JP5611822B2 - ヘモフィルス・インフルエンザb型菌用の培養培地 - Google Patents
ヘモフィルス・インフルエンザb型菌用の培養培地 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5611822B2 JP5611822B2 JP2010515566A JP2010515566A JP5611822B2 JP 5611822 B2 JP5611822 B2 JP 5611822B2 JP 2010515566 A JP2010515566 A JP 2010515566A JP 2010515566 A JP2010515566 A JP 2010515566A JP 5611822 B2 JP5611822 B2 JP 5611822B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medium
- peptone
- concentration
- protoporphyrin
- prp
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/102—Pasteurellales, e.g. Actinobacillus, Pasteurella; Haemophilus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
- C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
- C12P7/18—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic polyhydric
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P9/00—Preparation of organic compounds containing a metal or atom other than H, N, C, O, S or halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/90—Serum-free medium, which may still contain naturally-sourced components
- C12N2500/92—Medium free of human- or animal-derived components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/21—Haemophilus
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
タンパク態窒素源、
ヘム源、
β−NAD源、
炭水化物源
ビタミンおよび増殖因子の供給源、および
無機塩
を含む培地を意味すると解される。
プロトポルフィリンIX濃度が少なくとも0.01mg/l、少なくとも0.02mg/l、少なくとも0.03mg/l、少なくとも0.04mg/l、または好ましくは、少なくとも0.05mg/lである本発明の培養培地
である。
0.1mg/l〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
2〜50mg/lのβ−NAD、
2〜20g/lのグルコース、
2〜5g/lの酵母エキス、
0.4g/l〜1.5g/lのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態のNa+、NH4 +、Ca++、Mg++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは、7.0〜7.5となる)
を含む培養培地である。
(i) 本発明の液体培養培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを培養し、
(ii) (i)で得られた培養上清を回収し、そして、
(iii) 該培養上清からPRPを抽出する
ことを含む方法である。
(i) 固体培地上でヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを培養し、
(ii) (i)で得られた1つ以上のコロニーを本発明の液体培養培地に移して培養し、
(iii) (ii)で得られた培養上清を回収し、そして、
(iv) 該培養上清からPRPを抽出する
ことを含む方法である。
タンパク態窒素源、
ヘム源、
β−NAD源、
炭水化物源、
ビタミンおよび増殖因子の供給源、
無機塩、ならびに
ゲル化物質、通常、10〜30g/lの濃度の寒天
を含む。
コロニーの優れた個別化;
コロニーの優れた生存性;
コロニーの形態を研究することができるようなコロニーの発生および十分なサイズ
を得ることができる。コロニー間で区別できるようにするためには、16〜24時間の培養の終わりに十分なサイズ(約3〜5mm)のヘモフィルス・インフルエンザb型菌コロニーを得ることを可能にする培地を有することが必要である。
少なくとも1mg/lのβ−NAD、
少なくとも0.5mg/lのプロトポルフィリンIX、
固体培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも0.2g/lとなるのに十分な量の植物系ペプトンおよび酵母エキス(ここで、両者の割合は、培地中の植物系タンパク質の量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素の濃度が0.2g/l〜0.8g/lである場合には0.1〜9となり、培地のタンパク態窒素の濃度が0.8g/lを超える場合には1〜9となる割合である)、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のNa+、K+、Ca++、Mg++、Fe+++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培養培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは7.0〜7.5となる)
を含む。
5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのTween 80、
3〜4g/lのK2HPO4、
0.9〜3g/lのKH2PO4、
0.5〜2g/lのK2SO4、
20〜500mg/lのMgCl2、
2〜50mg/lのCaCl2・2H2O、
1〜5mg/lのFeCl3・6H2O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む。
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地を用いて行われる、PRPの製造方法。
完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型b細菌の集団の製造方法であって、
(i) ヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを、
5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのTween 80、
3〜4g/lのK2HPO4、
0.9〜3g/lのKH2PO4、
0.5〜2g/lのK2SO4、
20〜500mg/lのMgCl2、
2〜50mg/lのCaCl2・2H2O、
1〜5mg/lのFeCl3,・6H2O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む固体培地上で培養し;
(ii) (i)で得られた1つ以上の白色コロニーを、
0.1mg/l〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
2〜50mg/lのβ−NAD、
2〜20g/lのグルコース、
2〜5g/lの酵母エキス、
0.4g/l〜1.5g/lのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態の無機イオン:Na+、NH4 +、Ca++、Mg++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-のカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは7.0〜7.5となる)
を含む液体培養培地に移して培養し、
(iii) (ii)で得られた細菌培養物を凍結または凍結乾燥させる、
製造方法。
全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地によって行われる、完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型b細菌の集団の製造方法。
少なくとも1mg/lのβ−NAD、
少なくとも0.5mg/lのプロトポルフィリンIX、
培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも0.2g/lのタンパク態窒素であるのに十分な量のペプトンおよび酵母エキス(ここで、両者の割合は、培地中の植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素濃度が0.2g/l〜0.8g/lである場合には0.1〜9となり、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1〜9となる割合である)、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態の無機イオン:Na+、K+、Ca++、Mg++、Fe+++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-のカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは7.0〜7.5となる)
を含む、固体培養培地である。
5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのTween 80、
3〜4g/lのK2HPO4、
0.9〜3g/lのKH2PO4、
0.5〜2g/lのK2SO4、
20〜500mg/lのMgCl2、
2〜50mg/lのCaCl2・2H2O、
1〜5mg/lのFeCl3・6H2O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む。
(1)タンパク態窒素源が非動物起源のものであり、かつ、少なくとも1つの植物系ペプトンを含んでおり、ヘム源がプロトポルフィリンIXからなることを特徴とする、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型b培養用の培地;
(2)プロトポルフィリンIX濃度が少なくとも0.01mg/lである、(1)に記載の培地;
(3)プロトポルフィリンIX濃度が0.1mg/l〜5mg/lである、(2)に記載の培地;
(4)植物系ペプトンがコムギペプトンである、(1)〜(3)のいずれかに記載の培地;
(5)植物系ペプトンがエンドウペプトンである、(1)〜(4)のいずれに記載の培地;
(6)培養培地中の総植物系ペプトン濃度が0.08g/l〜2.25g/lのタンパク態窒素濃度と等価である、(1)〜(5)のいずれかに記載の培地;
(7)動物起源の混入物を含まない、(1)〜(6)のいずれかに記載の培地;
(8)0.1mg/l〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
2〜50mg/lのβ−NAD、
2〜20g/lのグルコース、
2〜5g/lの酵母エキス、
0.4g/l〜1.5g/lのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態のNa + 、NH 4 + 、Ca ++ 、Mg ++ 、HPO 4 -- 、H 2 PO 4 - 、SO 4 -- およびCl - イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは7.0〜7.5となる)
を含む、(5)〜(7)のいずれかに記載の液体培養培地;
(9)ポリリボシル・リビトール・リン酸(PRP)の製造方法であって、
(i) (1)〜(8)のいずれかに記載の液体培養培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを培養し、
(ii) (i)で得られた培養上清を回収し、そして、
(iii) 該培養上清からPRPを抽出する
ことを含む方法;
(10)ポリリボシル・リビトール・リン酸(PRP)の製造方法であって
(i) 固体培養培地上でヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを培養し、
(ii) (i)で得られた1つ以上のコロニーを、(1)〜(8)のいずれかに記載の液体培養培地中に移して培養し、
(iii) (ii)で得られた培養上清を回収し、そして、
(iv) 該培養上清からPRPを回収する
ことを含む方法;
(11)固体培養培地のタンパク態窒素源が非動物起源のものであり、少なくとも1つの植物系ペプトンを含む、(10)に記載の方法;
(12)植物系ペプトンがエンドウペプトンである、(11)に記載の方法;
(13)ヘム源がプロトポルフィリンIXからなる、(11)または(12)に記載の方法;
(14)固体培地が
少なくとも1mg/lのβ−NAD、
少なくとも0.5mg/lのプロトポルフィリンIX、
固体培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも0.2g/lであるのに十分な量の少なくとも1つの植物系ペプトンおよび酵母エキス(ここで、両者の割合は、培地中の植物系タンパク質の量と酵母エキスの量の比が、培地のタンパク態窒素の濃度が0.2g/l〜0.8g/lである場合には0.1〜9となり、培地のタンパク態窒素の濃度が0.8g/lを超える場合には1〜9となる割合である)、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のNa + 、K + 、Ca ++ 、Mg ++ 、Fe +++ 、HPO 4 -- 、H 2 PO 4 - 、SO 4 -- およびCl - イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは7.0〜7.5となる)
を含む、(10)〜(13)のいずれかに記載の方法;
(15)固体培地が
5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのTween 80、
3〜4g/lのK 2 HPO 4 、
0.9〜3g/lのKH 2 PO 4 、
0.5〜2g/mlのK 2 SO 4 、
20〜500mg/lのMgCl 2 、
2〜50mg/lのCaCl 2 ・2H 2 O、
1〜5mg/lのFeCl 3 ・6H 2 O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む、(14)に記載の方法;
(16)白色コロニーだけを液体培養培地中に移す、(14)または(15)に記載の方法;
(17)固体培養培地および液体培養培地が動物起源の混入物を含まない、(10)〜(16)のいずれかに記載の方法;
(18)完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型b細菌の集団の製造方法であって、
(i) ヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを、
5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのTween 80、
3〜4g/lのK 2 HPO 4 、
0.9〜3g/lのKH 2 PO 4 、
0.5〜2g/lのK 2 SO 4 、
20〜500mg/lのMgCl 2 、
2〜50mg/lのCaCl 2 ・2H 2 O、
1〜5mg/lのFeCl 3 ,・6H 2 O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む固体培地上で培養し;
(ii) (i)で得られた1つ以上の白色コロニーを、
0.1〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
2〜50mg/lのβ−NAD、
2〜20g/lのグルコース、
2〜5g/lのa 酵母エキス、
0.4g/l〜1.5g/lのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液形態のNa + 、NH 4 + 、Ca ++ 、Mg ++ 、HPO 4 -- 、H 2 PO 4 - 、SO 4 -- およびCl - イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは7.0〜7.5となる)
を含む液体培養培地中に移して培養し;そして、
(iii) (ii)で得られた細菌集団を凍結または凍結乾燥させる
ことを含む方法;
(19)全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地を用いて行われる、(18)に記載の方法;
(20)PRPの製造のための、(18)または(19)に記載の方法に従って得られる集団の使用;
(21)(10)〜(19)のいずれかに記載の方法に従って得られるPRPを含む、ヘモフィルス・インフルエンザb型菌髄膜炎に対するワクチン;
(22)タンパク態窒素源が非動物起源を含まないヘモフィルス・インフルエンザ血清型b用固体培養培地であって、
少なくとも1mg/lのβ−NAD、
少なくとも0.5mg/lのプロトポルフィリンIX、
培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも0.2g/lのタンパク態窒素であるのに十分な量の植物系ペプトンおよび酵母エキス(ここで、両者の割合は、培地中における植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素濃度が0.2g/l〜0.8g/lである場合には0.1〜9となり、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1〜9となる割合である)、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のNa + 、K + 、Ca ++ 、Mg ++ 、Fe +++ 、HPO 4 -- 、H 2 PO 4 - 、SO 4 -- およびCl - を含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5、好ましくは7.0〜7.5となる)
を含む固体培養培地;
(23)5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのTween 80、
3〜4g/lのK 2 HPO 4 、
0.9〜3g/lのKH 2 PO 4 、
0.5〜2g/lのK 2 SO 4 、
20〜500mg/lのMgCl 2 、
2〜50mg/lのCaCl 2 ・2H 2 O、
1〜5mg/lのFeCl 3 ・6H 2 O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む、(22)に記載の固体培地。
本発明は、結果的に本発明の内容を制限することなく本発明を例示する役割を果たす以下の実施例を考慮してさらに明瞭に理解されるであろう。
1)方法
ヘム源がヘミンもしくは二ナトリウム塩形態の動物起源のプロトポルフィリンIX(ブタプロトポルフィリン)であるか、または二ナトリウム塩形態の純粋な合成起源のプロトポルフィリンIXである液体植物系ペプトンベース培養培地中での16時間の細菌培養の後に得られたPRPの生産を比較した。培養培地中のヘミンおよびプロトポルフィリンIX濃度範囲は、試験したヘム源の関数としておよび試験した植物系ペプトンの関数としてPRP滴定曲線を得ることができるように約0.010g/lから約2g/lまで変化する。Kerryによって供給されたエンドウペプトンの酵素的加水分解物(Hy pea 7404)およびOrganotechnieによって供給されたコムギペプトン(19559)を0.87g/lのタンパク態窒素と等価の培養培地中濃度で試験した。現行のPRP生産条件を参照して、漸増濃度のヘミンの存在下でSolabiaによって供給されたカゼイン加水分解物(HAC)のような動物起源のペプトンを0.87g/lのタンパク態窒素と等価の濃度で含有する培地中でのPRPの生産を測定した(表3を参照)。
1.1.1. 限外濾過水中1g/lのβ−NAD(Fluka)の貯蔵溶液を、次いで、0.22μmで濾過滅菌した。
1.1.2. 溶解を補助するために25%アンモニア水(Cooper)5mlを含む限外濾過水中0.25/lのヘミン(Sigma)の貯蔵溶液。該貯蔵溶液を0.22μmで濾過滅菌する。
1.1.3. 溶解を促進するために25%アンモニア水(Cooper)5mlを含む限外濾過水中0.25g/lのブタプロトポルフィリンIX(Sigma)の貯蔵溶液。該貯蔵溶液を0.22μmで濾過滅菌する。
1.1.4. 溶解を促進するために25%アンモニア水(Cooper)5mlを含む限外濾過水0.25g/lの合成プロトポルフィリンIXの貯蔵溶液。該貯蔵溶液を、0.22μmで濾過滅菌する前に完全に溶解するために撹拌しながら水浴中にて80℃に加熱した。2007年3月30日に出願した出願番号第07/02334号のフランス特許出願に記載されたスキーム2に記載の工程を用いる方法に従ってプロトポルフィリンIXを二ナトリウム塩形態で合成した。
1.1.6. 限外濾過水中465.12g/lのグルコースの貯蔵溶液を、次いで、0.22μmで濾過滅菌した。
1.1.7. 濃縮溶液
それは、酵母エキスの貯蔵溶液40ml、グルコースの貯蔵溶液43mlおよびβ−NADの貯蔵溶液5mlからなる。
1.1.8. 基本培地
基本培地1リットル当たりタンパク態窒素0.95g相当を提供するのに十分な量のコムギ植物系ペプトン(Organotechnie−Ref 19559)またはエンドウ植物系ペプトン(Kerry−Ref Hypea 7404)(ここで、タンパク態窒素の量はkjedhal法に従ってアッセイした)、
乳酸ナトリウムの50%水溶液(VWR): 1.8ml、
リン酸水素二ナトリウム・12H2O(Budenheim): 31.14g、
リン酸二水素ナトリウム・2H2O(Merck): 2.03g、
L−シスチン(Jera France): 0.07g、
37%HCl(VWR): 0.07ml、
L−トリプトファン(Jera France): 0.02g、
硫酸アンモニウム: 1g、
硫酸マグネシウム・7H2O: 0.4g、
塩化カルシウム・2H2O: 0.02g/l、
限外濾過水: 1リットルにするのに十分な量。
最後に、基本培地を、オートクレーブを使用して121℃で30分間滅菌する。
500mlのエルレンマイヤーフラスコ中で培養を行った。種々の培養培地中の試験したヘミン(またはプロトポルフィリンIX)の理論濃度が10μg/l〜約2000μg/lとなるように、各エルレンマイヤーフラスコ中にコムギペプトンまたはエンドウペプトンを含有する基本培地100ml、濃縮培地8.8ml、および可変量のヘミン貯蔵溶液、ブタプロトポルフィリンIX貯蔵溶液または合成プロトポルフィリンIX貯蔵溶液を導入した(表1および2を参照)。各エルレンマイヤーフラスコに108〜1010細菌/mlを含有するヘモフィルス・インフルエンザ血清型bの凍結製品の内容物を0.2%(V/V)の接種率で接種する。インキュベーター中、37℃にて175rpmで撹拌しながら16時間インキュベートした後、少量の培養上清を回収することによって、各エルレンマイヤーフラスコ中にて得られた細菌懸濁液のODおよびPRP濃度を測定する。
サンドイッチ型ELISAアッセイに基づいて二重に培養上清のPRP生産力を決定した。
ELISAマイクロプレートを、ヘモフィルス・インフルエンザb型細菌で過剰免疫したウサギから免疫血清の溶液(あらかじめ0.2M炭酸塩緩衝液pH9.6で希釈しておいた(希釈率:約1/2000))100μlを各ウェルに導入して+4℃で一夜感作する。ELISAマイクロプレートをすすぎ、飽和した後、各マイクロプレート中にて、蒸留水中1mg/mlのPRP精製溶液から、希釈緩衝液(PBS/0.05%Tween 20/1%ウシ血清アルブミン)による連続希釈液を生成することによってキャリブレーションシリーズを調製する。アッセイされるべき培養上清も希釈緩衝液による連続希釈を行って導入する。37℃で約2時間、さらにインキュベートし、次いで、マイクロプレートをすすいだ後、破傷風タンパク質とコンジュゲートとしたヘモフィルス・インフルエンザb型菌ワクチンを接種したウサギの血清をビオチン化剤で処理して得たビオチン化ウサギ抗体の溶液(あらかじめ希釈緩衝液で希釈しておいた(希釈率:約1/500))100μLをマイクロウェルに導入する。37℃で1時間インキュベートし、次いで、すすいだ後、各マイクロウェルに、ペルオキシダーゼ(Southern Biotechnology−ref 7100−05)と結合したストレプトアビジンの溶液(あらかじめ希釈緩衝液で希釈しておいた(希釈率:約1/5000))100μlを添加する。37℃で1時間インキュベートし、すすいだ後、各マイクロウェルに可視化溶液(0.03%の過酸化水素0.3μlを加えた0.05Mリン酸塩−クエン酸塩緩衝液(pH=5)中0.4mg/mlのオルト−フェニレンジアミンの溶液)100μlを添加する。光から保護した20分間の可視化時間の後、2NのH2SO4 50μl/ウェルを添加することによって反応を遮断する。492および620nmでマイクロプレートを測定する(プラスチックの吸光度を考慮するため)。キャリブレーションシリーズによる補間によって、試験した試料について得られた光学密度値から、種々の培養上清中のPRP含有量を決定する。
1.4) 結果
結果を表1および2ならびに図1および2に示す。
約108細菌を含有するヘモフィルス・インフルエンザ血清型b細菌の均一集団の凍結乾燥品をDulbecco PBS緩衝液(Gibco ref 14040−083)1mlに取り込む。この緩衝液で10倍段階希釈を行う。希釈液(10-5、10-6および10-7)各50μlを回収し、種々の本発明の選択固体培地組成物を入れたペトリ皿、または10%(v/v)の脱線維素処理して沸騰処理したウマの血液(BioMerieux、Ref 55832)を加えたチャコール寒天を含有する標準固体培地(Difco、Ref 289410)を入れたペトリ皿に接種する。
PRPの定量化は、多糖類の反復単位の成分の1つであり、酸加水分解後に定量的に遊離されるリビトールをアッセイすることによって行われる。
各コロニーを限外濾過水500μlに取り込み、次いで、該懸濁液100μlを回収し、限外濾過水300μlで希釈する。
限外濾過精製水中1mg/lのリビトール貯蔵溶液を用いて開始し、0〜20μg/mlの範囲のリビトールキャリブレーションシリーズを調製する。キャリブレーションシリーズの各試料の最終容量は400μlである。
各試料調製物またはキャリブレーションシリーズの各試料に10Nのトリフルオロ酢酸溶液100μlを加える。120℃で2時間、加水分解を行う。次いで、全ての管を窒素流下で乾燥させ、分析時に各乾燥物を限外濾過精製水400μl中に取り込む。
あらかじめ480nM水酸化ナトリウム溶液で平衡化しておいた分析カラムCARBOPAC MA1(4×250mm)(DIONEX # 44066)上に各加水分解物100μlを注入する。該カラムに1M水酸化ナトリウム48%および限外濾過精製水溶液52%を含有する溶液を流速0.4ml/分で40分間流して、PRPの2つの構成単糖を溶離する。カラムの温度は、分析の期間全体で30℃に維持される。単糖は、アンペロメトリーセルと結合したED40マルチモード電気化学検出器(DIONEX #44094)を用いて検出される。
キャリブレーションシリーズからキャリブレーション曲線(クロマトグラフィーピークの表面積の関数としてのリビトールの量)を確立し、次いで、各試料調製物中に含まれるリビトールの量を補間によって決定する。それから各試料に含まれるPRPの量を推定し、次いで、各コロニー中のPRP濃度を推定して、リビトールがPRPの重量の41%であることが分かる。
MicroBCA法(Pierce)に従って決定した各コロニーのタンパク質含有量は、各コロニーのバイオマスを反映する。そのために、コロニーを個々に回収し、次いで、滅菌限外濾過水200μl中に取り込む。該混合物を30秒間ボルテックス撹拌する。試料(10μl〜40μl)を回収し、製造者の推奨に従ってMicroBCAキット(Pierce)を用いてタンパク質アッセイを行う。100μg/mlのウシアルブミン血清からキャリブレーションシリーズを調製する。分光光度計にて562nmで試料およびキャリブレーションシリーズを測定する。キャリブレーションシリーズを用いて、コロニー1つ当たりのμgで表される試料のタンパク質濃度を算出する。
タンパク質マスの単位(μgで表される)当たりのPRPのμgで表される結果を下記表に記載する。
N.D.: アッセイしていない
2つのPRP生産方法を比較した。第一の方法では、貯蔵集団と称されるヘモフィルス・インフルエンザb型細菌の集団の凍結品の内容物(約108細菌/ml)を本発明の液体培養培地に直接接種する。あらかじめ貯蔵集団の特徴を分析しておいた(次の段を参照)。第2のプロトコールでは、莢膜を持つ細菌を100%含有する白色コロニーから娘集団を選択することを可能にする本発明の選択固体培地を用いて貯蔵集団から娘集団を調製する。次いで、娘集団を貯蔵集団と同じ培養培地に接種する。次いで、貯蔵集団および娘集団によるPRPの生産を測定し、第3工程で比較する。
3.1.1: cap遺伝子座の分析
3.1.1.1: 試薬
細菌溶解緩衝液
Pett IV緩衝液: 10mM Tris−HCl pH7.4、1M NaCl
1X溶解溶液: 6mM Tris−HCl pH 7.4、1M NaCl、10mM EDTA、0.5%Brij 58、0.2%サルコシル、5mg/mlのリゾチーム、1μg/mlのRNase
ESP溶液: 10mM Tris−HCl pH7.4、1mM EDTA、1%SDS、1mg/mlのプロテイナーゼ
TE溶液: 10mM Tris−HCl pH7.4、0.1mM EDTA
酵素消化
SmaI:(GIBCO−BRL Ref: 15228−018)
10X消化緩衝液4:(GIBCO BRL、酵素を供給) − 使用時にヌクレアーゼを含まない滅菌精製水で10倍希釈する
KpnI:(INVITROGEN Ref: 155232−036)
10X消化緩衝液4:(INVITROGEN Ref: 155232−036) − 使用時にヌクレアーゼを含まない滅菌精製水で10倍希釈する
パルスフィールド電気泳動緩衝液
10X TBE緩衝液: 890mM Tris−HCl pH7.4、890mMホウ酸、250mM EDTA pH8.0 − 使用時に限外濾過水で20倍希釈する
ジゴキシゲニンで標識したPvuIIプローブ:
プラスミドpBR322−pU038(Department of Pediatrics − University of Oxford − John Radcliffe Hospital)から得たDNA調製物から特異的標識PvuIIプローブを得た。プラスミドDNA20μgを、あらかじめヌクレアーゼを含まない滅菌水で10倍希釈した10X緩衝液4(NEBIOLABS Ref. #B7002−S)中、40単位の酵素pvuII(NEBIOLABS Ref. #R0151−S)の存在下、37℃で2時間消化した。次いで、消化生成物を1%重量/容量で、0.25%容量/容量のブロモフェノールブルー、0.25%容量/容量のキシレンシアノールFF、および30%容量/容量のグリセロールを加えた1X TAE緩衝液の存在下でアガロースゲルにて電気泳動処理した。移動の終わりに、PvuII DNAフラグメントに対応する目的の2.1kbバンドを回収する。次いで、「Nucleospin」カラム(Macherey−Nalgel Ref: 740590.250)に通すことによってアガロースゲルからDNAを抽出し、次いで、260nmで分光光度測定して、その完全性をチェックする。最後に、標識化キット「DIG−Chem−Link Labeling and Detection Set」(ROCHE Ref: 1836463)を用いて、PvuIIプローブをジゴキシゲニンで標識する。標識プローブを−20℃で貯蔵する。
貯蔵集団のアンプルを解凍し、10%(v/v)脱線維素して沸騰したウマの血液(BioMerieux、ref 55832)を加えたチャコール寒天(Difco、ref 289410)からなる標準固体培地を入れたペトリ皿に接種する。10%CO2を入れたインキュベーター中にて37℃で18時間インキュベートした後、得られたコロニーを回収し、OD680nmが約1.8となるようにPett IV緩衝液に懸濁する。細菌懸濁液を2%(v/v)の低融点アガロース(Ref: BioRad、ref 162−0138)と混合し、50℃でテンパリングし、次いで、この混合物を約80μl/プラグの量でプラグモールド(BioRad Ref: 170−3713)中に分配する。かくして全細菌を含有するアガロースモールドが得られる。各プラグを1X溶解溶液1ml中に置く。37℃で6時間インキュベートした後、この溶液をESP溶液1mlと取り換える。50℃で一夜さらにインキュベートした後、各プラグをTE溶液4mlで30分間、3回洗浄する。次いで、各プラグに含まれている溶解した細菌のゲノムDNAを、酵素SmaI(GIBCO −BRL Ref: 15228−018)20単位を含有する1X消化緩衝液4(GIBCO BRL)300μlを用いて25℃で一夜消化し、次いで、TE溶液4mlで洗浄する。酵素KpnI(INVITROGEN ref: 155232−036)20単位を含有する1X緩衝液4(INVITROGEN Ref: 155232−036)200μlを用いて、消化を30℃で7時間続け、次いで、TE溶液で洗浄する。これら2つの制限酵素は、細菌ゲノムDNAのcap遺伝子座を遊離する。消化したプラグを0.8%v/vの認定アガロースゲル(BIORAD ref: 162−0138)中に挿入し、次いで、6ボルト/cm、角度120°、リニアプログレッション、初期スイッチ時0.9秒および最終スイッチ時11.54秒が適用されるような「Chef mapper」型(Biorad)セットの装置を用いて、0.5X TBE緩衝液中にて13時間パルスフィールド電気泳動処理する。製造者の推奨に従って装置「Vacugene XL Vacuum blotting System」(Pharmacia)を用いてセミドライトランスファーによってゲルを正帯電ナイロンフィルター(Roche Ref: 1209272)に移す。ナイロンフィルター上に移したDNAを312nmのUVで3分間固化する。次いで、フィルターを「DIG easy hyb」緩衝液(Roche ref: 1585738)中にて42℃で2時間プレハイブリダイズし、次いで、ジゴキシゲニンで標識した特異的PvuIIプローブを緩衝液1ml当たり20〜50ng含有する「DIG easy hyb」緩衝液中にて42℃で一夜ハイブリダイズする。このプローブは、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型bのcap遺伝子座を特異的に認識する。次いで、フィルターを、65℃で低ストリンジェンシー緩衝液を用いて2回洗浄し、次いで、高ストリンジェンシー緩衝液で洗浄する。次いで、キット「Dig−Chem−link labeling and detection Set」(Roche)を用いてアルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体の溶液を添加した後、蛍光基質(CDP −star: Roche Ref: 2041677)を用いてフィルターを可視化する。得られた電気泳動プロファイルを図3に示す。18kbおよび45kbの2つのバンドが観察され、これは、貯蔵集団のcap遺伝子座の構造が不均一であることを示している。集団の一部は、45kbの電気泳動バンドに対応する、18kb遺伝子のコピーを2つ持っているcap遺伝子座を有しており、残りは、18kbの電気泳動バンドに対応する、非二重形態のcap遺伝子座を有している。結果的に、貯蔵集団は、莢膜をもつ細菌と莢膜を持たない細菌の混合物である。この不均一さは、さらにまた、選択固体培地上に貯蔵集団を接種した後に得られる白色コロニーのパーセンテージを測定するための試験を用いて確認される(実施例2を参照)。
3.2.1)白色コロニーを形成する細菌のパーセンテージの測定
選択固体培地上で培養する工程および得られたコロニーの形態学的分析は、実施例2に記載した同操作条件に従って行われる。選択固体培地の組成は、実施例2の選択培地Aのものに対応する。
可視化されたコロニー100個当たりの白色コロニーの数を決定する。コロニーの60%が白色コロニーの形態であり、これにより、最初の貯蔵溶液が不均一であり、かつ、莢膜をもつ細菌および莢膜を持たない細菌の混合物を含有することが実際に裏付けられる。
3.2.2.1)娘集団の選択
選択固体培地A上で18〜24時間培養した後に得られた白色コロニーをBacto寒天を含まない選択固体培地と同一の液体培地の組成物2mlが入っている管に接種する。振盪しながら37℃で20時間さらにインキュベートした後、管の内容物を、1リットル当たりの組成が以下のとおりの本発明の液体培地50mlが入っているエルレンマイヤーフラスコに移す:
β−NAD: 5mg
プロトポルフィリンIX: 1mg
グルコース: 20g
酵母エキス: 5g
エンドウペプトン(Hypea 7404(Quest)):7.42g
乳酸ナトリウムの60%水溶液: 1.49ml
シスチン: 0.07g
トリプトファン: 0.02g
Na2HPO4・12H2O: 31.14g
NaH2PO4・2H2O: 2.03g
(NH4)2SO4: 1g
MgSO4・7H2O: 0.4g
CaCl2・2H2O: 0.02g
エルレンマイヤーフラスコを振盪しながら37℃のインキュベーター中に置く。600nmのODが2に近い場合には、細菌懸濁液中の最終濃度が20%(v/v)となるような量のグリセロールを添加する。該細菌懸濁液1mlをNunc管中に分配した後、−70℃で冷凍する。かくして、選択固体培地の組成物上で得られた白色コロニーから生産されて貯蔵集団の細菌に由来する娘細菌集団が凍結品の形態で得られる。
パラグラフ3.1.1.2に記載したプロトコールに従って娘集団のcap遺伝子座の分析を行った。電気泳動プロファイルは、45kbの単一バンドを示し、娘集団のcap遺伝子座が本質的に18kb遺伝子の二重形態であることを示している(図3を参照)。結果的に、娘細菌集団は、本質的に莢膜を持つ細菌からなっている。選択固体培地に接種した場合に白色コロニーを100%生産するということによって、この集団の均一性が確認される。
貯蔵集団または娘集団から得た約1010細菌が入っているアンプルの内容物を、パラグラフ3.2.2.1で示した組成の液体培地200mlが入っているエルレンマイヤーフラスコに直接接種する。
振盪(175rpm)しながら37℃+/−1℃で24時間インキュベートした後、培養上清を回収し、次いで、実施例1に記載の方法に従ってELISAによりPRP濃度を決定する。同試験を3回繰り返す。結果を下記表に示す。示された値は、3回の試験の平均値である。
出発細菌集団は、cap遺伝子座が18kb遺伝子のコピーを少なくとも2つ持っており、選択固体培地上で白色コロニーを100%生産する、完全に莢膜を持つ細菌の集団からなる。
パラグラフ3.2.2.1の操作プロトコールに従って選択された娘集団から得られた細菌を1ml当たり108〜1010個含有する凍結品の内容物を、パラグラフ3.2.2.1に示した組成の液体培地500mlが入っている1リットルの発酵槽に接種する。振盪しながら37℃で14時間インキュベートした後、第1の培養物を、初期ODが0.3となるように同液体培地500mlが入っている第2の1リットルの発酵槽に移す。同条件下で約5時間さらにインキュベートした後(得られたOD値は約4)、第2の培養物を、初期ODが0.3となるように培地500mlが入っている第3の1リットルの発酵槽に移し、次いで、約3時間インキュベートした後(得られたOD値は約4)、同液体培地500mlが入っている第4の1リットルの発酵槽中に注ぐ。この操作プロトコールは、通常PRPの工業的生産のために13000リットルの発酵槽中で行われる工程の研究室スケールへの適応である。
継代培養は細菌集団の特徴を変えず、細菌集団は継代培養の間じゅう完全に莢膜を持ったままである。PRPの生産もまた、非常に高いレベルで培養の間じゅう安定したままである。したがって、培養の間じゅう細菌集団の特徴は感知できるほど変化しないので、この培地の組成は莢膜を持つ細菌集団に対して安定化の役割を果たす。
Claims (24)
- タンパク態窒素源が非動物起源のものであり、かつ、エンドウペプトンおよびコムギペプトンからなる群から選択される少なくとも1つの植物系ペプトンを含んでおり、ヘム源がプロトポルフィリンIXを少なくとも0.05mg/lの濃度で含むことを特徴とする、ヘモフィルス・インフルエンザ血清型b培養用の培地。
- プロトポルフィリンIX濃度が0.1mg/l〜5mg/lである、請求項1に記載の培地。
- 培養培地中の総植物系ペプトン濃度が0.08g/l〜2.25g/lのタンパク態窒素濃度と等価である、請求項1または請求項2に記載の培地。
- 動物起源の混入物を含まない、請求項1〜3のいずれか1項に記載の培地。
- 液体形態であり、そして、
0.1mg/l〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
2〜50mg/lのβ−NAD、
2〜20g/lのグルコース、
2〜5g/lの酵母エキス、
0.4g/l〜1.5g/lのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液の形態のNa+、NH4 +、Ca++、Mg++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5となる)
を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の培地。 - pHが7.0〜7.5である、請求項5に記載の液体培養培地。
- ポリリボシル・リビトール・リン酸(PRP)の製造方法であって、
(i) 請求項1〜6のいずれか1項に記載の培養培地であって液体形態である培地中にてヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを培養し、
(ii) (i)で得られた培養上清を回収し、そして、
(iii) 該培養上清からPRPを抽出する
ことを含む方法。 - ポリリボシル・リビトール・リン酸(PRP)の製造方法であって
(i) 固体培養培地上でヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを培養し、
(ii) (i)で得られた1つ以上のコロニーを、請求項1〜7のいずれか1項に記載の培養培地であって液体形態である培地中に移して培養し、
(iii) (ii)で得られた培養上清を回収し、そして、
(iv) 該培養上清からPRPを回収する
ことを含む方法。 - 固体培養培地のタンパク態窒素源が非動物起源のものであり、少なくとも1つの植物系ペプトンを含む、請求項8に記載の方法。
- 植物系ペプトンがエンドウペプトンである、請求項9に記載の方法。
- 固体培地のヘム源がプロトポルフィリンIXを含む、請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 固体培地が
少なくとも1mg/lのβ−NAD、
少なくとも0.5mg/lのプロトポルフィリンIX、
固体培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも0.2g/lであるのに十分な量のエンドウペプトンおよびコムギペプトンからなる群から選択される少なくとも1つの植物系ペプトンおよび酵母エキス(ここで、両者の割合は、培地中の植物系タンパク質の量と酵母エキスの量の比が、培地のタンパク態窒素の濃度が0.2g/l〜0.8g/lである場合には0.1〜9となり、培地のタンパク態窒素の濃度が0.8g/lを超える場合には1〜9となる割合である)、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のNa+、K+、Ca++、Mg++、Fe+++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5となる)
を含む、請求項8〜11のいずれか1項に記載の方法。 - 培地のpHが7.0〜7.5である、請求項12に記載の方法。
- 固体培地が
5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのポリソルベート80、
3〜4g/lのK2HPO4、
0.9〜3g/lのKH2PO4、
0.5〜2g/mlのK2SO4、
20〜500mg/lのMgCl2、
2〜50mg/lのCaCl2・2H2O、
1〜5mg/lのFeCl3・6H2O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む、請求項12または請求項13に記載の方法。 - 固体培養培地上で得られた白色コロニーだけを液体培養培地中に移す、請求項12〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 固体培養培地および液体培養培地が動物起源の混入物を含まない、請求項8〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 完全に莢膜を持つヘモフィルス・インフルエンザ血清型b細菌の集団の製造方法であって、
(i) ヘモフィルス・インフルエンザ血清型bを、
5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのポリソルベート80、
3〜4g/lのK2HPO4、
0.9〜3g/lのKH2PO4、
0.5〜2g/lのK2SO4、
20〜500mg/lのMgCl2、
2〜50mg/lのCaCl2・2H2O、
1〜5mg/lのFeCl3,・6H2O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量との比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む固体培地上で培養し;
(ii) (i)で得られた1つ以上の白色コロニーを、
0.1〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
2〜50mg/lのβ−NAD、
2〜20g/lのグルコース、
2〜5g/lのa 酵母エキス、
0.4g/l〜1.5g/lのタンパク態窒素濃度と等価のエンドウペプトン、および
塩溶液形態のNa+、NH4 +、Ca++、Mg++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-イオンを含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5となる)
を含む液体培養培地中に移して培養し;そして、
(iii) (ii)で得られた細菌集団を凍結または凍結乾燥させる
ことを含む方法。 - 液体培地のpHが7.0〜7.5である、請求項17に記載の方法。
- 全ての工程が動物起源の混入物を含まない培地を用いて行われる、請求項17または請求項18に記載の方法。
- PRPの製造方法であって、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法に従って得られるヘモフィルス・インフルエンザ血清型b集団により生産されるPRPを回収することを含む、方法。
- 請求項7〜16および20のいずれか1項に記載の方法に従ってPRPを製造する工程を含む、ヘモフィルス・インフルエンザb型菌髄膜炎に対するワクチンの製造方法。
- タンパク態窒素源が非動物起源を含まないヘモフィルス・インフルエンザ血清型b用固体培養培地であって、
少なくとも1mg/lのβ−NAD、
少なくとも0.5mg/lのプロトポルフィリンIX、
培地中のタンパク態窒素濃度が少なくとも0.2g/lのタンパク態窒素であるのに十分な量のエンドウペプトンおよびコムギペプトンからなる群から選択される植物系ペプトンおよび酵母エキス(ここで、両者の割合は、培地中における植物系ペプトンの量と酵母エキスの量との比が、培地のタンパク態窒素濃度が0.2g/l〜0.8g/lである場合には0.1〜9となり、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1〜9となる割合である)、
炭水化物、
解毒剤、および
塩溶液の形態のNa+、K+、Ca++、Mg++、Fe+++、HPO4 --、H2PO4 -、SO4 --およびCl-を含む無機イオンのカクテル(これにより、培地のpHが6.5〜7.5となる)
を含む固体培養培地。 - pHが7.0〜7.5である、請求項22に記載の固体培養培地。
- 5〜50mg/lのβ−NAD、
0.5〜5mg/lのプロトポルフィリンIX、
1〜10g/lのグルコース、
1〜10mg/lのポリソルベート80、
3〜4g/lのK2HPO4、
0.9〜3g/lのKH2PO4、
0.5〜2g/lのK2SO4、
20〜500mg/lのMgCl2、
2〜50mg/lのCaCl2・2H2O、
1〜5mg/lのFeCl3・6H2O、
4〜8g/lのNaCl、
4〜8g/lの酵母エキス、および
4〜8g/lのエンドウペプトン(ここで、エンドウペプトンの量と酵母エキスの量の比は、培地のタンパク態窒素濃度が0.8g/lを超える場合には1以上である)
を含む、請求項22または請求項23に記載の固体培地。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR0756371 | 2007-07-10 | ||
FR0756371A FR2918671B1 (fr) | 2007-07-10 | 2007-07-10 | Milieu de culture d'haemophilus influenzae type b. |
PCT/FR2008/051223 WO2009007641A2 (fr) | 2007-07-10 | 2008-07-01 | Milieu de culture pour haemophilus influenzae de type b |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010532985A JP2010532985A (ja) | 2010-10-21 |
JP5611822B2 true JP5611822B2 (ja) | 2014-10-22 |
Family
ID=39027590
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010515566A Expired - Fee Related JP5611822B2 (ja) | 2007-07-10 | 2008-07-01 | ヘモフィルス・インフルエンザb型菌用の培養培地 |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8673617B2 (ja) |
EP (1) | EP2167639B1 (ja) |
JP (1) | JP5611822B2 (ja) |
KR (1) | KR101545641B1 (ja) |
CN (1) | CN101688174B (ja) |
AR (1) | AR067131A1 (ja) |
AU (1) | AU2008273968B2 (ja) |
BR (1) | BRPI0814217A2 (ja) |
CA (1) | CA2693101A1 (ja) |
FR (1) | FR2918671B1 (ja) |
IL (1) | IL202495A (ja) |
MX (1) | MX2009013634A (ja) |
WO (1) | WO2009007641A2 (ja) |
ZA (1) | ZA200908450B (ja) |
Families Citing this family (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR075817A1 (es) | 2009-03-11 | 2011-04-27 | Monsanto Technology Llc | Formulaciones herbicidas que comprenden glifosato y gliceridos alcoxilados |
PT105484A (pt) | 2011-01-14 | 2012-07-16 | Univ Nova De Lisboa | Um método de ambientómica funcional para engenharia de meio de cultura celular |
FR2992656B1 (fr) * | 2012-07-02 | 2016-10-07 | Sanofi Pasteur | Procede de production d'antigenes haemophilus influenzae type b |
WO2014009971A2 (en) * | 2012-07-07 | 2014-01-16 | Bharat Biotech International Limited | Non-alcoholic vaccine compositions free from animal- origin and process for preparation thereof |
WO2014200657A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces xiamenensis |
WO2014200658A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from promicromonospora vindobonensis |
WO2014200656A1 (en) | 2013-06-13 | 2014-12-18 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylase from streptomyces umbrinus |
US20160130571A1 (en) | 2013-06-17 | 2016-05-12 | Danisco Us Inc. | Alpha-Amylase from Bacillaceae Family Member |
WO2015050723A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from exiguobacterium, and methods of use, thereof |
WO2015050724A1 (en) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases from a subset of exiguobacterium, and methods of use, thereof |
BR112016010551A2 (pt) | 2013-11-20 | 2017-12-05 | Danisco Us Inc | variantes de alfa-amilases tendo suscetibilidade reduzida à clivagem da protease e métodos de uso das mesmas |
KR101723168B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
KR101729251B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-21 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
KR101723167B1 (ko) * | 2015-04-28 | 2017-04-05 | 주식회사 대웅 | 보툴리눔 독소의 제조를 위한 배지 조성물 |
CN105199998B (zh) * | 2015-11-04 | 2016-06-29 | 长春长生生物科技有限责任公司 | Hib综合培养基、b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其制备方法 |
WO2017173190A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
WO2017173324A2 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Danisco Us Inc. | Alpha-amylases, compositions & methods |
PL244159B1 (pl) | 2018-12-17 | 2023-12-11 | Univ Gdanski | Odczynnik do ochrony bakterii podczas liofilizacji i zastosowanie odczynnika do ochrony bakteryjnych szczepów probiotycznych podczas liofilizacji |
WO2021108502A1 (en) * | 2019-11-27 | 2021-06-03 | Evelo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for culturing hemoglobin-dependent bacteria |
CN110747148A (zh) * | 2019-12-02 | 2020-02-04 | 天津瑞普生物技术股份有限公司 | 一种副鸡禽杆菌培养基的制备方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4459286A (en) * | 1983-01-31 | 1984-07-10 | Merck & Co., Inc. | Coupled H. influenzae type B vaccine |
AU653964B2 (en) | 1990-12-06 | 1994-10-20 | Becton Dickinson & Company | Fastidious organism supplement |
SK18594A3 (en) | 1991-08-16 | 1994-08-10 | Merck & Co Inc | Method of production of capsular polysacharide without lipid and endotoxine |
US5371197A (en) | 1991-09-24 | 1994-12-06 | Merck & Co., Inc. | Protein-dimeric polysaccharide conjugate vaccine |
ES2325301T3 (es) * | 1995-06-23 | 2009-09-01 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Composicion de vacuna que comprende un antigeno polisacarido conjugado, adsorbido sobre fosfato de aluminio. |
US20040087020A1 (en) | 1997-05-28 | 2004-05-06 | Chiron S.P.A. | Culture medium with yeast or soy bean extract as amino acid source and no protein complexes of animal origin |
DE69842010D1 (de) | 1997-05-28 | 2010-12-30 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Faktors von Corynebacterium diphtheriae unter Verwendung eines Kulturmediums mit Hefeextrakt als Aminosäurenquelle und ohne Proteinkomplexe tierischer Herkunft |
FR2782093B1 (fr) | 1998-07-24 | 2002-02-08 | Agronomique Inst Nat Rech | Procede de preparation de cultures de bacteries lactiques |
CN1709505B (zh) * | 2005-07-13 | 2010-06-16 | 北京绿竹生物制药有限公司 | 多价细菌荚膜多糖-蛋白质结合物联合疫苗 |
-
2007
- 2007-07-10 FR FR0756371A patent/FR2918671B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-06-23 AR ARP080102690A patent/AR067131A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-07-01 WO PCT/FR2008/051223 patent/WO2009007641A2/fr active Application Filing
- 2008-07-01 MX MX2009013634A patent/MX2009013634A/es active IP Right Grant
- 2008-07-01 CA CA2693101A patent/CA2693101A1/en not_active Abandoned
- 2008-07-01 CN CN200880023989.0A patent/CN101688174B/zh active Active
- 2008-07-01 AU AU2008273968A patent/AU2008273968B2/en active Active
- 2008-07-01 KR KR1020107001212A patent/KR101545641B1/ko active IP Right Grant
- 2008-07-01 EP EP08806147.8A patent/EP2167639B1/fr not_active Revoked
- 2008-07-01 JP JP2010515566A patent/JP5611822B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-07-01 BR BRPI0814217-3A2A patent/BRPI0814217A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2008-07-10 US US12/170,625 patent/US8673617B2/en active Active
-
2009
- 2009-11-30 ZA ZA2009/08450A patent/ZA200908450B/en unknown
- 2009-12-03 IL IL202495A patent/IL202495A/en active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2693101A1 (en) | 2009-01-15 |
FR2918671B1 (fr) | 2010-10-15 |
FR2918671A1 (fr) | 2009-01-16 |
WO2009007641A8 (fr) | 2009-11-05 |
BRPI0814217A2 (pt) | 2014-10-21 |
IL202495A0 (en) | 2011-08-01 |
WO2009007641A2 (fr) | 2009-01-15 |
AU2008273968A1 (en) | 2009-01-15 |
ZA200908450B (en) | 2011-02-23 |
MX2009013634A (es) | 2010-01-26 |
JP2010532985A (ja) | 2010-10-21 |
CN101688174B (zh) | 2015-07-29 |
KR20100049546A (ko) | 2010-05-12 |
AR067131A1 (es) | 2009-09-30 |
KR101545641B1 (ko) | 2015-08-21 |
US20090017074A1 (en) | 2009-01-15 |
WO2009007641A3 (fr) | 2009-02-26 |
EP2167639A2 (fr) | 2010-03-31 |
AU2008273968B2 (en) | 2014-04-24 |
CN101688174A (zh) | 2010-03-31 |
EP2167639B1 (fr) | 2016-08-17 |
IL202495A (en) | 2014-01-30 |
US8673617B2 (en) | 2014-03-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5611822B2 (ja) | ヘモフィルス・インフルエンザb型菌用の培養培地 | |
Nam et al. | Native-feather degradation by Fervidobacterium islandicum AW-1, a newly isolated keratinase-producing thermophilic anaerobe | |
CN102224238B (zh) | 非天然氨基酸复制依赖性微生物和疫苗 | |
KR20180073699A (ko) | 박테리아 세포 배양에서 폴리사카라이드를 생성하기 위한 배지 및 발효 방법 | |
US6558926B1 (en) | Method for production of tetanus toxin using media substantially free of animal products | |
Hu et al. | Coupled bioconversion for preparation of N-acetyl-D-neuraminic acid using immobilized N-acetyl-D-glucosamine-2-epimerase and N-acetyl-D-neuraminic acid lyase | |
CN103122341A (zh) | 一种麦芽糊精底物特异性提高的环糊精糖基转移酶及其制备方法 | |
JP2021514679A (ja) | 糸状真菌宿主細胞によって発現された組換えシュウ酸デカルボキシラーゼ | |
Wang et al. | Purification and characterization of chitinase from a new species strain, Pseudomonas sp. TKU008 | |
JP2002543773A (ja) | アスペルギルス・ニガー培養物を得るための方法およびフェルラ酸とバニリン酸を生産するためのそれらの使用 | |
Wei et al. | Medium optimization for acarbose production by Actinoplanes sp. A56 using the response surface methodology | |
JP6778870B2 (ja) | 藍藻変異株及びそれを用いたコハク酸及びd−乳酸産生方法 | |
JP5528013B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ高生産菌 | |
JP7283469B2 (ja) | エタノールアミンリン酸リアーゼ組成物 | |
EP1673442B1 (en) | Transgenic organisms with lower growth temperature | |
JP3694335B2 (ja) | 耐熱性o−アセチルセリンスルフヒドリラーゼおよびその製造法 | |
JP3413294B2 (ja) | 2,5−ジヒドロキシピリジンの製造法および2,5−ジヒドロキシピリジン生産菌 | |
JPS6228678B2 (ja) | ||
CN109055334A (zh) | 一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法 | |
JP5537062B2 (ja) | アルカリプロテアーゼ高生産菌 | |
KR20200007903A (ko) | 세균성 다당류의 생산 | |
JP2006254789A (ja) | D−アミノアシラーゼの活性向上方法 | |
Sathya et al. | PRODUCTION AND OPTIMIZATION OF DEXTRANASE ENZYME FROM STREPTOCOCCUS MUTANS CAUSING DENTAL PLAQUES | |
SK500682016A3 (sk) | Spôsob biotransformácie trans-2-hexenálu na trans-2-hexenol pomocou rekombinantných enzýmov | |
Luis | The Haemophilus influenzae type b is a pathogenic bacterium, responsible for causing meningitis world-wide. The capsular polysaccharide is the main virulence factor and it is used as antigen against this microorganism. The purpose of this work is to establish a batch and fed-batch cultivation process in order to result high productivity of polysaccharide. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20110629 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20120309 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130312 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130612 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140218 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140519 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20140819 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20140903 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5611822 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |