JP2006254789A - D−アミノアシラーゼの活性向上方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】D−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はD−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加するD−アミノアシラーゼの活性向上方法、或いは、D−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はD−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加するD−アミノアシラーゼの活性化及び/又は安定化方法。
【選択図】 なし
Description
D−アミノアシラーゼ(以下、DAAともいう。)は公知の方法で得られるものを用いることができる。例えば、D-アミノアシラーゼ生産能を有する微生物により産生されたD−アミノアシラーゼを用い得る。
本発明のDAA活性向上方法においては、DAAに接触する溶液又はDAA溶液、即ち、D−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はD−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛を添加することを特徴とする。このとき、D−アミノアシラーゼの供給段階、例えば、DAA生産菌の培養段階や未精製DAA原料等における亜鉛の有無は特に限定されない。
処理工程が多数の工程から構成される場合には、そのうち、1又は複数の工程で用いる溶媒又は溶液を意味する。
本発明は、D−アミノアシラーゼにおける処理工程の工程液に亜鉛を添加することより、DAAを活性化及び/又は安定化する方法を提供する。
本発明において、DAAの回収工程には、DAA生産菌を培養した培養液もしくは培養菌体からDAAを含む粗抽出画分を回収する工程又は回収するための各種処理工程が包括される。
本発明において、D−アミノアシラーゼの精製工程には、粗抽出蛋白質からより純度の高いDAAを得る工程又はより純度の高いDAAを得るための各種処理工程およびそれらに準じる精製工程が包括される。
本発明においてD−アミノアシラーゼの粉末化工程には、DAA、好ましくは精製DAAを、粉末化する工程及び粉末化するための各種処理工程及びそれらに準じる工程が包括される。
本発明において、DAAの活性向上方法とは、DAAの活性化及び/又は安定化を目的とする方法全般を包括する概念であり、DAAの活性化方法及び安定化方法を包含する。
(1)DAA活性
以下の実施例において、D−アミノアシラーゼ(DAA)の活性は以下のように測定した。
K−リン酸緩衝液(0.1M、pH8.0)8.7mlに、D−アミノ酸オキシダーゼ溶液(バイオザイム社製、20U/ml)1ml、4−アミノアンピシリン溶液(第一化学薬品製、6.1mg/ml)0.1ml、TOOS溶液(同仁化学研究所製、32.2mg/ml)0.1ml、ペルオキシダーゼ溶液(東洋紡績製PEO−301、300U/ml)0.1mlを混合して第一反応試薬とした。
第一反応試薬1.5mlと酵素溶液0.1mlをキュベット中で混合し、37℃で1分間予備加温する。25mM N−アセチル−DL−バリン溶液(東京化成製)1.4mlを添加しゆるやかに混和後、水を対照に、37℃に制御された分光光度計で、555nmの吸光度変化を10分記録し、その吸光度変化を測定する。盲検は、酵素を溶解する溶媒を、酵素溶液の代わりに試薬混液に加えて、同様に吸光度変化を測定する。あらかじめD−バリン標準液を用いて作成した検量線を元に1分間あたりに生成したD−バリン量を算出する。上記条件下で1分間に1マイクロモルのD−バリンを生成する酵素量を1単位(1U)として酵素活性を算出する。
蛋白質濃度および総蛋白質量は以下のように求めた。
280nmにおける吸光度が0.1〜1.0AbsとなるようDAA溶液を蒸留水で希
釈し、この希釈液の280nmにおける吸光度を紫外分光光度計で測定する。
(1)遺伝子組換えによるD-アミノアシラーゼ生産菌の構築と培養
デフルビバクター・ルサチエンシス A131−3株由来のD−アミノアシラーゼをコードする構造遺伝子を、発現ベクターpBluescript KSN(+)のlacプロモーター制御下に位置するマルチクローニングサイトに挿入し、発現プラスミドpDAA3を構築した。挿入したD−アミノアシラーゼ遺伝子の塩基配列を配列表の配列番号1に示す。このpDAA3を用いてエシェリヒア・コリJM109株コンピテントセル(東洋紡績製コンピテントハイJM109)を当製品に添付のプロトコールに従って形質転換し、DAA生産菌コロニーを200μg/mlアンピシリン(ナカライテスク製)を含むLB寒天培地上に得た。このDAA生産菌コロニーを、500ml容坂口フラスコ中の200μg/mlアンピシリンを含む0.5×LB液体培地200mlに1白金耳植菌し、30℃で16時間振とう培養して種培養液を得た。DAA生産培地(1.0%グリセリン、1.2%ポリペプトン、2.4%酵母エキス、1.25%リン酸2カリウム、0.23%リン酸1カリウム、0.2mM IPTG、200μg/mlアンピシリン、pH7.4)6リットルを10リットル容ジャーファーメンター中に調製したのち種培養液を投入し、通気量2L/分、攪拌数480rpm、培養温度37.5℃で18時間通気攪拌培養した。培養終了時に測定した菌体濁度(660nm吸光度)は15.3であった。
(1)で得られた培養液を500ml容遠心チューブに分注し、日立製作所製高速遠心機を用いて回転数8000rpmで10分遠心し、デカントにより上清を除いて培養菌体を得た(得られた培養菌体は、以降、「培養菌体I」とも称す。)。この培養菌体の一部をとり、酢酸亜鉛二水和物を溶解した50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)もしくは亜鉛を含有しない50mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)に添加して、菌体濁度18となるよう懸濁し、再懸濁液を得た。酢酸亜鉛二水和物を溶解した50mMトリス−塩酸緩衝液は、亜鉛の終濃度が0.001mM、0.001mM、及び0.1mMとなるよう、調製した。
(1)DAA粗抽出液からの精製及び粉末化
実施例1で得られた培養菌体Iを二分し、一方は20mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)(A)に懸濁して懸濁液(2−A)を調製し、他方は酢酸亜鉛0.01mMを含有する20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)(B)に懸濁して懸濁液(2−B)を調製した。
精製DAA溶液への亜鉛添加による再活性化
実施例2において、菌体破砕工程のみ亜鉛を添加した緩衝液を用いて得られた精製DAA溶液900μlを1.5ml容エッペンドルフチューブに入れ、これに種々の濃度の酢酸亜鉛水溶液100μlもしくは蒸留水100μlを加えて、サンプルを作成した。これらサンプルを25℃恒温槽中で3時間インキュベートし、DAA活性を測定した。結果を表5に示す。
精製DAA溶液への亜鉛添加による安定化
実施例2において、菌体破砕工程のみ亜鉛を添加した緩衝液を用いて得られた精製DAA溶液900μlを、1.5ml容エッペンドルフチューブに入れ、これに種々の濃度の酢酸亜鉛水溶液100μlもしくは対照として蒸留水100μlを加えてサンプルとした。これらサンプルを40℃で1時間加温処理し、加温前と加温後のDAA活性の変動を調べた。また、加温処理前の活性に対する加温処理後の活性を活性残存率として表した。結果を表6に示す。
Claims (9)
- D−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はD−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛を添加することを特徴とするD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- D−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はD−アミノアシラーゼ含有溶液に亜鉛の終濃度が約0.001〜約1mMとなるように亜鉛を添加する請求項1に記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- 工程液が緩衝液である請求項1又は2に記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- D-アミノアシラーゼの処理工程が、D−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物が産生するD-アミノアシラーゼの処理工程である、請求項1〜3のいずれかに記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- D−アミノアシラーゼの処理工程が、D−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物が産生するD-アミノアシラーゼの回収、精製もしくは粉末化工程である、請求項4に記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- D−アミノアシラーゼ生産能を有する微生物がD−アミノアシラーゼ生産能を有する形質転換微生物である請求項4又は5記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- D−アミノアシラーゼがデフルビバクター・ルサチエンシス(Defluvibacter lusatiensis)由来である請求項1〜6のいずれかに記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- 活性向上方法が活性化方法であって、D−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はD−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の終濃度が約0.001〜約0.1mMとなるように亜鉛を添加する請求項1に記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
- 活性向上方法が安定化方法であって、D−アミノアシラーゼの処理工程に用いる工程液又はD−アミノアシラーゼ含有溶液に、亜鉛の終濃度が約0.01〜約1mMとなるように亜鉛を添加する請求項1に記載のD−アミノアシラーゼの活性向上方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010050516A1 (ja) | 2008-10-29 | 2010-05-06 | 株式会社カネカ | L-アミノ酸の製造方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62163689A (ja) * | 1986-01-13 | 1987-07-20 | Nagase Seikagaku Kogyo Kk | アミノアシラ−ゼ溶液の安定化法 |
WO2000078926A1 (fr) * | 1999-06-17 | 2000-12-28 | Amano Enzyme Inc. | Micro-organisme transforme et procede de production de d-aminoacylase |
WO2004055179A1 (ja) * | 2002-12-18 | 2004-07-01 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | D−アミノアシラーゼ |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62163689A (ja) * | 1986-01-13 | 1987-07-20 | Nagase Seikagaku Kogyo Kk | アミノアシラ−ゼ溶液の安定化法 |
WO2000078926A1 (fr) * | 1999-06-17 | 2000-12-28 | Amano Enzyme Inc. | Micro-organisme transforme et procede de production de d-aminoacylase |
JP2001000185A (ja) * | 1999-06-17 | 2001-01-09 | Amano Enzyme Inc | 形質転換微生物、d−アミノアシラーゼの製造方法 |
WO2004055179A1 (ja) * | 2002-12-18 | 2004-07-01 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | D−アミノアシラーゼ |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2010050516A1 (ja) | 2008-10-29 | 2010-05-06 | 株式会社カネカ | L-アミノ酸の製造方法 |
US9464306B2 (en) | 2008-10-29 | 2016-10-11 | Kaneka Corporation | Method for producing L-amino acid |
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