JP4639235B2 - Ｌ−カルニチン生合成関連遺伝子を含む腸内細菌属微生物、およびその微生物を用いたｌ−カルニチンの産生方法 - Google Patents

Description

技術分野
アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ）由来Ｌ−カルニチン生合成関連遺伝子を含む腸内細菌科に属する微生物、およびその微生物を用いたＬ−カルニチンの産生方法に関する。

背景技術
Ｌ−カルニチン（３−ヒドロキシ−４−トリメチルアミノブチレート）は、生物体内に一般的に存在し、活性化された長鎖脂肪酸をミトコンドリア内膜を横切ってミトコンドリアマトリックスに伝達する化合物であり、両性イオン化合物である。Ｌ−カルニチンは、リシンまたは蛋白質中のリシン（以下、蛋白質リシンという）から生合成されることが公知である。哺乳動物では、一般的に蛋白質リシンがＬ−カルニチン生合成の前駆体として使われるが、アカパンカビは、L-カルチニンの前駆体として遊離リシンを使用する。Ｌ−カルニチン生合成で、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−β−ヒドロキシリシン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒド、およびγ−ブチロベタインが中間体として形成される。γ−ブチロベタインは、γ−ブチロベタイン水酸化酵素によって水酸化され、Ｌ−カルニチンとなる。図１は、アカパンカビでのＬ−カルニチンの推定生合成経路を表す図面である。

Ｌ−カルニチンは、化学合成法、酵素反応による半合成法、および微生物法によって産生されうる。しかし、化学合成法による場合、不可避的に、ＤＬ−カルニチンのラセミ混合物が得られるために、それらを分離する必要がある。酵素反応による半合成法として、例えば、米国特許第４，２２１，８６９号（特許文献１）には、カルニチンデヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１．１．１０８）および助酵素ＮＡＤを使用してデヒドロカルニチンからＬ−カルニチンを産生する方法が開示されている。しかし、デヒドロカルニチンは、非常に不安定であり、アセトニルトリメチルアンモニウムと二酸化炭素とに自発的に分解される。また、ドイツ特許第ＤＥ−ＯＳ−３１２３９７５号（特許文献２）には、アカパンカビから単離したγ−ブチロベタイン水酸化酵素（ＥＣ １．１４．１１．１）でもってγ−ブチロベタインからＬ−カルニチンを産生する方法が開示されている。しかし、水酸化反応の間にα−ケトグルタラートおよび還元剤（すなわち、アスコルベート）が反応物中に添加されねばならないという短所がある。

微生物法によるＬ−カルチニンの産生に関して、米国特許第５，０２８，５３８号（特許文献３）には、クロトノベタイン（４−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアミノクロトン酸）を含有する培地で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０４４ Ｋ ７４をインキュベートする段階、および培養物からＬ−カルニチンを回収する段階を含む方法が開示されている。米国特許第４，７０８，９３６号（特許文献４）には、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ ｘｙｌｏｓｏｘｙｄａｎｓ）ＤＳＭ ３２２５（ＨＫ １３３１ｂ）をクロトノベタインおよび／またはγ−ブチロベタインを含む培地でインキュベートすることにより、Ｌ−カルニチンを産生する方法が開示されている。しかし、それらの方法によれば、クロトノベタインのようなＬ−カルニチン生合成の前駆体または中間体でない化合物を使用せねばならず、Ｌ−カルニチンの収率も高くない。従って、微生物法は、Ｌ−カルチニンの収率を改善させる必要がある。

これより、本発明者らは、廉価の前駆体を使用し、高収率でＬ−カルニチンを産生する微生物を探索していたところ、アカパンカビ由来のＬ−カルニチン生合成関連遺伝子が腸内細菌科に属する微生物で十分発現されるということを見い出し、本発明を完成するに至った。

米国特許第４，２２１，８６９号 ドイツ特許第ＤＥ−ＯＳ−３１２３９７５号 米国特許第５，０２８，５３８号 米国特許第４，７０８，９３６号

発明の詳細な説明
発明の技術的目標
本発明は、高収率でＬ−カルニチンを産生する微生物を提供する。

本発明は、前記微生物を用いてＬ−カルニチンを産生する方法もまた提供する。

発明の開示
本発明のある局面により、アカパンカビに由来するＮ−トリメチルリシン水酸化酵素（ＴＭＬＨ）活性をコードするポリヌクレオチド、アカパンカビに由来する３−ヒドロキシ−６−Ｎ−トリメチルリシンアルドラーゼ（ＳＨＭＴ）活性をコードするポリヌクレオチド、アカパンカビに由来するγ−トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＴＭＡＢＡＤＨ）活性をコードするポリヌクレオチド、およびアカパンカビに由来するγ−ブチロベタイン水酸化酵素（ＢＢＨ）活性をコードするポリヌクレオチドを含む腸内細菌科に属する微生物が提供される。

本発明の微生物は、前記四種それぞれの蛋白質をコードする四種のポリヌクレオチドを含むものであれば、限定されない。好ましくは、前記微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）であり、さらに好ましくは、大腸菌ＫＣＣＭ−１０５８１である。

四種の蛋白質、すなわちＴＭＬＨ、ＳＨＭＴ、ＴＭＡＢＡＤＨおよびＢＢＨをそれぞれコードする四種のポリヌクレオチドは、ベクターを介し、または単独で微生物細胞に導入されうる。前記四種の蛋白質をそれぞれコードする四種のポリヌクレオチドがベクターを介して微生物細胞に導入される場合、前記四種のポリヌクレオチドは単一のベクター、または二つもしくはそれ以上のベクターに含まれうる。本明細書において、「ベクター」という用語は、当技術分野に周知の意味を有し、一般的に、核酸を細胞内に導入するのに使われる核酸の構造体を指す。かかる核酸の構造体は、好ましくは、プラスミドまたはウイルスゲノム由来の核酸構造体である。

本発明で、アカパンカビに由来するＴＭＬＨ活性をコードするポリヌクレオチドは、アカパンカビ由来のＴＭＬＨをコードする。ＴＭＬＨは、アカパンカビ細胞でε−Ｎ−トリメチルリシンをβ−ヒドロキシ−ε−Ｎ−トリメチルリシンに転換する反応を触媒することが公知であるが、本発明はＴＭＬＨのかかる特定の作用メカニズムに限定されない。ＴＭＬＨをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、配列番号：１７のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

アカパンカビに由来するＳＨＭＴ活性をコードするポリヌクレオチドは、アカパンカビ由来のＳＨＭＴをコードする。ＳＨＭＴは、アカパンカビ細胞でβ−ヒドロキシ−ε−Ｎ−トリメチルリシンをγ−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒドに転換する反応を触媒することが公知であるが、本発明はＳＨＭＴのかかる特定の作用メカニズムに限定されない。ＳＨＭＴをコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１４のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、配列番号：１８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

アカパンカビに由来するＴＭＡＢＡＤＨ活性をコードするポリヌクレオチドは、アカパンカビ由来のＴＭＡＢＡＤＨをコードする。ＴＭＡＢＡＤＨ活性は、アカパンカビ細胞でγ−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒドをγ−ブチロベタインに転換する反応を触媒することが公知であるが、本発明はＴＭＡＢＡＤＨのかかる特定の作用メカニズムに限定されない。ＴＭＡＢＡＤＨ活性をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１５のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、配列番号：１９のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

アカパンカビに由来するＢＢＨ活性をコードするポリヌクレオチドは、アカパンカビ由来のＢＢＨをコードする。ＢＢＨは、アカパンカビ細胞でγ−ブチロベタインをＬ−カルニチンに転換する反応を触媒することが公知であるが、本発明はＢＢＨのかかる特定の作用メカニズムに限定されない。ＢＢＨ活性をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、配列番号：１６のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに好ましくは、配列番号：２０のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

本発明のもう一つの局面によると、本発明の微生物をε−Ｎ−トリメチルリシン、β−ヒドロキシ−Ｎ−トリメチルリシン、γ−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ−ブチロベタイン、およびそれらの混合物からなる群より選択される基質の存在下で培養し、Ｌ−カルニチンを培養物中に産生する段階を含む、Ｌ−カルニチンの産生方法が提供される。

本発明のＬ−カルニチンの産生方法において、本発明の微生物は、前記の通りである。

本発明のＬ−カルニチンの産生方法において、ε−Ｎ−トリメチルリシン、β−ヒドロキシ−Ｎ−トリメチルリシン、γ−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ−ブチロベタイン、およびそれらの混合物からなる群より選択される基質の濃度は、特に制限されるものではないが、好ましくは、培養培地の重量に基づき、０．１〜１０重量％の範囲である。

本発明のＬ−カルチニン産生方法において、培養物中のＬ−カルニチンは、分離および精製によって回収されうる。分離および精製は、当技術分野に周知である。非限定的な例として、Ｌ−カルチニンの回収は、限外濾過、遠心分離およびデカンテーションにより細胞培養物から上澄み液を分離して、陽イオン交換クロマトグラフィ、または電気透析後に再結晶によってなされうる。

発明の効果
本発明による腸内細菌科に属する微生物は、Ｌ−カルニチン生産能にすぐれ、発酵によるＬ−カルニチンを産生に有効に使用されうる。

本発明によるＬ−カルニチンの産生方法によれば、微生物を用いてＬ−カルニチンを高収率で産生できる。

発明を実施するための最良の形態
以降、本発明を以下の実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それらの実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。

実施例
以下の実施例では、アカパンカビからＬ−カルニチンの生合成に関連する四種の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを選択し、それらを含む核酸構造体を構築した。次に、それらの構造体を大腸菌に形質転換し、それから得られる形質転換された大腸菌株をＬ−カルニチン生合成の中間体を含む培地で培養し、Ｌ−カルニチンを産生して回収した。

実施例１：アカパンカビからのＮ−トリメチルリシン水酸化酵素（ＴＭＬＨ）、３−ヒドロキシ−６−Ｎ−トリメチルリシンアルドラーゼ（ＳＨＭＴ）、γ−トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＴＭＡＢＡＤＨ）、およびγ−ブチロベタイン水酸化酵素（ＢＢＨ）をコードするポリヌクレオチドの分離
本実施例では、アカパンカビからＴＭＬＨ、ＳＨＭＴ、ＴＭＡＢＡＤＨ、およびＢＢＨをコードする四種のポリヌクレオチドを分離し、クローニングしたポリヌクレオチドの配列を分析した。

（１）アカパンカビのｃＤＮＡライブラリーの調製
アカパンカビ菌体（胞子体を含む）を含む培養物から総ｍＲＮＡを分離し、ポリＴプライマーを利用して逆転写反応を行った。ＰＣＲ反応を行い、得られたｃＤＮＡを増幅した。増幅されたｃＤＮＡは、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化した後、λＡＤ５クローニングベクターのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ部位に挿入し、アカパンカビ由来ｃＤＮＡライブラリーを調製した。

次に、前記ｃＤＮＡライブラリーを大腸菌ＢＮＮ３２２に形質転換させた後で形質転換した大腸菌ＢＮＮ３２２を培養して増幅した。まず、大腸菌ＢＮＮ３２２をカナマイシン５０μｇ／ｍｌと０．２％ブドウ糖とを含むＬＢ培地で一晩培養した。その結果として得られた培養物を遠心分離した後、上澄み液を除去して細胞ペレットを１ｍｌの１０ｍＭ ＭｇＳＯ_４に再懸濁した。得られた懸濁液と５×１０^７ＰＦＵの前記λｃＤＮＡライブラリーとを３０℃で３０分間振盪なしに培養した。前記培養物に２ｍｌのＬＢ培地をさらに添加し、３０℃で１時間振盪培養した。培養された細胞をアンピシリン（７５μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地プレートに塗抹し、３７℃で８時間培養した。前記プレートのコロニーからＷｉｚａｒｄキットを使用してｃＤＮＡライブラリープールを精製した。このように精製されたｃＤＮＡライブラリープールを含むλファージをＴＭＬＨ、ＳＨＭＴ、ＴＭＡＢＡＤＨ、およびＢＢＨをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのテンプレートとして使用した。

（２）ＴＭＬＨをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＢ遺伝子）の増幅およびクローニング、ならびにＴＭＬＨ産生の検出
（ａ）ＴＭＬＨをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＢ遺伝子）の増幅およびクローニング
（１）のｃＤＮＡライブラリープールを含むλファージをテンプレートとし、配列番号：１と２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。その結果として得られるＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．４ｋｂの所望の産物を確認した。配列番号：１と２のプライマーは、アカパンカビ由来ＴＭＬＨの開始コドンと終止コドンとをコードすると推定される配列を含んでいた。公知のヒトおよびラット由来ＴＭＬＨのアミノ酸配列をアカパンカビゲノムから発現する全体蛋白質のアミノ酸配列と相同性検索を介し、アカパンカビ由来ＴＭＬＨを推定し、配列番号：１と２のプライマーは推定アカパンカビ由来ＴＭＬＨに基づき設計されたものである。

前記ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで消化し、同じ制限酵素で処理されたｐＢＳ ＫＳ^＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に連結した。ＰＣＲ産物をｐＢＳ ＫＳ^＋に挿入することにより得られるｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＢで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。形質転換された大腸菌ＤＨ５αを３７℃で８時間培養した。ｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＢを形質転換された大腸菌ＤＨ５αから分離してＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで処理し、ＰＣＲ産物が大腸菌ＤＨ５αに適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記分離されたｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＢをＮｄｅＩとＳａｌＩとで処理した後、アガロースゲルで電気泳動して、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を同じ制限酵素で処理された発現ベクターｐＴ７−７に連結してｐＴ７−７ｃａｒＢを得た（図２参照）。前記ｐＴ７−７ｃａｒＢで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。

（ｂ）ＴＭＬＨ産生の検出
ｐＴ７−７ｃａｒＢで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）が添加されたＬＢ培地５０ｍｌが充填された２５０ｍｌバッフルフラスコで、ＯＤ_６００値が０．６になるまで３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加した後で４時間さらに培養した。細胞培養物からｐＴ７−７ｃａｒＢを分離し、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで処理して制限断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分離した。その結果を図６に表した。図６に図示されているように、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片に対応するバンドを確認することができた（レーン２）。ｐＴ７−７ｃａｒＢのｃａｒＢのヌクレオチド配列を分析した結果、ｐＴ７−７ｃａｒＢのｃａｒＢのヌクレオチド配列は国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＮＣＢＩ）のアカパンカビゲノムデータベースに見出される配列と同一であった（配列番号：１７）。

ｐＴ７−７ｃａｒＢで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現されたＴＭＬＨの活性を調べた。まず、大腸菌培養物を４，０００×ｇで１５分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｇ／ｌグリセロール、および１ｍＭ ＤＴＴ）で処理して再懸濁した。前記細胞懸濁物をアイスバスに浸漬し、超音波粉碎器を利用して１０秒ずつ５回超音波処理して細胞を破砕した。細胞可溶化物を４℃で１０，０００ｇで２０〜３０分間遠心分離した。細胞破片を除去して上澄み液を回収し、細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取し、８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図７参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、ＴＭＬＨに該当する約５２ＫＤａのバンドを確認することができた。

（３）ＳＨＭＴをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＣ遺伝子）の増幅およびクローニング、ならびにＳＨＭＴ産生の検出
（ａ）ＳＨＭＴをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＣ）の増幅およびクローニング
（１）のｃＤＮＡライブラリープールを含むλファージをテンプレートとし、配列番号：３と４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．４ｋｂの所望の産物を確認した。配列番号：３と４のプライマーは、アカパンカビ由来ＳＨＭＴの開始コドンと終止コドンとをコードすると推定される配列を含んでいた。公知のヒトおよびラット由来ＳＨＭＴのアミノ酸配列をアカパンカビゲノムから発現する全体蛋白質のアミノ酸配列と相同性検索を介し、アカパンカビ由来ＳＨＭＴを推定して、配列番号：３と４のプライマーは推定アカパンカビ由来ＳＨＭＴに基づき設計された。

ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで消化し、同じ制限酵素で処理されたｐＢＳ ＫＳ^＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に連結した。ＰＣＲ産物をｐＢＳ ＫＳ^＋に挿入することにより得られるｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＣで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌ＤＨ５αを３７℃で８時間培養し、ｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＣを形質転換された大腸菌ＤＨ５αから分離してＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで処理し、ＰＣＲ産物が大腸菌ＤＨ５αに適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記分離されたｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＣをＮｄｅＩとＳａｌＩとで処理し、アガロースゲルで電気泳動して、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を同じ制限酵素で処理された発現ベクターｐＴ７−７に連結し、ｐＴ７−７ｃａｒＣを得た（図３参照）。前記ｐＴ７−７ｃａｒＣで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。

（ｂ）ＳＨＭＴ産生の検出
ｐＴ７−７ｃａｒＣで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の添加されたＬＢ培地５０ｍｌの充填された２５０ｍｌバッフルフラスコでＯＤ_６００値が０．６になるまで３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加した後で４時間さらに培養した。細胞培養物からｐＴ７−７ｃａｒＣを分離してＮｄｅＩおよびＳａｌＩで処理し、制限断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分離した。その結果を図６に表した。図６に図示されているように、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片に対応するバンドを確認することができた（レーン３）。ｐＴ７−７ｃａｒＣのｃａｒＣのヌクレオチド配列を分析した結果、ｐＴ７−７ｃａｒＢのｃａｒＢのヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアカパンカビゲノムデータベースに保存されている配列と同一であった（配列番号：１８）。

ｐＴ７−７ｃａｒＣで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現されたＳＨＭＴの活性を調べた。まず、形質転換された大腸菌培養物を４，０００×ｇで１５分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｇ／ｌグリセロール、および１ｍＭ ＤＴＴ）で処理して再懸濁した。前記細胞懸濁物をアイスバスに浸漬し、超音波粉碎器を利用して１０秒ずつ５回超音波処理して細胞を破砕した。細胞可溶化物を４℃で１０，０００ｇで２０〜３０分間遠心分離した。細胞破片を除去して上澄み液を回収し、細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取して８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図７参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、ＳＨＭＴに該当する約５３ＫＤａのバンドを確認することができた。

（４）ＴＭＡＢＡＤＨをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＤ）の増幅およびクローニング、ならびにＴＭＡＢＡＤＨ産生の検出
（ａ）ＴＭＡＢＡＤＨをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＤ）の増幅およびクローニング
（１）のｃＤＮＡライブラリープールを含むλファージをテンプレートとし、配列番号：５と６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．５ｋｂの所望の産物を確認した。前記配列番号：５と６のプライマーは、アカパンカビ由来ＴＭＡＢＤＨの開始コドンと終止コドンとをコードすると推定される配列を含んでいた。公知のヒトおよびラット由来ＴＭＡＢＤＨのアミノ酸配列をアカパンカビゲノムから発現する全体蛋白質のアミノ酸配列と相同性検索を介し、アカパンカビ由来ＴＭＡＢＤＨを推定して、配列番号：５と６のプライマーは推定アカパンカビ由来ＴＭＡＢＤＨに基づき設計された。

ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで消化し、同じ制限酵素で処理されたｐＢＳ ＫＳ^＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．）に連結した。ＰＣＲ産物をｐＢＳ ＫＳ^＋に挿入することにより得られるｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＤで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌ＤＨ５αを３７℃で８時間培養し、ｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＤを形質転換された大腸菌ＤＨ５αから分離してＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで処理し、ＰＣＲ産物が大腸菌ＤＨ５αに適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記分離されたｐＢＳ ＫＳ^＋ｃａｒＤをＮｄｅＩとＳａｌＩとで処理し、アガロースゲルで電気泳動して、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を同じ制限酵素で処理された発現ベクターｐＴ７−７に連結し、ｐＴ７−７ｃａｒＤを得た（図４参照）。前記ｐＴ７−７ｃａｒＤで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。

（ｂ）ＴＭＡＢＡＤＨ産生の検出
ｐＴ７−７ｃａｒＤで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリンの添加されたＬＢ培地５０ｍｌの充填された２５０ｍｌバッフルフラスコでＯＤ_６００値が０．６になるまで３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加した後で４時間さらに培養した。細胞培養物からｐＴ７−７ｃａｒＤを分離し、ＮｄｅＩおよびＳａｌＩで処理して制限断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分離した。その結果を図６に表した。図６に図示されているように、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片に対応するバンドを確認することができた（レーン４）。ｐＴ７−７ｃａｒＤのｃａｒＤのヌクレオチド配列を分析した結果、ｐＴ７−７ｃａｒＤのｃａｒＤのヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアカパンカビゲノムデータベースに保存されている配列と同一であった（配列番号：１９）。

ｐＴ７−７ｃａｒＤで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現されたＴＭＡＢＡＤＨの活性を調べた。まず、形質転換された大腸菌培養物を４，０００×ｇで１５分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｇ／ｌグリセロール、および１ｍＭ ＤＴＴ）で処理して再懸濁した。前記細胞懸濁物をアイスバスに浸漬し、超音波粉砕器を利用して１０秒ずつ５回超音波処理して細胞を破砕した。細胞可溶化物を４℃で１０，０００ｇで２０〜３０分間遠心分離した後、細胞破片を除去して上澄み液を回収し、細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取して８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図７参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、ＴＭＡＢＡＤＨに該当する約５５ＫＤａのバンドを確認することができた。

（５）ＢＢＨをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＥ）の増幅およびクローニング、ならびにＢＢＨ産生の検出
（ａ）ＢＢＨをコードするポリヌクレオチド（ｃａｒＥ）の増幅およびクローニング
（１）のｃＤＮＡライブラリープールを含むλファージをテンプレートとし、配列番号：７と８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．３ｋｂの所望の産物を確認した。前記配列番号：７と８のプライマーは、アカパンカビ由来ＢＢＨの開始コドンと終止コドンとをコードすると推定される配列を含んでいた。公知のヒトおよびラット由来ＢＢＨのアミノ酸配列をアカパンカビゲノムから発現する全体蛋白質のアミノ酸配列と相同性検索を介し、アカパンカビ由来ＢＢＨを推定して、配列番号：７と８のプライマーは推定アカパンカビ由来ＢＢＨに基づき設計された。

ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで消化し、同じ制限酵素で処理されたｐＵＣ１９に連結した。ＰＣＲ産物をｐＵＣ１９に挿入することにより得られるｐＵＣ１９ｃａｒＥで大腸菌ＤＨ５αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌ＤＨ５αをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の添加されたＬＢ培地で３７℃で８時間培養し、形質転換された大腸菌ＤＨ５αからｐＵＣ１９ｃａｒＥを分離してＥｃｏＲＩとＳａｌＩとで処理し、ＰＣＲ産物が大腸菌ＤＨ５αに適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記分離されたｐＵＣ１９ｃａｒＥをＮｄｅＩとＳａｌＩとで処理し、アガロースゲルで電気泳動して、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を得た。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片を同じ制限酵素で処理された発現ベクターｐＴ７−７に連結し、ｐＴ７−７ｃａｒＥを得た（図５参照）。前記ｐＴ７−７ｃａｒＥで大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。

ｐＴ７−７ｃａｒＥで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の添加されたＬＢ培地５０ｍｌの充填された２５０ｍｌバッフルフラスコでＯＤ_６００値が０．６になるまで３７℃で培養した後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加した後で４時間さらに培養した。細胞培養物からｐＴ７−７ｃａｒＥを分離してＮｄｅＩおよびＳａｌＩで処理し、制限断片をアガロースゲル電気泳動を用いて分離した。その結果を図６に表した。図６に図示されているように、ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ断片に対応するバンドを確認することができた。ｐＴ７−７ｃａｒＥのｃａｒＥのヌクレオチド配列（１，２７８ｂｐ）を分析した結果、ｐＴ７−７ｃａｒＥのｃａｒＥのヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアカパンカビゲノムデータベースに保存されている配列と同一であった（配列番号：２０）。

（ｂ）ＢＢＨ蛋白質産生の検出
ｐＴ７−７ｃａｒＥで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中に発現されたＢＢＨの活性を調べた。まず、形質転換された大腸菌培養物を４，０００×ｇで１５分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを１ｍｌの溶解緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４中の１４０ｍＭ ＮａＣｌ、２００ｇ／ｌグリセロール、および１ｍＭ ＤＴＴ）で処理して再懸濁した。前記細胞懸濁物をアイスバスに浸漬し、超音波粉碎器を利用して１０秒ずつ５回超音波処理して細胞を破砕した。細胞可溶化物を４℃で１０，０００ｇで２０〜３０分間遠心分離した後、細胞破片を除去して上澄み液を回収して細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取して８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った（図７参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った結果、ＢＢＨに該当する約４９ＫＤａのバンドを確認することができた。

実施例２：ｃａｒＢ、ｃａｒＣ、ｃａｒＤおよびｃａｒＥを含有する宿主細胞の構築
本実施例では、実施例１で調製されたアカパンカビｃＤＮＡライブラリーからｃａｒＢ遺伝子とｃａｒＥ遺伝子とを増幅し、それら２つの遺伝子を同時に有するｐＴ７−７ＢＥを構築した。また、実施例１で調製されたアカパンカビｃＤＮＡライブラリーからｃａｒＣ遺伝子とｃａｒＤ遺伝子とを増幅し、それら２つの遺伝子を同時に有するｐＡＣＹＣ１８４ＣＤを構築した。このように構築されたｐＴ７−７ＢＥとｐＡＣＹＣ１８４ＣＤとを大腸菌菌株に導入し、ｃａｒＢ、ｃａｒＣ、ｃａｒＤおよびｃａｒＥの遺伝子いずれもを有する形質転換された細胞を構築した。形質転換された細胞を大腸菌ＤＨ５αＣＪ２００４と命名し、２００４年１月２７日、国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託した（アクセッション番号：ＫＣＣＭ−１０５８１）。

（１）ｃａｒＢ遺伝子とｃａｒＥ遺伝子とを同時に有するｐＴ７−７ＢＥの構築
まず、アカパンカビｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、配列番号：１および２のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてｃａｒＢ遺伝子を増幅した。次に、アカパンカビｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、配列番号：７および８のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＴ７プロモータから終止コドンを含むｃａｒＥを増幅した。ｃａｒＢとｃａｒＥとの増幅産物をｐＴ７−７に導入した。まず、ｃａｒＥ増幅産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩとで処理してＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を得て、これを同じ制限酵素で処理されたｐＴ７−７と連結し、ｐＴ７−７ｃａｒＥを得た。次に、ｃａｒＢ増幅産物をＮｄｅＩとＥｃｏＲＩとで処理してＮｄｅＩ−ＥｃｏＲＩ断片を得て、これを同じ制限酵素で処理されたｐＴ７−７ｃａｒＥと連結し、ｐＴ７−７ＢＥを得た（図８参照）。

（２）ｃａｒＣ遺伝子とｃａｒＤ遺伝子とを同時に有するｐＡＣＹＣ１８４ＣＤの構築
まず、アカパンカビｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、配列番号：３および４のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＴ７プロモータから終止コドンを含むｃａｒＣ遺伝子を増幅した。次に、アカパンカビｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとし、配列番号：５および６のオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＴ７プロモータから終止コドンを含むｃａｒＤ遺伝子を増幅した。ｃａｒＣとｃａｒＤとの増幅産物をｐＡＣＹＣ１８４に導入した。まず、ｃａｒＣ増幅産物をＢａｍＨＩとＨＩｎｄＩＩＩとで処理してＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を得て、これを同じ制限酵素で処理されたｐＡＣＹＣ１８４と連結し、ｐＡＣＹＣ１８４ｃａｒＣを得た。次に、ｃａｒＤ増幅産物をＢａｍＨＩとＳａｌＩとで処理してＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ断片を得て、これを同じ制限酵素で処理されたｐＡＣＹＣ１８４ｃａｒＣと連結し、ｐＡＣＹＣ１８４ＣＤを得た（図９参照）。

実施例３：ＴＭＬＨ、ＳＨＭＴ、ＴＭＡＢＡＤＨおよびＢＢＨをコードするポリヌクレオチドを含む菌株を利用したＬ−カルニチンの産生
本実施例では、実施例１で構築されたｐＴ７−７ｃａｒＢ、ｐＴ７−７ｃａｒＣ、ｐＴ７−７ｃａｒＤ、およびｐＴ７−７ｃａｒＥでそれぞれ形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をトリメチルリシンを含む培地で混合培養し、Ｌ−カルニチン生産量を測定した。また、実施例２で構築されたｐＴ７−７ＢＥとｐＡＣＹＣ１８４ＣＤで同時に形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を培養し、Ｌ−カルニチン生産量を測定した。

（１）ｐＴ７−７ｃａｒＢ、ｐＴ７−７ｃａｒＣ、ｐＴ７−７ｃａｒＤ、およびｐＴ７−７ｃａｒＥでそれぞれ形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株の混合培養
まず、ｐＴ７−７ｃａｒＢ、ｐＴ７−７ｃａｒＣ、ｐＴ７−７ｃａｒＤ、およびｐＴ７−７ｃａｒＥでそれぞれ形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の添加されたＬＢ固体平板培地に塗抹して培養した。各菌株のコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の添加された２０ｍｌのＬＢ培地を含むフラスコで３７℃で１２時間、ＯＤ_６００が１．０になるまで培養した。これらの培養物を同量（０．１ｍｌずつ）で２ｍＭのトリメチルリシンを含むアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）の添加されたＬＢ培地２０ｍｌを含んでいる２５０ｍｌバッフルフラスコに添加し、３７℃でＯＤ_６００値が０．６になるまで培養した。ＩＰＴＧを添加する場合は、ＯＤ_６００値が０．６になった後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して４時間さらに培養した。対照としてトリメチルリシンの添加されていないＬＢ培地を使用し、同じ方法でＩＰＴＧを添加して培養した。

培養後、細胞培養物中のＬ−カルニチンの含有量を測定した。５００μｌの培養上澄み液を取り、１．２Ｍの過塩素酸５００μｌと混合した。混合溶液を室温で１０分間インキュベートした後、５分間遠心分離した。上澄み液６００μｌと０．７ＭのＫ_３ＰＯ_４ ３２０μｌとを混合し、アイスバスで２０分間放置した。混合液を５分間遠心分離し、７５０μｌの上澄み液だけを取って２５０μｌの滅菌蒸溜水と混合して希釈した。この希釈溶液に１００μｌのＤＮＴＢ／Ｈ_２Ｏ_２を入れて１０分間インキュベートした。５０μｌのカタラーゼ溶液を入れて３０分間室温でインキュベートした後、遠心分離して上澄み液１ｍｌを回収した。ここに、５０μｌのアセチルＣｏＡを入れ、室温で５分間インキュベートした。２．２６μｌのカルニチンアセチル転移酵素を入れ、室温で１０分間インキュベートした。最終溶液の４０５ｎｍでの吸光度を測定し、Ｌ−カルニチンの量を計算した。その結果を下記表１に表した。

（表１）混合培養によるＬ−カルニチンの生産量

表１に示されているように、ＴＭＬＨ、ＳＨＭＴ、ＴＭＡＢＡＤＨおよびＢＢＨをコードするポリヌクレオチドをそれぞれ含む菌株をトリメチルリシンを含む培地で混合培養することにより、Ｌ−カルニチンを高収率で産生できる。

（２）実施例２で構築されたｐＴ７−７ＢＥとｐＡＣＹＣ１８４ＣＤで同時に形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の培養を介したＬ−カルニチンの産生
まず、ｐＴ７−７ＢＥとｐＡＣＹＣ１８４ＣＤでそれぞれ形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）培養物をアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）とが添加されたＬＢ固体平板培地に塗抹して培養した。それぞれの培養物のコロニーをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）とクロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）とがそれぞれ添加された２０ｍｌのＬＢ培地を含むフラスコで３７℃で１２時間、ＯＤ_６００が１．０になるまで培養した。細胞培養物を同量（０．１ｍｌずつ）で２ｍＭのトリメチルリシンを含むＬＢ培地２０ｍｌを含んでいる２５０ｍｌバッフルフラスコに添加し、３７℃でＯＤ_６００値が０．６になるまで培養した。ＩＰＴＧを添加する場合は、ＯＤ_６００値が０．６になった後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して４時間さらに培養した。対照としてトリメチルリシンの添加されていないＬＢ培地を使用し、同じ方法でＩＰＴＧを添加して培養した。

培養後、細胞培養物中のＬ−カルニチンの含有量を前記（１）と同じ方法で測定した。その結果を下記表２に表した。

（表２）単一培養によるＬ−カルニチンの生産量

表２に示されているように、ＴＭＬＨ、ＳＨＭＴ、ＴＭＡＢＡＤＨおよびＢＢＨをコードするポリヌクレオチドを同時に含む菌株をトリメチルリシンを含む培地で培養することにより、Ｌ−カルニチンを高収率で生産できる。表１と表２に表した結果を比較すると、混合培養によるより単一培養による場合の方がＬ−カルニチンの収率が高いということが分かった。

アカパンカビで推定されるＬ−カルニチンの生合成経路を表す図面である。 ｐＴ７−７ｃａｒＢの構築を示す図である。 ｐＴ７−７ｃａｒＣの構築を示す図である。 ｐＴ７−７ｃａｒＤの構築を示す図である。 ｐＴ７−７ｃａｒＥの構築を示す図である。 ｐＴ７−７ｃａｒＢ、ｐＴ７−７ｃａｒＣ、ｐＴ７−７ｃａｒＤ、およびｐＴ７−７ｃａｒＥ中にそれぞれ挿入されている遺伝子の電気泳動図である（レーン１：マーカ、レーン２：ｃａｒＤ、レーン３：ｃａｒＣ、レーン４：ｃａｒＤ、およびレーン５：ｃａｒＥ）。 ｐＴ７−７ｃａｒＢ、ｐＴ７−７ｃａｒＣ、ｐＴ７−７ｃａｒＤ、およびｐＴ７−７ｃａｒＥでそれぞれ形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から得られた粗抽出物についての、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である（Ｍ：マーカ、レーン１：陰性対照群、レーン２：ＴＭＬＨ（５２ＫＤａ）、レーン３：ＳＨＭＴ（５３ＫＤａ）、レーン４：ＴＭＡＢＡＤＨ（５５ＫＤａ）、およびレーン５：ＢＢＨ（４９ＫＤａ））。 ｐＴ７−７ＢＥの構築を示す図である。 ｐＡＣＹＣ１８４ＣＤの構築を示す図である。

Claims (5)

1. 配列番号：１３に示されるアミノ酸配列を含む、Ｎ−トリメチルリシン水酸化酵素をコードするポリヌクレオチド；
   配列番号：１４に示されるアミノ酸配列を含む、３−ヒドロキシ−６−Ｎ−トリメチルリシンアルドラーゼをコードするポリヌクレオチド；
   配列番号：１５に示されるアミノ酸配列を含む、γ−トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチド；および
   配列番号：１６に示されるアミノ酸配列を含む、γ−ブチロベタイン水酸化酵素をコードするポリヌクレオチドを含む、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する微生物。
2. 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）である、請求項１記載の微生物。
3. 大腸菌ＫＣＣＭ−１０５８１である、請求項１記載の微生物。
4. 請求項１から請求項３のうちいずれか１項記載の微生物を、ε−Ｎ−トリメチルリシン、β−ヒドロキシ−Ｎ−トリメチルリシン、γ−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ−ブチロベタイン、およびそれらの混合物からなる群より選択される基質の存在下で培養し、Ｌ−カルニチンを培養物中に産生する段階を含む、Ｌ−カルニチンの産生方法。
5. ε−Ｎ−トリメチルリシン、β−ヒドロキシ−Ｎ−トリメチルリシン、γ−Ｎ−トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ−ブチロベタイン、およびそれらの混合物からなる群より選択される基質の濃度は、培養培地の重量に基づき、０．１〜１０重量％の範囲である、請求項４記載の方法。

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