JPH04293483A - ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼの製造方法に関するものである。

【０００２】本発明による酵素、ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼは、医農薬合成中間体として有用な
モノアセチルポリアミンの合成や、生体試料中のジアセ
チルポリアミンの定量等に使用される。

【０００３】

【従来の技術】ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは、ジアセチルポリアミンを加水分解してモノアセチ
ルポリアミンを生成する酵素で、例えば次の反応を触媒
する。

【０００４】 ジアセチルプトレッシン　　＋　Ｈ２Ｏ　　　→モノア
セチルプトレッシン　　＋　　ＣＨ３ＣＯＯＨ従来、ジ
アセチルポリアミンに作用するアミドヒドロラーゼに関
する知見はほとんどなく、従ってジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼの製造方法に関する報告がなく、工
業的に利用できる技術が確立されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の背景から、ジア
セチルポリアミンに作用し、モノアセチルポリアミンを
生成する酵素、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼを見い出し、かつ工業的にジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼを製造する技術の確立が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、アルカリゲネ
ス属、シュードモナス属、フザリウム属、キャンディダ
属、またはトリコスポロン属に属する微生物がジアセチ
ルポリアミンアミドヒドロラーゼを多く産生することを
見い出し、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明はアルカリゲネス属、シュー
ドモナス属、フザリウム属、キャンディダ属、またはト
リコスポロン属に属し、ジアセチルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、その培養物
からジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを採取す
ることを特徴とするジアセチルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼの製造方法である。

【０００８】本発明で使用するジアセチルポリアミンは
公知なものが特に制限されず用いうる。特に好適に使用
されるものを具体的に例示すれば、ジアセチル−１，２
−ジアミノエタン、ジアセチル　−　１，３−ジアミノ
プロパン、ジアセチルプトレッシン、ジアセチルカダベ
リン、ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン、ジアセ
チル−１，８−ジアミノオクタン、ジアセチルスペルミ
ジン、ジアセチルスペルミン等が挙げられる。

【０００９】本発明に使用される微生物は、アルカリゲ
ネス属、シュードモナス属、フザリウム属、キャンディ
ダ属、またはトリコスポロン属に属し、ジアセチルポリ
アミンアミドヒドロラーゼの生産能を有するものであれ
ば既存の菌株、自然界から新たに分離された菌株、およ
びこれらの変異株のいずれでも使用することができる。

【００１０】さらに、これらのアルカリゲネス属、シュ
ードモナス属、フザリウム属、キャンディダ属、または
トリコスポロン属に属し、ジアセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼの生産能を有する微生物からジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を単離
し、その遺伝子を同属あるいは他の属に属する微生物内
にて発現させるように導入して得られるジアセチルポリ
アミンアミドヒドロラーゼ生産菌も使用することができ
る。

【００１１】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼの製造方法は、ジアセチルポリアミンアミドヒ
ドロラーゼの生産能のあるアルカリゲネス属、シュード
モナス属、フザリウム属、キャンディダ属、またはトリ
コスポロン属に属する微生物の培養物からジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼを採取する方法であるが、
アルカリゲネス属、シュードモナス属、フザリウム属、
キャンディダ属、またはトリコスポロン属に属する微生
物の菌株としては、例えば アルカリゲネス・フェカリス　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ　ｆａｅｃａｌｉｓＩＦＯ　１３１１） アルカリゲネス・フェカリス　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ　ｆａｅｃａｌｉｓＩＦＯ　１４４７９） アルカリゲネス・スピーシーズ　（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ　Ｓｐ．　ＩＦＯ　１４１３０） シュードモナス・オーレオファシエンス　（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｕｎｓ　ＩＦＯ　
３５２１）シュードモナス・シンザンタ　（Ｐｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　ｓｙｎｚａｎｔｈａ　ＩＦＯ　３９１２
） シュードモナス・シンザンタ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓ　ｓｙｎｚａｎｔｈａ　ＩＦＯ　３９１３） シュードモナス・アエルギノーサ　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＩＦＯ　３０８０） シュードモナス・クロロラフィス　（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ
ｎａｓ　ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ　ＩＦＯ　３９０４
） フザリウム・オキシスポラム　　（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　
ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ　ＩＦＯ　７１９０） フザリウム・ソラニ　　（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｏｌａ
ｎｉ　ＩＦＯ　９９５５）キャンディダ・トロピカリス
　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓＩＦＯ　０
００７） キャンディダ・ギラモンジ　　（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕ
ｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＩＦＯ　０４５４） トリコスポロン・クタニウム　（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒ
ｏｎ　ｃｕｔａｎｅｕｍ　ＩＦＯ　１１９８） トリコスポロン・クタニウム　（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒ
ｏｎ　ｃｕｔａｎｅｕｍ　ＩＦＯ　０１７３） 等が挙げられる。

【００１２】上記の各微生物を培養するにあたって使用
する培地としては公知のものが使用される。例えばグル
コース、糖蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス、
酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、およびリン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特
に限定されないが、これらの成分の他にジアセチルプト
レッシン、ジアセチルカダベリン等のジアセチルポリア
ミンやモノアセチルプトレッシン、モノアセチル−１，
６−ジアミノヘキサン等のモノアセチルポリアミンを含
有させることが該酵素の生産性を高める上において有利
である。

【００１３】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼを生産する生産菌を培養する際の培養条件とし
ては、通気攪拌条件下で培養温度が１５〜４０℃の範囲
、好ましくは２０〜３５℃の範囲で培養する方法が好適
である。 培養時のｐＨ条件は、ｐＨ５．０〜９．０の範囲で、好
ましくはｐＨ６．０〜８．０の範囲が適当である。培養
時間は、特に限定されないが酵素の生産性等の経済性を
考慮すると増殖の後期に達する時間から休止状態に入っ
てから１０〜３０時間以内の範囲が適当である。

【００１４】培養によって得られた培養物から培養液と
菌体とを分離する方法としては、従来から行われている
遠心分離法や濾過等の方法が使用できるが、遠心分離法
が好適である。

【００１５】本発明のジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼの分離精製は、次のようにして行うことができ
る。

【００１６】菌体内に蓄積された該酵素を菌体から抽出
する方法としては、従来から行われている超音波による
菌体破砕、あるいはガラス・ビーズと共に回転させるダ
イノミル細胞破砕機による菌体破砕、またはリゾチーム
等の酵素やトルエン等の有機溶媒による細胞膜の破壊等
の方法が挙げられる。これらの中から適当な方法を選択
して菌体から酵素の抽出を行うことにより、酵素を採取
することができる。

【００１７】これらの方法で抽出された粗酵素液からジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼをさらに精製す
る必要がある場合には、通常実施されている一般的な酵
素の精製手段である硫酸アンモニウム沈澱法、イオン交
換カラムクロマトグラフィー法、ゲル濾過法、ヒドロキ
シアパタイトカラムクロマトグラフィー法、アフィニテ
ィーカラムクロマトグラフィー法、調製用電気泳動法等
の方法を適宜組み合わせるか、あるいは繰り返すことに
よって精製を行うことができる。

【００１８】本発明により得られたジアセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼは、以下の理化学的性質を有する
。

【００１９】■作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。例えば次の反応を触媒する。

【００２０】 ■温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、４〜３５
゜Ｃにおいて８０％以上の残存活性を有する。

【００２１】■ｐＨ安定性 ３０℃で、３０分間保存した時、ｐＨ５．６〜９．４に
おいて８０％以上の残存活性を有する。

【００２２】また、本発明により得られたジアセチルポ
リアミンアミドヒドロラーゼの理化学的性質をさらに詳
細にアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｓｆａｅｃａｌｉｓ　ＩＦＯ１４４７９）、およびキャ
ンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ　ｇｕｉｌｌｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ　ＩＦＯ　０４５４）を培養して得られ
たジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼについて例
示すると、以下の通りである。

【００２３】［アルカリゲネス属由来ジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ］ １．作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。すなわち以下の反応を触媒する。

【００２４】 ジアセチルポリアミン　　＋　　Ｈ２Ｏ　　　　　　　
→モノアセチルポリアミン　　＋　　ＣＨ３ＣＯＯＨ２
．基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、ジアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると表１のようになる。

【００２５】

【表１】 ＊Ｎ１−アセチルスペルミジン生成 ３．至適ｐＨ：ｐＨ８．５〜９．５　　（図１）４．ｐ
Ｈ安定性 ３０℃で３０分間保存した時、ｐＨ５．６〜９．４にお
いて８０％以上の残存活性を有する。（図２） ５．至適温度 ｐＨ９．０、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る。

【００２６】（図３） ６．温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、４〜５５
℃において、８０％以上の残存活性を有し、６７℃、３
０分間の処理で完全に失活する。（図４） ［キャンディダ属由来ジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼ］ １．作用 ジアセチルポリアミンを加水分解して、モノアセチルポ
リアミンを生成する。すなわち以下の反応を触媒する。

【００２７】 ジアセチルポリアミン　　＋　　Ｈ２Ｏ　　　　　　　
→モノアセチルポリアミン　　＋　　ＣＨ３ＣＯＯＨ２
．基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、ジアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると表２のようになる。

【００２８】

【表２】 ＊Ｎ１−アセチルスペルミジン生成 ３．至適ｐＨ：ｐＨ７．０〜８．０　（図５）４．ｐＨ
安定性 ３０℃で３０分間保存した時、ｐＨ５．２〜１１．４に
おいて８０％以上の残存活性を有する。（図６） ５．至適温度 ｐＨ７．５、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る。

【００２９】（図７） ６．温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、４〜３５
℃において８０％以上の残存活性を有し、５５℃、３０
分間の処理で完全に失活する。（図８）本発明における
ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの酵素活性測
定法および、酵素活性の表示方法は以下の通りである。

【００３０】２０ｍＭのジアセチルプトレッシン１．０
ｍｌと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ（特公昭
　５９−７４３５）６．８ユニット、プトレッシンオキ
シダーゼ　０．２８ユニット、パーオキシダーゼ　０．
９ユニット、２，４−ジクロロフェノール　０．７５ｍ
ｇ、４ーアミノアンチピリン　０．０６ｍｇを含む　０
．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍｌと、
ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを含有する被
検体　５０μｌを混合し、３０℃で　１時間反応させた
後、５１０ｎｍにおける吸光度を測定することによって
行われる。

【００３１】酵素活性値は、１分間当り　１μｍｏｌｅ
のモノアセチルプトレッシンを生成させる酵素を　１ユ
ニット　（μ　ｍｏｌｅ／ｍｉｎ）として表示する。

【００３２】

【発明の効果】本発明は、アルカリゲネス属、シュード
モナス属、フザリウム属、キャンディダ属、またはトリ
コスポロン属に属し、ジアセチルポリアミンアミドヒド
ロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、その培養物か
らジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを採取する
ことを特徴とするジアセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼの製造方法である。

【００３３】本発明によるジアセチルポリアミンアミド
ヒドロラーゼは、医農薬中間体として有用なモノアセチ
ルポリアミンを純粋かつ簡便に合成する際に、大変有利
である。

【００３４】また本発明は、ジアセチルポリアミンに作
用するアミドヒドロラーゼを工業的に製造できる技術を
提供する。

【００３５】以下、実施例により本発明をさらに具体的
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。

【００３６】

【実施例】実施例　１〜５ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．１
％食塩、０．２％ジアセチルプトレッシン、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウムか
ら成る培地（ｐＨ７．０）各１０ｍｌを大型試験管に分
注し、１２０℃で１５分間オートクレーブしたものに、
表３に示す各種微生物を斜面培養から、一白金耳接種し
た。２８℃で４８〜１２０時間振とう培養を行った後、
各培養液を予　め上記と同様の組成を有する培地　　４
００ｍｌ（１００ｍｌｘ４）を仕込滅菌しておいた坂　
口フラスコに加えて本培養を行った。２８℃で４８〜１
２０時間振とう培養を行った後　、培養液を遠心分離機
にかけて菌体を採取した。得られた菌体を１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）５０ｍｌに懸濁し、その懸濁液
を超音波破砕機にかけて菌体破砕を行っ　た。その破砕
液を遠心分離機により遠心分離し、粗酵素抽出液を得た
。各粗酵素抽出液０．０５ｍｌに、１００ｍＭリン酸緩
衝液（ｐＨ７．５）０．９５ｍｌ、および２０ｍＭジア
セチルプトレッシン１．０ｍｌを加えて３０℃で１時間
反応させた。５０％トリクロロ酢酸０．２ｍｌを　添加
して反応を停止させた後、生成したモノアセチルプトレ
ッシンを高速液体クロマトグラフィーにより定量した結
果を表３に示した。表中の生成モノアセチルプトレッシ
ンは、３０℃、１時間の反応で、０．０５ｍｌの粗酵素
抽出液の作用により生　成したモノアセチルプトレッシ
ン量であり、培地　１ｍｌ当りの活性とは、粗酵素抽出
液の酵素活性を元の培養液　１ｍｌ当りに換算したもの
である。

【００３７】

【表３】 実施例　６ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．２
％ジアセチルプトレッシン、０．１％食塩、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウム、
　　０．０２％消泡剤から成る培地（ｐＨ　７．０）０
．５Ｌ　を　２Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２
０分間オートクレーブした後、２８℃以下でこの培地に
アルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
　ｆａｅｃａｌｉｓ　　ＩＦＯ　　　１４４７９）を植
菌した。２８℃で４８時間振とう培養を行った後この培
養液を、予め上記と同様の組成を有する培地　２０Ｌを
仕込み減菌しておいたジャー・ファーメンターに加えて
本培養を行った。培養条件は２８℃、攪拌回転数１００
ｒｐｍ、通気２０Ｌ／ｍｉｎで、４８時間培養の後、培
養液を遠心分離にかけて菌体を採取した。得られた菌体
の２００ｇ（湿菌体重量）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ　７．５）１Ｌに懸濁し、その懸濁液を超音波破砕機
により菌体破砕を行った。その破砕液を遠心分離機を使
用して遠心分離し、上清液を得た。この上清液中のジア
セチルポリアミンアミドヒドロラーゼの総活性は　　１
，０８０ユニット、比活性は　０．０１４ユニット／ｍ
ｇ−タンハ゜ク　であった。

【００３８】この上清液を、予め　２０ｍＭ　のリン酸
緩衝液（ｐＨ　７．５）で平衡化した　６００ｍｌ　の
ＤＥＡＥ−セルロースのカラムに通し酵素を吸着させた
。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の直
線濃度勾配によりジアセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼを溶出させた。［総酵素活性　＝　９５０ユニット
、　比活性　＝　０．０７４ユニット／ｍｇ−タンハ゜
ク］この溶出液を限外濾過により脱塩した後、硫酸アン
モニウムを　２０％となるように添加し、次いで予め　
２０％の硫酸アンモニウムを含む　２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ　７．５）で平衡化しておいた　１００ｍｌの
ブチルトヨパール　６５０Ｍ　（東ソー社製）のカラム
に通し、酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝
液で洗浄した後、硫酸アンモニウムの逆直線濃度勾配に
よりジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出さ
せた。［　総酵素活性　＝　８４５ユニット、　比活性
　＝　１．６ユニット／ｍｇ−タンハ゜ク　］得られた
酵素溶液を限外濾過により濃縮した後、１．８Ｌのセフ
ァクリル　Ｓ−３００　（ファルマシア社製）を充填し
たカラムに通し、ゲル濾過を行い活性画分を集めた。　
［総酵素活性　＝　７６２ユニット、　比活性　＝２．
２ユニット／ｍｇ−タンハ゜ク　］この溶出液を、予め
　２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　　７．５）で平衡化し
ておいた　４０ｍｌの　ＥＡＨ−セファロース（ファル
マシア社製）のカラムに通し吸着させた。カラムを同様
の緩衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配により、ジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。 ［総酵素活性　＝　６７０ユニット、　比活性　＝　５
．１ユニット／ｍｇ−タンハ゜ク　］この溶出液を限外
濾過により脱塩した後、予め　２０ｍＭ　リン酸緩衝液
（ｐＨ７．５）で平衡化しておいた　７０ｍｌ　の　Ｄ
ＥＡＥ−トヨパール　６５０Ｓ　（東ソー社製）のカラ
ムに通し、酵素を吸着させた。 カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の直線
濃度勾配により、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼを溶出させた。［総酵素活性　＝　５７０ユニット
、　比活性　＝　８．５ユニット／ｍｇ−タンハ゜ク　
］この溶出液に、硫酸アンモニウムを　１５％となるよ
うに添加し、次いで予め　１５％の硫酸アンモニウムを
含む　２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
しておいた１００ｍｌのフェニル−セファロース４Ｂ　
　（ファルマシア社製）のカラムに通し、酵素を吸着さ
せた。 カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、硫酸アンモ
ニウムの逆直線濃度勾配により、ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素活性　＝　
４８０ユニット、　比活性　＝　１３ユニット／ｍｇ−
タンハ゜ク］こうして得られた酵素の純度をドデシル硫
酸ナトリウム存在下、および非存在下でのポリアクリル
アミドゲル電気泳動によって調べた結果、両者共に一本
のバンドのみが観察され、純粋なジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼであることが確認された。

【００３９】次に、こうして得られた精製酵素を　１０
ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）により適当に希釈
して調整した酵素標品を用いて本酵素の至適ｐＨ、基質
特異性、ｐＨ安定性および温度安定性を調べた。

【００４０】［至適ｐＨ］１０ｍＭ　ジアセチルプトレ
ッシンを含む０．１Ｍ　ブリットン−ロビンソン広域緩
衝液（　ｐＨ　４．４，５．７，　７．１，７．６，８
．７，９．４，１０．３，１１．３，１１．８，１２．
５　）０．９５ｍｌ　に０．０５ｍｌ　の酵素標品（０
．０４　ユニット）を添加混合し、３７℃下で　１５分
間反応を行った。この反応溶液　１．０ｍｌ　に　５０
％トリクロロ酢酸水溶液を　　０．１ｍｌ　加え、　０
℃下で２０分間放置し、次いで、　１Ｍ　リン酸緩衝液
（ｐＨ　７．５）０．９ｍｌ　を加えた。この溶液　０
．２ｍｌ　と　１０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５
）　０．８ｍｌ　と、アシルポリアミンアミドヒドロラ
ーゼ　６．８ユニット、プトレッシンオキシダーゼ　　
０．２８ユニット、パーオキシダーゼ　０．９ユニット
、２，４−ジクロロフェノール　０．７５ｍｇ、および
　４−アミノアンチピリン０．０６ｍｇを含む　０．１
Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　８．０）１ｍｌを混合し
、３７℃で　１５分間反応させた後、５１０ｎｍ　にお
ける吸光度を測定し、それぞれの酵素活性値を算出した
。以上の操作の後、最高の酵素活性値を１００％とした
相対活性（Ｒｅｌａｔｉｖｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を算
出し、グラフ化して図１を得た。図１より、本酵素の至
適　ｐＨ　は　８．５〜９．５　の範囲にあることがわ
かる。

【００４１】［基質特異性］酵素標品　０．０５ｍｌ（
１．３ユニット）を、各種ジアセチルポリアミンの１０
０ｍＭ溶液　０．１ｍｌ、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９
．０）０．８５ｍｌから成る反応液に添加し、３７゜Ｃ
で１５分間反応させた。５０％トリクロロ酢酸０．１ｍ
ｌを添加して反応を停止させた後、生成したモノアセチ
ルポリアミンを高速液体クロマトグラフィーにより定量
した。これらのジアセチルポリアミンに対する作用の強
さを、それぞれジアセチルプトレッシンに対する作用を
１００％とした相対活性値として表１に示す。

【００４２】［ｐＨ　安定性］０．１Ｍ　ブリットン−
ロビンソン広域緩衝液（ｐＨ　　３．７，４．４，５．
７，７．１，７．６，８．７，９．４，１０．３，　　
　１１．３，１１．８，１２．５　）０．９５ｍｌ　と
酵素標品　０．０５ｍｌ　（０．４ユニット）を混合し
、３０℃で　３０分間放置した後、各溶液　０．１ｍｌ
　と　１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）０．９ｍｌ
　を混合した。この酵素溶液　０．０５ｍｌと　２０ｍ
Ｍジアセチルプトレッシン　１．０ｍｌ　と、アシルポ
リアミンアミドヒドロラーゼ　６．８ユニット、プトレ
ッシンオキシダーゼ　　０．２８ユニット、パーオキシ
ダーゼ　０．９ユニット、２，４−ジクロロフェノール
　０．７５ｍｇ、および４−アミノアンチピリン　０．
０６ｍｇを含む　０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐＨ　
８．０）１ｍｌ　を混合し、３７℃で　１５分間反応さ
せた後、直ちに　５１０ｎｍ　における吸光度を測定し
、それぞれの酵素活性値を算出した。以上の操作の後、
最高の酵素活性値を　１００％とした相対活性を算出し
、グラフ化して図２を得た。図２から明らかなように、
本酵素は　ｐＨ　５．６〜９．４　の範囲において８０
％以上の残存活性を有している。

【００４３】［温度安定性］１０ｍＭ　リン酸緩衝液（
ｐＨ　７．５）で希釈した酵素標品（０．８ユニット）
を４、２３、３０、３７、４５、５３、６０、６７、７
５℃の各温度で　３０分間放置した。この酵素溶液を１
０ｍＭ　リン酸緩衝液で１０倍に希釈した希釈液　０．
０５ｍｌと　２０ｍＭ　ジアセチルプトレッシン　１ｍ
ｌと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ　６．８ユ
ニット、プトレッシンオキシダーゼ　　０．２８ユニッ
ト、パーオキシダーゼ　０．９ユニット、２，４−ジク
ロロフェノール　０．７５ｍｇ、および４−アミノアン
チピリン　０．０６ｍｇを含む　０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ　８．０）１ｍｌ　を混合し、３７℃で１５
分間反応させた後、５１０ｎｍ　における吸光度を測定
し、それぞれの酵素活性値を算出した。以上の操作の後
、最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を算出し
、グラフ化して図４を得た。図４から明らかなように、
本酵素は　５５℃までの温度において８０％以上の残存
活性を有している。

【００４４】実施例　７ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．２
％ジアセチルプトレッシン、０．１％食塩、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウム、
　　０．０２％消泡剤から成る培地（ｐＨ　７．０）０
．５Ｌを　２Ｌの三角フラスコに入れ、１２０℃で２０
分間オートクレーブした後、２８℃以下でこの培地にキ
ャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａｇｕｉｌｌｉ
ｅｒｍｏｎｄｉｉ　ＩＦＯ　０４５４）を植菌した。２
８℃で２４時間振とう培養を行った後この培養液を、予
め上記と同様の組成を有する培地　２０Ｌを仕込み減菌
しておいたジャー・ファーメンターに加えて本培養を行
った。培養条件は２８℃、攪拌回転数１００ｒｐｍ、通
気２０Ｌ／ｍｉｎで、２４時間培養の後、培養液を遠心
分離にかけて菌体を採取した。　　得られた菌体の４６
０ｇ（湿菌体重量）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ　７
．５）１Ｌに懸濁し、その懸濁液をダイノミル破砕機に
より菌体破砕を行った。その破砕液を遠心分離機を使用
して遠心分離し、上清液を得た。この上清液中のジアセ
チルポリアミンアミドヒドロラーゼの総活性は　２２０
ユニット　、比活性は０．００３ユニット／ｍｇ−タン
ハ゜ク　であった。

【００４５】この上清液を、予め　２０ｍＭ　のリン酸
緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した　１．５ＬのＤＥＡ
Ｅ−セルロースのカラムに通し酵素を吸着させた。カラ
ムを同様のリン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の直線濃度
勾配によりジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを
溶出させた。［総酵素活性　＝　１７０ユニット、　比
活性　＝　０．０８７ユニット／ｍｇ−タンハ゜ク　］
この溶出液を限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニ
ウムを　２５％となるように添加し、次いで予め　２５
％の硫酸アンモニウムを含む　２０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ　７．５）で平衡化しておいた　１００ｍｌのブチ
ルトヨパール　６５０Ｍ（東ソー社製）のカラムに通し
、酵素を吸着させた。カラムを同様のリン酸緩衝液で洗
浄した後、硫酸アンモニウムの逆直線濃度勾配によりジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。 ［　総酵素活性　＝　１６０ユニット、比活性　＝　０
．８７ユニット／ｍｇ−タンハ゜ク　］得られた酵素溶
液を限外濾過により濃縮した後、１．８Ｌのセファクリ
ル　Ｓ−３００（ファルマシア社製）を充填したカラム
に通し、ゲル濾過を行い活性画分を集めた。［総酵素活
性　＝　１３０ユニット、比活性　＝　２．０ユニット
／ｍｇ−タンハ゜ク　］この溶出液を、予め　２０ｍＭ
　リン酸緩衝液（ｐＨ　　７．５）で平衡化しておいた
　４０ｍｌの　ＥＡＨ−セファロース（ファルマシア社
製）のカラムに通し吸着させた。カラムを同様の緩衝液
で洗浄した後、食塩の直線濃度勾配により、ジアセチル
ポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素
活性　＝　　７７ユニット、比活性　＝　２．７ユニッ
ト／ｍｇ−タンハ゜ク］この溶出液を限外濾過により脱
塩した後、予め２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５
）で平衡化しておいた７０ｍｌ　の　ＤＥＡＥ−トヨパ
ール　６５０Ｓ（東ソー社製）のカラムに通し、酵素を
吸着させた。　　カラムを同様のリン酸緩衝液で洗浄し
た後、食塩の直線濃度勾配により、ジアセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼを溶出させた。［総酵素活性　＝
　５４ユニット、　比活性　＝　５．２ユニット／ｍｇ
−タンハ゜ク　］この溶出液を限外濾過により脱塩した
後、次いで予め　２０ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ７．５
）で平衡化しておいた　２０ｍｌのＤＥＡＥ−セルロー
スのカラムに通し、酵素を吸着させた。カラムを同様の
リン酸緩衝液で洗浄した後、食塩の逆直線濃度勾配によ
り、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを溶出さ
せた。［総酵素活性　＝　３３ユニット、　比活性　＝
１５ユニット／ｍｇ−タンハ゜ク　］こうして得られた
酵素の純度をドデシル硫酸ナトリウム存在下、および非
存在下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動によって調
べた結果、両者共に一本のバンドのみが観察され、純粋
なジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼであること
が確認された。

【００４６】次に、こうして得られた精製酵素を　１０
ｍＭ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）により適当に希釈
して調整した酵素標品を用いて本酵素の至適ｐＨ、基質
特異性、ｐＨ安定性および温度安定性を調べた。

【００４７】［至適ｐＨ］１０ｍＭ　ジアセチルプトレ
ッシンを含む０．１Ｍ　ブリットン−ロビンソン広域緩
衝液（　ｐＨ　４．５，５．０，　５．６，６．５，７
．０，７．５，８．２，８．７，９．０，９．５，１０
．１，１１．０，１１．３，１１．５，１１．９　）０
．９５ｍｌに　０．０５ｍｌの酵素標品（０．０３　ユ
ニット）を添加混合し、３７℃下で　１５分間反応を行
った。この反応溶液　１．０ｍｌに５０％トリクロロ酢
酸水溶液を０．１ｍｌ加え、　０℃下で　２０分間放置
し、次いで、　１Ｍ　リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）０
．９ｍｌを加えた。この溶液　０．４ｍｌと　１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ　７．５）０．６ｍｌと、アシルポ
リアミンアミドヒドロラーゼ　６．８ユニット、プトレ
ッシンオキシダーゼ　　０．２８ユニット、パーオキシ
ダーゼ　　０．９ユニット、　２，４−ジクロロフェノ
ール　０．７５ｍｇ、および４−アミノアンチピリン　
０．０６ｍｇを含む　０．１Ｍ　トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ　８．０）１ｍｌを混合し、３７℃で１５分間反応さ
せた後、５１０ｎｍ　における吸光度を測定し、それぞ
れの酵素活性値を算出した。以上の操作の後、最高の酵
素活性値を　１００％とした相対活性（Ｒｅｌａｔｉｖ
ｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を算出し、グラフ化して図５を得
た。図５より、本酵素の至適ｐＨは　７．０〜８．０　
の範囲にあることがわかる。

【００４８】［基質特異性］酵素標品　０．０５ｍｌ（
０．０５ユニット）を、各種ジアセチルポリアミンの１
００ｍＭ　溶液　０．１ｍｌ、０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ　７．５）０．８５ｍｌから成る反応液に添加し、
３７℃で１５分間反応を行った。５０％トリクロロ酢酸
０．１ｍｌを添加して反応を停止させた後、生成したモ
ノアセチルポリアミンを高速液体クロマトグラフィーに
より定量した。これらのジアセチルポリアミンに対する
作用の強さを、それぞれジアセチルプトレッシンに対す
る作用を１００％とした相対活性値として表２に示す。

【００４９】［ｐＨ　安定性］０．１Ｍ　ブリットン−
ロビンソン広域緩衝液（ｐＨ　　４．５，５．０，５．
６，６．５，７．０，７．５，８．２，８．７，９．０
，９．５，１０．１，１１．０，１１．３，１１．５，
１１．９　）０．９５ｍｌ　と酵素標品　０．０５ｍｌ
（０．４ユニット）を混合し、３０℃で　　３０分間放
置した後、各溶液　０．１ｍｌと　１Ｍ　リン酸緩衝液
（ｐＨ　７．５）０．９ｍｌを混合した。この酵素溶液
　０．０５ｍｌと　２０ｍＭジアセチルプトレッシン　
１．０ｍｌと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ　
６．８ユニット、プトレッシンオキシダーゼ　　０．２
８ユニット、パーオキシダーゼ　０．９ユニット、２，
４−ジクロロフェノール　　　　０．７５ｍｇ、および
４−アミノアンチピリン　０．０６ｍｇを含む０．１Ｍ
　トリス塩酸緩衝液（　ｐＨ　８．０　）１ｍｌ　を混
合し、３７℃で　１５分間反応させた後、直ちに　５１
０ｎｍ　における吸光度を測定し、それぞれの酵素活性
値を算出した。以上の操作の後、最高の酵素活性値を１
００％とした相対活性を算出し、グラフ化して図６を得
た。図６から明らかなように、本酵素は　　ｐＨ　５．
２〜１１．４　の範囲において　８０％以上の残存活性
を有している。

【００５０】［温度安定性］１０ｍＭ　リン酸緩衝液（
ｐＨ　７．５）で希釈した酵素標品（０．０３ユニット
）を　４、２５、３０、３７、４０、４３、４５、５５
、６５℃　の各温度で　３０分間放置した。この酵素溶
液を１０ｍＭリン酸緩衝液で１０倍に希釈した希釈液０
．０５ｍｌと　２０ｍＭジアセチルプトレッシン　１ｍ
ｌと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ　６．８ユ
ニット、プトレッシンオキシダーゼ　　０．２８ユニッ
ト、パーオキシダーゼ　０．９ユニット、２，４−ジク
ロロフェノール　０．７５　ｍｇ、および４−アミノア
ンチピリン　０．０６ｍｇを含む　０．１Ｍトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ　８．０）１ｍｌを混合し、　３７℃で１
５分間反応させた後、５１０ｎｍ　における吸光度を測
定し、それぞれの酵素活性値を算出した。　　以上の操
作の後、最高の酵素活性値を１００％とした相対活性を
算出し、グラフ化して図８を得た。 図８から明らかなように、本酵素は　３５℃までの温度
において　８０％以上の残存活性を有している。

【００５１】実施例　８〜１０ 実施例２、３、５で培養して得られた、各粗酵素抽出液
を、ＤＥＡＥ−セルロース（１００ｍｌ）、ブチルトヨ
パール（１００ｍｌ）およびセファクリル　Ｓ−３００
（５００ｍｌ）の各カラムクロマトグラフィーにより精
製した。得られた酵素の純度をドデシル硫酸ナトリウム
存在下、および非存在下でのポリアクリルアミドゲル電
気泳動によって調べた結果、両者共に１本のバンドのみ
が観察され、純粋なジアセチルポリアミンアミドヒドロ
ラーゼであることが確認された。こうして得られた精製
酵素を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）により適当
に希釈して調製した酵素標品を用いて、ｐＨ安定性、温
度安定性および至適ｐＨを調べた。

【００５２】［ｐＨ安定性］０．１Ｍ　ブリットン−ロ
ビンソン広域緩衝液の各ｐＨが、４．６、５．４、６．
２、７．５、８．５、９．２、１０．０、１０．８、で
あること以外は、実施例６と全く同様にｐＨ安定性を調
べた。実施例６と同様にグラフ化して、図９、１０、１
１を得た。図９、１０、１１より明らかなように、シュ
ウドモナス属由来、フザリウム属由来およびトリコスポ
ロン属由来のジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ
は、それぞれｐＨ５．２〜９．６、ｐＨ　　５．４〜１
０．２、ｐＨ５．６〜１０．４の範囲において８０％以
上の残存活性を有している。 ［温度安定性］３０分間放置する温度が、それぞれ４、
３０、３７、　４３、　５０、５６℃であること以外は
、実施例６と全く同様に温度安定性を調べた。実施例６
と同様にグラフ化して、図１２、１３、１４を得た。図
１２、１３、１４より明らかなように、シュウドモナス
属由来、フザリウム属由来およびトリコスポロン属由来
のジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼは、それぞ
れ４５℃、４０℃、３８℃までの温度において８０％以
上の残存活性を有している。 ［至適ｐＨ］０．１Ｍ　ブリットン−ロビンソン広域緩
衝液の各ｐＨが、５．６、６．３、７．２、８．６、９
．４、１１．０であること以外は、実施例６と全く同様
に至適ｐＨを調べた。実施例６と同様にグラフ化して、
図１５、　１６、１７を得た。図１５、１６、１７より
明らかなように、シュウドモナス属由来、フザリウム属
由来およびトリコスポロン属由来のジアセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼの至適ｐＨは、それぞれｐＨ８．
１〜９．１、ｐＨ８．９〜　９．９、ｐＨ５．８〜６．
８である。

【図面の簡単な説明】

【図１】アルカリゲネス属由来ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。

【図２】同酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図３】同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図４】同酵素の温度安定性を示す図である。

【図５】キャンディダ属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。

【図６】同酵素のｐＨ安定性を示す図である。

【図７】同酵素の温度活性曲線を示す図である。

【図８】同酵素の温度安定性を示す図である。

【図９】シュードモナス属由来ジアセチルポリアミンア
ミドヒドロラーゼのｐＨ安定性を示す図である。

【図１０】フザリウム属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのｐＨ安定性を示す図である。

【図１１】トリコスポロン属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼのｐＨ安定性を示す図である。

【図１２】シュードモナス属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼの温度安定性を示す図である。

【図１３】フザリウム属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼの温度安定性を示す図である。

【図１４】トリコスポロン属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼの温度安定性を示す図である。

【図１５】シュードモナス属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。

【図１６】フザリウム属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。

【図１７】トリコスポロン属由来ジアセチルポリアミン
アミドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
   ｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
   属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、キャンディダ
   （Ｃａｎｄｉｄａ）属、またはトリコスポロン（Ｔｒｉ
   ｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属に属しジアセチルポリアミンア
   ミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物を培養し、その
   培養物からジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを
   採取することを特徴とするジアセチルポリアミンアミド
   ヒドロラーゼの製造方法。