 생체에서 항상성을 유지하는데 불리하고 각종 질병의 악화를 유발하거나 추가하는 병원성이 될 수 있는 외인성 항원(예, 바이러스, 세균 독소 및 화학 물질), 자가항원(예, 자가반응성 림프구; 암 세포 및 과잉의 내인성 인자(예, 시토카인, 호르몬 또는 성장인자)를 포획하여 제거하기 위한 방어 시스템인 체액성 면역을 가진다. 이러한 체액성 면역에서, 항체는 중요한 역할을 한다.
항체는 4 개의 폴리펩티드 사슬, 즉 두 개의 긴 폴리펩티드 사슬(면역글로불린 중쇄; IgH 사슬) 및 두 개의 짧은 폴리펩티드 사슬(면역글로불린 경쇄; IgL 사슬)을 포함하는 Y-형의 기본 구조를 가진다. Y-형 구조는 디설파이드 결합에 의해 가교된 두 개의 IgH 사슬이 또 다른 디설파이드 결합을 통해 IgL 사슬의 각각에 연결되는 경우 만들어진다.
생체에 유해한 항원을 포획하고 제거하는 이러한 기능으로 인해, 항체는 오 랫동안 약물로서 사용되어 왔다. 다클론성 항체는 특이 항원에 대한 다양한 유형의 항체를 포함하는 항혈청이 사용된 경우 항체 약물의 최초 형태이었다. 그러나, 이러한 항혈청을 수득하는 방법은 혈청으로부터의 수집으로 국한되므로 공급은 불가피하게 제한된다. 또한, 항원에 특이적인 단일형의 항체 분자를 이러한 항혈청으로부터 분리해내는 것이 극히 어렵다.
문헌[Kohler and Milstein in 1975 (Nature, Vol. 256, p. 495-497, 1975)]에 의해 하이브리도마를 사용하여 단클론성 항체를 성공적으로 제조함으로써, 요구에 따라 특이 항원에 대한 항체를 생성하는 것이 가능해졌으므로, 이러한 문제점들이 해결되었고 단클론성 항체를 약물로서 사용하기 위한 가능성을 열게 되었다.
전형적으로, 인간 단클론성 항체의 생성은 골수원의 파트너 세포주와의 융합에 의한 인간 B-림프구의 무한증식화를 필요로 한다. 이들 세포 융합의 결과물은 "하이브리도마"라 명명되는데, 이는 모 세포주 둘 다의 특징인 지속적인 성장능 및 순수 항체 생성능을 가진다.
그러나, 단클론성 항체 제조에 사용가능한 유일한 인간 B-세포는 말초 혈액 중에 순환하는 것이므로, 단클로성 항체 생성용 세포원은 제한된다. 또한, 이론적으로는 가능할 지라도, 이들이 야기한 면역 반응이 새로운 것이 아니거나 재발된 것이 아니라면 항원에 대한 인간 단클론성 항체를 제조하는 것은 어렵다. 게다가, 분비된 단클론성 항체의 양이 전형적으로 많지 않기 때문에 하이브리도마 세포 배양액으로부터 높은 수준의 분리된 단클론성 항체를 제조하는 것은 어려운 것으로 입증되었다.
단클론성 항체 생성의 이론적인 결과 및 실제적인 결과를 연결하기 위해, 말초 혈액으로부터 수득되는 B-세포의 희소성을 해소하여 무한증식화의 기회를 더욱 높이기 위해서는 중합 공정의 효율이 매우 높을 필요가 있다.
다량의 단클론성 항체를 비용효율이 높은 방식으로 생성하는 방법이 필요하며 이러한 방법을 가지는 것이 매우 유리하다는 것이 광범위하게 인식되고 있다.
발명의 요약
본 발명의 일부 구체예의 일면에 따라, 세포-융합 방법이 제공되는데, 본 방법은 액체 및 나노구조를 가지는 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 융합하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 일면에 따라, 진핵세포를 배양하는 방법이 제공되는데, 본 방법은 액체 및 나노구조를 가지는 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하여 진핵세포를 배양하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 일면에 따라, 진핵세포 배양 배지, 및 액체 및 나노구조를 가지는 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
본 발명의 일부 구체예의 일면에 따라, 포장재, 및 상기 포장재 내에 담긴 진핵세포 배양용으로 확인된 액체 조성물로서, 상기 액체 조성물은 액체 및 나노구조를 가지며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예의 일면에 따라, 포장재, 및 상기 포장재 내에 담긴 단클론성 항체 생성용으로 확인된 액체 조성물로서, 상기 액체 조성물은 액체 및 나노구조를 가지며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 제조 물품이 제공된다.
본 발명의 일부 구체예의 일면에 따라, 단클론성 항체의 생성 방법이 제공되는데, 본 방법은 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지 중에서 무한증식 세포를 항체 생성 세포와 융합하여 하이브리도마를 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예의 일면에 따라, 세팔로스포린을 물질의 분산 또는 용해가 가능한 조건하에서 나노구조 및 액체와 접촉시키는 단계를 포함하여 세팔로스포린을 용해시키거나 분산시키는 방법이 제공되며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포는 동일하다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포는 동일하지 않다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포는 초대 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 세포는 무한증식 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 동일하지 않은 세포는 종양세포 및 항체 생성 세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 동일하지 않은 세포는 줄기 세포 및 체세포를 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 줄기 세포는 배아 줄기 세포가다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 체세포는 근세포 또는 골세포이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 항체 생성 세포는 B 림프구이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, B 림프구는 인간 B 림프구이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, B 림프구는 말초 혈액 단핵세포이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 종양세포는 융합단계 이전에 하이브리도마 생성을 증가시키는 시간 동안 상기 액체 조성물에서 인큐베이션된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 시간은 1 일 이상이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 유체 분자의 적어도 일부는 상기 액체의 분자와 동일하다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 유체 분자의 적어도 일부는 기체 상태이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 나노구조의 농도는 리터당 1020개 미만의 나노구조이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 나노구조는 상기 나노구조의 클러스터(cluster)를 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 나노구조는 그들 사이에서 원거리 상호작용(long range interaction)을 유지할 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 액체 조성물은 물의 완충능보다 큰 완충능을 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 액체 조성물은 수산화인회석으로부터 제제화된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 액체 조성물은 편광을 변경시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 배지는 성장인자, 혈청 및 항생제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제제를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 진핵세포는 단일세포이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 단일세포는 하이브리도마이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 배양 단계는 HCF의 부재하에 수행된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 진핵세포는 중간엽 줄기 세포가다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 진핵세포 배양 배지는 성장인자, 혈청 및 항생제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제제를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 액체 조성물은 세포 증식률을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 하이브리도마를 클로닝하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 클로닝 단계는 상기 하이브리도마를 상기 액체 조성물을 포함하는 배지 중에서 인큐베이션함으로써 수행된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 클로닝 단계는 HCF의 부재하에 수행된다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 상기 방법은 상기 클로닝 단계 이후 단클론성 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 있는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 것과 유사 또는 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료는 아래 기술된다. 불일치한 경우에, 정의를 비롯한 특허 명세서는 조절될 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 설명을 위한 것일 뿐, 제한하고자 의도된 것이 아니다.
본 발명은 첨부된 도면과 관련하여 단지 일례로서 여기에 기술된다. 도면과 관련하여 상세하게는 도시한 도면은 일례로서, 단지 본 발명의 바람직한 실시예를 예시적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 원리 및 개념적 양상을 가장 유용하고 쉽게 이해할 수 있게 설명하도록 하기 위해 나타낸다. 이 점에서, 본 발명을 근본적으로 이해하는데 필요한 설명보다 더 상세하게 본 발명을 구조적으로 설명하고자 하는 시도는 이루어지지 않았지만, 도면에 의한 설명은 본 발명의 일부 형태가 실제로 어떻게 구체화될 수 있는지를 당업자들에게 명백하게 한다.
도면에서:
도 1은 RO (역삼투) 물의 Neowater™에 기초한 MEM 배지에서의 골수 세포의 증식을 나타내는 막대 그래프이다.
도 2는 557 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정된, 다양한 물 조성물의 수산화나트륨 적정을 나타내는 그래프이다.
도 3A-C는 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 수산화나트 륨 적정을 나타내는 삼중으로 수행된 실험의 그래프이다.
도 4A-C는 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 수산화나트륨 적정을 나타내는 그래프로서, 각각의 그래프는 세 개의 삼중 실험을 요약한 것이다.
도 5A-C는 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 염산 적정을 나타내는 삼중으로 수행된 실험의 그래프이다.
도 6은 pH에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 염산 적정을 나타내는 그래프로서, 그래프는 세 개의 삼중 실험을 요약한 것이다.
도 7A-C는 557 ㎚에서의 흡광도에 의해 측정된, 나노구조를 포함하는 물과 RO 물의 염산(도 10A) 및 수산화나트륨(도 10B-C) 적정을 나타내는 그래프이다.
도 8A-B는 RO(도 8A) 및 나노구조를 포함하는 물(도 8B)의 염산 적정 이후 큐벳의 사진이다. 각각의 큐벳은 1 ㎕ 염산의 첨가를 나타낸다.
도 9A-C는 RF 물(도 9A), RF2 물(도 9B) 및 RO 물(도 9C)의 염산 적정을 나타내는 그래프이다. 화살표는 두 번째 조사를 가리킨다.
도 10은 RO 물과 비교한 FR2 물의 염산 적정을 나타내는 그래프이다. 실험은 3 회 반복하였다. 세 실험 모두에 대한 평균치를 RO 물에 대하여 플롯팅하였다.
도 11A-J는 분말의 분산시 다양한 시간 간격으로 3회 시도한 후 적색 분말(red powder) 및 Neowater™를 포함하는 용액의 사진이다. 도 11A-E는 실시예 8 C 부분으로부터의 우측 시험관 C(50% EtOH+Neowater™) 및 좌측 시험관 B(탈수 Neowater™)를 나타낸다. 도 11G-J는 밤새 적색 분말의 분쇄(crushing) 및 100 ㎕ Neowater™의 적정 이후의 용액을 나타낸다.
도 12A-C는 나노드롭(nanodrop)으로 측정된 3 개의 상이한 용액 2 ㎕의 흡광도 판독치이다. 도 12A는 밤새 분쇄 이후 적색 분말의 용액+100 ㎕ Neowater™를 나타낸다. 도 12B는 100% 탈수 Neowater™ 첨가 이후 적색 분말의 용액을 나타내며, 도 12C는 EtOH+Neowater™(50%-50%) 첨가 이후 적색 분말의 용액을 나타낸다.
도 13은 1번 바이얼(CD-Dau + Neowater™), 4번 바이얼(CD-Dau + Neowater™ 중 10% PEG) 및 5번 바이얼(CD-Dau + 50% 아세톤 + 50% Neowater™)의 분광광도계 측정 그래프이다.
도 14는 Neowater™ 중 용해 물질(청색 선) 및 소량의 용매 아세톤을 함유하는 용해 물질(분홍색 선)의 분광광도계 측정 그래프이다.
도 15는 Neowater™(청색 선) 및 아세톤(분홍색 선) 중 용해 물질의 분광광도계 측정 그래프이다. 엷은 청색 및 황색 선은 상이한 비율의 아세톤 증발을 나타내며, 보라색 선은 아세톤을 함유하지 않는 용액이다.
도 16은 200-800 nm에서의 CD-Dau의 분광광도계 측정 그래프이다. 청색 선은 RO 중 용해 물질을 나타내는 반면, 분홍색 선은 Neowater™ 중 용해 물질을 나타낸다.
도 17은 200-800 nm에서의 t-boc의 분광광도계 측정 그래프이다. 청색 선은 RO 중 용해 물질을 나타내는 반면, 분홍색 선은 Neowater™ 중 용해 물질을 나타낸다.
도 18A-D는 200-800 nm에서의 분광광도계 측정 그래프이다. 도 18A는 에탄올 증발 직후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14B의 그래프이다. 도 18B는 에탄올 증발 24 시간 이후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14B의 그래프이다. 도 18C는 에탄올 증발 직후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14A의 그래프이다. 도 18D는 에탄올 증발 24 시간 이후 에탄올의 존재하 및 부재하 AG-14A의 그래프이다.
도 19는 에탄올 증발 24 시간 이후 AG-14A 및 AG-14B의 현탁액 사진이다.
도 20A-G는 Neowater™에 용해된 펩티드의 분광광도계 측정 그래프이다. 도 20A는 Neowater™에 용해된 펩티드 X의 그래프이다. 도 20B는 Neowater™에 용해된 X-5FU의 그래프이다. 도 20C는 Neowater™에 용해된 NLS-E의 그래프이다. 도 20D는 Neowater™에 용해된 Palm-PFPSYK(CMFU)의 그래프이다. 도 20E는 Neowater™에 용해된 PFPSYKLRPG-NH2의 그래프이다. 도 20F는 Neowater™에 용해된 NLS-p2-LHRH의 그래프이고, 도 20G는 Neowater™에 용해된 F-LH-RH-palm kGFPSK의 그래프이다.
도 21A-G는 크리스털 바이올렛 분석법(crystal violet assay)에 의해 측정된, Neowater™에 용해된 펩티드의 세포독성 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 21A는 Neowater™에 용해된 펩티드 X의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 21B는 Neowater™에 용해된 X-5FU의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 21C는 Neowater™에 용해된 NLS-E의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 21D는 Neowater™에 용해된 Palm-PFPSYK(CMFU)의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 21E는 Neowater™에 용해된 PFPSYKLRPG-NH2의 세포독성 효과의 그래프이다. 도 21F는 Neowater™에 용해된 NLS-p2-LHRH의 세포독성 효과의 그래프이고, 도 21G는 Neowater™에 용해된 F-LH-RH-palm kGFPSK의 세포독성 효과의 그래프이다.
도 22는 에탄올 및 Neowater™에서의 레티놀 흡광도의 그래프이다.
도 23은 여과 후 에탄올 및 Neowater™에서의 레티놀 흡광도의 그래프이다.
도 24A-B는 시험관 사진으로서, 좌측은 Neowater™ 및 물질 "X"를 함유하고, 우측은 DMSO 및 물질 "X"를 함유한다. 도 24A는 24 시간 방치시킨 후의 시험관을 나타내고, 도 24B는 48 시간 방치시킨 후의 시험관을 나타낸다.
도 25A-C는 가열 및 진탕 공정 직후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 28A), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 25B) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 25C)의 사진이다.
도 26A-C는 가열 및 진탕 공정하고 60 분 후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 26A), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 26B) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 26C)의 사진이다.
도 27A-C는 가열 및 진탕 공정하고 120 분 후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 27A), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 27B) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 27C)의 사진이다.
도 28A-C는 가열 및 진탕 공정하고 24 시간 후 용매 1 및 2와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 28A), 용매 3 및 4와 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 28B) 및 용매 5 및 6과 함께 물질 "X"를 포함하는 시험관(도 28C)의 사진이다.
도 29A-D는 Neowater™를 포함하는 용매 및 감소 농도의 DMSO 중에 물질 "X"를 포함하는 유리병의, 진탕 직후(도 29A), 진탕하고 30 분 후(도 29B), 진탕하고 60 분 후(도 29C) 및 진탕하고 120 분 후(도 29D)의 사진이다.
도 30은 분광광도계에 의해 측정된, 와류하고 6 시간 후의 RO/Neowater™ 중 물질 "X"의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 31A-B는 분광광도계에 의해 측정된, 에탄올 중 SPL2101(도 31A) 및 아세톤 중 SPL5217(도 31B)의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 32A-B는 분광광도계에 의해 측정된, Neowater™ 중 SPL2101(도 32A) 및 Neowater™ 중 SPL5217(도 32B)의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 33A-B는 분광광도계에 의해 측정된, Neowater™(도 33A) 및 DMSO(도 33B) 중 탁솔(taxol)의 흡수 특징을 나타내는 그래프이다.
도 34는 293T 세포에 대한 상이한 용매 중 탁솔의 세포독성 효과를 나타내는 막대 그래프이다. 대조군 RO = RO 물로 제조한 배지; 대조군 Neo = Neowater™로 제조한 배지; 대조군 DMSO RO = RO 물 + 10 ㎕ DMSO로 제조한 배지; 대조군 Neo RO = RO 물 + 10 ㎕ Neowater™로 제조한 배지; 탁솔 DMSO RO = RO 물 + DMSO 중 용해된 탁솔로 제조한 배지; 탁솔 DMSO Neo = Neowater™ + DMSO 중 용해된 탁솔로 제조한 배지; 탁솔 NW RO = RO 물 + Neowater™ 중 용해된 탁솔로 제조한 배지; 탁솔 NW Neo = Neowater™ + Neowater™ 중 용해된 탁솔로 제조한 배지.
도 35A-B는 두 개의 상이한 Taq 중합효소를 사용하여 실시예 16에 기술된 프로토콜에 따라 가열한 후의 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 존재하 및 부재하에 수득된 PCR 산물을 나타내는 브롬화 에티듐으로 염색한 DNA 겔의 사진이다.
도 36은 두 개의 상이한 Taq 중합효소를 사용하여 실시예 17에 기술된 프로토콜에 따라 가열한 후의 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 존재하 및 부재하에 수득된 PCR 산물을 나타내는 브롬화 에티듐으로 염색한 DNA 겔의 사진이다.
도 37A는 Neowater™ 내 및 DMSO 내 0.5 mM 탁솔의 분광광도계 판독치를 나타내는 그래프이다.
도 37B-C는 Neowater™ 내 및 DMSO 내 탁솔의 HPLC 판독치를 나타낸다. 도 37B는 탁솔의 신선하게 제조된 표준 (DMSO) 제제의 HPLC 판독치를 나타낸다. 도 37C는 -20 ℃에서 6 개월 저장 후 Neowater™ 내에 분산된 탁솔의 HPLC 판독치를 나타낸다.
도 38은 DMSO 내 또는 Neowater™ 제제 내 다양한 탁솔 농도의 PC3 세포 생존률을 나타내는 막대 그래프이다. 각각의 점은 8 회 반복치로부터의 평균 표준 편차를 나타낸다.
도 39는 Neowater™에 의한 융합 효율의 향상을 나타내는 막대 그래프이다. 융합은 표준 프로토콜에 따라 수행되었고, 배양 배지 및 PEG는 Neowater™(NPD) 또는 대조군 물(DI)과의 분말 형성으로부터 재구성되었다. 각 융합의 경우, 단일 배치로부터 PBMC는 두 개로 동일하게 분열되었고 이를 사용하여 Neowater™에 또는 대조군 물에 기초한 시약 중에서 두 개의 비슷한 실험을 준비하였다. 본 도면은 각각의 융합 실험에서 하이브리도마-양성 웰의 백분율을 나타낸다. 백분율은 융합 공정 이후 세포가 시딩되고 성장된 96-웰 플레이트로부터 하이브리도마-양성 웰의 수로서 계산되었다. 모든 Neowater™- 및 대조군 물-융합 사이의 차는 카이-스퀘어(Chi-square) 분석에 의해 통계학적으로 유의한 것임을 알 수 있었다(p<<0.001). 향상률은 식 [(Neowater™-융합에서 하이브리도마의 수/대조군 물-융합에서 하이브리도마의 수)×100%-100%]에 의해 산출되었다.
도 40은 Neowater™(NPD) 및 대조군 물(DI)에서 반-안정한 클론의 클로닝 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 반-안정성 항체-생성 클론으로부터 200 개의 세포를 계수하고 96-웰 플레이트에 10 ㎖의 부피로 시딩하였다(평균 1-2 개 세포/100 ㎕/웰). 도면은 클로닝 실험 당 하이브리도마-양성 웰의 평균 백분율을 나타낸다. 에러 막대는 평균의 표준 에러를 표시한다.
도 41A-B는 10% FCS 내 안정한 하이브리도마 클론으로부터의 항체 분비를 향상시키는 Neowater™의 능력을 나타내는 막대 그래프이다. 두 개의 비슷한 배양액을 안정한 하이브리도마 클론으로부터 여러 개 제조하였다. 하나는 Neowater™(NPD) 배지에서 성장시키고 다른 것은 대조군 물(DI) 배지에서 성장시켰으며, 둘 다 표준 배양 조건을 유지하게 하였다. 성장 1주일 후, 상청액을 수집하고 항체 농도를 표준 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 각 컬럼은 Neowater™(NPD) 및 대조군 물(DI) 배양액에서 측정된 평균 항체 농도를 나타낸다. 에러 막대는 평균의 표준 에러를 표시한다. 도 41A는 배양 상청액에서 측정된 총 항체 농도를 나타내고; 도 41B는 세포당 정규화된 항체 농도를 나타낸다.
도 42A-B는 3% FCS에서 안정한 하이브리도마 클론에 의한 IG 생성을 나타내는 그래프이다. 안정한 하이브리도마 클론의 동일한 배양액으로부터 유래한 두 개의 배양액을 성장시켰으며, 하나는 Neowater™(NPD)에서, 다른 것은 3% FCS를 보충한 대조군 물(DI) 기초 배지에서 성장시켰다. 시딩하기 전, 세포를 무혈청 배지에서 세척하여 임의의 잔류 혈청의 제거를 확인하였다. 2 주 동안, 나타낸 바와 같이 상청액을 수집하고, 세포를 같은 날 계수하였다. 4 일째 및 10 일째에 배양액을 공급하고 배지를 6 일째에 배양액에 배치하였다. DI 배양액 내 세포가 이들 조건하에서 정상적으로 증식하였지만, 측정가능한 양의 항체를 생성하는데 실패하였다.
도 43A-C는 감소된 혈청 배지에서의 CHO 세포 성장을 나타내는 막대 그래프이다. 도 43A: Neowater™ (NPD) 및 대조군 물(DI) 기초 배지에서 10-cm 페트리 접시 당 1.5×106 개의 초기 밀도로 세포를 삼중으로 시딩하였다. 밤새 성장시킨 후, 이들을 트립신처리에 의해 떼어내고 계수하였다. 결과를 생존 세포의 수로서 제시하였다. 각 컬럼은 각 처리군 내 세포의 평균 수를 나타낸다. 에러 막대는 평균의 표준 에러를 표시한다. 처리군간의 차이는 30%이다. 그래프는 대표적인 실험의 결과를 제공하며, 이는 복제물을 통해 수행되었고 3 회 반복하였다.
도 43B,C: Neowater™(NPD) 또는 5% 또는 1% FCS가 보충된 대조군 물(DI) 배지에서 다중 복제물(처리군 당 18 웰)로 96-웰 플레이트에 세포를 시딩하였다. 결과를 정량하고 크리스털 바이올렛 염료 체류 분석법(crystal violet dye retention assay)에 의해 분석하였다. 각 컬럼은 제시된 처리 이후의 평균 세포 밀도를 O.D.유닛으로 나타내었다. 에러 막대는 평균의 표준 에러를 표시한다. *NPD와 DI 성장 세포 사이의 유의차 p=0.0006, 총 차이 7%. **NPD와 DI 성장 세포 사이의 유의차 p=0.0001, 총 차이 14%.
도 44A-B는 초대 인간 섬유모세포 증식에 대한 Neowater™의 영향을 설명하는 막대 그래프이다. 초대 인간 섬유모세포를 96-웰 플레이트에 두 가지 초기 세포 밀도로 반복하여 접종하였다: 웰 당 5000 개 세포 및 10000 개 세포. 밤새 성장시킨 후, 세포를 고정하고 크리스털 바이올렛 염료 체류 방법에 의해 분석하였다. 결과를 O.D. 값으로 나타내었다. 각 컬럼은 제시된 성장 조건의 평균 O.D.를 나타내고; 에러 막대는 평균의 표준 에러를 표시한다. *5000개 세포/웰의 세포 밀도에 대한 DI(대조군 물)와 NPD(Neowater™) 사이의 유의차(p<<0.0001). **10000개 세포/웰의 세포 밀도에 대한 DI와 NPD 사이의 유의차(p<<0.0001). 도 44B. 24-웰 플레이트 초대 인간 섬유모세포를 NPD 및 DI 기초 배지에 삼중으로 시딩하였다. 이어, 삼중의 세트(NPD 및 DI 모두에서)에 대해 24 시간마다 생존 세포를 떼어내고 계수하여 분석하였다. 결과를 웰 당 생존 세포의 수로 제시하였고, 에러 막대는 평균의 표준 에러를 표시한다.
도 45는 세포수를 계수함으로써 측정된 중간엽 줄기 세포 증식에 대한 Neowater™의 영향을 나타내는 막대 그래프이다.
도 46은 크리스털 바이올렛 염색에 의해 측정된 중간엽 줄기 세포 증식에 대한 Neowater™의 영향을 나타내는 막대 그래프이다.
도 47은 100% 아세톤에 용해시킨 세팔로스포린의 분광광도계 판독치이다.
도 48은 여과 전후 Neowater™ 에 용해시킨 세팔로스포린의 분광광도계 판독치이다.
도 49A-B는 상이한 세팔로스포린 농도를 가진 LB에서의 DH5α 성장 곡선이다. 세균은 두 가지의 별도의 경우에 대하여 37 ℃ 및 220 rpm에서 성장시켰다.
도 50A-B는 두 가지 별도의 경우에 대하여 접종하고 7 시간 후 대조군 성장(세팔로스포린 무첨가)에 준거하여 두 가지의 상이한 세팔로스포린 농도에 따른 DH5α 생존률을 나타내는 막대 그래프이다(대조군은 100 ㎕의 Neowater™를 함유함).
도 51은 DDW 스펙트럼과 비교하여 Neowater™의 광학 활성을 나타내는 그래프이다. 적색 및 청색 곡선은 다른 날 측정된 상이한 Neowater™ 배치의 측정치이다.
바람직한 구체예의 설명
본 발명은 세포 성장 및 세포 융합 모두를 향상시킬 수 있는 신규한 조성물에 관한 것이다.
특히 본 발명은 단클론성 항체 생성을 향상시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 적어도 하나의 구체예를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명은 이후의 발명의 상세한 설명에 나타내었거나 실시예에 의해 예시된 상세 구조로 그의 적용이 제한되는 것이 아님을 이해하여야 한다. 본 발명은 그 외에도 구체화할 수 있거나 다양한 방법으로 실행 또는 수행될 수 있다. 또한, 여기에 사용하는 표현 및 용어는 설명을 위한 것이지 제한하는 것으로서 간주되어서는 안 되는 것으로 이해하여야 한다.
인간 단클론성 항체의 생성은 골수원의 파트너 세포주와의 융합에 의한 인간 B-림프구의 무한증식화를 필요로 한다. 그러나, 단클론성 항체 생성에 사용가능한 유일한 인간 B-세포는 말초 혈액 중에 순환하는 것이므로, 단클로성 항체 생성용 세포원은 제한된다.
또한, 분비된 단클론성 항체의 양이 전형적으로 많지 않기 때문에 하이브리도마 세포 배양액으로부터 높은 수준의 분리된 단클론성 항체를 생성하는 것은 어려운 것으로 입증되었다.
단클론성 항체 제조의 이론적인 결과 및 실제적인 결과를 연결하기 위해, 말초 혈액으로부터 수득되는 B-세포의 희소성을 해소하여 무한증식화의 기회를 더욱 높이기 위해서는 중합 공정의 효율이 매우 높을 필요가 있다. 또한, 하이브리도마의 안정성 및 그로부터의 단클론성 항체의 분비 둘 다를 향상시키기 위한 방법을 탐구할 필요가 있다.
본 발명을 실시하는 동안에, 본 발명자들은 나노입자(이를 테면, 미국 특허출원 제60/545,955호와 제10/865,955호 및 국제특허출원 공개 제WO2005/079153호에 기술된 것들)를 포함하는 조성물이 세포 융합성 및 세포 안정성 둘 다를 증진시킨다는 것을 밝혀내었다.
다음에 오는 실시부 및 이하에 설명된 바와 같이, 본 발명자들은 상기한 나 노구조 및 액체가 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 융합 파트너(MEP-2) 세포의 융합을 증진시키고 또한 이로부터 생성된 하이브리도마의 안정성을 증진시킨다는 것을 입증하였다(아래 실시예 1의 표 1과 3, 실시예 19의 표 6 및 도 39). 또한, 본 발명자들은 나노구조 및 액체가 하이브리도마로부터의 항체 분비를 증가시킨다는 것을 보여 주였다. 즉, 본 발명의 액체 및 나노구조는 단클론성 항체의 분리 및 생성을 도울 수 있다.
본 발명은 단클론성 항체 생성을 증진시킬 뿐만 아니라 다른 진핵세포 사이의 융합을 증가시키고 일반적으로 세포, 특히 중간엽 줄기 세포의 성장을 향상시키는 신규한 조성물을 제공하기 위해 이러한 결과를 모색하였다(도 45-46).
따라서, 본 발명의 하나의 일면에 따르면, 세포-융합 방법이 제공되는데, 본 방법은 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 융합하는 단계를 포함한다.
본원에 사용된 어구 "세포-융합"은 둘 이상의 생존 세포의 (생체외 또는 생체내) 합체를 말한다.
세포-융합은 융합생성 조건하에 세포를 결합하는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 세포는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 센다이 바이러스와 같은 융합 자극의 존재하에 융합될 수 있다(예를 들어, 문헌[Harlow & Lane (1988) in Antibodies, Cold Spring Harbor Press, New York]을 참조할 수 있다). 다르게 는, 세포는 적절한 전기적 조건하에서 융합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "나노구조"는, 각각 나노미터 또는 나노미터 이하 크기이며 통상 "나노입자"를 축약한 하나 이상의 입자를 포함하는 마이크로미터 이하의 크기인 구조를 말한다. 구조 중 서로 다른 구성요소들(예를 들어, 나노입자, 분자) 사이의 거리는 나노구조가 "연속 나노구조"로 언급된 경우 수십 피코미터 이하일 수 있거나, "불연속 나노구조"로 언급된 경우 수백 피코미터 내지 수백 나노미터일 수 있다. 따라서, 본 구체예의 나노구조는 나노입자, 나노입자의 배열 또는 하나 이상의 나노입자 및 하나 이상의 분자의 임의의 배열을 포함할 수 있다.
상술한 조성물의 액체는 바람직하게는 수중 액체(aquatic liquid), 예를 들어 물이다.
본 발명의 이러한 일면의 하나의 바람직한 구체예에 따르면, 액체 조성물의 나노구조는 정연한 유체 분자에 의해 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하는데, 이들은 코어 물질 및 서로 정상의 물리적 상태로 존재한다. 이러한 액체 조성물은 본 발명자에 의한 미국 특허출원 제60/545,955호 및 제10/865,955호 및 국제특허출원 공개 제WO2005/079153호에 개시되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
코어 물질의 예로는 강유전성 물질, 강자성 물질 및 압전성 물질이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 강유전성 물질은 일부 온도 범위에서 전기장의 인가에 의하여 역전되거나 방향이 바뀔 수 있는 영구적인 전기 극성을 유지하는 물질이다. 강자성 물질은 영구 자화를 유지하는 물질로서, 자기장 인가에 의하여 가역적일 수 있다. 바람직하게도, 나노구조는 코어 물질의 강유전성 또는 강자성 특성을 보유함으로써, 마크로 스케일의 물리적 특성이 나노스케일 환경으로 옮겨지는 특별한 특성을 포함한다.
코어 물질은 또한 결정성 구조를 가질 수 있다.
본원에 사용된 어구 "정연한 유체 분자"는 밀접한 관계의, 예를 들어 서로 상관관계가 있는 유체 분자들의 조직화된 배열을 말한다. 예를 들어, 하나의 유체 분자의 순간적 치환은 코어 물질을 둘러싸는 하나 이상의 다른 유체 분자의 순간적 치환과 서로 관련될 수 있다.
본원에 사용된 어구 "정상의 물리적 상태(steady physical state)"는 물질 또는 분자가 적어도 극소(local minimum)의 임의의 포텐셜에 의해 결합된 상황을 의미한다. 이와 같은 포텐셜의 대표적인 예로는 반데르발스 포텐셜, 유카와(Yukawa) 포텐셜, 레나르드-존스(Lenard-Jones) 포텐셜 등이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 다른 형태의 포텐셜이 또한 예측된다.
바람직하게도, 인벨롭의 정연한 유체 분자는 담체 조성물의 액체 분자와 동일하다. 인벨롭의 유체 분자는 담체 조성물의 액체 분자와 동일하지 않은 추가의 유체를 포함할 수 있고, 이와 같이 인벨롭은 이종(heterogeneous) 유체 조성물을 포함할 수 있다.
정연한 유체 분자의 인벨롭 형성으로 인해, 본 구체예의 나노구조의 비중은 바람직하게는 액체의 비중과 동일하거나 작다.
유체 분자는 액체 상태 또는 기체 상태일 수 있거나 이 둘의 혼합물일 수 있 다.
나노구조의 바람직한 농도는 리터 당 1020 나노구조 이하, 보다 바람직하게는 리터 당 1015 나노구조 이하이다. 바람직하게도, 액체 중의 나노구조들은 그들 사이에 끌어당기는 정전력에 기인하여 클러스터를 형성할 수 있다. 바람직하게도, 나노구조들 사이의 간격이 클러스터 형성을 방해하는 경우에도(약 0.5-10 ㎛), 나노구조는 원거리 상호작용을 유지할 수 있다.
이론에 결부됨이 없이, 나노구조들 사이의 원거리 상호작용이 본 발명의 액체 조성물의 독특한 특징을 유도하는 것으로 여겨진다. 하나의 이러한 특징은 다음에 오는 실시부에 입증된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물이 두 세포 형태 사이의 융합 공정을 향상시킬 수 있다는 것이다. 또한, 액체 조성물은 다음에 오는 실시부의 실시예 2에서 입증된 바와 같이 세포의 안정성을 향상시키는 것으로 나타났다. 또한, 액체 조성물은 하이브리도마로부터의 항체 분비를 향상시키는 것으로 나타났다(실시예 19).
본 발명의 이러한 일면에 따른 나노구조의 생성은 "탑-다운(top-down)" 공정을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 공정은 고체 분말(예를 들어, 미네랄, 세라믹 분말, 유리 분말, 금속 분말, 합성 중합체)을 충분히 높은 온도, 바람직하게는 약 700 ℃ 이상으로 가열하는 방법 단계를 포함한다. 고려되는 고체 분말의 예로 BaTiO3, W03 및 Ba2F9O12가 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 놀랍게도, 본 발명자들은 또한 수산화인회석(HA)을 가열하여 본 발명의 조성물을 생성할 수 있음을 알 수 있었다. 수산화인회석은 무독성을 특징으로 하며 일반적으로 인간 치료요법에 대하여 FDA 승인되어 있기 때문에 특히 바람직하다.
많은 수산화인회석 분말이 다양한 제조업자, 이를 테면 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 및 클래리온 파마슈티칼스(clarion pharmaceuticals)로부터 입수가능하다는 것이 인지될 것이다(예를 들어, 카탈로그 번호 1306-06-5).
표 4에 나타낸 바와 같이, HA에 기초한 액체 조성물은 모두 물에 비해 향상된 완충능을 포함한다.
이어, 가열된 분말을 그의 밀도 이상 온도(density anomaly temperature) 이하(예, 3 ℃ 또는 2 ℃)의 차가운 액체에 침지한다. 동시에, 차가운 액체 및 분말을 전자기 RF 조사선, 바람직하게는 500 MHz 이상, 750 MHz 또는 그 이상의 조사선에 조사하는데, 여기서 상기 조사선은 연속파 RF 조사선 또는 변조 RF 조사선일 수 있다.
상술한 생성 공정 동안, 소스 분말의 대량의 응집물 중 일부가 붕괴되고 소스 분말의 개개 입자 중 일부가 그의 형태를 변경하여 구형 나노구조가 된다는 것이 본 발명자에 의해 입증되었다. 생성 공정 동안, 라디오파 처리에 의해 나노버블이 발생하고, 이상 온도(anomaly temperature) 이하의 물의 뜨거운 입자의 주입으로 인해 공동(cavitation)이 생성된다는 것이 가정되었다[Katsir et al., "The Effect of rf-Irradiation on Electrochemical Deposition and Its Stabilization by Nanoparticle Doping", Journal of The Electrochemical Society, 154(4) D249-D259, 2007]. 물이 이상 온도 이하로 유지되기 때문에, 뜨거운 입자가 국부 가열 을 야기하고, 차례로 가열 위치의 비체적이 국부적으로 감소하며, 이어 다른 위치에서 가압을 야기한다. 공정 동안 및 공정 이후 수 시간 이하의 일정 시간 간격 동안, 물은 외부 대기와의 기체 교환 및 주변 전자파 방사의 선택적 흡수를 포함하는 자기조직화 공정을 거치는 것이 가정되었다. 자기조직화 공정을 통해 나노버블 및 나노구조로 구성된 안정한 구조 분포에 이르게 된다는 것이 추가로 가정되었다.
다음에 오는 실시부에 입증된 바와 같이, 본 구체예의 액체 조성물은 비소멸성의 원편광 이색성 신호를 특징으로 한다. 원편광 이색성은 물질이 특정 파정에서 평면 편광과 상호작용하는 경우 일어나는 광학 현상이다. 원편광 이색성은 물질과 하나의 편광 구성요소의 상호작용 특징이 물질과 또다른 편광 구성요소의 상호작용 특징과 다른 경우 일어난다. 예를 들어, 물질에 대한 좌우 원편광 성분의 상이한 흡수에 따라 흡수대는 음 또는 양일 수 있다.
액체 조성물의 비소멸 원편광 이색성 신호는 액체 조성물이 광학적으로 활성인 배지임을 가리킨다는 것이 인지된다. 즉, 본 구체예의 액체 조성물은 그것과 상호작용하는 동안 편광을 변경시킬 수 있다. 본 발명자는 본 구체예의 액체 조성물의 광학 활성은 상기 언급된 나노버블과 나노구조의 안정한 구조 분포의 형성에 의해 명백한 원거리 질서의 결과이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명의 액체 조성물은 세포-융합의 공정을 돕는 것으로 나타났다. 세포의 예로는 초대 세포 및 무한증식 세포, 동일 세포 및 비동일세포, 인간 세포 및 비인간 세포가 포함된다.
어구 "무한증식 세포"는 몇 세대 동안 또는 무한정으로 세포 배양액에서 계 대될 수 있는 세포 또는 세포주를 말한다. 무한증식 세포의 예는 종양 세포이다.
즉, 예를 들어 본 발명의 액체 조성물은 종양 세포와 항체 생성 세포(예, B 림프구) 사이의 생체외 융합을 도와 하이브리도마를 생성하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "하이브리도마"는 단일 막내에서 두 개의 세포, 즉 B-세포와 같은 면역 시스템으로부터의 분비 세포와 종양 세포와 같은 무한증식 세포를 융합함으로써 생성되는 세포를 말한다. 생성된 하이브리드 세포는 클로닝되어 동일한 딸세포를 생성할 수 있다. 이들 각각의 딸 클론은 몇 세대에 걸쳐 면역 세포의 세포 생성물을 분비할 수 있다.
본 발명의 이러한 일면의 바람직한 구체예에 따르면, B 림프구는 인간 B 림프구이다. 본 발명의 이러한 일면의 또다른 바람직한 구체예에 따르면, B 림프구는 말초 혈액 중에 순환하는 것들, 예를 들어 PBMC이다.
본 발명에 따라 하이브리도마를 생성하는데 사용될 수 있는 종양 세포의 예로는 마우스 골수종 세포 및 세포주, 래트 골주송 세포주 및 인간 골수종 세포주가 포함된다.
바람직하게도, 골수종 세포주는 선택 절차가 확립될 수 있도록 하는 마커를 포함한다. 예를 들어, 골수종 세포주는 HGPRT 네가티브 (하이포크산틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제) 네가티브일 수 있다. 그의 특정 예로는 마우스로부터 유래된 X63-Ag8(X63), NS1-Ag4/1(NS-1), P3X63-Ag8.UI(P3UI), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO.BU.1; 래트로부터 유래된 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3); 및 인간으로부터 유래 된 U266AR(SKO-007), GM1500 GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2), 8226AR/NIP4-1(NP41) 및 MFP-2가 포함된다.
본 발명의 이러한 일면에 따르면, 종양세포 및/또는 B 림프구는 본 발명의 액체 조성물을 포함하는 배지(예, 배양 배지)에서 인큐베이션된다.
본원에 사용된 어구 "배양 배지"는 진핵세포를 최소 12 시간 동안 생존가능하게 하는 조성물, 바람직하게는 복제하는 하도록 하는 조성물을 가진 배지를 말한다.
본 발명의 액체 조성물에서의 인큐베이션은 하이브리도마의 수를 증가시키기 위해 융합 공정 이전, 융합 공정 중 및/또는 융합 공정 이후 수행될 수 있다. 융합 공정 이전의 본 발명의 액체 조성물에서의 인큐베이션은 하이브리도마 생성을 향상시키도록 임의의 시간 길이 동안 수행될 수 있다. 바람직하게도, 인큐베이션은 1 일 이상 동안 이루어진다. 이하의 실시예 1에 나타낸 바와 같이, MFP-2 세포(골수종 세포)는 융합 전 대략 20 일 동안 본 발명의 액체 조성물을 포함하는 세포 배지에서 성장되었다. 융합 절차 그 자체는 또한 본 발명의 액체 조성물을 포함하는 배지에서 수행되었다.
본 발명의 일면 중 어느 것에 따르면, 배양 배지의 액체 부분은 이하에 추가로 개시된 바와 같은 본 조성물의 액체 조성물로 완전히 또는 부분적으로 교환될 수 있다.
본 발명의 일면 중 어느 것에 따르면, 각 세포는 특정 방식으로 상이한 배양 배지에 반응하므로, 배양 배지는 전형적으로 경험적 근거에 기초하여 선택된다. 배양 배지의 예가 이하에 추가로 개시되어 있다.
본 발명의 액체 조성물은 종양 세포 및 수지상 세포와 같은 다른 세포들간의 생체외 융합을 돕는데 사용될 수 있다. 이러한 융합 세포는 항암 백신으로서 유효할 수 있는 것으로 나타났다[Zhang K et al., World J Gastroenterol. 2006 Jun 7;12(21):3438-41].
본 발명의 액체 조성물을 체세포와 줄기 세포 사이의 생체내 융합을 돕기 위해 사용될 수 있다. 그들의 강력한 생식력 및 재생력 때문에, 줄기 세포는 상이한 기관, 이를 테면 간, 뇌 및 심장에 및 골수의 손상을 회복하는데 사용될 수 있다. 줄기 세포의 회복 특성 중 일부는 본래 이들이 회복하는 장기에 상주하는 세포와의 융합하는 그의 능력으로부터 오는 것으로 알려져 있다[Wang et al., 2003, Nature 422, 897-901]. 따라서, 본 발명의 액체 조성물은 줄기 세포와 체세포, 이를 테면 골세포와 근육세포간의 융합을 향상시키는데 사용될 수 있다. 즉, 줄기 세포는 이들이 표적 부위에 더 빠르고 더 효율적으로 융합함으로써 줄기 세포 손상 공정을 지배하도록 본 발명의 액체 조성물로 처리될 수 있다.
본 발명의 액체 조성물은 또한 세포-융합에 의한 핵산의 생체내 전이에 사용될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hoppe UC, Circ Res. 1999 Apr 30;84(8):964-72]을 참조할 수 있다.
본 발명의 조성물에 의해 촉진될 수 있는 또다른 생체외 융합 공정은 배아 줄기 세포와 인간 세포 사이의 융합이다. 이러한 융합은 배아 줄기 세포와 유사한 방식으로 거동하는 하이브리드를 생성하여 이식조직에 대해 유전적으로 적합한 줄 기 세포를 생성하는 것으로 보여주었다. 특히, 인간 배아 줄기(hES) 세포는 인간 섬유모세포와 융합하여 안정한 사배수체 DNA 함량을 유지하고 hES 세포의 형태, 성장률 및 항원 발현 패턴 특성을 가진 하이브리드 세포를 생성한다[Cowan et al., Science, 2005 Aug 26;309(5739):1369-73].
본 발명의 조성물에 의해 촉진될 수 있는 또다른 생체외 융합 공정은 체세포 핵 전이이다. 이는 체세포가 제핵 난모세포와 융합되는 공정이다. 난모세포는 배아의 발달에 필요한 영양소 및 다른 에너지-생성 물질을 제공하는 반면 체세포의 핵은 유전 정보를 제공한다. 이러한 절차는 배아 줄기 세포의 클로닝 및 생성에 사용된다.
본 발명을 실시하는 동안에, 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물이 융합 공정, 그에 의해 생성된 하이브리도마의 클로닝 및 그로부터의 항체의 분비를 비롯한 단클론성 항체 생성의 모든 공정을 향상시킬 수 있음을 밝혀내었다. 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물의 존재하에 생성된 클론 하이브리도마가 본 발명의 액체 조성물의 부재하에 생성된 클론 하이브리도마 보다 더욱 안정하다는 것을 밝혀내었다.
즉, 본 발명의 또다른 일면에 따르면, 단클론성 항체를 생성하는 방법이 제공되는데, 본 방법은 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물을 포함하는 배지에서 무한증식 세포를 항체 생성 세포와 융합하여 하이브리도마를 수득하는 단계를 포함하며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인 벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재한다.
본원에 사용된 어구 "단클론성 항체"는 그것이 면역반응하는 임의의 항원에 대하여 단일의 결합 친화성을 포함하는 면역 분자를 말한다.
본 발명의 이러한 일면에 따르면, 단클론성 항체는 상술한 바와 같은 본 발명의 액체 조성물에서 무한증식 세포를 항체 생성 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성함으로써 생성된다. 이어, 생성된 하이브리도마를 클로닝한다. 본 발명의 이러한 일면의 바람직한 구체예에 따르면, 클로닝 단계는 본 발명의 액체 조성물을 포함하는 배지에서 단일 하이브리도마를 인큐베이션함으로써 수행된다.
본 발명의 액체 조성물의 존재하에 생성된 클론 하이브리도마가 그의 부재하에 생성된 것들 보다 더욱 안정하기 때문에, 클로닝 절차는 전형적으로 HCF와 같은 안정화 인자의 첨가를 필요로하지 않는다.
하이브리도마의 생성 및 그의 선택적 클로닝 이후, 단클론성 항체는 스크리닝되고 회수될 수 있다. 기능적 및 구조적 분석법을 비롯한 다수의 스크리닝 방법이 당업계에 공지되어 있다. 샌드위치 ELISA 분석법을 사용하여 하이브리도마를 스크리닝하기 위한 예시적인 방법이 아래 실시예 2에 개시되어 있다.
단클론성 항체를 회수하기 위한 기술이 또한 당업계에 널리 공지되어 있으며, 전형적으로 표준 단백질 정제 방법을 포함한다.
본 발명의 또다른 추가의 일면에 따르면, 상술한 바와 같은 본 발명의 조성물을 포함하며, 본원에 개시된 바와 같은 단클론성 항체의 생성에 사용하기 위해 포장재 내에 포장되고 포장재 내 또는 그 위의 인쇄물로 식별되는 제조 물품이 제 공된다.
본 발명의 조성물은 본원에 개시된 하이브리도마와 같은 진핵세포 물질의 안정화를 향상시키는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명자들은 본 발명의 조성물이 다른 진핵세포 물질의 안정화를 향상시키는데 이용될 수 있음을 보여주었다.
즉, 본 발명의 또다른 일면에 따르면, 진핵세포를 배양하는 방법이 제공된다. 본 방법은 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재한다.
이론에 결부됨이 없이, 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물이 다수의 이유로 배양 배지에서 사용하기에 특히 적합한 것으로 생각한다.
첫 번째로, 본 발명자들은 액체 조성물이 그 안에서 배양된 세포의 증식률을 증가시킬 수 있음을 보여주었다(도 1, 실시예 3 및 도 43A-C, 실시예 19).
두 번째로, 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물이 제제의 용해도를 증가시킨다는 것을 보여주었다(실시예 8-15, 도 11-34 및 실시예 18 및 21). 이는 배양 배지에 첨가될 필요가 있는 수불용성 제제의 용해도를 향상시키는데 특히 적절할 수 있다.
세 번째로, 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물이 향상된 완충능을 포함하는 것, 즉 물 보다 큰 완충능을 포함하는 것을 보여주었다(실시예 4-7, 도 2-10). 이는 pH에 특히 민감한 세포에 적절할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "완충능"은 산 또는 염기가 첨가될 때 안정한 pH를 유지하는 조성물의 능력을 말한다.
마지막으로, 본 발명자들은 본 발명의 액체 조성물이 단백질을 안정화할 수 있다는 것을 보여주었다(실시예 16-16, 도 35-36). 이는 불안정성 펩티드 제제가 배양 배지에 첨가될 필요가 있는 경우나 세포가 분비하는 펩티드 제제를 안정화하기 위해 특히 적절할 수 있다.
본 발명의 이러한 일면에 따르면, 세포는 성장, 유지 및/또는 클로닝과 같으나 이들에 한정되지 않는 임의의 목적을 위해 배양될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 인큐베이션 시간은 임의의 방식으로 제한되지 않으며, 세포는 요구되는 한 본 발명의 조성물에서 배양될 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 조성물은 전형적으로 저농도로 존재하는 인자의 오토크린 분비(autocrine secretion)를 필요로 하는 세포를 배양하는데 특히 유용할 수 있다. 예를 들어, 중간엽 줄기 세포는 증식을 향상시키는 DKK1을 분비하는 것으로 나타났다. 본 발명의 조성물의 정연한 구조는 DKK1 농도를 효과적으로 증가시킴으로써 그의 성장을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 불안정화하려는 경향을 가진 세포를 배양하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 세포의 예로는 하이브리도마, 동결 단계 이후 재배양되는 세포 및 저농도로 존재하는 세포가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 임의의 진핵세포 배양 배지 중 수함량의 모두 또는 일부를 본 발명의 액체 조성물로 교환하는 것을 예기한다. 배지 중 수함량의 제거는 동결건 조, 공기-건조 및 오븐-건조와 같은 기술을 사용하여 수행될 수 있다. 즉, 배양 배지의 액체 부분은 본 발명의 액체 조성물의 5%, 더욱 바람직하게는 10%, 더욱 바람직하게는 20%, 더욱 바람직하게는 40%, 더욱 바람직하게는 60%, 더욱 바람직하게는 80%, 더욱더 바람직하게는 100%를 포함할 수 있다.
다수의 배지가 또한 건조 성분으로서 상업적으로 입수가능하다. 그 자체로, 본 발명의 액체 조성물은 배지 중 수성분의 사전 제거할 필요없이 첨가될 수 있다.
진핵세포 배양 배지의 예로는 DMEM, RPMI, 에임스 배지(Ames Media), CHO 세포 배지, Ham's F-10 배지, Ham's F-12 배지, Leibovita L-15 배지, 맥코이 배지(McCoy's medium), MEM 알파 배지가 포함된다. 이러한 배지는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 및 인비트로겐(Invitrogen)과 같은 회사로부터 폭넓게 입수가능하다.
배지가 다른 성분, 이를 테면 성장인자, 혈청 및 항생제를 포함할 수 있음이 인지될 것이다. 이러한 성분은 시그마 알드리치(Sigma Aldrich) 및 인비트로겐(Invitrogen)과 같은 회사로부터 상업적으로 입수가능하다.
바람직하게도, 본 발명의 액체 조성물은 그 안에서 세포를 인큐베이션하기 전에 (예를 들어 여과 멸균에 의해) 안정화된다.
본 발명의 추가의 일면에 따르면, 상술한 바와 같은 본 발명의 조성물을 포함하며, 본원에 개시된 바와 같이 진핵세포를 배양하기 위해 포장재 내에 포장되고 포장재 내 또는 그 위의 인쇄물로 식별되는 제조 물품이 제공된다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 조성물은 기존의 배양 배지로서 제조될 수 있 다. 따라서, 진핵세포 배양 배지 및 상술한 바와 같은 액체 조성물을 포함하는 세포 배양 배지가 제공된다.
본 발명의 또다른 일면에 따르면, 물질의 분산 또는 용해를 가능하게 하는 조건하에서 세팔로스포린을 나노구조 및 액체와 접촉시키는 단계를 포함하는 세팔로스포린을 용해 또는 분산시키는 방법이 제공되는데, 여기서 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재한다.
가용화 공정을 돕기 위해, 본 발명의 액체 조성물의 첨가 이전 또는 이후에 세팔로스포린을 용매에 용해시킬 수 있다. 본 발명에서 극성, 비극성, 유기(이를 테면 에탄올 또는 아세톤) 또는 비유기 용매를 비롯한 임의의 용매를 사용하는 것은 물질의 용해도를 더욱 증가시키기 위한 것임을 인지할 것이다.
물질이 본 발명의 액체 조성물에 계속 용해/분산되어 있도록 용매는 가용화 공정 중 언제라도 (완전히 또는 부분적으로) 제거될 수 있다. 증발(즉, 가열 또는 가압에 의해) 또는 임의의 다른 방법과 같이 용매를 제거하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "약"은 ±10%를 말한다.
본 발명의 추가의 목적, 장점 및 신규한 특징은 비한정적인 하기 실시예의 실험을 통해 당업자들에게 자명할 것이다. 또한 상기 설명되고 이하 청구 범위에서 청구하는 본 발명의 다양한 일례 및 일면은 하기 실시예를 통해 실험적으로 입 증될 것이다.
실시예
상기 설명과 함께 본 발명을 비한정적인 방식으로 설명하는 하기 실시예가 이하에 참고로 기술된다.
일반적으로, 본원에 사용된 용어 및 본 발명에 이용된 실험 방법은 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, 문헌["Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al, (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)], 미국 특허 제4,666,828호; 제4,683,202호; 제4,801,531호; 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 설명된 방법들, 문헌["Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)]을 참 조할 수 있으며; 이용가능한 면역학적분석법이 특허 및 과학 문헌에 널리 기술되어 있고, 예를 들어 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,853,987호; 제3,867,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,034,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호 및 제5,281,521호; 문헌["Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. L, ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) and "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)]을 참고할 수 있는데, 상기 문헌들은 모두 본원에 충분히 설명된 바와 같이 본원에 참고로 포함된다. 다른 일반적인 참고문헌은 본 문서 전체에 걸쳐 제공된다. 그 안에 있는 방법은 당업계에 널리 알려진 것으로서 독자의 편의를 위해 제공된다. 그 안에 포함된 모든 정보는 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1
인간 하이브리도마의 분리에 대한 나노구조를 포함하는 물의 효과
나노구조를 포함하는 물이 단클론성 항체 생성의 제 1 단계 - 하이브리도마 의 분리에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
세포 성장을 위한 시약: RPMI 1640을 이스라엘의 베이트-하에멕(Beit-HaEmek)으로부터 분말로 구입하였고, 이를 Neowater™(이스라엘, 두쿱) 또는 대조군 물로 재구성하고 역삼투에 의해 정제하였다. 재구성 후, 제조업자의 권고에 따라 중탄산나트륨을 배지에 첨가하고 pH를 7.4로 조정하였다. 배양 배지에 10% 소태아 혈청, L-글루타민(4 mM), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신 (0.1 mg/mL), MEM-비타민(0.1mM), 비필수 아미노산(0.1mM) 및 피루브산 나트륨(1mM)을 보충하였으며, 이들은 모두 기브코 비알엘 라이프 테크놀러지(GIBCO BRL, Life Technologies)로부터 구입하였다. HCF는 오리젠(OriGen)으로부터 구입하였다. 상기 언급된 보충물 모두는 물-기초의 액체 형태로 구입하였고, Neowater™-기초 또는 대조군 배지로 희석하였다. 8-아자구아닌, HT 및 HAT는 시그마(Sigma)로부터 구입하고 분말형을 Neowater™-기초 또는 대조군 RPMI로 재구성하였다.
화학 시약: 분말 PBS(기브코 비알엘 라이프 테크놀러지)를 Neowater™ 또는 대조군 물로 재구성하였다. 플레이크 PEG-1500(시그마)을 두 형태의 멸균 PBS(50% w/v)로 재구성하고; 액체 PEG의 pH를 약 7로 조정하였고, 이를 여과-멸균하였다. 행크스 평형화 염 용액을 베이트-하에멕으로부터 구입하였다. ELISA 플레이트-코팅용 탄산염-중탄산염 완충액(0.05 M, pH=9.6), OPD(0.4 mg/mL로 사용) 및 인산염-시트르산염 완충액(0.05 M, pH=5.0)은 시그마로부터 구입하였다.
항체: 염소 항-인간 IgM 및 HRP-컨쥬게이트 염소 항-인간 IgM는 잭슨 이뮤노 리서치(Jackson ImmunoResearch)로부터 구입하였다. 표준 인간 IgM는 시그마로부터 구입하였다.
융합: 인간 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 및 융합 파트너(MFP-2) 세포를 혼합 및 펠렛팅 이전에 혈청-무함유 배양 배지로 4 회 세척하였다. 37 ℃로 예비-가온한 300 ㎕의 PEG-1500을 상기 세포 혼합물(10-200×106개 세포)에 첨가하고 일정하게 진탕하면서 3 분 동안 인큐베이션시켰다. 이어, 행크스 평형화 염 용액 및 완전 RPMI로 세포 혼합물로부터 PEG를 희석시켰다. 소태아 혈청(10%) 및 HT(x2)를 생성된 세포 현탁액에 첨가하였다. 본 공정 중에 생성된 하이브리도마를 HAT 선택 완전 RPMI내 96-웰 플레이트에서 배양하였다. 하이브리도마 세포가 웰의 약 1/4를 채웠을 때 항체를 위한 상청액의 스크리닝을 시작하였다.
샌드위치 ELISA: IgM을 위한 하이브리도마 상청액을 샌드위치 ELISA를 사용하여 스크리닝하였다. 간단히, 포획 항체(염소 항-인간 IgM)를 탄산염/중탄산염 완충액에서 제조하고 100ng/100㎕/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 적용하였다. 이어, 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 단계들은 모두 실온에서 수행하였다. PBS 중 0.3% 분유로 블록킹하고 1 시간 후, 하이브리도마로부터의 상청액을 1.5 시간 동안 첨가하였다. PBS에 1:500으로 희석시킨 인간 혈청을 양성 대조군으로 사용하였다. 하이브리도마 성장 배지는 음성 대조군으로 사용하였다. 이차 항체(HRP-컨쥬게이트 염소 항-인간 IgM)를 1:5000의 농도의 블록킹 용액에서 제조하고 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 비색 반응을 생성하기 위해, 플레이트를 0.03% H2O2를 함유하는 인산염-시트르산염 완충액에서 OPD와 함께 인큐베이션시켰다. 15 분 후 10% 염산을 가지고 색 반응을 중지시켰다. 반응의 판독 및 기록은 492 nm 파장 필터를 사용하여 멀티스캔-어센트(Multiscan-Ascent)에서 수행하였다.
결과
동일한 실험 두 세트를 수행하였는데, 첫 번째는 모두 Neowater™-기초 시약(액체 보충물의 첨가 제외)이었고, 두 번째는 표준 역삼투수(본원에서는 대조군 물)에서 제조한 시약이었다. 개시된 실험에서 Neowater™의 사용은 세포 성장의 지점에서 개시하였고, 즉 MFP-2 세포의 두 개체군을 하나는 Neowater™-기초 완전RPMI에 다른 하나는 대조군 물-기초 완전 RPMI에 동일한 밀도로 플레이팅하였다. 이 단계에서, MFP-2는 HAT-내성 세포를 선택하기 위해 8-아자구아닌의 존재하에 성장시켰다. 성장 1 주일 후, 동일한 수의 림프구 및 MFP-2 세포를 가지고 두 개의 융합 실험을 수행하였다. 각각의 융합물을 96-웰의 8 개 플레이트에 플레이팅하였다. 대략 20 일 후, 두 융합물로부터의 하이브리도마에 대하여 그의 IgM 생성능을 시험하였다. 각 플레이트에서 발견된 다수의 IgM-양성 클론을 아래 표 1에 나타내었다.
[표 1]
플레이트 번호 플레이트 내 IgM-양성 웰의 수
대조군 Neowater™
1 61 88
2 14 88
3 22 80
4 8 87
5 32 70
6 66 85
7 1 88
8 0 87
총 양성 웰 204 673
평균치 25 84
대조군 보다 높은 농도를 가진 웰의 수 5 18
대조군 보다 높은 IgM 농도를 가진 하이브리도마의 백분율 2.5% 2.7%
대조군 및 Neowater™ 내 IgM-양성 웰의 평균 수 사이에 통계학적 유의차를 발견되었다(대조군 대 Neowater™ 에 대한 비대응 양측 t-검증(Unpaired two-tailed t-test): p<0.001). 또한, 상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 플레이트 당 하이브리도마의 수는 비교적 일정한데, 이는 Neowater™가 하이브리도마의 생성을 더욱 일관성있게 할 수 있음을 나타내는 것으로 아마도 안정화 영향의 결과이다. 따라서, 인간 단클론성 항체를 분비하는 안정한 하이브리도마 클론을 생성 및 분리하는 전체 공정은 Neowater™에서 크게 향상된다.
대조군 및 Neowater™ 내 IgM-양성 세포의 양이 또한 (측정 농도가 희석 혈청 보다 높은 경우) 측정되었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, χ2 검정을 사용하여 통계학적 유의차가 없는 것으로 검출되었다. 이는 Neowater™ 가 하이브리도마의 형성 및 안정화에 영향을 미치고 분비 수준에서 중요한 역할을 하지 않음을 강하게 제안한다.
하이브리도마 형성 이후 Neowater™ 기초 배지에서 항체 분비의 동력학을 분석하였다. 하이브리도마를 안정화시킴으로써 총 분비율을 세포의 분비 기구의 실시에 의한 것보다 더 높일 수도 있지만, Neowater™가 분비율을 증가시키는 것으로 나타났다.
대조군과 Neowater™ 사이의 IgM-생성 하이브리도마 수의 차는, Neowater-환경에서 더욱 정확한 ELISA 측정법에 기인한 것일 수 있으므로, 다음의 실험을 수행하였다: 다음의 1) Tris 완충액, 2) 대조군 성장 배지(완전 RPMI), 3) Neowater™ 성장 배지(완전 RPMI)에서 희석시키고 세 개의 검량 곡선을 작성하였다. 본 실험의 결과를 아래 표 2에 나타내었다.
[표 2]
IgM 농도(㎍/㎖) 6.25 12.5 25 50
Tris 완충액 0.382 0.504 0.932 1.327
대조군 배지 0.749 0.852 0.908 0.980
Neowater 배지 0.628 0.800 0.88 0.948
표 2가 나타내는 바와 같이, 대조군 및 Neowater™ 배지 둘 다 Tris 완충액에 비해 광학 밀도값이 약간 변형되었다(제조업자의 권고에 따라 표준 IgM은 조정되어야 함). 그러나, 시험 범위에서 대조군 및 Neowater™ 사이의 광학 밀도값의 통계학적 유의차는 발견되지 않았다.
실시예 2
인간 하이브리도마의 클로닝에 대한 나노구조를 포함하는 물의 효과
적절한 하이브리도마의 분리 이후 단클론성 항체 생성의 다음 단계는 클로닝 에 의해 이를 안정화시키는 것이다. 나노구조를 포함하는 물이 하이브리도마의 클론형성능을 방해할 수 있는 지를 시험하기 위해, 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
클로닝 : 하이브리도마의 클로닝은 표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 간단히, 제한된 세포수(대략 104 개)는 96 웰 접시의 상부 열에 걸쳐 연속적으로 희석시킨 다음, 제 1 열의 내용물을 나머지 8개의 열 아래로 연속적으로 희석시켰다. 이 방식에서, 플레이트의 오른쪽 아래쪽에 향하는 웰이 단일 세포를 가지기 쉽다.
IgM 함량에 대한 스크리닝: IgM을 위한 하이브리도마 상청액을 샌드위치 ELISA를 사용하여 스크리닝하였다. 간단히, 포획 항체(염소 항-인간 IgM)를 탄산염/중탄산염 완충액에서 제조하고 100ng/100㎕/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 적용하였다. 이어, 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 단계들은 모두 실온에서 수행하였다. PBS 중 0.3% 분유로 블록킹하고 1 시간 후, 하이브리도마로부터의 상청액을 1.5 시간 동안 첨가하였다. PBS에 1:500으로 희석시킨 인간 혈청을 양성 대조군으로 사용하였다. 배경을 위해 그리고 음성 대조군으로서 하이브리도마 성장 배지를 사용하였다. 이차 항체(HRP-컨쥬게이트 염소 항-인간 IgM)를 1:5000 농도의 블록킹 용액에서 제조하고 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 비색 반응을 생성하기 위해, 플레이트를 0.03% H2O2를 함유하는 인산염-시트르산염 완충액에서 OPD와 함께 인큐베이션시켰다. 15 분 후 10% 염산을 가지고 색 반응을 중지시켰다. 반응의 판독 및 기록은 492 nm 파장 필터를 사용하여 멀티스캔-어센 트(Multiscan-Ascent)에서 수행하였다.
결과
동일한 양성 모-웰로부터 서브클론 플레이트를 다음의 방식으로 제조하였다. 플레이트 I은 HCF의 첨가 없이 Neowater™ 배지에서 서브클로닝하였고; 플레이트 II는 HCF를 첨가한 대조군 배지에서 서브클로닝하였으며; 플레이트 III은 HCF를 함유하는 Neowater™ 배지에서 서브클로닝하였다. 플레이트를 2 주 동안 현미경적으로 처리하였더니, 그 후 웰 내의 세포 밀도는 측정가능한 양의 항체를 생성하기에 매우 충분하였다. 이어, 세 플레이트의 상청액을 그의 IgM 함량에 대하여 시험하였다. 본 실험을 요약하는 결과를 아래 표 3에 나타내었다.
[표 3]
플레이트 I 플레이트 II 플레이트 III
배지 0.217 0.205 0.264
평균 0.319 0.341 0.318
St. Dev 0.285 0.310 0.253
IgM-양성 웰의 수 28 34 32
* 클로닝 프로토콜: 플레이트 I - Neowater™ 완전 RPMI에서; 플레이트 II - 대조군 완전 RPMI + HCF (10%); 플레이트 III - Neowater™ 완전 RPMI + HCF (10%).
각각의 플레이트에서 생성된 항체 양의 분포 또는 IgM-생성 클론의 빈도 사이에 통계학적 유의차는 발견되지 않았는데, 이는 HCF를 함유하는 대조군 배지에서 뿐만 아니라 Neowater™ 기초 배지에서 하이브리도마가 클론을 형성하였음을 나타내는 것이다. 대조군 배지에서, 하이브리도마는 HCF의 첨가 없이는 클론을 형성하지 않는다. 이는 Neowater™ 기초 배지가 불안정한 하이브리도마의 클론 형성능을 향상시키는 환경을 만들어 낸다는 것을 제시하는 것이다. 이러한 개념은 또한 Neowater™ 기초 시약에서의 융합 및 Neowater™ 기초 배지에서의 성장 이후 하이브리도마 회수의 향상된 빈도에 의해 확증된다.
논의 및 결론
본원에 개시된 실험의 결과는 물리적인 세포 융합 효율의 향상화에 의해서든 융합 공정에서 생성된 하이브리도마의 안정화에 의해서든 Neowater™가 융합 공정을 향상시킨다는 것을 나타낸다. 어느 식이든, Neowater™에서 제조된 융합의 수율은 대조군 보다 상당히 컸다(p<0.001 표 1). 또한, 하이브리도마의 고수율 및 항체 농도의 분포가 대조군 및 Neowater™ 시험 사이에 크게 다르지 않기 때문에(표 1), Neowater™ 는 아마도 항체 생성 및 분비의 메카니즘을 방해하지 않는다.
그러나, 클로닝 실험은 Neowater™가 새로운 클론에 대해 안정화 효과를 가질 수 있다는 가설을 뒷받침하는 중요한 증거를 보여주었다. HCF를 사용하지 않은 클로닝은 대부분의 경우 성공적이고 안정하게 클론을 형성할 수 없다. 실제로 마크로파지로 조절된 배지인 이러한 시약의 역할은 단일-세포 성장을 지지하는 것이다. HCF로부터의 하이브리도마에 의해 수용된 인자가 없으면, 이들은 대부분 죽거나 증가하도록 관리되나 그의 항체 생성능은 해이해진다. HCF가 없는 Neowater™에서 클로닝하는 동안 살아있는 항체-분비 하이브리도마가 수득된다는 사실은 그 자체로 가치있는 발견이다, 또한, HCF-클로닝에서 확립된 클론과 통계학적으로 비교한 경우, 이들 클론은 그의 생성성 및 빈도가 동일하다.
다른 관찰은 또한 Neowater™의 안정화 효과의 가설을 뒷받침한다. 예를 들어, 대조군 배지내로 녹아 들어간 후 회수에 실패한 세포 개체군은 Neowater™-기 초 배지에서 천천히 회수되었다. Neowater™-환경에서 발생 및 성장된 생성 클론은 배지가 대조군으로 변화되었을 때 1 일간 항체 분비를 멈추었다.
실시예 3
중식에 대한 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 효과
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 세포를 증식시키는 지를 확인하기 위해, 인간 중간엽 세포에 대해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
인간 중간엽 줄기 세포의 증식을 RO 물 또는 Neowater™에 기초한 배지에서 조사하였다.
배지의 제조: 2.5 g의 MEM 및 0.55 g의 NaHCO3를 RO 물 또는 Neowater™에 첨가하여 250 ㎖의 MEM 알파 배지를 제조하였다.
세포 배양: 세포를 20% 소태아 혈청, 100u/㎖ 페니실린 및 1 ㎎/㎖의 스트렙토마이신으로 보충한 MEM α에 유지시켰다(Colter et al., 2001, PNAS 98:7841-7845). 세포를 계수하고 하나는 RO 물에 기초하고 다른 하나는 Neowater™에 기초한 두 가지 유형의 MEM α 배지에서 500개 세포/㎖의 농도로 희석하였다. 세포를 각 웰에 50 개의 세포를 가진 100 ㎕ 배지의 96 웰 플레이트에서 성장시켰다. 8 일 후, 세포 증식률을 크리스털 바이올렛 생육성 분석법에 의해 추정하였다. 분석법에서 염료가 DNA를 염색한다. 용해시, 단층에 의해 흡수된 염료의 양은 590 nm에서 플레이트 판독기에서 정량하였다.
결과
크리스털 바이올렛 생육성 분석법의 결과를 표 4 및 도 1에 요약하였다.
[표 4]
0.032355 0.013255 0.065955 0.047855 0.054855
0.011455 0.014955 0.035255 0.068055 0.073255 Neowater
0.051955 0.070455 0.053155 0.073955 0.045355
0.029055 0.030555 0.037055 0.023455 0.041955
0.005555 0.009155 0.018355 0.005455 0.072455
0.026955 0.008255 0.012055 0.007155 0.046055
0.010555 0.017555 0.030155 0.002055 0.023255 RO
0.029955 0.001955 0.020855 0.025255 0.022955
T 검정 0.000238
결론
본 발명의 액체 조성물은 세포의 증식을 증가시킨다.
실시예 4
나노구조를 포함하는 조성물의 완충능
완충능에 대한 나노구조를 포함하는 조성물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
페놀 레드 용액(20 ㎎/25 ㎖)을 제조하였다. 290 ㎕를 13 ㎖의 RO 물 또는 여러 배치(batch)의 나노구조를 포함하는 물[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에 첨가하였다. 각각의 물의 출발 pH는 상이하였지만 페놀 레드 용액이 첨가된 후 황색 또는 엷은 오렌지색이었으므로 이들 모두 산성이었음을 알 수 있었다. 2.5 ㎖의 각각의 물 + 페놀 레드 용액을 큐벳에 첨가하였다. 수산화나트륨의 부피를 증가시켜 각각의 큐벳에 첨가하고, 분광광도계에 서 흡수 스펙트럼을 판독하였다. 산성 용액의 피크는 430 nm이었고, 알칼리 용액의 피크는 557 nm이었다. 파장 범위는 200-800 nm이나, 0.02M 수산화나트륨의 첨가와 관련하여 그래프는 단지 557 nm의 파장만이 조회되었다.
결과
수산화나트륨 적정 후 각각의 물 용액에 대한 557 nm에서의 흡광도를 표 5에 요약하였다.
[표 5]
NW1 HAP NW2 AB 1-2-3 NW3 HA 18 NW4 Alexander NW5 HA-99-X NW6 RO 첨가된 0.02M 수산화나트륨 (㎕)
0.026 0.033 0.028 0.093 0.011 0.118 0.011 00
0.132 0.17 0.14 0.284 0.095 0.318 0.022 4
0.192 0.308 0.185 0.375 0.158 0.571 0.091 6
0.367 0.391 0.34 0.627 0.408 0.811 0.375 8
0.621 0.661 0.635 1.036 0.945 1.373 0.851 10
1.074 1.321 1.076 1.433 1.584 1.659 1.491 12
도 2 및 표 5에 나타낸 바와 같이, RO 물은 수산화나트륨을 첨가한 경우 더 큰 pH 변화를 보이고 있다. 그것은 경미한 완충 효과를 가지는데, 흡광도가 0.09 A에 도달했을 때 완충 효과는 "깨져" 수산화나트륨이 더 많이 첨가될수록 pH가 더 크게 변한다. HA-99 물은 RO와 유사하다. NW (#150905-106) (Neowater™), AB 물 Alexander (AB 1-22-1 HA Alexander)는 약간의 완충 효과를 가지고 있다. HAP 및 HA-18은 Neowater™ 보다 더 큰 완충 효과를 보이고 있다.
요약하면, 본 실험으로부터, HA-99-X를 제외한 시험된 나노구조를 포함하는 모든 새로운 물 형태(HAP, AB 1-2-3, HA-18, Alexander)는 Neowater™와 유사한 특 징을 보인다.
실시예 5
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 완충능
완충능에 대한 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
50 ㎖의 RO 물 또는 나노구조를 포함하는 물[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에 수산화나트륨 및 염산을 첨가하고 pH를 측정하였다. 실험은 삼중으로 수행되었다. 모두, 3 개의 실험을 수행하였다.
수산화나트륨 적정: - 1 ㎕ 내지 15 ㎕의 1M 수산화나트륨을 첨가하였다.
염산 적정: - 1 ㎕ 내지 15 ㎕의 1M 염산을 첨가하였다.
결과
수산화나트륨 적정에 대한 결과를 도 3A-C 및 4A-C에 도시하였다. 염산 적정에 대한 결과를 도 5A-C 및 도 6에 도시하였다.
동일한 pH 수준에 도달하기 위해서 RO 물에 요구된 것보다 더 많은 양의 수산화나트륨이 필요하기 때문에, 나노구조를 포함하는 물은 완충능이 있다. 이러한 특징은 7.6-10.5의 pH 범위에서 더욱 크다. 또한, 나노구조를 포함하는 물은 동일한 pH 수준에 도달하기 위해서 RO 물에 요구된 것보다 더 많은 양의 염산이 필요하다. 이러한 효과는 알칼리 범위보다 산성 pH 범위에서 더 높다. 예를 들어, 10 ㎕의 수산화나트륨 1M(총합으로)을 첨가한 경우, RO의 pH는 7.56에서 10.3으로 증가하였다. 나노구조를 포함하는 물의 pH는 7.62에서 9.33으로 증가하였다. 1O ㎕ 의 염산 0.5M(총합으로)을 첨가한 경우, RO의 pH는 7.52에서 4.31로 감소한 반면, 나노구조를 포함하는 물의 pH는 7.71에서 6.65로 감소하였다. 이러한 특징은 7.7-3의 pH 범위에서 더 크다.
실시예 6
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 완충능
완충능에 대한 나노구조를 포함하는 액체 조성물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
페놀 레드 용액(20 ㎎/25 ㎖)을 제조하였다. 1 ㎖를 45 ㎖의 RO 물 또는 나노구조를 포함하는 물[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에 첨가하였다. pH를 측정하고 필요에 따라 적정하였다. 3 ㎖의 각각의 물 + 페놀 레드 용액을 큐벳에 첨가하였다. 수산화나트륨 또는 염산의 부피를 증가시켜 각각의 큐벳에 첨가하고, 분광광도계에서 흡수 스펙트럼를 판독하였다. 산성 용액의 피크는 430 nm이었고, 알칼리 용액의 피크는 557 nm이었다. 파장 범위는 200-800 nm이나, 0.02M 수산화나트륨의 첨가와 관련하여 그래프는 단지 557 nm의 파장만이 조회되었다.
염산 적정:
RO: 45 ㎖ pH 5.8
1 ㎖ 페놀 레드 및 5 ㎕ 수산화나트륨 1M을 첨가하였다. 새로운 pH = 7.85
Neowater™ (# 150905-106): 45 ㎖ pH 6.3
1 ㎖ 페놀 레드 및 4 ㎕ 수산화나트륨 1M을 첨가하였다. 새로운 pH = 7.19
수산화나트륨 적정:
I. RO: 45 ㎖ pH 5.78
1 ㎖ 페놀 레드, 6 ㎕ 염산 0.25M 및 4 ㎕ 수산화나트륨 0.5M을 첨가하였다. 새로운 pH = 4.43
Neowater™ (# 150604-109): 45 ㎖ pH 8.8
1 ㎖ 페놀 레드 및 45 ㎕ 염산 0.25M을 첨가하였다. 새로운 pH = 4.43
II. RO: 45 ㎖ pH 5.78
1 ㎖ 페놀 레드 및 5 ㎕ 수산화나트륨 0.5M을 첨가하였다. 새로운 pH = 6.46
Neowater™ (# 120104-107): 45 ㎖ pH 8.68
1 ㎖ 페놀 레드 및 5 ㎕ 염산 0.5M을 첨가하였다. 새로운 pH = 6.91
결과
도 7A-C 및 도 8A-B에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 물의 완충능이 RO 물의 완충능 보다 더 높았다.
실시예 7
RF 물의 완충능
완충능에 대한 RF 물의 효과를 조사하였다.
재료 및 방법
2-3 ㎕ 방울의 수산화나트륨 1M을 첨가하여 150 ㎖ RO 물의 pH를 올렸다(pH= 5.8). 이 물 50 ㎖을 3 개의 병에 분취하였다. 3 개의 병을 다음과 같이 처리하였다:
1번 병: 처리하지 않음(RO 물)
2번 병: RO 물을 3OW로 30 분 동안 조사하였다. 이 병을 적정 개시 전에 벤치(bench)에 10 분 동안 방치하였다(RF 물).
3번 병: pH가 5에 도달했을 때 RF 물을 두 번째 조사하였다. 조사 후, 적정을 계속하기 전에 병을 10 분 동안 벤치에 방치하였다.
적정은 50 ㎖ 물에 1 ㎕ 0.5M 염산을 첨가함으로써 수행하였다. pH 값이 4.2 이하에 도달했을 때 적정을 종료하였다.
실험은 삼중으로 수행되었다.
결과
도 9A-C 및 도 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, RF 물 및 RF2 물은 나노구조를 포함하는 담체 조성물의 것과 유사한 완충 특성을 포함한다.
실시예 8
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려진 두 물질을 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 농도 1 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
A. 에탄올/[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)] 기초 용액에서의 용해
재료 및 방법
다양한 조성으로 분말을 용해하여 5 개의 시험을 실시하였다. 조성은 다음과 같다:
A. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 990 ㎕ Neowater™
B. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 990 ㎕ Neowater™ (90 분간 탈수).
C. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 495 ㎕ Neowater™ + 495 ㎕ EtOH (50%-50%).
D. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 900 ㎕ Neowater™ + 90 ㎕ EtOH (90%-10%).
E. 10 ㎎ 분말 (적색/백색) + 820 ㎕ Neowater™ + 170 ㎕ EtOH (80%-20%).
시험관을 와류시키고(vortexed) 60 ℃로 1 시간 동안 가열하였다.
결과
1. 5 개의 시험관 모두 백색 분말은 용해되지 않았다.
2. 적색 분말은 용해되었지만 잠시 후 침전되었다. 색이 엷은 황색으로 변했기 때문에 시험관 C가 분말을 더 잘 용해시킨 것처럼 보였다.
B. 분쇄한 후 에탄올/[ Neowater ™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스( Do -Coop technologies )] 기초 용액에서의 용해
재료 및 방법
분쇄한 후, 적색 분말을 다음과 같은 4 개의 조성물로 용해시켰다:
A. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 49.5 ㎕ RO.
B. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 49.5 ㎕ Neowater™.
C. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 9.9 ㎕ EtOH → 39.65 ㎕ Neowater™ (20%-80%).
D. 1/2 ㎎ 적색 분말 + 24.75 ㎕ EtOH → 24.75 ㎕ Neowater™ (50%-50%).
총 반응 부피: 50 ㎕.
시험관을 와류시키고 60 ℃로 1 시간 동안 가열하였다.
결과
분쇄 후에 적색 분말을 용해시키기 위해서는 20%의 에탄올만 Neowater™와 함께 필요하였다.
C. 강력한 분쇄한 후 에탄올/[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)] 용액에서의 용해
재료 및 방법
하나는 분말 단독(바이얼 1)에 대해, 다른 하나는 100 ㎕ Neowater™에 분산시킨 분말에 대해 실시하는 두 가지의 분쇄 프로토콜을 수행하였다.
두 개의 조성물을 교반기 위에 있는 두 개의 바이얼에 넣고 물질을 밤새 분쇄하였다:
15 시간 후, 100 ㎕의 Neowater™를 2-3 분당 10 ㎕의 적정에 의해 1 ㎎의 적색 분말(1번 바이얼)에 첨가하였다.
0-24 시간 동안 시험관을 사진 촬영하여 변화를 모니터링하였다(도 14F-J).
비교로서, 두 개의 시험관을 관찰하였는데 시험관 중 하나는 990 ㎕ Neowater™(90 분간 탈수)에 분산시킨 적색 분말을 포함하였고(1% 용액), 다른 하나는 50% 에탄올/50% Neowater™를 포함하는 용액 중에 분산시킨 적색 분말을 포함 하였다(1% 용액). 시험관을 60 ℃에서 1 시간 동안 가열하였다. 시험관을 도 14A-E에 도시하였다. 24 시간 후, 각각의 용액으로부터 2 ㎕를 취하여 나노드롭(nanodrop)에서 흡광도를 측정하였다(도 15A-C)
결과
도 11A-J는 강력한 분쇄 후에는 물질이 24 시간 동안 안정하게 유지되고 침전되지 않았기 때문에 적색 물질을 용해시킬 수 있음을 설명한다. 그러나, 도 11A-E는 시간이 지남에 따라 물질의 색이 변하는 것을 보여준다(안정하지 않음).
1번 바이얼은 거의 흡수하지 않았다(도 12A); 용액 B의 흡광 피크는 220-270 nm에 존재하였고(도 12B) 왼쪽으로 쉬프트(shift)되었으며(220 nm); 용액 C의 흡광 피크는 250-330 nm에 존재하였다(도 12C).
결론
적색 물질의 분쇄에 의해 물질이 Neowater™에 분산하게 되었다. 분산액은 24 시간에 걸쳐 유지되었다. 유리 바이얼 내 물질의 유지는 100% 탈수 Neowater™ 및 EtOH-Neowater™(50%-50%) 모두에서 72 시간 후에도 안정한 용액을 유지하였다.
실시예 9
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 다이드제인(daidzein), 다우노루비신(daunorubicine) 및 t-boc 유도체 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려진 세 가지 물질[다이드제인-다우노마이신 접합체(Daidzein-daunomycin conjugate, CD-Dau); 다우노루비신(세루비딘 염산염, Cerubidine hydrochloride); 다이드제인의 t-boc 유도체(tboc-Daid)]을 나노 구조를 포함하는 액체 조성물이 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
A. CD-Dau의 용해 - 제 1 부:
필요 농도: 3 ㎎/㎖ Neowater.
특성: 물질은 DMSO, 아세톤, 아세토니트릴에 용해한다.
특성: 물질은 EtOH에 용해한다.
다음과 같은 5 개의 상이한 유리 바이얼을 준비하였다:
1. 5 ㎎ CD-Dau + 1.2 ㎖ Neowater™.
2. 1.8 ㎎ CD-Dau + 600 ㎕ 아세톤.
3. 1.8 ㎎ CD-Dau + 150 ㎕ 아세톤 + 450 ㎕ Neowater™ (25% 아세톤).
4. 1.8 ㎎ CD-Dau + 600 ㎕ 10% *PEG (폴리에틸렌 글리콜).
5. 1.8 ㎎ CD-Dau + 600 ㎕ 아세톤 + 600 ㎕ Neowater™.
1번, 4번 및 5번 바이얼에 대해, 시료를 와류시키고 분광광도계 측정을 수행하였다.
아세톤을 증발시키기 위해 바이얼을 개방해 두었다(2번, 3번 및 5번 바이얼).
결과
1번 바이얼 (100% Neowater ): 2-3 시간 후 CD-Dau가 침전되었다.
2번 바이얼(100% 아세톤): CD-Dau가 아세톤에 현탁되었지만, 아세톤이 물질을 용해시켰기 때문에 48 시간 후 물질이 부분적으로 침전되었다.
3번 바이얼(25% 아세톤): CD-Dau가 그다지 용해되지 않았고 물질이 용액에 부유하였다(용액이 흐리게 보였다).
4번 바이얼(10% PEG+Neowater): CD-Dau가 1번 바이얼내 CD-Dau 보다는 더 잘 용해되었지만, 100% 아세톤과의 혼합물만큼은 잘 용해되지 않았다.
5번 바이얼: CD-Dau를 먼저 아세톤에 현탁시키고, 완전히 용해시킨 후에 아세톤을 교환하기 위해 Neowater™를 첨가하였다. Neowater™가 존재하였음에도 불구하고 먼저 아세톤이 물질을 용해하였다. 그러나, 아세톤이 증발함에 따라 물질은 바이얼의 바닥에 부분적으로 침전되었다(그러나, 물질은 현탁된 채로 유지되었다).
분광광도계 측정(도 13)은 아세톤의 존재하 및 부재하 모두에서 물질의 거동을 나타낸다. 물 또는 10% PEG로 현탁된 물과 비교하였더니 아세톤의 경우에는 2 개의 피크가 존재하였는데, 두 경우는 모두 하나의 피크만을 보여주었다.
B. CD - Dau 의 용해 - 제 2 부:
2번, 4번 및 5번 용액으로부터 아세톤이 증발되자마자, 물질이 약간 침전되어 추가량의 아세톤을 바이얼에 첨가하였다. 이러한 프로토콜은 아세톤 및 Neowater™의 존재하에서 물질의 용해를 가능하게 하고, 그와 동시에 용액으로부터 아세톤의 후속적인 증발을 가능하게 한다(이러한 공정을 2회 수행하였다). 두 번째 사이클 후, 액체상을 바이얼로부터 제거하고, 추가량의 아세톤을 침전 물질에 첨가하였다. 침전 물질이 용해되면 앞서 제거한 액체상과 합하였다. 합한 용액을 다시 증발시켰다. 물질이 전혀 용해되지 않았기 때문에 1번 바이얼로부터 용액을 제거하고, 대신 1.2 ㎖의 아세톤을 침전에 첨가하여 물질을 용해시켰다. 그 뒤, 1.2 ㎖의 10% PEG + Neowater™도 첨가하고, 얼마후 용액으로부터 아세톤을 증발시켰다. 이러한 공정이 완료했을 때, 바이얼들을 하나의 바이얼로 합하였다(총 부피 3 ㎖). 이와 같은 최종 부피의 상부에 3 ㎖의 아세톤을 첨가하여 물질을 용해시켜 투명한 액화 용액을 수득한 다음, 50 ℃에서 다시 증발시켰다. 일단 이러한 상태에 도달하면 용액이 분리된다는 사실에 기인하여 용액은 평형에 도달하지 않았다. 평형을 피함으로써, 물질의 수화 상태가 유지되어 액체로서 유지된다. 용매를 증발시킨 후, 물질을 깨끗한 바이얼로 옮기고 진공 조건하에 밀폐하였다.
C. CD - Dau 의 용해 - 제 3 부:
아세톤-용해 물질 2 ㎖ 및 이전 실험에서 남은 나머지 물질 1 ㎖을 첨가하여 추가의 3 ㎖ 물질(총 부피 6 ㎖)을 생성하였다.
1.9 ㎖의 Neowater™를 아세톤이 함유된 바이얼에 첨가하였다.
1OO ㎕ 아세톤 + lOO㎕ Neowater™를 남아있는 물질에 첨가하였다.
50 ℃로 조정된 핫 플레이트상에서 증발시켰다.
용액이 안정해질 때까지 이러한 공정을 3회 반복하였다(아세톤의 첨가 및 그것의 증발).
두 바이얼을 함께 합하였다.
이들 두 용액을 합한 후에 물질이 약간 침전되었다. 아세톤을 첨가하고 용 매의 증발을 반복하였다.
바이얼을 합하기 전에(3 ㎖ + 2 ㎖), 제 2 부에 상술된 바와 같은 실험에서 제조된 첫 번째 용액을 용액이 평형에 도달하고 평형을 유지하도록 9 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이와 같이 실시함으로써 미리 용해된 물질은 침전되지 않았다. 다음날 아침, 용액의 흡수도를 확립하여 상이한 그래프를 수득하였다(도 14). 두 바이얼을 합한 후에 물질이 약간 침전되었기 때문에 흡수도 측정을 다시 수행하였다. 부분적인 침전의 결과로서, 아세톤(5 ㎖)을 첨가하여 용액을 1:1로 희석시킨 다음 핫 플레이트상에서 50 ℃로 용액을 증발시켰다. 증발 공정을 수행하는 동안 용액의 분광광도계 판독정보는 아세톤의 존재에 기인하여 변화하였다(도 15). 이들 실험은 소량의 아세톤이 존재하는 경우 흡수도 판독정보에 영향을 미칠 수 있다는 것을 암시한다.
B. 다우노루비신(세루비딘 염산염)의 용해
필요 농도: 2 ㎎/㎖
재료 및 방법
하나의 바이얼에는 2 ㎎ 다우노루비신 + 1 ㎖ Neowater™를 제조하고, 다른 바이얼에는 2 ㎎의 다우노루비신 + 1 ㎖ RO를 제조하였다.
결과
분광광도계 측정에 의해 설명된 바와 같이(도 16), 물질은 Neowater™ 및 RO 모두에 쉽게 용해되었다.
결론
다우노루비신은 어려움없이 Neowater™ 및 RO에 용해한다.
C. t-boc의 용해
필요 농도: 4 ㎎/㎖
재료 및 방법
1.14 ㎖의 EtOH를 18.5 ㎎의 t-boc(유성 물질)를 함유하는 하나의 유리 바이얼에 첨가하였다. 그 후, 이것을 두 개의 바이얼로 분배하고, 용액이 25% EtOH를 포함하도록 1.74 ㎖의 Neowater™ 또는 RO 물을 상기 바이얼들에 첨가하였다. 분광광도계 측정 후, 용액으로부터 용매를 증발시키고, 각 바이얼의 최종 부피가 2.31 ㎖가 되도록 두 바이얼 모두에 Neowater™를 첨가하였다. 두 바이얼 내 용액을 하나의 깨끗한 바이얼에 합한 다음 수송을 위해 진공 조건하에서 포장하였다.
결과
분광광도계 측정치를 도 17에 도시하였다. 물질을 에탄올에 용해시켰다. Neowater™를 첨가한 다음 열(50 ℃)에 의해 용매를 증발시킴으로써, 물질을 Neowater™에 용해시킬 수 있었다.
결론
물질을 용해시키기 위한 최적의 방법은 먼저 물질을 용매(아세톤, 아세트산 또는 에탄올)를 사용하여 용해시킨 다음 친수성 유체(Neowater™)를 첨가하고 용액을 가열하여 용매를 증발시킴으로써 용매를 제거하는 것이었다.
실시예 10
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 AG-14A 및 AG-14B 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려진 두 가지 약초 물질(herbal material) AG-14A 및 AG-14B를 나노구조를 포함하는 액체 조성물이 농도 25 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
제 1 부
재료 및 방법
4 개의 시험관 각각에서 분말의 최종 농도가 2.5 ㎎/㎖가 되도록, 2.5 ㎎의 각각의 물질(AG-14A 및 AG-14B)을 Neowater™ 단독 또는 75% Neowater™와 25% 에탄올을 포함하는 용액에 용해시켰다. 시험관을 와류시키고 에탄올을 증발시키기 위해 50 ℃로 가열하였다.
결과
에탄올의 존재하 및 부재하에 Neowater™ 중에서 두 가지 약초 물질의 분광광도계 측정치를 도 18A-D에 도시하였다.
결론
RO 중의 현탁액은 AG-14B를 용해시키지 않았다. Neowater™중 AG-14B의 현탁액은 응집되지 않았던 반면, RO 물에서는 응집되었다.
AG-14A 및 AG-14B는 Neowater/RO에 용해되지 않았다.
제 2 부
재료 및 방법
5 ㎎의 AG-14A 및 AG-14B를 62.5 ㎕ EtOH + 187.5 ㎕ Neowater™에서 희석하였다. 추가의 62.5 ㎕ Neowater™를 첨가하였다. 시험관을 와류시키고 에탄올을 증발시키기 위해 50 ℃로 가열하였다.
결과
EtOH에 현탁시키고 Neowater™를 첨가한 다음 증발시켜 AG-14A 및 AG-14B를 용해시켰다.
도 19에 도시된 바와 같이, AG-14A 및 AG-14B는 48 시간 동안 현탁액 중에 안정하게 유지되었다.
실시예 11
나노구조를 포함하는 담체의 펩티드 용해능
모두 물에 용해되지 않는 것으로 알려지 7 개의 세포독성 펩티드를 나노구조를 포함하는 담체 조성물이 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다. 또한, 나노구조를 포함하는 담체 조성물이 펩티드의 세포독성 활성에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 Skov-3 세포에 대한 펩티드의 효과를 측정하였다.
재료 및 방법
가용화: 7 개의 펩티드(펩티드 X, X-5FU, NLS-E, PaIm-PFPSYK (CMFU), PFPSYKLRPG-NH2, NLS-p2-LHRH 및 F-LH-RH-palm kGFPSK)를 모두 0.5 mM로 Neowater™에 용해시켰다. 분광광도계 측정을 실시하였다.
시험관내 실험: Skov-3 세포를 맥코이(McCoy) 5A 배지에서 성장시키고, 96 웰 플레이트에서 1500 세포/웰의 농도로 희석시켰다. 24 시간 후, 최종 농도가 각 각 10-6M, 10-7M 및 10-8M이 되도록 2 ㎕(0.5 mM, 0.05 mM 및 0.005 mM)의 펩티드 용액을 1 ㎖의 맥코이 5A 배지에서 희석시켰다. 각각의 처리를 9 회 반복하였다. 각각의 플레이트는 세 농도로 2 개의 펩티드, 및 6 개의 웰 대조군을 함유하였다. 90 ㎕의 맥코이 5A 배지 + 펩티드를 상기 세포들에 첨가하였다. 1 시간 후, 10 ㎕의 FBS를 첨가하였다(경쟁을 방지하기 위해). 24 시간 후 및 48 시간 후에 크리스털 바이올렛에 기초한 생육성 분석법으로 세포를 정량하였다. 이러한 분석법에서 염료는 DNA를 염색한다. 가용화시, 플레이트 판독기에서 단층이 흡수한 염료의 양을 정량하였다.
결과
Neowater™에 희석시킨 7 개의 펩티드에 대한 분광광도계 측정치를 도 20A-G에 도시하였다. 도 20A-G에 도시된 바와 같이, 용해된 펩티드는 모두 세포독성 활성을 포함하였다.
실시예 12
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 레티놀 용해능
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 레티놀을 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
레티놀(비타민 A)을 시그마(Sigma)(Fluka, 99% HPLC)로부터 구입하였다. 레티놀을 다음의 조건하에서 Neowater™에 용해시켰다.
EtOH 및 Neowater™ 중 1% 레티놀(1 ㎖ 중 0.01 g)
EtOH 및 Neowater™ 중 0.5% 레티놀(1 ㎖ 중 0.005 g)
EtOH 및 Neowater™ 중 0.5% 레티놀(25 ㎖ 중 0.125 g)
EtOH 및 Neowater™ 중 0.25% 레티놀(25 ㎖ 중 0.0625 g). 최종 EtOH 농도: 1.5%
EtOH에서의 레티놀의 흡광 스펙트럼: 표준화 그래프(calibration graph)를 작성하기 위해 상이한 레티놀 농도를 가진 레티놀 용액을 무수 EtOH에서 제조하고; 분광광도계에서 흡광 스펙트럼을 검출하였다.
미지 농도의 EtOH를 함유하는 Neowater™ 중 0.25% 및 0.5% 레티놀로 이루어진 2 개의 용액을 분광광도계에서 검출하였다. 일부 오일 방울이 물에 용해되지 않았기 때문에 레티놀의 실제 농도도 역시 미지였다.
여과: 최종 EtOH 농도 1.5%로 Neowater™ 중 0.25 % 레티놀의 용액 2개를 제조하였다. 이 용액을 0.44 및 0.2 ㎕ 필터에서 여과하였다.
결과
레티놀은 산성 Neowater™에서 보다 알칼리성 Neowater™에서 쉽게 용해하였다. 용액의 색은 황색이었으며 시간이 경과함에 따라 흐려졌다. 흡광도 실험에서, 0.5% 레티놀은 0.125% 레티놀과 유사한 패턴을 보였고, 0.25% 레티놀은 0.03125% 레티놀과 유사한 패턴을 보였다 - 도 22 참조. 레티놀은 열에 불안정하기 때문에; (레티놀의 융점은 63 ℃임), 가열멸균처리될(autoclave) 수 없다. 레티놀이 (EtOH에) 완전히 용해된 경우에 여과가 가능하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, 여과된 이후에는 용액 중에 0.03125% 미만의 레티놀이 존재하였다. 두 필터 모두 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 13
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 물질 X 용해능
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 물질 X를 최종 농도 40 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
제 1 부 - 물 및 DMSO 중의 용해도
재료 및 방법
첫 번째 시험관에서는, 25 ㎕의 Neowater™가 1 ㎎의 물질 "X"에 첨가되었다. 두 번째 시험관에서는, 25 ㎕의 DMSO가 1 ㎎의 물질 "X"에 첨가되었다. 두 시험관 모두 와류시키고 60 ℃로 가열한 다음 진탕기에서 1 시간 동안 진탕하였다.
결과
물질은 Neowater™에 전혀 용해되지 않았다(시험관 1). 물질은 DMSO에 용해되어 황갈색이 수득되었다. 용액은 24-48 시간 동안 유지되었고 그의 안정성을 경시적으로 분석하였다(도 24A-B).
결론
Neowater™가 물질 "X"를 용해시키지 못해 물질이 침전된 반면, DMSO는 물질 "X"를 거의 완전히 용해시켰다.
제 2 부 - 시간 경과에 따른 상이한 용매내 물질 안정성/동역학의 조사 및 DMSO의 감소
재료 및 방법
각각 총 반응 부피 25 ㎕를 함유하는 6 개의 상이한 시험관을 분석하였다:
1. 1 ㎎ "X" + 25 ㎕ Neowater™ (100%).
2. 1 ㎎ "X" + 12.5 ㎕ DMSO ――――→ 12.5 ㎕ Neowater™ (50%).
3. 1 ㎎ "X" + 12.5 ㎕ DMSO + 12.5 ㎕ Neowater™ (50%).
4. 1 ㎎ "X" + 6.25 ㎕ DMSO + 18.75 ㎕ Neowater™ (25%).
5. 1 ㎎ "X" + 25 ㎕ Neowater™+ 수크로오스* (10%).
6. 1 ㎎ + 12.5 ㎕ DMSO + 12.5 ㎕ 탈수 Neowater™** (50%).
* O.1 g 수크로오스 + 1 ㎖ (Neowater™) = 10% Neowater™ + 수크로오스
** 탈수 Neowater™는 Neowater™를 60 ℃에서 90 분 동안 탈수하여 제조하였다.
시험관 모두를 와류시키고 60 ℃로 가열한 다음 1 시간 동안 진탕하였다.
결과
0 시간에서 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 25A-C에 도시하였다. 가용화하고 60 분 후에 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 26A-C에 도시하였다. 가용화하고 120 분 후에 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 27A-C에 도시하였다. 가용화하고 24 시간 후에 6 개의 용매 및 물질 X를 포함하는 시험관을 도 28A-C에 도시하였다.
결론
모든 시험관에서 물질이 24 시간 후에 침전되었기 때문에, 물질 "X"는 시간이 경과하는 내내 안정하게 유지되지 않았다.
동일한 비율의 용매를 함유하였더라도, 2번 시험관과 6번 시험관의 용매는 차이가 있다. 이는 6번 시험관이 탈수되지 않은 Neowater™ 보다 더욱 친수성인 탈수된 Neowater™를 함유하고 있기 때문이다.
제 3 부 - 추가의 시간 경과에 따른 상이한 용매내 물질 안정성/동역학의 조사 및 DMSO의 감소
재료 및 방법
1 ㎎ 물질 "X" + 50 ㎕ DMSO를 유리 시험관에 배치하였다. 50 ㎕ Neowater™를 시험관내로 적정한 다음(2-3 초당 5 ㎕씩), 500 ㎕의 Neowater™ 용액(9% DMSO + 91% Neowater™)을 첨가하였다.
두 번째 유리 시험관에는, 1 ㎎의 물질 "X" + 50 ㎕의 DMSO를 첨가하였다. 50 ㎕의 RO를 시험관내로 적정한 다음(2-3 초당 5 ㎕씩), 500 ㎕의 RO 용액(9% DMSO + 91% RO)을 첨가하였다.
결과
도 29A-D에 도시된 바와 같이, 물질 "X"는 Neowater™를 포함하는 용액에 분산된 채로 유지되었지만, RO 물을 포함하는 용액에서는 시험관 바닥에 침전되었다. 도 30은 와류시키고 6 시간 후 RO/Neowater™ 및 아세톤에 분산된 물질의 흡수 특징을 도시한 것이다.
결론
물질 "X"는 Neowater™와 비교하여 RO에서 다르게 용해하였고 RO에 비해 Neowater™에서 더욱 안정하다는 것이 명백하다. 분광광도계 측정치(도 30)로부터, 그래프 아래의 면적이 RO에서보다 넓기 때문에 물질 "X"는 5 시간 후에도 Neowater™에 더 잘 용해되었음이 명백하다. Neowater™가 물질 "X"를 수화시킨다는 것이 명백하다. DMSO의 양은 20-80% 까지 감소될 수 있고, 물질 "X"를 수화시키고 이것을 Neowater™ 중에 분산시킨 Neowater™에 기초한 용액이 제조될 수 있다.
실시예 14
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 SPL 2101 및 SPL 5217 용해능
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 물질 SPL 2101 및 SPL 5217를 최종 농도 30 ㎎/㎖로 용해시킬 수 있는 지를 확인 하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
SPL 2101을 그의 최적 용매(에탄올)에 용해시켰고(도 31A), SPL 5217을 그의 최적 용매(아세톤)에 용해시켰다(도 31B). 두 화합물을 유리 바이얼에 넣고 어둡고 차가운 환경에 유지하였다. 데시케이터에서 용매의 증발을 수행한 다음, 미량이라도 용매들이 존재하지 않을 때까지 오랜 시간에 걸쳐 Neowater™를 상기 용액에 첨가하였다.
결과
도 32A-B에 분광광도계 데이터에 의해 도시된 바와 같이 SPL 2101 및 SPL 5217은 Neowater™에 용해하였다.
실시예 15
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 탁솔 용해능
나노구조를 포함하는 담체 조성물이 물질 탁솔(파클리탁셀, Paclitaxel)을 최종 농도 0.5 mM으로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
가용화: 17% EtOH를 함유하는 Neowater™ 또는 DMSO 중에서 0.5 mM의 탁솔 용액을 제조하였다(4 ㎖ 중 0.0017 g). 분광광도계를 사용하여 흡광도를 검출하였다.
세포 생육성 분석: 150,000 개의 293T 세포를 3 ㎖의 DMEM 배지를 함유하는 6 웰 플레이트에 시딩하였다(seed). 각각의 처리군을 RO 또는 Neowater™에 기초한 DMEM 배지에서 성장시켰다. 최종 농도가 1.666 μM이 되도록 탁솔(Neowater™ 또는 DMSO에 용해시킴)을 첨가하였다(3 ㎖의 배지 중 0.5 mM 탁솔 10 ㎕). 탁솔로 처리하고 24 시간 후에 세포를 수확하고 사멸된 세포를 검출하기 위해 트립판 블루 용액을 사용하여 계수하였다.
결과
도 33A-B에 도시된 바와 같이 탁솔은 DMSO 및 Neowater™ 둘 다에 용해되었다. 다양한 탁솔 용액에 대한 293T 세포의 생육성을 도 34에 도시하였다.
결론
Neowater™ 중의 용액으로 된 후 탁솔은 세포독성 효과를 포함하였다.
실시예 16
나노구조를 포함하는 액체 조성물의 안정화 효과
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 단백질의 안정성에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
두 가지의 상업용 Taq 중합효소(Peq-lab 및 Bio-lab)를 PCR 반응에 제공하여 ddH2O(RO) 및 나노구조를 포함하는 담체[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)]에서의 그의 활성을 측정하였다. 효소를 다른 시간 동안(1 시간에서 2.5 시간까지) 95 ℃로 가열하였다. 다음과 같은 2 가지 형태의 반응을 수행하였다:
물 단독 - 효소와 물만 비등시켰다.
내부성분 모두 - 반응 성분 모두를 비등시켰다: 효소, 물, 완충액, dNTP, 게놈 DNA 및 프라이머.
비등시킨 후, 필요한 임의의 추가의 반응 성분을 PCR 관에 첨가하고 통상의 PCR 프로그램을 30 사이클로 셋팅하였다.
결과
도 35A-B에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 담체 조성물은 모든 성 분이 열 응력에 가해진 조건하 및 효소만 열 응력에 가해진 조건하 모두에서 열로부터 효소를 보호하였다. 반대로, RO 물은 모든 성분이 열 응력에 가해진 조건하에서만 열로부터 효소를 보호하였다.
실시예 17
나노구조를 포함하는 담체의 안정화 효과에 대한 추가의 설명
나노구조를 포함하는 담체 조성물이 두 가지의 상업용 Taq 중합효소(Peq-lab 및 Bio-lab)의 안정화에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
PCR 반응은 다음과 같이 구성하였다:
Peq-lab 시료
나노구조를 포함하는 담체 조성물[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)] 또는 증류수[역삼투(Reverse Osmosis) = RO) 20.4 ㎕
0.1 ㎕ Taq 중합효소(Peq-lab, Taq DNA 중합효소, 5 U/㎕).
세 개의 시료를 구성하여 95 ℃의 일정한 온도에서 PCR 장치에 배치하였다. 인큐베이션 시간은 60, 75 및 90 분이었다.
Taq 효소를 비등시킨 후, 다음의 성분을 첨가하였다:
2.5 ㎕ 1OX 반응 완충액 Y (Peq-lab)
0.5 ㎕ dNTP 1O mM (Bio-lab)
1 ㎕ 프라이머 GAPDH 혼합물 10 pmol/㎕
0.5 ㎕ 게놈 DNA 35 ㎍/㎕
Bio-lab 시료
나노구조를 포함하는 담체[Neowater™, 이스라엘 소재 두-쿱 테크놀로지스(Do-Coop technologies)] 또는 증류수[역삼투(Reverse Osmosis) = RO) 18.9 ㎕.
0.1 ㎕ Taq 중합효소(Bio-lab, Taq 중합효소, 5 U/㎕)
5 개의 시료를 구성하고 95 ℃의 일정한 온도에서 PCR 장치에 배치하였다. 인큐베이션 시간은 60, 75, 90, 120 및 150 분이었다.
Taq 효소를 비등시킨 후, 다음의 성분을 첨가하였다:
2.5 ㎕ TAQ 1OX 완충액 Mg-무함유 (Bio-lab)
1.5 ㎕ MgCl2 25 mM (Bio-lab)
0.5 ㎕ dNTP 1O mM (Bio-lab)
1 ㎕ 프라이머 GAPDH 혼합물 (10 pmol/㎕)
0.5 ㎕ 게놈 DNA (35 ㎍/㎕)
각각의 처리군(Neowater 또는 RO)에 대하여, 양성 및 음성 대조군을 제조하였다. 양성 대조군은 효소를 비등시키지 않은 것이었다. 음성 대조군은 효소를 비등시키지 않고 반응에 DNA를 함유시키지 않은 것이었다. 비등 taq 분석뿐만 아니라 대조군 반응에 대하여 PCR 혼합물을 제조하였다.
시료를 PCR 장치에 배치하고 다음과 같이 가동시켰다:
PCR 프로그램:
1. 94 ℃ 2 분 변성
2. 94 ℃ 30 초 변성
3. 60 ℃ 30 초 어닐링(annealing)
4. 72 ℃ 30 초 연장(elongation)
단계 2-4를 30회 반복
5. 72 ℃ 10 분 연장
결과
도 36에 도시된 바와 같이, 나노구조를 포함하는 액체 조성물은 효소 둘 다를 열 응력으로부터 최대 1.5 시간 동안 보호하였다.
실시예 18
나노구조를 포함하는 액체 조성물이 탁솔을 용해시킬 수 있다는 추가의 증거
나노구조를 포함하는 담체 조성물이 물질 탁솔(파클리탁셀, Paclitaxel)을 0.08% 에탄올의 존재하에 최종 농도 0.5 mM으로 용해시킬 수 있는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
가용화 : 0.5 mM의 탁솔 용액을 제조하였다(4 ㎖ 중 0.0017 g). 탁솔을 에탄올에 용해시키고 20 일에 이르는 RT 저속 용매 교환 절차를 사용하여 Neowater™로 교환하였다. 절차 말기에, 40% 미만의 에탄올이 용액에 남았고, 최종 투여 농도에서 에탄올은 0.08%에 이르렀다. 용액을 0.2 ㎛ 필터를 사용하여 멸균하였다. 탁 솔을 DMSO(0.5 mM)에 따로따로 준비하였다. 용액 모두는 -20 ℃로 유지하였다. 분광광도계를 사용하여 흡광도를 검출하였다.
세포 생육성 분석: 2000개의 PC3 세포를 10% FCS와 함께 100 ㎕의 RPMI 기초 배지를 함유하는 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 시딩하였다(seed). 처리하고 24 시간 후에 0.5 mM 탁솔 2.1 ㎕, 1 ㎕ 및 0.5 ㎕를 1 ㎖의 RPMI 배지에 희석한 다음 최종 농도가 각각 1 μM, 0.5 μM 및 0.25 μM에 이르게 하였다. 처리군 당 최소 8 번 반복하였다. 탁솔 첨가하고 24 시간 후, 크리스털 바이올렛 비색 분석법을 사용하여 세포 밀도를 정량함으로써 세포 증식률을 평가하였다.
처리하고 24 시간 후, 세포를 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 크리스털 바이올렛을 첨가하고 실온에서 10 분간 인큐베이션하였다. 세포를 3 회 세척한 후, 50% 에탄올 중 100M 시트르산 나트륨을 함유하는 용액을 사용하여 세포로부터 색을 용출하였다. 광학 밀도의 변화를 분광광도계 플레이트 판독기를 사용하여 570 nm에서 판독하였다. 세포 생육성은 제어 광학 밀도의 백분율로서 나타내었으며, 블랭크의 공제 후 100%로 간주되었다.
결과
DMSO 또는 Neowater™에 용해시킨 0.5 mM 탁솔의 분광광도계 흡광도를 도 37A에 나타내었다. 도 37B-C는 두 제제에 대한 HPLC 판독치이다. 측정 결과, 6 개월 저장기간 후 Neowater™에 분산시킨 탁솔의 제제에서 아무런 구조 변화를 보이지 않았다.
DMSO 또는 Neowater™에 용해시킨 이후, 탁솔이 유도한 세포 생육성 손실의 결과를 도 38에 나타내었다.
결론
Neowater™에 용해시킨 탁솔(최종 작업 농도에서 에탄올 0.8% 함유)은 인간 전립선 암 세포주에 대하여, DMSO에 용해시킨 탁솔과 유사한 시험관내 세포 생육성/독성을 나타내었다.
실시예 19
인간 하이브리도마의 분리에 대한 나노구조를 포함하는 물의 효과를 나타내는 추가의 실험
나노구조를 포함하는 물이 단클론성 항체 생성의 제 1 단계 - 하이브리도마의 분리에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
세포 성장을 위한 시약: 세포 성장을 위한 모든 배지 및 보충물은 기브코 비알엘 라이프 테크놀러지(GIBCO BRL, Life Technologies)로부터 구입하였다. RPMI 1640 및 DMEM은 분말 형태로 구입하여 NPD 또는 DI 물에 재구성하였다. 재구성 후, 제조업자의 권고에 따라 중탄산나트륨을 배지에 첨가하고 pH는 추가로 조정하지 않았다. 사용 직전에, 모든 배지를 0.22 ㎛ 필터(Millipore)를 통해 여과멸균하였다. 하이브리도마 세포의 성장 후, RPMI에 10% 소태아 혈청, L-글루타민(4 mM), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(0.1 mg/mL), MEM-비타민(0.1mM), 비필수 아미노산(0.1mM) 및 피루브산 나트륨(1mM)을 보충하였다. 모든 보충물은 액체 형태로 구입하였고, 제조업자에 따라 사용하였다(의미: 이들을 Neowater™ 또는 대조군 물(DI 기초 배지 - 18.2 메가 오옴의 초순수 탈이온수(DI 물, UHQ PS, ELGA Labwater))에 희석시킴). 8-아자구아닌, HT 및 HAT는 시그마(Sigma)로부터 구입하고 분말형을 NPD 또는 DI RPMI로 재구성하였다. 인간 초대 섬유모세포 및 CHO 세포 성장에 사용된 DMEM에 10% 소태아 혈청, L-글루타민(4 mM), 페니실린(100 U/mL), 스트렙토마이신(0.1 mg/mL)을 보충하였다. 하이브리도마 클론형성 인자는 바이오 베리스(BioVeris)로부터 구입하였다.
화학 시약: 분말 PBS를 기브코 비알엘 라이프 테크놀러지로부터 얻었다. PEG-1450(P5402, 시그마)을 시그마로부터 구입하고, Neowater™ 또는 대조군 물에 기초한 멸균 PBS로 재구성하였다(50% w/v). 표본의 pH를 7.2로 조정하였고, DMSO(v/v)(시그마)를 10% 첨가하고, 0.45 ㎛ 필터(Millipore)를 통해 PEG 용액을 멸균여과하였다. 행크스 평형화 염 용액을 이스라엘의 바이오로지컬 인더스트리즈 베이트-하에멕 엘티디(Biological Industries Beit-HaEmek LTD)로부터 구입하였고, 그 자체로 Neowater™ 또는 대조군 - 기초 실험에 사용하였다. ELISA 플레이트-코팅용 탄산염-중탄산염 완충액(0.05 M, pH=9.6), OPD(0.4 mg/mL로 사용) 및 인산염-시트르산염 완충액(0.05 M, pH=5.0)은 시그마로부터 구입하였다.
항체: 염소 항-인간 IgM/IgG 및 HRP-컨쥬게이트 염소 항-인간 IgM/IgG는 잭슨 이뮤노리서치(Jackson ImmunoResearch)로부터 구입하였다. 표준 인간 IgM/IgG는 시그마로부터 구입하였다.
세포: 이들 실험에서 사용된 모든 세포(MFP-2, CHO 및 초대 인간 섬유모세포)는 이들 세포가 실험화 이전에 배지에 적응하도록 Neowater™ 및 대조군 - 기초 배지에 1 주일 동안 유지하였다. 또한, 융합 파트너 세포주 MFP-2를, HGPRT 마이 너스 표현형을 유지하도록 소태아 혈청 및 8-아자구아닌 이외의 첨가제를 첨가한 RPMI 배지에 유지시켰다. 초대 인간 섬유모세포를 에이티시시(ATCC)로 부터 얻어 DMEM에 유지시켰다. CHO 세포주를 DMEM에 유지시켰다. 모든 세포 배양액을 소태아 혈청, 글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 배양 배지로 이루어진 완전 배지에서 수행하였다. MFP-2 세포주의 경우, 비타민, 비필수 아미노산 및 피루브산염이 또한 완전 배지에 첨가되었다.
방법
세포 융합: 인간 말초 혈액 림프구와의 하이브리도마를 생성하기 위해, 융합생성제로서 작용하는 PEG 1450를 가지고 화학적 융합 기술[Kohler G, Milstein C (1975) Nature 256: 495-497]을 사용하였다. PEG 1450은 전형적으로 10% DMSO를 첨가한 PBS에서 제조하였다. 이들 실험의 경우, 대조군 물에 기초한 PBS에서 제조된 대조군 표본 PEG를 사용한 반면, Neowater™을 사용하여 PBS를 제조한 다음 이를 사용하여 PEG/DMSO 용액을 제조하였다. Neowater™을 대조군 물과 비교하는 모든 융합 실험의 경우, 모든 시약은 소태아 혈청 및 보충물의 농축물을 제외한 대조군 물 및 Neowater™에서 제조하였다. 또한, PEG-1450과의 융합 이후 HBSS의 구입 액체 형태를 사용하여 행크스 평형화 염(HBSS)에 세포 희석(이하 참조)을 수행하였고 제조업자로부터의 것을 그대로 사용하였다.
하이브리도마의 생성을 위해, 인간 말초 혈액 단클론성 세포(PBMC)를 새로 채혈한 전혈 40 ㎖로부터 분리하여 Histopaque 1077 (시그마)로 정제한 다음 무혈청 대조군 물 기초 배양 배지에서 4 회 세척하였다. MFP-2 융합 파트너 세포를 Neowater™ 또는 대조군 물 기초 배지에서 성장시킨 다음 무혈청의 각각의 배지로 4회 세척하였다. 각 실험의 경우, PBMC의 단일 배치를 두 개의 동등한 분획으로 나누고, 하나는 Neowater™ 융합에 사용하고 다른 하나는 대조군 물 융합에 사용하였다. 이어, MFP-2 및 PBMC를 무혈청의 Neowater™ 또는 대조군 물 기초 배지에서 혼합하고 펠렛팅하였다. PEG-1450을 37 ℃로 예비-가온한 다음 10-20O×106개의 혼합 세포에 대해 300 ㎕를 첨가하였다. 세포 혼합물을 일정하게 진탕하면서 3 분 동안 PEG와 함께 인큐베이션하였다. 이어, 행크스 평형화 염 용액 및 완전 RPMI(Neowater™ 또는 대조군 물에서 제조)를 가지고 세포 혼합물로부터 PEG를 희석하였다. 생성된 세포 현탁액에 소태아 혈청(10%) 및 HT(x2)를 첨가하였다. 본 공정에서 생성된 하이브리도마를 HAT 선별 완전 RPMI에서 96-웰 플레이트(세포 밀도- 2×106 개 림프구/웰)에서 배양하였다. 하이브리도마 세포가 웰의 약 1/4를 채웠을 때 면역글루불린 생성을 위한 상청액의 스크리닝을 시작하였다.
샌드위치 ELISA: IgM/IgG를 위한 하이브리도마 상청액을 샌드위치 ELISA를 사용하여 스크리닝하였다. 간단히, 포획 항체(염소 항-인간 IgM/IgG)를 탄산염/중탄산염 완충액에서 제조하고 100ng/100㎕/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 적용하였다. 이어, 플레이트를 4 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 다음 단계들은 모두 실온에서 수행하였다. PBS 중 0.3% 분유로 블록킹하고 1 시간 후, 하이브리도마로부터의 상청액을 1.5 시간 동안 첨가하였다. PBS에 1:500으로 희석시킨 인간 혈청을 양성 대조군으로 사용하였다. 배경을 위해 그리고 음성 대조군으로서 하이브리도 마 성장 배지를 사용하였다. 이차 항체(HRP-컨쥬게이트 염소 항-인간 IgM/IgG)를 1:5000의 농도의 블록킹 용액에서 제조하고 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 비색 반응을 생성하기 위해, 플레이트를 0.03% H2O2를 함유하는 인산염-시트르산염 완충액에서 OPD와 함께 인큐베이션시켰다. 15 분 후 10% 염산을 가지고 색 반응을 중지시켰다. 반응의 판독 및 기록은 492 nm 파장 필터를 사용하여 멀티스캔-어센트(Multiscan-Ascent)에서 수행하였다. 사용된 모든 시약은 NPD 또는 DI 기초 하이브리도마 상청액으로 이루어진 샌드위치 층을 제외하고 표준품이었다.
클로닝: 선택된 클론의 200 개 세포를 부피 10 ㎖의 배지에 희석하고 평균적으로 웰에 1-2 개의 세포가 담기도록 96-웰 플레이트(100 ㎕/웰)에 시딩하였다. 세포를 인큐베이션하고 주기적으로 공급하며 현미경적으로 클론 성장을 모니터하였다. 클론이 웰의 1/4-1/2를 차지했을 때 그의 상청액을 분석하였다. 클로닝의 효율을 플레이트당 생존 클론의 수로 나타내었다. 10 퍼센트 HCF(하이브리도마 클론형성 인자)를 실험 설계에 따라 첨가하였다.
세포 성장 분석: 초대의 무한증식 세포주의 성장을 크리스털 바이올렛 염료 체류 분석을 사용하여 모니터하였다. 고정된 세포의 수를 96-웰 플레이트에 여러 번 반복하여 시딩하였다. 세포 성장을 4% 포름알데히드로 고정화하여 정지시켰다. 이어, 고정 세포를 0.5% 크리스털 바이올렛으로 염색한 다음 물로 넓게 세척하였다. 체류하는 염료를 50% 에탄올(v/v) 중 0.1M 시트르산 나트륨 100 ㎕/웰로 추출하였다. 이어, 웰의 흡광도를 멀티스캔-어센트(Multiscan-Ascent) 및 적절한 필터 를 가지고 550 nm에서 판독하였다.
초대 인간 섬유모세포 배양: 계대 20 개에서 출발하여, 인간 섬유모세포를 배양하고 세포가 전형적인 섬유모세포 형태를 나타내고 그의 수가 초기 시딩 양 이하로 떨어지지 않는 한, 매주 계대하였다. 계대수 및 계산된 개체 배가의 수를 기록하였다. 세포의 형태 및 생존률을 현미경적으로 모니터하였다. 본 실험에 사용된 인간 섬유모세포의 개체 배가는 일반적으로 25이었다.
데이터 분석: Neowater™ 또는 대조군-기초 실험에서 융합 및 클로닝 효율의 통계학적 유의차를 카이-스퀘어 시험에 의해 결정하였다. 초대 인간 섬유모세포에 의한 성장 시험의 결과를 비대응 스튜던트 t-검정에 의해 분석하였다. 통계학적 p-값<0.05가 유의적인 것으로 고려되었다.
결과
Neowater™은 인간 단클론성 항체 생성에 대한 하이브리도마 형성의 효율을 향상시킨다.
화학적 융합 실험의 결과를 도 39에 나타내었다. 이들 실험에서, 단일 개체로부터의 PBMC를 Neowater™ 또는 대조군 기초 환경에서 융합하기 위해 정제한 후 두 그룹으로 나누었다. NPD와 DI 환경 사이에서 하이브리도마 수율의 통계학적 유의차가 입증되었다. 대조군 기초 배지에서의 비슷한 융합에 비해 Neowater™ 기초 융합 실험에서의 하이브리도마 수율이 더 큰 경향이 뚜렷하였다. 향상율을 식 [(Neowater™ 융합에서의 하이브리도마의 수/대조군 물 융합에서의 하이브리도마의 수)×100%-100%]에 의해 계산하였으며, 이들 결과를 도 39에 나타내었다. 향상 정 도는 변할 수 있으며, 8 개의 일련의 융합 실험에서 22 에서 227 퍼센트까지 변하였다. NPD에서의 융합의 효율 증가는 변하지만, 이는 각각의 융합이 상이한 도너로부터의 림프구를 사용하여 수행되었기 때문이라고 생각하지 못한 것은 아니다. 그 자체로, 하이브리도마 형성에 대한 NPD 수성 환경 영향의 크기는 어느 정도의 유전적 배경으로 기능한다.
NPD 물에서의 하이브리도마 서브클론의 수율 증가
단클론성 항체 생성 공정에서 중대한 단계 중 하나는, 특이적 단클론성 항체의 분비에 대하여 양성인 것으로 알려진 초대 하이브리도마 개체로부터 안정한 서브클론을 분리하는 단계이다. 이는 전형적으로 특이적 초대 하이브리도마 클론의 연속적인 서브클로닝에 의해 달성된다. 웰당 1-2 개의 시딩 세포를 포함하는 서브클로닝의 목적은 유전적으로 안정한 단일 기원의 클론을 형성하는 것 및 고유의 단클론성 항체를 생성하는 것이다. 본 공정 동안, 하이브리도마 세포는 항체 생성능을 잃기 때문이 아니라 유전적 불안정성 또는 증식률 때문에 죽을 수 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 클론의 성장 및 안정화를 촉진하는 다양한 인자를 가진 마크로파지 조절 배지로 이루어진 하이브리도마 클론형성 인자(HCF)가 사용된다. 그러나, 사용된 융합 파트너 세포주가 골수 기원이기 때문에, 그것으로 생성되는 하이브리도마는 아마도 그 자신의 클론성 증식을 촉진하는 오토크린 인자를 분비할 것이다. 그러나 이들 인자의 오토크린 작용은 그의 비교적 낮은 농도 때문에 표준 시험관내 배양에서는 명확하지 않다. 생체이용성을 향상시키는 Neowater™ 기초 배지의 능력을 시험하였고, 따라서 세포-국재 농도를 내내 증가시켰다. 이는 대조 군 물 대 Neowater™ 기초 배지에서의 초대 하이브리도마 세포의 서브클로닝을 통해 그리고 또한 두 클로닝 배지에 HCF를 첨가하는 효과를 관찰함으로써 최적으로 달성되었다.
MFP-2와 PBMC의 융합 및 초대 하이브리도마 클론의 성장 이후, 항체-생성 하이브리도마를 동정하였고 보충물을 함유하는 Neowater™ 또는 대조군 물 기초 배지에서 서브클로닝하였다. 이들 실험의 결과를 표 6에 나타내었다. 종합적으로, 시험된 각각의 초대 하이브리도마의 경우, 대조군 물 기초 배지에 비해 Neowater™ 기초 배지에서의 클론 성장이 더 우수한 것으로 관찰되었다. HCF가 Neowater™ 및 대조군 물 기초 배지 모두에 첨가된 경우, 두 제제 모두에서 유사한 비율로 클론의 수가 증가하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 도 40에 도시한 바와 같이, 반안정성 클론으로부터의 세포의 클론형성능이 또한 NPD 기초 배지에서 향상되었다.
[표 6]
처리군 DI-RPMI+HCF NPD-RPMI+HCF DI-RPMI NPD-RPMI
96 웰로부터의 하이브리도마-양성 웰의 수(%) 28(29) 46(48) 13(13) 25(26)
표 6: 단일의 초대 항체-생성 하이브리도마 클론으로부터, 200 개의 세포가 계수되었고, 10 ㎖의 부피로 첨가되었으며, 96-웰 플레이트에 걸쳐 시딩하였다(평균 1-2 개 세포/100 ㎕/웰). 상기 표는 각 처리군에서 현미경적으로 계수된 생존 서브클론의 수(괄호 안은 백분율)를 나타낸다.
카이 - 스퀘어 분석:
DI-RPMI+HCF 대 DI-RPMI p=0.008; DI-RPMI+HCF 대 NPD-RPMI p=유의하지 않음; DI-RPMI+HCF 대 NPD-RPMI+HCF p=0.008; NPD-RPMI+HCF 대 DI-RPMI p<0.00001; NPD-RPMI+HCF 대 NPD-RPMI p=0.002; NPD-RPMI 대 DI-RPMI p=0.03.
NPD 물에서 성장한 하이브리도마로부터 단클론성 항체의 분비 증가
단클론성 항체의 분비에 대한 Neowater™ 수성 환경의 효과를 조사하기 위해, 몇몇 안정화된 하이브리도마 클론으로부터 인간 단클론성 항체의 생성을 조사하였다. 5 년 이상 동안 항체를 안정하게 생성해 온 하이브리도마 클론을 대조군 물 기초 배지에서 성장시킨 다음 이로부터 두 개의 비슷한 배양액을 제조하였는데, 하나는 Neowater™ 에서 다른 하나는 대조군 물 기초 배지에서 제조하였다. 몇 일간의 적응기간 후, 세포를 등가 밀도로 반복 시딩하고, 5 일간 성장시킨 후 상청액을 회수하여 표준 샌드위치 ELISA에 의해 항체 농도를 측정하였다. 이들 실험 중 하나의 결과를 도 41에 도시하였지만, 모두 유사한 결과를 보여주었다. 그래프로부터 확실히 알 수 있는 바와 같이, 반복적인 Neowater™ 기초 배양액으로부터의 수율은 다소 변화가 있었지만(Neowater™ 기초 배양 농도의 범위는 101 내지 40 ㎍/㎖인 반면, 대조군 물의 범위는 더 좁았다: 30-32 ㎍/㎖), 전체적으로 Neowater™ 기초 배지에서의 단클론성 항체의 수율이 더 우수하였다. 그러나, 일부 세포는 Neowater™ 기초 배지에서 더 빠르게 성장하였다(아래 참조). 즉, 이러한 결과는 세포 당 분비가 우수한 것보다는 유사하게 분비하는 세포의 증식이 우수한 것을 반영한 것일 수 있다. 이러한 편재를 피하기 위해, 항체 농도를 각 배양액 내 세포의 수로 정규화하였다(도 41B). 정규화 후, 결과는 배치 농도와 유사하였고, Neowater™ 기초 배지에서의 단클론성 항체의 분비가 대조군 물 기초 배지에서 수득된 것보다 대략 2 배임을 나타낸다.
분비에 대한 Neowater™ 배지의 효과를 더 연구하기 위해, 단클론성 항체의 분비를 감소된 혈청에서 성장시킨 배양액에서 조사하였다. 본 실험에 의해 덜 활성적이나(10% 소태아 혈청을 함유하는 완전 배지에 비해 비교적 비활동적임) 여전히 대사활성적인 배양액에서의 분비의 조사가 가능해졌고, 이로써 Neowater™ 기초 배지의 증식 편재의 일부를 제거할 수 있었다. 도 42는 이들 실험의 결과를 나타내는데, 여기서 3% FCS에서 성장시킨 안정한 하이브리도마 클론 중 생존 세포의 총수 및 일일 항체 농도를 반복적으로 정량하였다. Neowater™ 배양액에서, 항체 농도는 배양액 내 생존 세포의 양에 따라 변하였다. 세포 증식 및 수의 변화는 또한 배지 교체 및 공급의 함수이며(4 일 및 10 일째 세포를 공급하기 위해 배지를 배양액에 첨가하였고, 6 일째에 배지가 완전히 교체됨), 이는 또한 항체의 농도에 영향을 미친다. 반대로, 대조군 물 배양액 중 세포는 계속 증식하였지만 어떠한 측정가능한 양의 항체를 생성하지는 못했다. 도 42의 그래프는 하이브리도마 세포 증식과 배양액의 항체 함량 사이의 전형적인 관계를 나타낸다. 일반적으로, Neowater™ 기초 배지에서, 세포 수의 증가 후 항체의 양이 증가하였는데, 이는 공급 후 증식 폭발 이후 일어난다. 그래프의 패턴은 배지 교체로부터의 항체 농도에 대한 희석 효과 및 또한 세포 증식의 동시 상승을 반영한다(배지 교체 후 6 일째).
Neowater™ 기초 수성 환경에서의 세포 증식
하이브리도마 클론을 사용한 이전 실험의 결과는 Neowater™ 기초 배지가 인 간 하이브리도마 세포의 생존력 및 클론성 증식에 영향을 미쳤음을 제시하였다. 이러한 가설을 추가로 조사하기 위해, 무한증식성 CHO 세포주 및 초대 인간 섬유모세포의 성장을 Neowater™ 및 대조군 물 기초 배지에서 연구하였다.
무한증식 세포주는 Neowater™에서 더 빠르게 성장한다
CHO 세포를 Neowater™ 및 대조군 물 기초의 완전 DMEM 유사 배양액에서 성장시켰다. 세포를 10-cm 페트리 접시 당 1.5×106 개의 초기 농도로 배양액(replicate culture)에 반복 시딩하였다. 밤새 성장시킨 후, 이들을 트립신처리에 의해 떼어내어 계수하였다. 결과를 도 43A-C에 도시하였고, 이는 Neowater™ 배지에서 세포가 평균적으로 거의 30% 까지 더 빠르게 성장하였음을 입증한다. CHO 세포 성장에 대한 혈청 고갈의 효과를 조사하기 위해, 세포를 5% 또는 1% FCS를 함유하는 유사한 Neowater™ 및 대조군 물 기초 배양액에 반복 시딩하였다. 이들 실험에서, 세포 질량은 크리스털 바이올렛 염료 체류 분석법에 의해 정량하였다. 본 실험의 결과를 도 43A-C에 도시하였으며, 이는 혈청 감소 조건하에서 세포가 대조군 물 기초 배지에 비해 Neowater™ 기초 배지에서 더 빠르게 성장한다는 것을 나타낸다.
초대 인간 섬유모세포는 NPD 물에서 더 느리게 성장한다
비교적 낮은 계대(개체 배가 20)의 초대 인간 섬유모세포를 먼저 Neowater™ 및 대조군 물 기초 배지에서 배양하여 세포를 그들 각각의 성장 배지에 적응시켰다. 초대 섬유모세포는 세포 밀도에 민감하기 때문에, 상이한 초기 시딩 밀도를 가지고 세포 증식에 대한 Neowater™ 대 대조군 물 기초 배지의 효과를 조사하였다. 96-웰 플레이트에서, 두 가지 세포 밀도, 5000 개 세포/웰 및 10,000 개 세포/웰로 Neowater™ 및 대조군 물 기초 배지 모두의 웰에 반복 시딩하였다. 밤새 성장시킨 후, 플레이트를 크리스털 바이올렛 염료 체류 분석법에 의해 분석하였다. 이러한 분석의 결과를 도 44A에 도시하였다. 두 세포 밀도 모두에서, Neowater™ 기초 배지에서 보다 대조군 물 기초 배지에 성장한 섬유모세포가 더 빠르게 증식하였다. 이러한 차이는 통계학적으로 매우 유의적인 것임을 알 수 있었다(p<<0.0001). 차이의 백분율 계산에 의하면, 더 높은 밀도에서의 처리군들간의 차이(56%)는 더 낮은 밀도에서의 것(44%)보다 더욱 현저하게 나타났다.
초대 인간 섬유모세포 성장에 대한 NPD 기초 배지의 효과를 추가로 연구하기 위해, 대조군 물 및 Neowater™ 기초 배지에서의 섬유모세포의 성장을 복수로 배양액에서 8 일에 걸쳐 실시하였다. 이전 실험에서 섬유모세소가 DI 기초 배지에서 이러한 밀도로 웰을 증식시켰기 때문에, 세포를 여러 개의 유사한 배양액에 10,000 개 세포/웰로 시딩하였다. 본 실험으로부터의 성장 곡선을 도 44B에 도시하였다. 상기 곡선으로부터 알 수 있는 바와 같이, 초대 인간 섬유모세포는 대조군 물 기초 배지에 비해 Neowater™ 기초 배지에서 덜 증식하였다. 이는 Neowater™에서의 환경이 초대 섬유모세포 성장에 덜 적합하다는 것을 나타내는 것이며, 섬유모세포 증식이 세포 밀도의 함수이므로, 세포-세포 감지력이 약간 저하한다는 것을 제시한다.
실시예 20
중간엽 줄기 세포(MSCs)의 성장에 대한 나노구조를 포함하는 물의 효과
MSC는 그 자신 및 그 주위의 세포에 영향을 미치는 분비 인자로 알려지 오토/파라크린 세포(Caplan and Dennis 2006, J Cell Biochem 98(5): 1076-84)이다. 문헌[Gregory et al., (Gregory, Singh et al. 2003, J Biol Chem. 2003 Jul 25;278(30):28067-78. Epub 2003 May 9)]은 5 개 세포/㎠로 배양된 MSC가 그의 증식을 향상시키는 Wnt 신호전달 경로의 dickkpof1(DKK1)을 분비한다는 것을 보여주었다. 유사한 효과가 매우 낮은 밀도로 시딩된 고증식성 세포로부터 20% 배지를 첨가함으로써 달성될 수 있다.
MSC의 성장에 대한 Neowater™의 효과를 결정하기 위해 다음의 실험을 수행하였다.
재료 및 방법
세포 배양: 승인된 프로토콜하에 라니아도 병원(Laniado Hospital) 및 텔 아비브 대학에서 성인 공여자로부터 인간 골수(BM) 세포를 수득하였다. 이들을 본질적으로 개시된 바와 같이 배양하였다. 간단히, 19-70세 사이의 남성 및 여성 공여자의 장골능선으로부터 10-㎖의 BM 흡인액을 취했다. 단핵세포를 밀도 구배(피콜/패크(ficoll/paque), 시그마)를 사용하여 분리하고 25 mM 글루코스를 함유하는 αMEM 배지에 현탁시킨 다음(모든 배양 배지 성분은 이스라엘의 바이오로지컬 인더스트리즈 베이트-하에멕 엘티디(Biological Industries Beit-HaEmek LTD)로부터 얻음), 16% FBS(lot no. CPB0183, Hyclone, Logan, Utah), 100 유닛/㎖ 페니실린, 100 ㎎/㎖ 스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 보충하였다. 세포를 10-cm 배양 접시(뉴욕 소재 코닝(Corning))에 플레이팅하고 5% 가습 CO2를 가지고 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 24 시간 후, 비접착성 세포를 버리고 부착성 세포를 PBS로 2 회 철저히 세척하였다. 세포를 5 내지 7 일 동안 인큐베이션하고 0.25% 트립신 및 1 mM EDTA로 37 ℃에서 5 분 동안 처리하여 회수한 다음 50-100 개 세포/㎠로 시딩하고, 컨플루언스하도록 배양한 다음 계대 1이라 명명하였다. 계대 1로부터의 세포를 24 웰 플레이트에 50-100 개 세포/㎠로 시딩하고, 분말 배지(바이오로지컬 인더스트리즈 베이트-하에멕 엘티디(Biological Industries Beit-HaEmek LTD, 이스라엘 01-055-1A))로부터 제조한 Neowater™ 또는 RO 물에 기초한 배지에서 배양하였다. 크리스털 바이올렛 분석법에 의해 5 일마다 한번 씩 총 20 일간 세포 생존률을 분석하였다. 또한, 공여자의 것 중 하나로부터의 세포를 상기 밀도로 6 웰 플레이트에 시딩하고(삼중), 혈구계를 사용하여 세포를 계수하였다.
결과
여성 한 명 및 남성 두 명인 세 공여자의 계대 2-4로부터의 골수를 50-100 개 세포/㎠의 밀도로 성장시키고 세포 계수(도 45) 및 크리스털 바이올렛(도 46)을 사용하여 분석하였다.
결론
본원에 나타낸 데이터에 기초한 바, Neowater™ 기초 배지에서의 줄기 세포(MSC)의 성장률이 낮은 세포 밀도에서 향상된다. 세포가 높은 컨플루언스에 도달한 경우, 속도가 감소하고 20 일 내에 두 조건 모두에서 세포의 양이 조정된다. 문헌[Gregory et al (Gregory, Singh et al. 2003, J Biol Chem. 2003 Jul 25;278(30):28067-78. Epub 2003 May 9)]에는 MSC의 성장 속도가 DKK1의 오토크린 분비를 통해 영향을 받는다고 제시되어 있다. MSC의 성장 속도에서 최초 4-5 일에 보여진 지연기는 저농도의 DKK1에 기인한다. 성장 배지에서 고농도의 DKK1에 도달한 경우, 세포는 배가 당 24-48 시간의 고속으로 증식한다. 상기 데이터는 성장 기간의 이동을 보여주는 것으로, 이는 배지 중 더 고농도의 DKK1이 더 이른 기간에 존재한다는 것을 의미한다. 이러한 현상은 세포 부근에서 DKK1의 국소 농도에 의해 설명될 수 있고, 이는 증식을 향상시킨다.
실시예 21
세팔로스포린 가용화
다음 실험의 목적은 저속 용매 교환 절차를 사용하여 불용성 세팔로스포린을 Neowater(NW)에 3.6 ㎎/㎖의 농도로 용해시키는 것과, 암피실린(Amp) 내성을 가진 pUC19 플라스미드로 형질전환시킨 이. 콜라이(E. Coli) DH5α 균주에 대한 그의 생물활성을 평가하는 것이다.
재료 및 방법
저속 용매 교환: 25 ㎎의 세팔로스포린을 5 ㎖의 유기 용매 아세톤(5 ㎎/㎖)에 용해시켰다. NW를 첨가하기 전에, 재료를 Heλios α 분광광도계를 사용하여 분석하였다(도 47). 재료는 아세톤에 거의 용해하지 않았다. 초기에 모래와 유사한 외관으로 침전하였다. 유기 용매를 Neowater™로 교환하는 절차를 멀티 블록 히터(30 ℃로 설정), 데시케이터 안쪽 및 후드 위에서 수행하였다. 표 7에 제시한 등식에 따라 유기 용매 농도를 계산하였다.
[표 7]
분석 천칭
% 아세톤 ㎖ 1-0.1739X = 가중치
% EtOH ㎖ 1-0.2155X = 가중치
굴절계
% 아세톤 ㎖ 0.0006X + 1.3328 = 굴절률 (RI) 값
% EtOH ㎖ 0.0006X + 1.3327 = 굴절률 (RI) 값
굴절계: RI: 1.3339, 등식 계산에 따라: 1.833 %.
분석 천칭: 평균 0.9962, 등식에 따라: 1.941%
용액을 0.45㎛ 필터를 사용하여 성공적으로 여과하였다. 여과 절차 전후에 용액의 분광광도계 판독을 수행하였다.
Neowater™에 용해된 세팔로스포린의 생물활성의 분석: pUC19 플라스미드(암피실린 내성)을 가진 DH5α 이. 콜라이(E. Coli)를 100 ㎍/㎖ 암피실린을 보충한 액체 LB 배지에서 37 ℃ 및 220 rpm (분당 회전수)으로 밤새 성장시켰다.
전날밤(ON)의 출발자 100 ㎕를 신선한 액체 LB에서 다음과 같이 재접종하였다:
a. 100 ㎕의 Neowater™ (두 번째 실험만) 및 무항생제(두 시험 모두)를 가진 3개의 시험관.
b. 100 ㎕의 세팔로스포린 원액(50 ug/㎖)을 함유하는 3 개의 시험관
c. 100 ㎕의 세팔로스포린 원액(5 ug/㎖)을 함유하는 3 개의 시험관
세균을 37 ℃ 및 220 rpm에서 인큐베이션하였다. 연속적인 OD의 판독은 테 칸 스펙트라플루오로 플러스(TECAN SPECTRAFlour Plus)를 사용하여 590 nm 필터로 96 웰의 투명한 플레이트를 사용하여 연속적인 OD를 판독하였다.
결과
도 48은 여과 전후에 Neowater™에 용해시킨 세팔로스포린의 분광광도계 판독치이다.
도 49A-B 및 50A-B에 나타낸 바와 같이, Neowater™에 용해한 경우 세팔로스포린은 생물학적으로 이용가능하며, 심지어 대량 희석된 경우에 조차 세균 성장 억제제로서 생물활성적이다. 주목할 것은, 본 실시예에 의해 Neowater™ 자체는 세균 성장 억제에 있어서 아무런 역할이 없음이 교시된다.
실시예 22
Neowater™ 의 광학 활성
유도된 원거리 질서의 사인(signature)을 시험하기 위해 Neowater™에 대한 편광분석법 측정을 사용하였다. NPD 용액의 광학 활성(원편광 및 타원편광에 관해)은 원편광 이색성 (CD) 방법을 사용하여 측정하였다.
원편광 이색성(CD) 실험 절차: CD 분광법의 목적은 수용액을 통과한 좌선성 및 우선성 (L및 R) 편광 사이의 흡수 차이를 검출하는 것이다. 이러한 차이는 물에 침지된 광학적으로 활성인 (키랄) 분자, 분자 또는 나노입자의 분포, 또는 수중 또는 용액 중에서 정연한 구조를 유도하는 임의의 다른 것으로부터 발생될 수 있다. 여기에 보고된 측정은 실온(298K)에서 Jasco K851 CD 편광계를 사용하여 수행되었다. 1 nm 및 10 초 증분을 사용하여 190 nm 및 280 nm에서 스펙트럼을 스캐닝 하였다. 감도 및 분해능을 증가시키도록, 10 cm 석영 큐벳을 사용함으로써 매우 긴 광 경로가 확보되었다(정상 모드의 조작에서 1 mm 이하인 것에 비해).
결과
결과는 Neowater™가 원편광 이색성을 보인다는 것을 나타낸다. DDW의 CD 스펙트럼(이것은 바탕선으로서 사용됨)과 비교하여 상이한 배치의 Neowater™에서 수행된 두 개의 전형적인 CD 스펙트럼을 도 51에 도시하였다. 약 0.5 밀리디그리의 광학 활성의 검출된 크기가 105-106 몰의 통상의 펩티드 용액의 효과와 유사한 것이 주목된다. 따라서, 무시할만한 수준이 아니다. 좌선성 편광 대 우선성 편광의 흡수에서 CD 측정된 차이는 구조적 비대칭에 기인하여 상승한다 - 정연한 구조가 양성 및/또는 음성 신호를 가질 수 있는 스펙트럼을 생성하는 반면, 정규 구조의 부재는 소멸성 CD 강도를 생성한다. 따라서, 본 발명자들은 NPD 용액의 CD 스펙트럼에서 비소멸성 신호의 확장은 나노입자 및 나노버블의 그물에 의해 형성된, Neowater™에서의 원거리 배향 질서의 형성과 관련이 있는 것으로 제안하였다.
명확하게 하기 위해 별도의 구체예의 문맥에 기술된 본 발명의 특정의 특성은 또한 하나의 구체예에 함께 제공될 수 있음이 인지될 것이다. 반대로, 요약하여 하나의 구체예의 문맥에 기술된 본 발명의 다양한 특성은 또한 별도로 또는 임의의 적합한 서브컴비네이션으로 제공될 수 있다.
본 발명은 그의 특정 구체예와 함께 기술되었지만 다양한 대안, 수정 및 변형도 본 분야의 기술자에게 자명할 것이라는 것은 명백하다. 따라서, 첨부되는 청 구범위의 정신 및 광범위한 범위 내에 포함되는 모든 대안, 수정 및 변형도 포함시키고자 한다. 본 명세서에서 언급된 모든 공개 문헌, 특허 및 특허 출원은 이들 각각의 공개 문헌, 특허 및 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 이들 본원에서 전체적으로 참고문헌으로서 인용된 것처럼 본 명세서에서 전체적으로 참고문헌으로서 포함된다. 추가로, 본 명세서에서 참고문헌의 인용 또는 확인은 상기 문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용가능함을 용인하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

Claims (82)

  1. 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 융합하는 단계를 포함하여, 세포를 융합하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포가 동일한 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포가 동일하지 않은 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포가 초대 세포를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포가 무한증식 세포를 포함하는 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 동일하지 않은 세포가 종양세포 및 항체 생성 세포를 포함하는 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 동일하지 않은 세포가 줄기 세포 및 체세포를 포함하 는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 체세포가 근세포 또는 골세포인 방법.
  10. 제6항에 있어서, 상기 항체 생성 세포가 B 림프구인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 B 림프구가 인간 B 림프구인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 B 림프구가 말초 혈액 단핵세포인 방법.
  13. 제6항에 있어서, 상기 종양세포가 융합단계 이전에 하이브리도마 생성을 증가하도록 하는 시간 동안 상기 액체 조성물에서 인큐베이션되는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 상기 시간이 1 일 이상인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020개 미만의 나노구조인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터(cluster)를 형성할 수 있는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용(long range interaction)을 유지할 수 있는 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 액체 조성물이 물의 완충능보다 큰 완충능을 포함하는 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 액체 조성물이 수산화인회석으로부터 제제화되는 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 액체 조성물이 편광을 변경시킬 수 있는 방법.
  23. 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지에서 세포를 배양함으로써 진핵세포를 배양하는 단계를 포함하여, 진핵세포를 배양하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 배지가 성장인자, 혈청 및 항생제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제제를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 상기 진핵세포가 단일 세포인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 단일 세포가 하이브리도마인 방법.
  27. 제23항에 있어서, 상기 배양 단계가 HCF의 부재하에 수행되는 방법.
  28. 제23항에 있어서,상기 진핵세포가 중간엽 줄기 세포인 방법.
  29. 제23항에 있어서, 상기 유체 분자 중 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 방법.
  30. 제23항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태인 방법.
  31. 제23항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020개 미만의 나노구조인 방법.
  32. 제23항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터를 형성할 수 있는 방법.
  33. 제23항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있는 방법.
  34. 제23항에 있어서, 상기 액체 조성물이 물의 완충능보다 큰 완충능을 포함하는 방법.
  35. 제23항에 있어서, 상기 액체 조성물이 수산화인회석으로부터 제제화되는 방법.
  36. 제23항에 있어서, 상기 액체 조성물이 편광을 변경시킬 수 있는 방법.
  37. 진핵세포 배양 배지; 및 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 세포 배양 배지.
  38. 제37항에 있어서, 상기 진핵세포 배양 배지가 성장인자, 혈청 및 항생제로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 제제를 추가로 포함하는 세포 배양 배지.
  39. 제37항에 있어서, 상기 유체 분자 중 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 세포 배양 배지.
  40. 제37항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태인 세포 배양 배지.
  41. 제37항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020개 미만의 나노구조인 세포 배양 배지.
  42. 제37항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터를 형성할 수 있는 세포 배양 배지.
  43. 제37항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있는 세포 배양 배지.
  44. 제37항에 있어서, 상기 액체 조성물이 물의 완충능보다 큰 완충능을 포함하는 세포 배양 배지.
  45. 제37항에 있어서, 상기 액체 조성물이 세포 증식율을 증가시킬 수 있는 세포 배양 배지.
  46. 제37항에 있어서, 상기 액체 조성물이 수산화인회석으로부터 제제화되는 세포 배양 배지.
  47. 제37항에 있어서, 상기 액체 조성물이 편광을 변경시킬 수 있는 세포 배양 배지.
  48. 포장재; 및 상기 포장재 내에 담긴 진핵세포 배양용으로 확인된 액체 조성물로서, 상기 액체 조성물은 액체 및 나노구조를 가지며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하 되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 제조 물품.
  49. 제48항에 있어서,상기 진핵세포가 중간엽 줄기 세포인 제조 물품.
  50. 제48항에 있어서, 상기 유체 분자 중 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 제조 물품.
  51. 제48항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태인 제조 물품.
  52. 제48항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020개 미만의 나노구조인 제조 물품.
  53. 제48항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터를 형성할 수 있는 제조 물품.
  54. 제48항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있는 제조 물품.
  55. 제48항에 있어서, 상기 액체 조성물이 물의 완충능보다 큰 완충능을 포함하는 제조 물품.
  56. 제48항에 있어서, 상기 액체 조성물이 세포 증식율을 증가시킬 수 있는 제조 물품.
  57. 제48항에 있어서, 상기 액체 조성물이 수산화인회석으로부터 제제화되는 제조 물품.
  58. 제48항에 있어서, 상기 액체 조성물이 편광을 변경시킬 수 있는 제조 물품.
  59. 포장재; 및 상기 포장재 내에 담긴 단클론성 항체 생성용으로 확인된 액체 조성물로서, 상기 액체 조성물은 액체 및 나노구조를 가지며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 제조 물품.
  60. 제59항에 있어서, 상기 유체 분자 중 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 제조 물품.
  61. 제59항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태인 제조 물품.
  62. 제59항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020개 미만의 나노구조인 제조 물품.
  63. 제59항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터를 형성할 수 있는 제조 물품.
  64. 제59항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있는 제조 물품.
  65. 제59항에 있어서, 상기 액체 조성물이 물의 완충능보다 큰 완충능을 포함하는 제조 물품.
  66. 제59항에 있어서, 상기 액체 조성물이 세포 증식율을 증가시킬 수 있는 제조 물품.
  67. 제59항에 있어서, 상기 액체 조성물이 수산화인회석으로부터 제제화되는 제조 물품.
  68. 제59항에 있어서, 상기 액체 조성물이 편광을 변경시킬 수 있는 제조 물품.
  69. 액체 및 나노구조를 가진 액체 조성물로서 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는 액체 조성물을 포함하는 배지에서 무한증식 세포를 항체 생성 세포와 융합하여 하이브리도마를 수득하는 단계를 포함하여, 단클론성 항체를 생성하는 방법.
  70. 제69항에 있어서, 상기 하이브리도마를 클로닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 클로닝 단계가 상기 하이브리도마를 상기 액체 조성물을 포함하는 배지에서 인큐베이션함으로써 수행되는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 클로닝 단계가 HCF의 부재하에 수행되는 방법.
  73. 제70항에 있어서, 상기 클로닝 단계 이후 단클론성 항체를 회수하는 단계를 추가로 포함는 방법.
  74. 제69항에 있어서, 상기 유체 분자 중 적어도 일부가 상기 액체의 분자와 동일한 방법.
  75. 제69항에 있어서, 상기 유체 분자의 적어도 일부가 기체 상태인 방법.
  76. 제69항에 있어서, 상기 나노구조의 농도가 리터당 1020개 미만의 나노구조인 방법.
  77. 제69항에 있어서, 상기 나노구조가 상기 나노구조의 클러스터를 형성할 수 있는 방법.
  78. 제69항에 있어서, 상기 나노구조가 그들 사이에서 원거리 상호작용을 유지할 수 있는 방법.
  79. 제69항에 있어서, 상기 액체 조성물이 물의 완충능보다 큰 완충능을 포함하는 방법.
  80. 제69항에 있어서, 상기 나노구조가 수산화인회석으로부터 제제화되는 방법.
  81. 제69항에 있어서, 상기 액체 조성물이 편광을 변경시킬 수 있는 방법.
  82. 물질의 분산 또는 용해가 가능한 조건하에서 세팔로스포린을 나노구조 및 액체와 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 각각의 나노구조는 정연한 유체 분자의 인벨롭에 의하여 둘러싸인 나노미터 크기의 코어 물질을 포함하되 상기 코어 물질 및 상기 정연한 유체 분자의 인벨롭이 정상의 물리적 상태로 존재하는, 세팔로스포린을 용해시키거나 분산시키는 방법.
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