JP4847456B2 - 新規な酵素及びその製造方法並びに該酵素を用いるモノアセチルポリアミンの製造方法 - Google Patents
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Description
ポリアミンデヒドロゲナーゼとしては、例えばシュードモナス属(特許文献6参照、非特許文献21参照)、シトロバクター属(非特許文献21参照)及びセラチア属(非特許文献22参照)の細菌由来等が知られているが、ジアセチルポリアミンに対する活性は示されていない。
また、キャンディダ属由来、アルカリゲネス属由来の酵素の最適な基質はジアミノアルカン類(プトレッシン、カダベリン等)のジアセチル体である。N1,N8−ジアセチルスペルミジンを基質とすると、生成物としてN1−モノアセチルスペルミジンが得られるが、その活性はジアセチルプトレッシンの5〜10%程度にすぎなかった(特許文献7参照)。
(1)ジアセチルポリアミンの2級アミンのC−N結合を開裂して、モノアセチルポリアミンとアルデヒドを生成する反応を触媒する酵素であり、N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン及びN8−アセチルスペルミジンに対する活性よりもジアセチルポリアミンに対する活性が高い、という基質特異性を有する新規酵素。
(2)ジアセチルポリアミンが、N1,N12−ジアセチルスペルミンであることを特徴とする、上記(1)に記載の酵素。
(3)酵素反応の生成物が、N1−アセチルスペルミジンと3−アセトアミドプロパナールであることを特徴とする、上記(1)若しくは(2)のいずれかに記載の酵素。
(4)酵素がジアセチルポリアミンオキシダーゼであることを特徴とする、上記(1)〜(3)のいずれかに記載の酵素。
(5)下記(a)〜(g)の理化学的性質を有する新規酵素:
(a)作用:酸素存在下にてN1,N12−ジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する;
(b)基質特異性:N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン及びN8−アセチルスペルミジンに対する活性よりもN1,N12−ジアセチルポリアミンに対する活性が高い;
(c)至適pH:6.5〜8.5;
(d)安定pH:5.5〜9.5;
(e)至適温度:37〜55℃;
(f)熱安定性:37℃以下[200mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて30分間処理した場合、90%以上の残存活性];
及び
(g)分子量:約90,000から92,000(ゲルろ過法)。
(6)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の酵素の生産能を有する微生物、細胞、又はそれらの培養物から該酵素を回収することを特徴とする、新規酵素の製造方法。
(7)微生物、細胞が酵母である、上記(6)に記載の酵素の製造方法。
(8)酵母がデバリオミセス(Debaryomyces)属、キャンディダ(Candida)属、若しくはピキア(Pichia)属の酵母からなる群から選ばれた1又は2以上の酵母である、上記(7)に記載の酵素の製造方法。
(9)酵母がデバリオミセス マラマ (Debaryomyces marama)、デバリオミセス マラムス (Debaryomyces maramus)、デバリオミセス ハンセニイ (Debaryomyces hansenii)、キャンディダ グラブラタ (Candida glabrata)、若しくはピキア ミヌタ (Pichia minuta)からなる群から選ばれた1又は2以上の酵母である上記(8)に記載の酵素の製造方法。
(10)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の酵素活性を有する、以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
(11)上記(1)〜(5)のいずれかに記載の酵素活性を有する、以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質をコードする遺伝子:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
(12)以下の(a)、(b)、(c)又は(d)のDNAからなる遺伝子:
(a)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記(1)〜(5)のいずれかに記載の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(c)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長と80%以上の相同性を示し、かつ上記(1)〜(5)のいずれかに記載の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAにおいて、1から数個のDNAが欠失、置換及び/又は付加され、かつ上記(1)〜(5)のいずれかに記載の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(13)上記(11)又は(12)記載の遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組換え体DNA。
(14)上記(13)記載の組換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
(15)上記(14)記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から上記(1)〜(5)のいずれかに記載の酵素を回収することを特徴とする酵素の製造方法。
(16)ジアセチルポリアミンに(1)〜(5)、若しくは(10)のいずれかに記載の酵素を作用させて、モノアセチルポリアミンを回収することを特徴とする、モノアセチルポリアミンの製造方法。
(17)N1,N12−ジアセチルスペルミンに上記(1)〜(5)、若しくは(10)のいずれかに記載の酵素を作用させて、生成物となるN1−アセチルスペルミジンを回収することを特徴とする、N1−アセチルスペルミジンの製造方法。
ポリアミンとは、同一分子内に2個以上のアミノ基を有する化合物の総称であり、第一級アミノ基を2個有するジアミン類や第一級アミンと第二級アミンを合わせて3個以上有する化合物群とされ、一般式化6のように表される。
(1a)作用:化10に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する。
(1b)基質特異性:ジアセチルスペルミン>N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン,N8−アセチルスペルミジン
例えば、pH7.5の条件下において、ジアセチルスペルミンを基質として用いたときの活性を100としたとき、N1−アセチルスペルミン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が90以下、好ましくは60以下、更に好ましくは50以下、もっとも好ましくは40以下である理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。本評価におけるpHの条件や緩衝液の種類と濃度についてはなんら制限されない。
(1c)至適pH:6.5〜8.5
例えば、緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、温度37℃にて酵素反応を行い、至適pHを求める。例えば、至適pHとしてpH6.5〜8.5、好ましくはpH7.0〜8.0の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(1d)安定pH:6.0〜8.0
例えば、緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、30℃で30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定pHの範囲として、pH6.0〜8.0、好ましくはpH6.5〜7.5の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(1e)至適温度:37〜55℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として37〜55℃の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(1f)熱安定性:37℃以下
例えば、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用い、夫々の温度において30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは90%以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例えば、酵素が安定に存在できる範囲として、37℃以下の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(1g)分子量:約92,000(ゲルろ過法)
分子量はゲルろ過法、Native PAGE法、SDS−PAGE法等を用いて測定することができる。本発明酵素の分子量については特に限定されないが、例えば、分子量の一例として、分子量約92,000(ゲルろ過法)の本発明酵素などが挙げられる。
また、さらに本発明の新規な酵素の一形態として、例えば、以下の(2a)〜(2g)に記載の理化学的性質をそれぞれ若しくはそれらを適宜併せて有するジアセチルスペルミンオキシダーゼ等も本発明酵素として挙げられる。なお、下記の酵素の理化学的性質は、測定上不可避的な誤差を含んでいる。
(2a)作用:化10に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する。
(2b)基質特異性:ジアセチルスペルミン>N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン,N8−アセチルスペルミジン
例えば、pH7.5の条件下において、ジアセチルスペルミンを基質として用いたときの活性を100としたとき、N1−アセチルスペルミン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジンを基質として用いたときの活性が90以下、好ましくは60以下、更に好ましくは50以下である理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。本評価におけるpHの条件や緩衝液の種類と濃度についてはなんら制限されない。
(2c)至適pH:7.0〜8.5
例えば、緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、温度37℃にて酵素反応を行い、至適pHを求める。例えば、至適pHとしてpH7.0〜8.5、好ましくはpH7.5〜8.0の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(2d)安定pH:5.5〜9.5
例えば、緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、30℃で30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。例えば、安定pHの範囲として、pH5.5〜9.5、好ましくはpH6.5〜9.0の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(2e)至適温度:45〜55℃
例えば、後述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行い作用適温の範囲を求める。例えば、作用適温の範囲として45〜55℃の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(2f)熱安定性:37℃以下
例えば、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用い、夫々の温度において30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定する。このとき好ましくは90%以上の活性が残存している場合、その温度において酵素は安定であると言える。例えば、酵素が安定に存在できる範囲として、37℃以下の理化学的性質を有する本発明酵素などが挙げられる。
(2g)分子量:約90,000(ゲルろ過法)
分子量はゲルろ過法、Native PAGE法、SDS−PAGE法等を用いて測定することができる。本発明酵素の分子量については特に限定されないが、例えば、分子量の一例として、分子量約90,000(ゲルろ過法)の本発明酵素などが挙げられる。
0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)0.9ml、7.0mM ジアセチルスペルミン溶液 0.1ml、15mM Toos溶液 0.04ml、150U/mlペルオキシダーゼ(キッコーマン社製)溶液 0.04ml、1.76%(w/v) 4−アミノアンチピリン溶液 0.02mlの混合液を37℃で5分間インキュベートした。0.2%(w/v)のウシ血清アルブミン(BSA,シグマ社製)を含有する50mMリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて適宜希釈した酵素サンプル 0.05mlを反応液に添加、混合した。全容1.15mlを37℃で3分間反応させ、反応開始から3分間の、反応溶液の555nmにおける吸光度の変化を分光光度計を用いて測定した。ジアセチルスペルミンオキシダーゼの酵素1Uは、上記測定条件下において、ジアセチルスペルミンを基質とするときに1分間あたり1μmolの過酸化水素を生成する酵素量とした。なお本条件におけるミリモル分子吸光係数を1.57cm2/μmolとした。なお、本測定方法は一例を示したものであり、活性測定の試薬の種類や濃度、pHについては何ら制限するものではない。例えば、0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)の代わりに0.2M リン酸緩衝液(pH7.5)等を用いることもできる。
なかでも、デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)及びキャンディダ グラブラタ Noda 162 (FERM BP−10602)は、本発明者らが茨城県内及び千葉県内の土壌よりそれぞれ分離して得た菌株であり、2006年5月10日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に基づき寄託され、それぞれ、受託番号FERM BP−10603、及び、FERM BP−10602が付与されている。その菌学的性質は以下に示すとおりである。なお、菌学的性質の同定のための実験、および分類同定の基準として「THE YEASTS. A Taxonomic Study」、第4版(1998年, Edited by C. P. Kurtzman and J. W. Fell)を参考にした。
デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)の菌学的性質
(A)培養的・形態的性質
a)YM液体培地(表面発育の有無、培地の混濁状態):表面発育は見られるが皮膜の形成なし。培地は混濁せず底部に生育。
b)YM寒天培地(生育の様相、色、光沢、拡散性色素):白色で周囲は滑らか。表面は滑らかでつや無し。色素生産無し。
c)ダルモー平板培養法:偽菌糸の形成は見られないが、伸長した細胞の連鎖は見られる。
d)形状(YM寒天培地25℃ 3日間培養):円型(0.6−1.2μm)−楕円形(1.0−1.2×1.2−2.1μm)あるいは連鎖した棍棒状(0.6−1.0×1.5−3.6μm) 図1参照
e)増殖の形式(出芽・分裂の区別):多極出芽
(B)胞子の形成
a)有性胞子:いずれの培地においても観察されない。
b)射出胞子:いずれの培地においても観察されない。
(C)生理学的・化学分類学的性質
a)最適生育条件(pH):5.5
b)最適生育条件(温度):25℃
c)生育の範囲(pH):2.5−11.0
d)生育の範囲(温度):5−30
e)硝酸塩の資化:−
f)脂肪の分解:+
g)尿素の分解:+(Weak)
h)ジアゾニウムブルーBの呈色反応:−
i)ゼラチンの液化:+
j)耐塩性:18%
k)カロチノイドの生成:−
l)顕著な有機酸の生成:+
m)デンプン様物質の生成:−
n)ビタミンの要求性:−
o)資化性と発酵性
a)GC含量(HPLC):32.8
b)ユビキノン:Q−9
c)細胞壁の糖組成:NT
d)近縁菌種とのDNA−DNA相同性:93% vs. デバリオミセス ハンセニイ(JCM1990T)
e)18S rDNA homology:99.8% vs. デバリオミセス ハンセニイ(JCM1990T,GenBank accession no. AB013590)
本菌株は、以上のごとき菌学的性質を有することから、デバリオミセス ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)と同定した。
(A)培養的・形態的性質
a)YM液体培地(表面発育の有無、培地の混濁状態):表面発育は見られない。培地は混濁せず、底部のみに生育。
b)YM寒天培地(生育の様相、色、光沢、拡散性色素):クリーム色で周囲は滑らか。表面は滑らかでつや有り。色素生産無し。
c)ダルモー平板培養法:偽菌糸の形成は見られない。
d)形状(YM寒天培地25℃ 3日間培養):卵型〜楕円形(0.3−1.2×1.0−2.1μm) 図2参照
e)増殖の形式(出芽・分裂の区別):多極出芽
(B)胞子の形成
a)有性胞子:いずれの培地においても観察されない。
b)射出胞子:いずれの培地においても観察されない。
(C)生理学的・化学分類学的性質
a)最適生育条件(pH):6.0
b)最適生育条件(温度):30℃
c)生育の範囲(pH):2.0−11.0
d)生育の範囲(温度):15−44
e)硝酸塩の資化:−
f)脂肪の分解:−
g)尿素の分解:−
h)ジアゾニウムブルーBの呈色反応:−
i)ゼラチンの液化:−
j)耐塩性:14%
k)カロチノイドの生成:−
l)顕著な有機酸の生成:+
m)デンプン様物質の生成:−
n)ビタミンの要求性:+
o)資化性と発酵性
a)GC含量(HPLC):36.0
b)ユビキノン:Q−6
c)細胞壁の糖組成:NT
d)近縁菌種とのDNA−DNA相同性:84% vs. キャンディダ グラブラタ(NRRL Y−65T)
e)18S rDNA homology:100% vs. キャンディダ グラブラタ(NRRL Y−65T,GenBank accession no. AY046237)
本菌株は、以上のごとき菌学的性質を有することから、キャンディダ グラブラタ(Candida glabrata)と同定した。
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含む酵素。
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含む酵素。
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と80%以上の相同性を示すアミノ酸配列を含む酵素。
ここで、「1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加された」とは、例えば1〜20個、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたことを意味する。
また、「80%以上の相同性を示す」とは、配列番号1で表されるアミノ酸配列との相同性が80%以上であれば特に制限がなく、例えば80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上である。
上記本発明酵素として、例えば、デバリオミセス マラマ HUT 7199、デバリオミセス マラムス NBRC 0668、デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)、キャンディダ グラブラタ Noda 162 (FERM BP−10602)、ピキア ミヌタ IAM 12215などの染色体DNA又はcDNA由来の酵素遺伝子をクローニングし、これを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られる酵素なども挙げられる。
次に、本発明酵素をコードする遺伝子(以下、「本発明遺伝子」という)としては、例えば、以下の(d)、(e)又は(f)などが挙げられる。
(d)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA。
(e)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ上記本発明酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(f)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長と80%以上の相同性を示し、かつ上記本発明酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA。
ここで、「ストリンジェントな条件」とは、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザンブロット・ハイブリダイゼーション法等(Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989))を行った際、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、この条件は使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列および長さによって異なる。このような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度および塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出してしまう場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を上げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の温度を下げるとともに、必要に応じて洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。このような条件としては、例えば、後記実施例7の項目(3)において特異的なシグナルが観察できることから、ハイブリダイゼーションは、DIG Easy Hyb試薬(ロシュ・ダイアグノスティクス社製)を用いて37〜42℃で一晩行う。洗いは、0.5×SSC、0.1% SDSを用い、15分間、2回行う。洗いの温度は、45℃以上、好ましくは52℃以上、更に好ましくは57℃以上である。このようなストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAは、DNAの塩基配列と一定以上の相同性を有するDNAなどが挙げられる。本発明における、「塩基配列の全長と80%以上の相同性を示す塩基配列を含むDNA」の相同性は、例えば80%以上、好ましくは90%以上、最も好ましくは95%以上である。
本発明遺伝子として、例えば、デバリオミセス マラマ HUT 7199、デバリオミセス マラムス NBRC 0668、デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)、キャンディダ グラブラタ Noda 162 (FERM BP−10602)、ピキア ミヌタ IAM 12215などの染色体DNA又はcDNA由来の酵素遺伝子やこれを適当なベクター宿主系に導入して、発現させて得られる酵素をコードする遺伝子などが挙げられる。さらに、天然型の酵素タンパクをコードする遺伝子に遺伝子工学的技術や変異処理などの方法により種々の変異を導入した遺伝子も、本発明遺伝子に含まれる。
本発明遺伝子の取得方法としては、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、前述した本発明オキシダーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNA又はmRNAを抽出する。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNA又はcDNAのライブラリーを作製する。ついで、上記本発明酵素のアミノ酸配列に基づき、適当なプローブDNAを合成して、これを用いて染色体DNA又はcDNAのライブラリーからスクリーニングする方法、あるいは、上記アミノ酸配列や取得した遺伝子の部分配列情報に基づき、適当なプライマーDNAを作製して、Degenerate PCR法、Inverse PCR法、5’−RACE法、3’−RACE法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応(PCR法)により、目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させ、これらを連結させて全長の本発明遺伝子を含むDNAを得ることができる。また、上記プローブDNAとのハイブリダイゼーションを用いて、種々の生物から本発明オキシダーゼをコードする本発明遺伝子を得ることもできる。さらに、既知である類似酵素の遺伝子配列やその周辺の配列、アミノ酸の配列の情報を利用して適当な混合塩基プライマーを作製し、PCR法により、目的の遺伝子断片を含むDNAを増幅させることもできる。
上記のようにして得られた本発明遺伝子を、大腸菌ラクトースオペロンやトリプトファンオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むDNA配列(The Operon,p.227, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980を参照)を保有するベクターDNAに挿入し、得られた組み換え体DNAを用いて、例えば、大腸菌等に形質導入して本発明酵素高生産株を得る。
用いられるベクターDNAは、如何なるものでもよく、例えば、プラスミドDNA若しくはバクテリオファージDNA等でもよい。プロモーターの種類についても特に限定はなく、lac(ラクトースオペロン)、trp(トリプトファンオペロン)、tac(lacとtrpオペロンを融合したもの)等、如何なるものを用いてもよい。pBR系、pUC系についても特に限定はされず、具体的には、tacプロモーターを有するpBR系ベクターであるpKK223−3やpUTE120K’、lacプロモーターを有するpBR系ベクターであるpUTE500K’(特開平08−205861号公報記載)、trpプロモーターを有するpBR系ベクターであるpUTE110K’、T7プロモーターを有するpETベクター(宝酒造社製)等を用いることができる。また得られた組み換え体DNAを用いて、大腸菌のほか、適宜、他の細菌、酵母、糸状菌、放線菌などの微生物や動物細胞などを形質転換又はそれらに形質導入して夫々の菌株を得ることができる。好ましくは、大腸菌K−12、さらに好ましくは大腸菌JM109(宝酒造社製)、DH5α(宝酒造社製)、BL21(宝酒造社製)等が用いられる。
さらに上記遺伝子を改変する方法としては、既知の如何なる方法でも用いることができるが、例えば、前記の組換え体DNAに、ハイドロキシルアミン、亜硝酸などの化学変異剤を接触させる方法、またはPCR法を用いてランダムに変換する等の点変異方法、市販のキットを使用する部位特異的な置換または欠失変異を生じさせるための周知技術である部位特異的変異誘導法、この組換え体DNAを選択的に開裂し、次いで選択されたオリゴヌクレオチドを除去又は付加し、連結する方法、すなわちオリゴヌクレオチド変異誘導法等が挙げられる。次いで、上記処理後の組換え体DNAを脱塩カラム、QIAGEN(キアゲン社製)等を用いて精製し、種々の組換え体DNAを得ることができる。
次に、上記組換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から本発明酵素を回収する。一般に、形質転換体又は形質導入体の培養は、用いられた宿主の生育に適した培地を用いて培養される。例えば、宿主として大腸菌を用いた場合、培地の種類や組成は特に限定されないが、LB培地等が好ましく用いられる。酵素生産誘導基質として、適量のイソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)等を適宜添加してもよい。なお、培地の初発pHは、例えば、7〜9に調整するのが適当である。また培養は、例えば、10〜42℃、好ましくは15〜37℃前後で6〜120時間、通気撹拌深部培養、振とう培養、静置培養等により実施するのが好ましい。培養終了後、該培養物より本発明酵素を回収するには、通常の酵素回収手段を用いることができる。
培養物から、例えば、濾過、遠心分離等の操作により菌体を分離し、洗菌する。この菌体から本発明酵素を回収することが好ましい。この場合、菌体をそのまま用いることもできるが、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイナミル等の種々の破壊手段を用いて菌体を破壊する方法、リゾチームの如き細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法、トリトンX−100等の界面活性剤を用いて菌体から酵素を抽出する方法等により、菌体から本発明酵素を回収するのが好ましい。
このようにして得られた粗酵素液から本発明酵素を単離するには、通常の酵素精製に用いられる方法が使用できる。例えば、硫安塩析法、有機溶媒沈澱法、イオン交換クロマトグラフ法、ゲル濾過クロマトグラフ法、吸着クロマトグラフ法、電気泳動法等を適宜組み合わせて行うのが好ましい。
本発明酵素を用いる反応時間はいかなる時間でもよいが、1時間から3日間、さらに具体的には3時間から2日間程度で反応を停止させるのが好ましい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
探索には、土壌より分離した菌、植物より分離した菌、及び微生物保存機関から分与された保存菌を用いた。土壌由来菌については、千葉県野田市、茨城県筑波付近を中心とする土壌及び植物約900サンプルを回収し、それぞれ小スパーテル1さじ若しくは断片を培地(酵母エキス0.3%、トリプトン0.3%、グルコース0.6%、ジアセチルスペルミン0.1%、ジアセチルスペルミジン0.1%、pH6.0)を用いて、30℃、1日振とう培養したのち、平面培地(上記培地+寒天1.2%)で分離した。分離した菌株は約15,000株で主にバクテリア、酵母であった。保存菌は酵母650株、糸状菌350株、バクテリア200株を用いた。
デバリオミセス マラマ HUT 7199を150mL容三角フラスコに入れた培地(酵母エキス0.3%、トリプトン0.3%、グルコース0.6%、pH6.0)50mLに接種し、30℃、120rpmで3日間回転振とう培養した。これを種培養として、5L三角フラスコに入れた上記培地1Lに10mlずつ接種し、30℃、90rpmで3日間回転振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。
溶出された活性画分をセントリプレップ10(アミコン社製)で濃縮し、HPLCにて陰イオン交換クロマトグラフィー[TSK−GEL SuperQ−5PW(東ソー社製、7.5mm×7.5cm)]を行った。20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で洗浄後、0〜500mM 塩化ナトリウムを含有するリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて直線濃度勾配法により溶出させた。流速は0.5ml/minで行い、220nmでモニターした。
得られた活性画分はマイクロコン10(アミコン社製)で濃縮し、20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で透析した。得られた酵素は以下の理化学的性質を決定するのに用いた。
実施例2により得られた本発明酵素の理化学的性質は、下記のとおりであった。
(a)作用
反応産物を特定するために反応液をTLC解析した。50μlの反応液(7mM ジアセチルスペルミン、20mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、本発明酵素 1U/ml)を30℃で1日間インキュベートし、TLCで反応産物を解析した(クロロホルム:メタノール:アンモニア水:水=2:4:1:1、ニンヒドリン発色)。各種ポリアミンのRf値(移動率)は、ジアセチルスペルミン 0.49、ジアセチルスペルミジン 0.71、N1−アセチルスペルミン 0.07、N1−アセチルスペルミジン 0.20、N8−アセチルスペルミジン 0.29、スペルミン 0、スペルミジン 0.03であり、反応液についてはジアセチルスペルミンのスポットが消失し、N1−アセチルスペルミジンに相当するスポットが検出された。このことから、本発明酵素はジアセチルスペルミンを分解してN1−アセチルスペルミジンを生ずることが確かめられた。ヒト由来等のポリアミンオキシダーゼはジアセチルスペルミンに対する活性は高くはないものの、化10に示した反応を触媒し、N1−アセチルスペルミジンと3−アセトアミドプロパナールを生成することが知られている(非特許文献6参照)。よって本酵素は、従来のポリアミンオキシダーゼの反応様式と同様に、2級アミンのC−N結合を酸化的に開裂することが示唆された。また、本酵素による反応は、前述した過酸化水素を測定する活性測定法で活性測定可能であることから、本酵素はオキシダーゼであると言える。
従って本酵素は、化10に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を酸化的に開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成することが示された。
(b)基質特異性
前述した酵素活性の測定方法により、基質としてジアセチルスペルミン、ジアセチルスペルミジン、N1−アセチルスペルミン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジン、スペルミン、スペルミジンを用いて、本発明酵素の活性を測定した。なお活性測定においては、0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)と0.2M リン酸緩衝液(pH7.5)のそれぞれを用いて評価した。本発明酵素のジアセチルスペルミンに対する活性を100%としたときのジアセチルスペルミジン、N1−アセチルスペルミン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジン、スペルミンおよびスペルミジンに対する活性を表3に示す。このように本酵素は、ジアセチルスペルミンに比較して、N1−アセチルスペルミン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジン等のモノアセチルポリアミン類に作用しにくいという(ジアセチルスペルミン>N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン,N8−アセチルスペルミジン)、新規かつ有用な基質特異性を有することがわかった。
(c)至適pH
緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、温度37℃にて酵素反応を行った。結果を図3に示す。本発明酵素は、pH7.5において最も高い活性を示した。また、pH6.5〜8.5でもpH7.5付近における活性値の50%以上を示したことから、本発明オキシダーゼの至適pHはpH6.5〜8.5であり、最も好ましい至適pHはpH7.5であると判断した。
(d)安定pH
緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、30℃で30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定した。結果を図4に示す。最も高い残存活性を示したpHである、pH7.0付近での残存活性に対して70%以上の活性を残存するpH範囲はpH6.0〜8.0であった。
以上から、本発明オキシダーゼの安定pH範囲はpH6.0〜8.0であると判断した。
(e)至適温度
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図5に示す。最も高い活性を示した温度である、50℃付近での活性に対して80%以上の活性を示す温度範囲は、37〜55℃であった。以上から、本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、37〜55℃であると判断した。
(f)熱安定性
50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて、各温度で30分間処理した時の熱安定性の結果は、図6に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、37℃付近まで安定であった。
(g)分子量
先に述べた条件にて、ゲルろ過[TSKgel G3000SWXL(東ソー社製、7.8mm×30cm)、MW−Marker(和光純薬工業社製)]を行い、本発明酵素の分子量を約92,000と推定した。
また、Native−PAGE[PAGミニ「第一」10/20(第一化学薬品社製)、タンパク質分子量マーカー「第一」I(第一化学薬品社製)]で分子量を求めた。本発明酵素の分子量は約110,000であった。
さらに、SDS−PAGE[PAGミニ「第一」10/20(第一化学薬品社製)、BenchMark Protein Ladder(インビトロジェン社製)]で分子量を求めた。本発明酵素のサブユニットの分子量は約55,000であった。従って、本発明酵素は分子量が約55,000のサブユニットから構成される、分子量が約110,000の2量体であると推定された。
(h)ジアセチルスペルミンに対するKm値
前記活性測定法において、基質であるジアセチルスペルミンの濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数(Km)を求めた。この結果、ジアセチルスペルミンに対するKm値は0.10mM[0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)]であることが判かった。
実施例2に示した酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199からの本発明酵素の製造法と同様の方法で精製が可能であった。また得られた精製酵素の理化学的性質についても酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199由来の酵素とほぼ同一の性質を示した。
実施例2に示した酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199からの本発明酵素の製造法と同様の方法で精製が可能であった。得られた本発明酵素の理化学的性質は、下記のとおりであった。
(a)作用
実施例3に示した酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199が生産する本発明酵素と同様の方法で反応産物を特定した結果、本発明酵素もジアセチルスペルミンを分解してN1−アセチルスペルミジンを生ずることが確かめられた。また、過酸化水素を測定する活性測定法で活性測定が可能であったことから、化10に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を酸化的に開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する反応様式であることが示された。
(b)基質特異性
実施例3に示した酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199が生産する本発明酵素と同様の方法を用いて基質特異性を評価した。0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)および0.2M リン酸緩衝液(pH7.5)における各種ポリアミンに対する活性を表3に示す。このように本酵素は、ジアセチルスペルミンに比較して、N1−アセチルスペルミン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジン等のモノアセチルポリアミン類に作用しにくいという(ジアセチルスペルミン>N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン,N8−アセチルスペルミジン)、新規かつ有用な基質特異性を有することがわかった。
(c)至適pH
緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、温度37℃にて酵素反応を行った。結果を図7に示す。本発明酵素は、pH8.0において最も高い活性を示した。また、pH7.0〜8.5でもpH8.0付近における活性値の50%以上を示したことから、本発明オキシダーゼの至適pHはpH7.0〜8.5であり、最も好ましい至適pHはpH8.0であると判断した。
(d)安定pH
緩衝液として200mM 酢酸緩衝液(pH4.5〜6.0)、200mM リン酸カリウム緩衝液(pH6.0〜8.0)、200mM PIPES−NaOH(pH6.5〜7.5)、200mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5〜9.5)を用い、夫々のpHにおいて、30℃で30分間処理した後、本発明酵素の残存活性を測定した。結果を図8に示す。最も高い残存活性を示したpHである、pH6.5〜8.0付近での残存活性に対して70%以上の活性を残存するpH範囲はpH5.5〜9.5であった。
以上から、本発明オキシダーゼの安定pH範囲はpH5.5〜9.5であると判断した。
(e)至適温度
上述の活性測定法における反応液と同一組成よりなる反応液を用い、種々の温度にて本酵素の活性測定を行った。結果を図9に示す。最も高い活性を示した温度である、50℃付近での活性に対して80%以上の活性を示す温度範囲は、45〜55℃であった。以上から、本発明オキシダーゼの至適温度の範囲は、45〜55℃であると判断した。
(f)熱安定性
50mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)を用いて、各温度で30分間処理した時の熱安定性の結果は、図10に示す通りであり、本発明オキシダーゼは、37℃付近まで安定であった。
(g)分子量
先に述べた条件にて、ゲルろ過[TSKgel G3000SWXL(東ソー社製、7.8mm×30cm)、MW−Marker(和光純薬工業社製)]を行い、本発明酵素の分子量を約90,000と推定した。
また、Native−PAGE[PAGミニ「第一」10/20(第一化学薬品社製)、タンパク質分子量マーカー「第一」I(第一化学薬品社製)]で分子量を求めた。本発明酵素の分子量は約130,000であった。
さらに、SDS−PAGE[PAGミニ「第一」10/20(第一化学薬品社製)、BenchMark Protein Ladder(インビトロジェン社製)]で分子量を求めた。本発明酵素のサブユニットの分子量は約65,000であった。従って、本発明酵素は分子量が約65,000のサブユニットから構成される、分子量が約130,000の2量体であると推定された。
(h)ジアセチルスペルミンに対するKm値
前記活性測定法において、基質であるジアセチルスペルミンの濃度を変化させて活性測定を行い、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数(Km)を求めた。この結果、ジアセチルスペルミンに対するKm値は0.11mM[0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)]であることが判かった。
ピキア ミヌタ IAM 12215を150mL容三角フラスコに入れた培地(酵母エキス0.3%、トリプトン0.3%、グルコース0.6%、ジアセチルスペルミン0.5%、ジアセチルスペルミジン0.5%、pH6.0)50mLに接種し、30℃、120rpmで3日間回転振とう培養した。これを種培養として、5L三角フラスコに入れた上記培地1Lに10mlずつ接種し、30℃、90rpmで3日間回転振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。酵素の精製は実施例2に示した酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199からの本発明酵素の製造法と同様の方法で可能であった。得られた本発明酵素の理化学的性質は、下記のとおりであった。
(a)作用
実施例3に示した酵母ピキア ミヌタ IAM 12215が生産する本発明酵素と同様の方法で反応産物を特定した結果、本発明酵素もジアセチルスペルミンを分解してN1−アセチルスペルミジンを生ずることが確かめられた。また、過酸化水素を測定する活性測定法で活性測定が可能であったことから、化10に示したとおり、酸素存在下にてジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を酸化的に開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する反応様式であることが示唆された。
(b)基質特異性
実施例3に示した酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199が生産する本発明酵素と同様の方法を用いて基質特異性を評価した。0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)および0.2M リン酸緩衝液(pH7.5)における各種ポリアミンに対する活性を表3に示す。0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)の条件下では、ジアセチルスペルミン比較して、N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジンについてより高い反応性が認められ、新規な基質特異性は見出すことはできなかったものの、0.2M リン酸緩衝液(pH7.5)条件下において本酵素は、ジアセチルスペルミンに比較して、N1−アセチルスペルミン、N1−アセチルスペルミジン、N8−アセチルスペルミジン等のモノアセチルポリアミン類に作用しにくいという(ジアセチルスペルミン>N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン,N8−アセチルスペルミジン)、新規かつ有用な基質特異性を有することがわかった。
(1)デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)由来の本発明酵素のアミノ酸配列の分析
実施例4にて得られたデバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)由来の本発明酵素を、50mMトリス−塩酸緩衝液(pH9.0)中で、37℃にて一晩、エンドプロテイナーゼ Asp−N(宝酒造社製)処理し、断片化した。上記断片を、Capcell Pak C18 SG300(資生堂社製)を用いた逆相高速液体クロマトグラフィーにより分取した。3種の断片ペプチドについてアミノ酸配列を、Procise 492 プロテインシーケンサー(アプライドバイオシステムズ社製)を用いて、エドマン法により分析した。結果として、以下の3つの内部アミノ酸配列情報を得た。
(1)DXEKPLEINQAKLHRVAEDIEKFIELYFFEE(配列番号3)
(2)DLITQLSGEHGCGLSEKNIRFAG(配列番号4)
(3)DQVPNNSXLSAPLKGP(配列番号5)
(Xは未同定)
(2)デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)由来の本発明酵素をコードする遺伝子の部分断片の取得1
デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)を培地(酵母エキス0.3%、トリプトン0.3%、グルコース0.6%、pH6.0)3mLに接種し、30℃、140rpmで3日間往復振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。この菌体よりGenとるくん・酵母用(宝酒造社製)を用いて、染色体DNAを得た。
次いで、実施例項目(1)で得られたアミノ酸配列を基に、コドンが縮重している箇所を混合塩基とした複数個のPCR用プライマーを作製した。染色体DNAを鋳型とし、Ex Taq DNA ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用いてPCRを行った。PCR反応は、PCRマスターサイクラーグラジエント(エッペンドルフ社製)にて、熱変性94℃,2分、アニール58℃,30秒、伸長反応72℃,2分の条件下、30サイクル行った。結果としてセンスプライマーが5’−GARAARCCNYTNGARATDAAYCARGCNAA−3’(配列番号6)(29 mer,Aはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミン、Rはアデニン又はグアニン、Nはアデニン、シトシン、グアニン又はチミン、Yはシトシン又はチミン、Dはアデニン、グアニン又はチミンを示す。)、アンチセンスプライマーが5’−ATRTTYTTYTCNSWNARNCCRCANCCRTGYTC−3’(配列番号7)(32mer,Sはシトシン又はグアニン、Wはアデニン又はチミンを示す。)であるとき、1.0kbp程度に相当する遺伝子断片が増幅された。
増幅したDNA断片を1%アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、pT7Blue T Vector(宝酒造社製)に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿入DNAの塩基配列を、マルチキャピラリーDNA解析システムCEQ2000(ベックマン・コールター社製)を用いて決定した。その結果、DNA断片(1020bp)が、PCRのプライマー設計に用いたペプチドのアミノ酸配列を正しくコードする塩基配列を両端に有していた。また、決定した塩基配列から推定されるアミノ酸配列中には、プロテインシークエンサーで決定した内部アミノ酸配列が存在した。従って、得られた増幅DNA断片は、本発明酵素をコードする遺伝子の一部分(部分遺伝子)であることが判明した。
(3)デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)染色体DNAのサザンブロット解析
次いで、実施例項目(2)で調製した染色体DNA2μgを、各種制限酵素を用い、37℃で5時間消化した。得られた制限酵素消化DNAを0.7%アガロースゲル電気泳動に供した。泳動後、サザンブロット法により、ナイロン膜(Hybond−N+、GEヘルスケアバイオサイエンス社製)にDNAを転写した。ハイブリダイゼーションのプローブとしては、実施例項目(2)で得られたプラスミド遺伝子を鋳型とし、M13プライマーを用いて、PCR Dig ラベリングミックス(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)存在下でPCR増幅させたものを使用した。PCRの反応条件等は、上記実施例項目(2)と同様に行った。
上記のナイロン膜を2×SSC(0.3M NaCl、0.03M クエン酸ナトリウム;pH7.0)で洗浄後、DIGシステムを用い、ユーザーガイド(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)に従い、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションを行った後のナイロン膜の洗浄は、0.1% SDS含有2×SSC(15mM NaCl、1.5mM クエン酸ナトリウム;pH7.0)で室温にて5分間、2回ののち、0.1% SDS含有0.1×SSCで68℃にて15分間、2回行った。その結果、BamHIの消化産物で約3.6kbpの位置にハイブリダイズしたプローブに由来するシグナルが認められた。
(4)デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)由来の本発明酵素をコードする遺伝子の部分断片の取得2
上記の結果に基づき、BamHI消化した染色体DNA10μgを1.0%アガロースゲル電気泳動で分離し、約3.6kbpの大きさに相当する位置のアガロースゲルを切り出し、DNA断片を抽出した。該DNA断片をT4 DNA Ligase(Roche社製)を用いてセルフライゲーションさせた。上記のライゲーション産物を鋳型とし、次のとおり常法に従いインバースPCRを行った。実施例項目(2)で決定した部分遺伝子配列をもとに、PCR用プライマーとして5’−ATAAGCATGTATCCGACCCAATCAA−3’(25mer)(配列番号8)及び5’−ATAACGCTTTTGATCCTCTGTCAAT−3’(25mer)(配列番号9)を作製した。Ex Taq DNA ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用い、熱変性94℃,2分、アニール62℃,30秒、伸長反応72℃,4分の条件下、30サイクルのPCRを行った。結果として約2.8kbpの増幅DNAを得ることができた。
本PCR産物を鋳型とし、センスプライマー 5’−CCGTTGGATCTTATCACCCAATTGT−3’(25mer)(配列番号10)、アンチセンスプライマー 5’−TTTTCAATGTCTTCTGCAACTCTGT−3’(25mer)(配列番号11)を用いて、さらに同条件にてPCRを行った。結果として約2.6kbpの増幅DNAを得ることができた。
増幅したDNA断片を1%アガロースゲル電気泳動後のゲルより回収し、pT7Blue T Vector(宝酒造社製)に組み込み、組み換え体プラスミドを得た。該プラスミド中の挿入DNAの塩基配列を決定した結果、推定されるアミノ酸配列中には、プロテインシークエンサーで決定した内部アミノ酸配列が存在した。従って、得られた増幅DNA断片は、本発明酵素をコードする遺伝子の一部分(部分遺伝子)であることが判明した。また、推定されたアミノ酸配列の上流側には終止コドンの2アミノ酸の後にメチオニンが存在していたことから、このメチオニンをコードするATGが本発明酵素をコードする遺伝子の5’末端であると推定された。さらに3’末端側に終止コドンであるTAAが含まれていることがわかった。
(5)デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)由来の本発明酵素をコードする全長遺伝子のクローニング
先ず、上記の操作で得られた塩基配列に基づき、本酵素遺伝子の5’末端あるいは3’末端を含むオリゴヌクレオチド(計30塩基のオリゴヌクレオチド、3’末端側は相補鎖)を設計した。このプライマー中にNdeI部位を組み込んでおき、PCRで増幅した産物を、NdeIを作用させて消化することにより、コーディング領域が得られるようにしておいた。すなわち、5’−TACCAGTAGTGGCATATGTCACAACCAATT−3’(30 mer)(配列番号12)、アンチセンスプライマーとして5’−TTCCATATAATCCATATGTTAGCCAGATAT−3’(30 mer)(配列番号13)を合成した。実施例項目(2)で調製した染色体遺伝子を鋳型とし、合成プライマー及びKOD Plus ポリメラーゼ(東洋紡社製)を用い、熱変性94℃,15秒、アニール50℃,30秒、伸長反応68℃,2分の条件下、30サイクルのPCRを行った。結果として増幅DNA(約1.5kbp)が得られ、これをNdeIで消化して、本発明酵素をコードする領域のDNAを得ることができた。
得られたDNAを、大腸菌ラクトースオペロン等に由来するプロモーター、オペレーター及びリボゾーム結合部位等の発現領域を含むDNA配列(The Operon, p.227, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980を参照)を保有するpUC系ベクターpUTE300K’(特開2005−65583号公報記載)のNdeI部位に挿入し、組み換え体プラスミドDNA pDASpmOX−D300を得た。D.M.Morrisonの方法(Methods in Enzymology,68,p.326−331,1979)に従い、組み換え体プラスミドDNA pDASpmOX−D300を用いて大腸菌(E.coli)JM109(宝酒造社製)を形質転換し、形質転換株、E.coli JM109(pDASpmOX−D300)を得た。菌体よりQIAGEN tip−100(キアゲン社製)を用いて組み換え体プラスミドpDASpmOX−D300を抽出して精製し、組み換え体プラスミドを100μg得た。
該プラスミド中の挿入DNAの塩基配列を決定した。染色体DNAを鋳型とした複数ロットのPCRを行うことにより、errorが入っていないことを確認した。決定した本発明酵素遺伝子の塩基配列を配列番号2に、また、該DNA配列から翻訳されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号1に夫々示した。pDASpmOX−D300に挿入されている本発明酵素遺伝子のORFは、1461bp、487アミノ酸からなっていることが判明した。
(6)Reverse Transcription−PCR(RT−PCR)を用いる、デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)由来の本発明酵素をコードする遺伝子のクローニング
デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)を培地(酵母エキス0.3%、トリプトン0.3%、グルコース0.6%、pH6.0)3mLに接種し、30℃、140rpmで2日間往復振とう培養した。この培養液を遠心処理して上清を廃棄し、菌体を回収した。この菌体よりMasterPure Yeast RNA Purification Kit(エアブラウン社製)を用いて、RNAを得た。得られたRNAから、さらにOligotex−dT30 <Super> mRNA Purification Kit(宝酒造社製)を用いて精製mRNAを得た。これを鋳型とし、実施例項目(5)記載のプライマー及びRNA PCR Kit(宝酒造社製)用いてRT−PCRを行った。得られた増幅DNA(約1.5kbp)の塩基配列を解析した結果、実施例項目(5)で得られた塩基配列(配列番号2)と完全に一致した。よって、実施例項目(5)で得られた塩基配列中にはイントロンは含まれていないことがわかった。
(7)デバリオミセス ハンセニイ Tsukuba 42 (FERM BP−10603)由来の本発明酵素を生産する組換え菌の取得
本発明酵素遺伝子には2箇所のEcoRV部位が存在していたため、QuickChange Site−Directed Mutagenesis Kit (Stratagene社製)を用いる部位特異的変異によりこれらを消去した。用いたプライマーの組合わせは、1箇所目の消去では5’−TGATAAGGATATAAAGGTGTACGCA−3’(25 mer)(配列番号14)と5’−TGCGTACACCTTTATATCCTTATCA−3’(25 mer)(配列番号15)であり、2箇所目の消去では5’−ATGCTCAGATACCTTGAATTGTGGT−3’(25 mer)(配列番号16)と5’−ACCACAATTCAAGGTATCTGAGCAT−3’(25 mer)(配列番号17)であった。
次にEcoRV部位を組み込んだセンスプライマー 5’−TCACACAGGAGGGATATCATGTCACAACCA−3’(30 mer)(配列番号18)およびアンチセンスプライマー 5’−TCAATGCATATGGATATCTTAGCCAGATAT−3’(30 mer)(配列番号19)を合成した。2箇所のEcoRV部位が消去されたプラスミドpDASpmOX−D300’を鋳型とし、上記プライマーおよびEx Taq DNA ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用い、熱変性94℃,2分、アニール50℃,30秒、伸長反応72℃,2分の条件下、30サイクルのPCRを行った。結果として増幅DNA(約1.5kbp)が得られ、これをEcoRVで消化して、本発明酵素をコードする領域のDNAを得ることができた。本遺伝子には2箇所のEcoRV部位が消去された以外のerrorが入っていないことを確認した。
lac(ラクトースオペロン)とtrp(トリプトファンオペロン)を融合したtacプロモーターを保有するpBR系ベクターpUTE120K’のEcoRV部位に挿入し、組み換え体プラスミドDNA pDASpmOX−D120を得た。組み換え体プラスミドDNA pDASpmOX−D120を用いてE.coli DH5α(宝酒造社製)を形質転換し、形質転換株、E.coli DH5α(pDASpmOX−D120)を得た。
得られたE.coli DH5α(pDASpmOX−D120)を、LB−IPTG−amp培地〔バクトトリプトン1%(W/V),酵母エキス0.5%(W/V), NaCl 0.5%(W/V),イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(1mM)及びアンピシリン(50μg/ml)〕にて20℃で10時間振とう培養した後、酵素活性を測定したところ、0.2U/mlであった。
(8)組換え本発明酵素の製造法
大腸菌(E.coli)DH5α(pDASpmOX−D120)を実施例項目(7)の方法にて5lの培地で培養し、本発明酵素を生産させた。本培養液から、実施例2に記載の方法により、精製された本発明酵素を得た。
実施例7 項目(2)記載の方法にて、染色体遺伝子をそれぞれ調製した。次いで、実施例7 項目(4)で得られた構造遺伝子の開始コドンより上流および終止コドンより下流の塩基配列情報から、5’−TAGATGTCTAGTATAAGTAAATA−3’(23mer)(配列番号20)及び5’−AAAAAAAATTTACGTCCTAAAATCA−3’(25mer)(配列番号21)のプライマーを作製した。染色体遺伝子を鋳型とし、上記プライマーおよびEx Taq DNA ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用い、熱変性94℃,2分、アニール50℃,30秒、伸長反応72℃,2分の条件下、30サイクルのPCRをそれぞれ行った結果、ともに増幅DNA(約1.5kbp)が得られた。塩基配列を解析した結果、ともに実施例7 項目(5)で得られた塩基配列(配列番号2)と完全に一致した。
非特許文献20によれば、キャンディダ ボイディニイ NBRC 10574が生産するポリアミンオキシダーゼはN1−アセチルスペルミジンに高い反応性を示すことが知られていたが、ジアセチル体を含むその他の各種ポリアミンに対する基質特異性についての詳細は知られていない。そこで本酵素の基質特異性を調べるために下記のとおりに精製酵素を作製した。まず実施例7 項目(2)記載の方法にて、染色体遺伝子を調製した。次いで既知の遺伝子配列情報から、EcoRV部位を組み込んだプライマーである5’−ATTTTAATTAAAGATATCATGACAACAGTA−3’(30mer)(配列番号22)及び5’−AAAGTAATAAAAGATATCTTATAATTTAGA−3’(30mer)(配列番号23)を設計した。染色体遺伝子を鋳型とし、上記プライマーおよびEx Taq DNA ポリメラーゼ(宝酒造社製)を用い、熱変性94℃,2分、アニール50℃,30秒、伸長反応72℃,2分の条件下、30サイクルのPCRをそれぞれ行った結果、ともに増幅DNA(約1.5kbp)が得られた。これをEcoRVで消化し、実施例7 項目(7)記載のpUTE120K’のEcoRV部位に挿入し、組み換え体プラスミドDNA pPAOX−CB120を得た。これを用いて大腸菌(E.coli)DH5α(宝酒造社製)を形質転換し、形質転換株、E.coli DH5α(pPAOX−CB120)を得た。該プラスミド中の挿入DNAの塩基配列を解析した結果、非特許文献20に記載の塩基配列と完全に一致し、errorが入っていないことを確認した。
得られた組換え大腸菌を実施例7 項目(8)に記載の方法で25℃にて培養し、酵素を精製した。得られた比較対照用の精製酵素について、実施例3に示した酵母デバリオミセス マラマ HUT 7199が生産する本発明酵素と同様の方法を用いて基質特異性を評価した。0.2M Tris−HCl緩衝液(pH7.5)および0.2M リン酸緩衝液(pH7.5)における各種ポリアミンに対する活性を表3に示す。非特許文献20によれば、本ポリアミンオキシダーゼはN1−アセチルスペルミジンオキシダーゼとされているが、ジアセチルスペルミン、ジアセチルスペルミジンにも比較的高い反応性を示した。しかしながら、N1−アセチルスペルミジンやN1−アセチルスペルミンに対する反応性と比較すると低いものであったため、本ポリアミンオキシダーゼは、「N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン,N8−アセチルスペルミジンよりもジアセチルポリアミンに良く作用する」という、本発明で見出された新規な基質特異性を有していないことが確認された。
ジアセチルスペルミン・2塩酸塩150mgを、実施例2にて調製した本発明酵素 2U/ml及びカタラーゼ(Sigma社製) 0.5U/mlを含む60mlの反応液[20mM トリス−塩酸緩衝液(pH7.5)、基質濃度7mM]に溶解し、30℃で1日間インキュベートし、TLCでN1−アセチルスペルミジンの生成を確認した(クロロホルム:メタノール:アンモニア水:水=2:4:1:1、ニンヒドリン発色)。セントリプレップ10(アミコン社製)を用いて水で透析し、酵素タンパクを除去した。透析外液を陽イオン交換樹脂[DOWEX 50W−X4(H+)]カラム(1cm×10cm)に通し、反応生成物を吸着させた。水で洗浄後、1M アンモニアで溶出させた。溶出液を減圧濃縮した後、クロロホルム:メタノール=1:1の溶媒に溶解させて、シリカゲルカラムカラム(2cm×15cm)に吸着させた。展開溶媒としてクロロホルム:メタノール(1:1〜0:1)を用いて溶出させ、N1−アセチルスペルミジン溶出画分に塩酸を添加した後減圧濃縮し、78mgのN1−アセチルスペルミジン2塩酸塩を得た(収率72%)。これをエタノールで再結晶し、45mgのN1−アセチルスペルミジン2塩酸塩を得た(収率41%)。融点と1H,13C−NMRの測定値は文献既知の値(非特許文献23参照)と一致した。
なお、いずれの酵素もプトレッシンには反応しなかった。
Claims (12)
- 下記(1a)〜(1g)の理化学的性質を有するジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1):
(1a)作用:酸素存在下にてN1,N12−ジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する;
(1b)基質特異性:N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン及びN8−アセチルスペルミジンに対する活性よりもN 1 ,N 12 −ジアセチルスペルミンに対する活性が高い;
(1c)至適pH:6.5〜8.5;
(1d)安定pH:6.0〜8.0;
(1e)至適温度:37〜55℃;
(1f)熱安定性:37℃以下[200mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて30分間処理した場合、90%以上の残存活性];
及び
(1g)分子量:92,000(ゲルろ過法);又は、
下記(2a)〜(2g)の理化学的性質を有するジアセチルポリアミンオキシダーゼ(2):
(2a)作用:酸素存在下にてN1,N12−ジアセチルスペルミンの2級アミンのC−N結合を開裂して、N1−アセチルスペルミジン、3−アセトアミドプロパナール及び過酸化水素を生成する;
(2b)基質特異性:N1−アセチルスペルミン,N1−アセチルスペルミジン及びN8−アセチルスペルミジンに対する活性よりもN 1 ,N 12 −ジアセチルスペルミンに対する活性が高い;
(2c)至適pH:7.0〜8.5;
(2d)安定pH:5.5〜9.5;
(2e)至適温度:45〜55℃;
(2f)熱安定性:37℃以下[200mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)にて30分間処理した場合、90%以上の残存活性];
及び
(2g)分子量:90,000(ゲルろ過法)。 - 請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)の生産能を有するデバリオミセス(Debaryomyces)属の酵母、若しくは、請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(2)の生産能を有するキャンディダ(Candida)属の酵母、又は、それらの培養物から該酵素を回収することを特徴とする請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)又は(2)の製造方法。
- 酵母がデバリオミセス マラマ (Debaryomyces marama)、デバリオミセス マラムス (Debaryomyces maramus)、デバリオミセス ハンセニイ (Debaryomyces hansenii)、及び、キャンディダ グラブラタ (Candida glabrata)からなる群から選ばれた1又は2以上の酵母である請求項2に記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)又は(2)の製造方法。
- 請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)の活性を有する、以下の(a)、(b)又は(c)のタンパク質:
(a)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質;
(b)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1から数個のアミノ酸が欠失、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質;
(c)配列番号1で表されるアミノ酸配列と90%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 配列番号1で表されるアミノ酸配列と95%以上の相同性を示すアミノ酸配列からなる、請求項4記載のタンパク質。
- 請求項4又は5に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
- 以下の(a)、(b)又は(c)のDNAからなる遺伝子:
(a)配列番号2で表される塩基配列からなるDNA;
(b)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長と90%以上の相同性を示し、かつ請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNA;
(c)配列番号2で表される塩基配列からなるDNAにおいて、1から数個のDNAが欠失、置換及び/又は付加され、かつ請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)の活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 配列番号2で表される塩基配列からなるDNAの全長と95%以上の相同性を示し、かつ請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)の酵素活性を有するタンパク質をコードするDNAからなる、請求項7記載の遺伝子。
- 請求項6〜8のいずれか一項に記載の遺伝子をベクターDNAに挿入したことを特徴とする組換え体DNA。
- 請求項9記載の組換え体DNAを含む形質転換体又は形質導入体。
- 請求項10記載の形質転換体又は形質導入体を培地に培養し、培養物から請求項4又は5記載のタンパク質を回収することを特徴とする、ジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)の製造方法。
- N1,N12−ジアセチルスペルミンに請求項1記載のジアセチルポリアミンオキシダーゼ(1)若しくは(2)、又は、請求項4若しくは5記載のタンパク質を作用させて、生成物となるN1−アセチルスペルミジンを回収することを特徴とする、N1−アセチルスペルミジンの製造方法。
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