JPH04234992A - モノアセチルポリアミンの製造方法 - Google Patents
モノアセチルポリアミンの製造方法Info
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- JPH04234992A JPH04234992A JP41529090A JP41529090A JPH04234992A JP H04234992 A JPH04234992 A JP H04234992A JP 41529090 A JP41529090 A JP 41529090A JP 41529090 A JP41529090 A JP 41529090A JP H04234992 A JPH04234992 A JP H04234992A
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はジアセチルポリアミンを
、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの存在下に
加水分解することを特徴とするモノアセチルポリアミン
の製造方法に関する。より詳しくは、ジアセチルポリア
ミンの加水分解能を有する微生物の菌体、該菌体から得
られる粗酵素抽出液、若しくは精製酵素等をジアセチル
ポリアミンに作用させることを特徴とするモノアセチル
ポリアミンの製造方法である。 【０００２】 【従来の技術】ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは、ジアセチルポリアミンを加水分解してモノアセチ
ルポリアミンを生成する酵素で、例えば次のの反応を触
媒する酵素である。 【０００３】ジアセチルプトレッシン＋Ｈ２Ｏ →
モノアセチルプトレッシン＋ＣＨ３ＣＯＯＨ 【０００
４】従来、ジアセチルポリアミンに作用するアミドヒド
ロラーゼに関する知見はほとんどなく、従って工業的に
利用できる技術は確立されていない。 【０００５】また、ジアセチルポリアミンからモノアセ
チルポリアミンを有機化学的に合成し、純粋なモノアセ
チルポリアミンを得ようとする際には遊離ポリアミンが
大量に副成し、分離精製する操作が煩雑である上、収率
が低いという問題点があった。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】上記背景から、ジアセ
チルポリアミンに作用し、モノアセチルポリアミンを生
成する酵素、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ
を見い出すことが望まれていた。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、ジアセチルポ
リアミンに作用しモノアセチルポリアミンを生成する酵
素であるジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを微
生物中に見い出し、かつまたジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼを、ジアセチルポリアミンに作用させる
ことにより、モノアセチルポリアミンを製造し得ること
を見い出し、本発明を完成するに至った。 【０００８】即ち本発明は、ジアセチルポリアミンをジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの存在下に加水
分解することを特徴とするモノアセチルポリアミンの製
造方法である。 【０００９】本発明で使用するジアセチルポリアミンは
公知なものが特に制限されず用いうる。特に好適に使用
されるものを具体的に例示すれば、ジアセチル−１，２
−ジアミノエタン、ジアセチル−１，３−ジアミノプロ
パン、ジアセチルプトレッシン、ジアセチルカダベリン
、ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン、ジアセチル
−１，８−ジアミノオクタン、ジアセチルスペルミジン
、ジアセチルスペルミン等が挙げられる。 【００１０】本発明で好適に用いられるジアセチルポリ
アミンアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物は下記
のとおりである。 【００１１】アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、
エシエリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ） 属、アエロバ
クター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ） 属、セラチア（Ｓｅ
ｒｒａ−ｔｉａ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｏｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ
） 属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｕｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）
属、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）
属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、またはトリコスポロン（
Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ） 属に属する微生物があげ
られ、これらのうち特にアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ） 属、
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、またはトリコスポ
ロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ） 属に属する微生物
が好ましく用いられる。 【００１２】これらの微生物の菌株としては、例えばエ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＩ
ＦＯ １２７１３）、アエロバクター・クロアケ（Ａｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＩＡＭ １２２１
）、セラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＩＦＯ ３０５４）、アルカリゲ
ネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃ
ａｌｉｓ ＩＦＯ １４４７９） 、アルカリゲネス・
フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉ
ｓ ＩＦＯ １３１１１）、アルカリゲネス・スピーシ
ーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅ−ｎｅｓ ＳＰ． ＩＦＯ １
４１３０）、シュードモナス・オーレオファシエンス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｕｓ Ｉ
ＦＯ ３５２１ ）、シュードモナス・シンザンタ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｎｚａｎｔｈａ ＩＦＯ
３９１３） 、シュードモナス・シンザンタ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｎｚａｎｔｈａ ＩＦＯ ３９１
２）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ３０８０
）、 シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ Ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ＩＦＯ ３９
０４）、 ストレプトミセス・グリシウス（Ｓｔｏｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｕｅｓ ＩＦＯ １２８７
５）、ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｏｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＩＦＯ １２８
５４）、ストレプトミセス・フラジエ（Ｓｔｏｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ＩＦＯ １２７７３）
、ストレプトミセス・アルプス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｌｂｕｓ ＩＦＯ １３０１４） 、ノカル
ディア・エリスロポリス（Ｎｏｃａｒｄｉａｅｒｙｔｈ
ｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＯ １２６８２）、ミコバクテリ
ウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅ
ｉＩＦＯ １３１６０）、ミコバクテリウム・スメグマ
ティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔ
ｉｓＩＦＯ ３１５４）、アスペルギルス・ニガー（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＩＦＯ６６６１）
、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ ３０１０５）、ムコール・ジャ
バニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ ＩＦＯ
４５７０）、ケトミウム・グロボサム（Ｃｈａｅｔｏｍ
ｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍＡＴＣＣ ６２０５）、フザ
リウム・オキシスボラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ ＩＦＯ ７１９０）、フザリウム・ソラニ
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ＩＦＯ ９９５５
）、デバリオミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃ
ｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ ＩＦＯ ０７９４）、キャン
ディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａ
ｌｉｓ ＩＦＯ ０００７）、キャンディダ・ギラモン
ジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩ
ＦＯ ０４５４）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ ＩＦＯ ０８７０）、ロドト
ルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ
ＩＦＯ １１０１）、トリコスポロン・クタニウム（Ｔ
ｒｉ−ｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ ＩＦＯ
１１９８）、トリコスポロン・クタニウム（Ｔｒｉｃ
ｈｏｓｐｏｒｏｎｃｕｔａｎｅｕｍ ＩＦＯ ０１７３
）等があげられる。これらの菌株のうちアルカリゲネス
・フエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌ
ｉｓ ＩＦＯ １４４７９）、シュードモナス・クロロ
ラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａ
ｐｈｉｓ ＩＦＯ ３９０４）、 シュードモナス・シ
ンザンタ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔ
ｈａ ＩＦＯ ３９１３）、フザリウム・オキシスポ
ラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ−ｒｕｍ Ｉ
ＦＯ ７１９０）、 フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒ
ｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ＩＦＯ ９９５５） 、キャン
ディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ ＩＦＯ ０４５４）、トリコスポロン
・クタニウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎ
ｅｕｍ ＩＦＯ １１９８）、トリコスポロン・クタ
ニウム（（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕ
ｍ ＩＦＯ ０１７３）等が好ましく用いられる。 【００１３】上記の各微生物を培養するにあたって使用
する培地としては、公知のものが使用される。例えばグ
ルコース、精蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス
、酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、及びリン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特
に限定されないが、これらの成分の他にジアセチルプト
レッシン、ジアセチルカダベリン等のジアセチルポリア
ミンやモノアセチルプトリッシン、モノアセチル−１，
６−ジアミノヘキサン等のモノアセチルポリアミンを含
有させることが重要である。 【００１４】ジアセチルポリアミン、又はモノアセチル
ポリアミンは最初から培地に加えてもよいし、培養途中
で添加してもよい。培地の形態は液体、固体のいずれで
もよい。また培養の方法は静置培養、振トウ培養、通気
攪拌培養のいずれでもよいが、大量培養には通気攪拌に
らる液体培養が適している。培養温度は、１５〜４０℃
。好ましくは２０〜３５℃で行う。 【００１５】本発明の製造方法を実施するには、上記の
ようにして得られる培養液、該培養液から採取した菌体
または該菌体の処理物、例えば洗浄菌体、乾燥菌体、菌
体磨砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌
体抽出物、あるいは精製酵素を、反応を阻害しない無機
または有機の溶媒中、好ましくは水性溶媒中でジアセチ
ルポリアミンに作用させることによりモノアセチルポリ
アミンを生成させることができる。また、菌体、粗酵素
抽出液、あるいは精製酵素を通常用いられる菌体、酵素
の固定化方法により固定化したものを用いることもでき
る。 【００１６】ジアセチルポリアミンの添加濃度は約１０
ｍＭ以上で、反応を阻害しない範囲であれば特に制限は
ない。作用させる温度は酵素の死活しない温度であれば
よく、通常約１０〜約５０℃、好ましくは約２５〜約４
０℃である。ｐＨは６〜１０好ましくは７〜９である。 【００１７】培養液に、ジアセチルポリアミンを添加す
る場合は、対数増殖期に添加することが好ましい。添加
する濃度は約１０ｍＭ以上で反応を阻害しない濃度であ
ればよい。 【００１８】また菌体を用いる場合は、上記培地で培養
した対数増殖期及び静止期の菌体を遠心分離により集め
、生理食塩水等で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）等に菌体を懸濁し、ジアセチルポリアミンを約
１０ｍＭ以上で反応を阻害しない濃度で添加すればよい
。 【００１９】このようにして得た培養液あるいは、反応
液からのモノアセチルポリアミンの回収は、イオン交換
カラムクロマトグラフィー、結晶化等の公知の方法で行
うことができる。 【００２０】以上の諸方法のうち、ジアセチルポリアミ
ンの存在下に培養して得た菌体を分離し、超音波等によ
り細胞を破砕し得られた粗酵素抽出液を硫安分画、透析
、カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過等により精製し
た酵素標品を用いるのが好ましい。このような標品の中
でアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｆａｅｃａ−ｌｉｓ ＩＦＯ １４４７９）、およ
びキャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉ
ｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩＦＯ ０４５４）、が生産し
たジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを後記実施
例１８、又は同２０に従って精製した酵素標品について
以下に具体的に示す。 【００２１】ジアセチルプトレッシン０．２％を含む培
地にアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｆａｅｃａ−ｌｉｓ ＩＦＯ １４４７９）また
はキャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉ
ｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ＩＦＯ ０４５４）を接種
し４０Ｌジャー・ファーメンターにて２８℃、２４〜４
８時間培養した後、培養液から菌体を分離し、超音波破
砕後、またはダイノミルにて菌体を破砕し得られた粗酵
素抽出液を、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲ
ル濾過、疎水性カラムクロマトグラフィー等により精製
したジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの理化学
的性質は次の通りである。 【００２２】〔アルカリゲネス属由来ジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ〕 １． 作 用 ジアセチルポリアミンのアミド結合を加水分解してモノ
アセチルポリアミンを生成する。 ２． 基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、シアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると第１表のようになる。 ３． 至適 ｐＨ： ｐＨ ８．５〜９．５（第１
図）。 ４． ｐＨ安定性 ３０℃で３０分間保存した時、ｐＨ７．０〜９．０にお
いて９０％以上の残存活性を有する（第２図）。 【００２３】 第１表 ───────────────────────
─────────── 基
質
相対活性 （％） ───────
─────────────────────────
── ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
５．７ ジアセチル−１，３−ジアミノプロパン
６７．７ ジアセチルプトレッシン
１００ ジアセチルカダベリン
７８．７ ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン
９６．０ ジアセチル−１，８−ジアミノオクタン
２１．０ ジアセチルスペルミジン
５．５ ジアセチルスペルミン
３．８ ─────────────────────────
────────── ＊Ｎ１ −アセチルスペルリジン生成５．
至適温度 ｐＨ９．０、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る（第３図）。 ６． 温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、５３℃ま
での温度で９０％以上の残存活性を有し、６７℃、３０
分間の処理で完全に失活する（第４図）。 【００２４】〔キャンディダ属由来ジアセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼ〕 １． 作 用 ジアセチルポリアミンのアミド結合を加水分解してモノ
アセチルポリアミンを生成する。 ２． 基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、シアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると第２表のようになる。 【００２５】 第２表 ───────────────────────
─────────── 基
質
相対活性 （％） ───────
─────────────────────────
── ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
９１．９ ジアセチル−１，３−ジアミノプロパン
１７．８ ジアセチルプトレッシン
１００ ジアセチルカダベリン
６５．０ ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン
３９．４ ジアセチル−１，８−ジアミノオクタン
２６．３ ジアセチルスペルミジン
１０．０ ジアセチルスペルミン
１５．１ ─────────────────────────
────────── ＊Ｎ１ −アセチルスペルミジン生成 ３． 至適 ｐＨ： ｐＨ ７．０〜８．０（第５
図）。 ４． ｐＨ安定性 ３０℃で３０分間保存した時、ｐＨ５．５〜１１．３に
おいて９０％以上の残存活性を有する（第６図）。 ５． 至適温度 ｐＨ７．５、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る（第７図）。 ６． 温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、３２℃ま
での温度で９０％以上の残存活性を有し、５５℃、３０
分間の処理で完全に失活する（第８図）。 【００２６】本発明におけるジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼの酵素活性測定方法及び、酵素活性の表
示方法は以下の通りである。 【００２７】２０ｍＭのジアセチルプトレッシン１．０
ｍｌと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ（特公昭
５９−７４３５）６．８ユニット、プトレッシンオキシ
ダーゼ０．２８ユニット、パーオキシダーゼ０．９ユニ
ット、２．４−ジクロロフェノール０．７５ｍｇ、４−
アミノアンチピリン０．０６ｍｇを含む０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍｌジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼを含有する被検体５０μｌ を
混合し、３０℃で１時間反応させた後、５１０ｎｍにお
ける吸光度を測定することによって行われる。 【００２８】酵素活性値は、１分間当り１μｍｏｌｅの
モノアセチルプトレッシンを生成させる酵素量を１ユニ
ット（μｍｏｌｅ／ｍｉｎ）として表示する。 【００２９】 【実施例】実施例１〜１６ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．１
％食塩、０．２％ジアセチルプトレッシン、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウム（
ｐＨ７．０）の培地各１０ｍｌを大型試験管に分注し、
１２０℃で１５分間オートクレーブしたものに、第２表
に示す各種微生物を斜面培養から、１白金耳接種し、２
８℃で２４〜１２０時間振とう培養した。培養終了後遠
心分離により菌体を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）５ｍｌで洗浄した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７．５）５ｍｌに懸濁して氷冷下で超音波処理（１
８０Ｗ、５〜１０分）した。この超音波処理液を遠心分
離して粗酵素抽出液を得た。粗酵素抽出液０．２ｍｌに
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１．０ｍｌ、お
よび２０ｍＭジアセチルプトレッシン０．８ｍｌを加え
て３０℃で３時間反応させた。５０％トリクロロ酢酸０
．２ｍｌを添加して反応を停止させた後、生成したモノ
アセチルプトレッシンを高速液体クロマトグラフィーに
より定量した。結果を第２表に示した。表中の生成モノ
アセチルプトレッシン（μｍｏｌｅ）は、３０℃、３時
間の反応で、０．２ｍｌの粗酵素抽出液の作用により生
成したモノアセチルプトレッシン量であり、培地１ｍｌ
当りの活性とは、粗酵素抽出液の酵素活性を元の培養液
の１ｍｌ当りに換算したものである。 【００３０】 【表１】 【００３１】実施例１７ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．１
％食塩、０．０５％リン酸第一カリウム、０．１５％リ
ン酸第二カリウム、０．２％ジアセチルプトレッシン、
０．０２％消泡剤を含む培地（ｐＨ７．０）０．５Ｌを
２Ｌの三角フラスコに入れ１２０℃で２０分間オートク
レーブした後、アルカリゲネス・フェカリス（ Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ ＩＦＯ １４４７
９）を植菌した。２８℃で４８時間振とう培養を行った
後、この培養液を予め上記と同様の組成を有する培地２
０Ｌを仕込み滅菌しておいたジャーファメンターに加え
て本培養を行った。培養条件は２８℃、攪拌回転数１０
０ｒｐｍ、通気２０Ｌ／ｍｉｎ で４８時間培養の後培
養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。 【００３２】得られた菌体の約２００ｇ（湿菌体重量）
を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１Ｌに懸濁し、
その懸濁液を超音波破砕機により菌体破砕を行った（２
２０Ｗ、８０ｍｉｎ ）。その破砕液を遠心分離機を使
用して遠心分離し、粗酵素抽出液を得、前記の酵素活性
の測定法により、活性測定を行わた。その結果、粗酵素
抽出液の酵素活性は、０．７１Ｕ／ｍｌであった。また
酵素活性値より３０℃１時間、粗酵素抽出液０．０５ｍ
ｌでモノアセチルプトレッシン２．１μｍｏｌｅを生成
したことになる。 【００３３】実施例１８ 実施例１７において、アルカリゲネス・フェカリス（
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓＩＦＯ
１４４７９）を培養した菌体から得られた粗酵素抽出液
を、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したＤＥＡＥ−セルロースカラム（６００ｍｌ）に吸着
させ、食塩（０．１〜０．７Ｍ）の直線濃度勾配溶出を
行った。活性画分を集め限外濾過により脱塩した後、硫
酸アンモニウムを２０％となるように添加し、次いで予
め２０％の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡したブチルトヨパール６５０Ｍ
（東ソー社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸
アンモニウム（２０〜０％）の逆直線濃度勾配溶出を行
った。活性画分を集め、限外濾過により脱塩した後、次
いでセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）カラ
ム（１．８Ｌ）のゲル濾過を行った。活性画分を集め、
次いで予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡
化したＥＡＨ−セファロース（ファルマシア社製）カラ
ム（４０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．６Ｍ）の直
線濃度勾配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過に
より脱塩した後、次いで予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ
（東ソー社製）カラム（７０ｍｌ）に吸着させ、食塩（
０〜０．３５Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画
分を集め、限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウ
ムを１５％となるように添加し、次いで予め１５％の硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸酸緩衝液（ｐＨ７
．５）で平衡化したフェニル−セファロース４Ｂ（ファ
ルマシア社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸
アンモニウム（１５〜０％）の逆直線濃度勾配溶出を行
った。活性画分を集め、限外濾過により脱塩を行い、タ
ンパク質３８．５ｍｇ含む精製酵素溶液３７ｍｌを得た
。該酵素の理化学的性質は前述のとおりである。この精
製酵素溶液０．０５ｍｌを用いた以外は、実施例１７と
全く同様にジアセチルプトレッシンの加水分解反応を行
った。その結果、精製酵素溶液の酵素活性は１３．０ユ
ニット／ｍｌ、比活性は、１２．５ユニット／ｍｇ−タ
ンパクであった。また酵素活性値より、３０℃、１時間
、精製酵素溶液０．０５ｍｌで、モノアセチルプトレッ
シン３９μｍｏｌｅ生成したことになる。 【００３４】実施例１９ キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌ
ｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩＦＯ ０４５４）を植菌するこ
と、培養時間が２４時間であること、およびダイノミル
により菌体破砕を行うこと以外は、実施例１７と全く同
様に粗酵素抽出液を得、酵素活性の測定を行った。その
結果、粗酵素抽出液の酵素活性は０．１１ユニット／ｍ
ｌであった。また酵素活性値より３０℃１時間、粗酵素
抽出液０．０５ｍｌでモノアセチルプトレッシン０．３
２μｍｏｌｅを生成しこたとになる。 【００３５】実施例２０ 実施例１９において、キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩＦＯ ０
４５４）を培養した菌体から得られた粗酵素抽出液を予
め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡したＤＥ
ＡＥ−セルロースカラム（１．５Ｌ）に吸着させ、食塩
（０〜０．５Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画
分を集め限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウム
を２５％となるように添加し、次いで予め２５％の硫酸
アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５
）で平衡化したフェニル−セファロース４Ｂ（ファルマ
シア社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸アン
モニウム（２５〜０％）の逆直線濃度勾配溶出を行った
。活性画分を集め、限外濾過により脱塩した後、次いで
セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）カラム（
１．８Ｌ）のゲル濾過を行った。活性画分を集め、次い
で予め２０ｍＭリン酸酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したＥＡＨ−セファロース（ファルマシア社製）カラム
（４０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．２５Ｍ）の直
線濃度勾配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過に
より脱塩した後、次いで予め２０ｍＭリン酸酸緩衝液（
ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０
Ｓ（東ソー社製）カラム（１０ｍｌ）に吸着させ、食塩
（０〜０．２Ｍ）の直線勾配溶出を行った。活性画分を
集め、限外濾過により脱塩した後、次いで予め１０ｍＭ
リン酸酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した、ＤＥＡＥ
−セルロースカラム（２０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０
〜０．２Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画分を
集め、限外濾過により脱塩を行い、タンパク質１．９ｍ
ｇを含む精製酵素溶液７．０ｍｌを得た。該酵素の理化
学的性質は前述のとおりである。この精製酵素溶液０．
０５ｍｌを用いた他は、実施例１７と全く同様にジアセ
チルプトレッシンの加水分解反応を行った。その結果、
精製酵素溶液の酵素活性は３．６ユニット／ｍｌ、比活
性は１３．２ユニット／ｍｇ−タンパクであった。また
酵素活性値により、３０℃、１時間、精製酵素活性０．
０５ｍｌで、モノアセチルプトレッシン１１μｍｏｌｅ
生成したことになる。 【００３６】実施例２１ 実施例１８で得られた精製酵素溶液０．０５ｍｌを各種
ジアセチルポリアミンの１００ｍＭ溶液０．１ｍｌ、０
．１Ｍ炭酸酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．８５ｍｌから成
る反応液に添加し、３７℃で１５分間反応を行った。５
０％トリクロロ酢酸０．１ｍｌを添加して反応を停止さ
せた後、生成したモノアセチルポリアミンを高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量した。結果を第３表に示す
。 【００３７】 第３表 ───────────────────────
─────────── ジアセチルポ
リアミン モノアセチルポリア
ミン生成量
（１０３ ×μｍｏｌｅ） ──────────
────────────────────────
ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
１１．７ ジアセチル−１，３−
ジアミノプロパン １３５ ジア
セチルプトレッシン
９０２ ジアセチルカダベリン
７１０
ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン
８６６ ジアセチル−１，８−ジアミ
ノオクタン １８９ ジアセチル
スペルミジン
４９．６＊ ジアセチルスペルミン
３４．３ ──────────────────
──────────────── ＊Ｎ１ −
アセチルスペルミジン生成 【００３８】実施例２２ 実施例２０で得られた精製酵素溶液０．０５ｍｌを各種
ジアセチルポリアミンの１００ｍＭ溶液０．１ｍｌ、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．８５ｍｌから成
る反応液に添加し、３７℃で１５分間反応を行った。５
０％トリクロロ酢酸０．１ｍｌを添加して反応を停止さ
せた後、生成したモノアセチルポリアミンを高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量した。結果を第４表に示す
。 【００３９】 第４表 ───────────────────────
─────────── ジアセチルポ
リアミン モノアセチルポリア
ミン生成量
（１０３ ×μｍｏｌｅ） ──────────
────────────────────────
ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
６８２ ジアセチル−１，３
−ジアミノプロパン １３２
ジアセチルプトレッシン
７４２ ジアセ
チルカダベリン
４８２ ジアセチル−１，
６−ジアミノヘキサン ２９２
ジアセチル−１，８−ジアミノオクタン
１９５ ジアセチルスペルミ
ジン
４７．２＊ ジアセチルスペルミン
１１２ ─────────────────
───────────────── ＊Ｎ１
−アセチルスペルミジン生成 【００４０】実施例２３ 実施例１７および１９で得られた菌体各０．５ｇを２０
％ジアセチルプトレッシンを含む５０ｍＭリン酸酸緩衝
液（ｐＨ７．５）２．０ｍｌに添加し、３０℃で２０時
間反応させた後、遠心分離により菌体を取り除いた。上
清液に５０％トリクロロ酢酸０．２ｍｌを加えて反応を
停止した後、生成したモノアセチルプトレッシンを高速
液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を第５表
に示す。 【００４１】 第５表 ───────────────────────
─────────── 微
生 物 名
モノアセチルプトレッシン
（μｍｏｌｅ） ───
─────────────────────────
────── アルカリゲネス・フェカリス
６８０
キャンディダ・ギラモンジ
５３６ ───────
─────────────────────────
── 【００４２】実施例２４〜３９ 実施例１〜１６で得られた各種微生物の培養液を用いた
以外は、実施例１〜１６と全く同様にしてジアセチルプ
トレッシンの加水分解を行った。結果を第６表に示す。 表中の生成モノアセチルプトレッシン量は、３０℃、３
時間の反応で０．２ｍｌの培養液の作用により生成した
量である。 【００４３】 【表２】 【００４４】 【発明の効果】本発明により、医農薬中間体として有用
なモノアセチルポリアミンを、穏和な条件で、収率よく
製造することができる。また、ジアセチルポリアミンに
作用するアミドヒドロラーゼを工業的に利用できる技術
を提供する。 【００４５】実施例により本発明をさらに具体的に以下
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。
、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの存在下に
加水分解することを特徴とするモノアセチルポリアミン
の製造方法に関する。より詳しくは、ジアセチルポリア
ミンの加水分解能を有する微生物の菌体、該菌体から得
られる粗酵素抽出液、若しくは精製酵素等をジアセチル
ポリアミンに作用させることを特徴とするモノアセチル
ポリアミンの製造方法である。 【０００２】 【従来の技術】ジアセチルポリアミンアミドヒドロラー
ゼは、ジアセチルポリアミンを加水分解してモノアセチ
ルポリアミンを生成する酵素で、例えば次のの反応を触
媒する酵素である。 【０００３】ジアセチルプトレッシン＋Ｈ２Ｏ →
モノアセチルプトレッシン＋ＣＨ３ＣＯＯＨ 【０００
４】従来、ジアセチルポリアミンに作用するアミドヒド
ロラーゼに関する知見はほとんどなく、従って工業的に
利用できる技術は確立されていない。 【０００５】また、ジアセチルポリアミンからモノアセ
チルポリアミンを有機化学的に合成し、純粋なモノアセ
チルポリアミンを得ようとする際には遊離ポリアミンが
大量に副成し、分離精製する操作が煩雑である上、収率
が低いという問題点があった。 【０００６】 【発明が解決しようとする課題】上記背景から、ジアセ
チルポリアミンに作用し、モノアセチルポリアミンを生
成する酵素、ジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼ
を見い出すことが望まれていた。 【０００７】 【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる従
来の欠点を解決すべく鋭意研究した結果、ジアセチルポ
リアミンに作用しモノアセチルポリアミンを生成する酵
素であるジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを微
生物中に見い出し、かつまたジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼを、ジアセチルポリアミンに作用させる
ことにより、モノアセチルポリアミンを製造し得ること
を見い出し、本発明を完成するに至った。 【０００８】即ち本発明は、ジアセチルポリアミンをジ
アセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの存在下に加水
分解することを特徴とするモノアセチルポリアミンの製
造方法である。 【０００９】本発明で使用するジアセチルポリアミンは
公知なものが特に制限されず用いうる。特に好適に使用
されるものを具体的に例示すれば、ジアセチル−１，２
−ジアミノエタン、ジアセチル−１，３−ジアミノプロ
パン、ジアセチルプトレッシン、ジアセチルカダベリン
、ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン、ジアセチル
−１，８−ジアミノオクタン、ジアセチルスペルミジン
、ジアセチルスペルミン等が挙げられる。 【００１０】本発明で好適に用いられるジアセチルポリ
アミンアミドヒドロラーゼ生産能を有する微生物は下記
のとおりである。 【００１１】アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ
）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、
エシエリヒア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ） 属、アエロバ
クター（Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ） 属、セラチア（Ｓｅ
ｒｒａ−ｔｉａ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｏｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ
） 属、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕ
ｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｕｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）
属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、フザリウム（Ｆｕｓ
ａｒｉｕｍ）属、ケトミウム（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ）
属、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）
属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ロドトルラ（
Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）属、またはトリコスポロン（
Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ） 属に属する微生物があげ
られ、これらのうち特にアルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉ
ｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ） 属、
キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、またはトリコスポ
ロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ） 属に属する微生物
が好ましく用いられる。 【００１２】これらの微生物の菌株としては、例えばエ
シェリヒア・コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＩ
ＦＯ １２７１３）、アエロバクター・クロアケ（Ａｅ
ｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ ＩＡＭ １２２１
）、セラチア・マルセスセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍ
ａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＩＦＯ ３０５４）、アルカリゲ
ネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃ
ａｌｉｓ ＩＦＯ １４４７９） 、アルカリゲネス・
フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉ
ｓ ＩＦＯ １３１１１）、アルカリゲネス・スピーシ
ーズ（Ａｌｃａｌｉｇｅ−ｎｅｓ ＳＰ． ＩＦＯ １
４１３０）、シュードモナス・オーレオファシエンス（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｕｒｅｏｆａｃｉｅｕｓ Ｉ
ＦＯ ３５２１ ）、シュードモナス・シンザンタ（Ｐ
ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｎｚａｎｔｈａ ＩＦＯ
３９１３） 、シュードモナス・シンザンタ（Ｐｓｅｕ
ｄｏｍｏｎａｓ Ｓｙｎｚａｎｔｈａ ＩＦＯ ３９１
２）、シュードモナス・アエルギノーザ（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ ＩＦＯ ３０８０
）、 シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏ
ｍｏｎａｓ Ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ＩＦＯ ３９
０４）、 ストレプトミセス・グリシウス（Ｓｔｏｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｕｅｓ ＩＦＯ １２８７
５）、ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｏｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ ＩＦＯ １２８
５４）、ストレプトミセス・フラジエ（Ｓｔｏｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ ＩＦＯ １２７７３）
、ストレプトミセス・アルプス（Ｓｔｏｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ａｌｂｕｓ ＩＦＯ １３０１４） 、ノカル
ディア・エリスロポリス（Ｎｏｃａｒｄｉａｅｒｙｔｈ
ｒｏｐｏｌｉｓ ＩＦＯ １２６８２）、ミコバクテリ
ウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｈｌｅ
ｉＩＦＯ １３１６０）、ミコバクテリウム・スメグマ
ティス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｍｅｇｍａｔ
ｉｓＩＦＯ ３１５４）、アスペルギルス・ニガー（Ａ
ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＩＦＯ６６６１）
、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｏｒｙｚａｅ ＩＦＯ ３０１０５）、ムコール・ジャ
バニクス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ ＩＦＯ
４５７０）、ケトミウム・グロボサム（Ｃｈａｅｔｏｍ
ｉｕｍ ｇｌｏｂｏｓｕｍＡＴＣＣ ６２０５）、フザ
リウム・オキシスボラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓ
ｐｏｒｕｍ ＩＦＯ ７１９０）、フザリウム・ソラニ
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ＩＦＯ ９９５５
）、デバリオミセス・ハンセニ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃ
ｅｓ ｈａｎｓｅｎｉｉ ＩＦＯ ０７９４）、キャン
ディダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａｔｒｏｐｉｃａ
ｌｉｓ ＩＦＯ ０００７）、キャンディダ・ギラモン
ジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩ
ＦＯ ０４５４）、ロドトルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔ
ｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ ＩＦＯ ０８７０）、ロドト
ルラ・ルブラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｒｕｂｒａ
ＩＦＯ １１０１）、トリコスポロン・クタニウム（Ｔ
ｒｉ−ｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕｍ ＩＦＯ
１１９８）、トリコスポロン・クタニウム（Ｔｒｉｃ
ｈｏｓｐｏｒｏｎｃｕｔａｎｅｕｍ ＩＦＯ ０１７３
）等があげられる。これらの菌株のうちアルカリゲネス
・フエカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌ
ｉｓ ＩＦＯ １４４７９）、シュードモナス・クロロ
ラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａ
ｐｈｉｓ ＩＦＯ ３９０４）、 シュードモナス・シ
ンザンタ（Ｐｓｅｕｄｏ−ｍｏｎａｓ ｓｙｎｘａｎｔ
ｈａ ＩＦＯ ３９１３）、フザリウム・オキシスポ
ラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ−ｒｕｍ Ｉ
ＦＯ ７１９０）、 フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒ
ｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ ＩＦＯ ９９５５） 、キャン
ディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅ
ｒｍｏｎｄｉｉ ＩＦＯ ０４５４）、トリコスポロン
・クタニウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎ
ｅｕｍ ＩＦＯ １１９８）、トリコスポロン・クタ
ニウム（（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｕ
ｍ ＩＦＯ ０１７３）等が好ましく用いられる。 【００１３】上記の各微生物を培養するにあたって使用
する培地としては、公知のものが使用される。例えばグ
ルコース、精蜜、可溶性でんぷん等の炭素源、肉エキス
、酵母エキス、ポリペプトン等の窒素源、及びリン酸第
一カリウム、リン酸第二カリウム、塩化ナトリウム、硫
酸マグネシウム等の無機塩類を含有するものであれば特
に限定されないが、これらの成分の他にジアセチルプト
レッシン、ジアセチルカダベリン等のジアセチルポリア
ミンやモノアセチルプトリッシン、モノアセチル−１，
６−ジアミノヘキサン等のモノアセチルポリアミンを含
有させることが重要である。 【００１４】ジアセチルポリアミン、又はモノアセチル
ポリアミンは最初から培地に加えてもよいし、培養途中
で添加してもよい。培地の形態は液体、固体のいずれで
もよい。また培養の方法は静置培養、振トウ培養、通気
攪拌培養のいずれでもよいが、大量培養には通気攪拌に
らる液体培養が適している。培養温度は、１５〜４０℃
。好ましくは２０〜３５℃で行う。 【００１５】本発明の製造方法を実施するには、上記の
ようにして得られる培養液、該培養液から採取した菌体
または該菌体の処理物、例えば洗浄菌体、乾燥菌体、菌
体磨砕物、菌体の自己消化物、菌体の超音波処理物、菌
体抽出物、あるいは精製酵素を、反応を阻害しない無機
または有機の溶媒中、好ましくは水性溶媒中でジアセチ
ルポリアミンに作用させることによりモノアセチルポリ
アミンを生成させることができる。また、菌体、粗酵素
抽出液、あるいは精製酵素を通常用いられる菌体、酵素
の固定化方法により固定化したものを用いることもでき
る。 【００１６】ジアセチルポリアミンの添加濃度は約１０
ｍＭ以上で、反応を阻害しない範囲であれば特に制限は
ない。作用させる温度は酵素の死活しない温度であれば
よく、通常約１０〜約５０℃、好ましくは約２５〜約４
０℃である。ｐＨは６〜１０好ましくは７〜９である。 【００１７】培養液に、ジアセチルポリアミンを添加す
る場合は、対数増殖期に添加することが好ましい。添加
する濃度は約１０ｍＭ以上で反応を阻害しない濃度であ
ればよい。 【００１８】また菌体を用いる場合は、上記培地で培養
した対数増殖期及び静止期の菌体を遠心分離により集め
、生理食塩水等で洗浄後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．０）等に菌体を懸濁し、ジアセチルポリアミンを約
１０ｍＭ以上で反応を阻害しない濃度で添加すればよい
。 【００１９】このようにして得た培養液あるいは、反応
液からのモノアセチルポリアミンの回収は、イオン交換
カラムクロマトグラフィー、結晶化等の公知の方法で行
うことができる。 【００２０】以上の諸方法のうち、ジアセチルポリアミ
ンの存在下に培養して得た菌体を分離し、超音波等によ
り細胞を破砕し得られた粗酵素抽出液を硫安分画、透析
、カラムクロマトグラフィー、ゲル濾過等により精製し
た酵素標品を用いるのが好ましい。このような標品の中
でアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅ
ｓ ｆａｅｃａ−ｌｉｓ ＩＦＯ １４４７９）、およ
びキャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉ
ｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩＦＯ ０４５４）、が生産し
たジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼを後記実施
例１８、又は同２０に従って精製した酵素標品について
以下に具体的に示す。 【００２１】ジアセチルプトレッシン０．２％を含む培
地にアルカリゲネス・フェカリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎ
ｅｓ ｆａｅｃａ−ｌｉｓ ＩＦＯ １４４７９）また
はキャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉ
ｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ ＩＦＯ ０４５４）を接種
し４０Ｌジャー・ファーメンターにて２８℃、２４〜４
８時間培養した後、培養液から菌体を分離し、超音波破
砕後、またはダイノミルにて菌体を破砕し得られた粗酵
素抽出液を、イオン交換カラムクロマトグラフィー、ゲ
ル濾過、疎水性カラムクロマトグラフィー等により精製
したジアセチルポリアミンアミドヒドロラーゼの理化学
的性質は次の通りである。 【００２２】〔アルカリゲネス属由来ジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼ〕 １． 作 用 ジアセチルポリアミンのアミド結合を加水分解してモノ
アセチルポリアミンを生成する。 ２． 基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、シアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると第１表のようになる。 ３． 至適 ｐＨ： ｐＨ ８．５〜９．５（第１
図）。 ４． ｐＨ安定性 ３０℃で３０分間保存した時、ｐＨ７．０〜９．０にお
いて９０％以上の残存活性を有する（第２図）。 【００２３】 第１表 ───────────────────────
─────────── 基
質
相対活性 （％） ───────
─────────────────────────
── ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
５．７ ジアセチル−１，３−ジアミノプロパン
６７．７ ジアセチルプトレッシン
１００ ジアセチルカダベリン
７８．７ ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン
９６．０ ジアセチル−１，８−ジアミノオクタン
２１．０ ジアセチルスペルミジン
５．５ ジアセチルスペルミン
３．８ ─────────────────────────
────────── ＊Ｎ１ −アセチルスペルリジン生成５．
至適温度 ｐＨ９．０、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る（第３図）。 ６． 温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、５３℃ま
での温度で９０％以上の残存活性を有し、６７℃、３０
分間の処理で完全に失活する（第４図）。 【００２４】〔キャンディダ属由来ジアセチルポリアミ
ンアミドヒドロラーゼ〕 １． 作 用 ジアセチルポリアミンのアミド結合を加水分解してモノ
アセチルポリアミンを生成する。 ２． 基質特異性 １０ｍＭの濃度における各基質に対する本酵素の相対活
性は、シアセチルプトレッシンに対する活性を１００と
して表示すると第２表のようになる。 【００２５】 第２表 ───────────────────────
─────────── 基
質
相対活性 （％） ───────
─────────────────────────
── ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
９１．９ ジアセチル−１，３−ジアミノプロパン
１７．８ ジアセチルプトレッシン
１００ ジアセチルカダベリン
６５．０ ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン
３９．４ ジアセチル−１，８−ジアミノオクタン
２６．３ ジアセチルスペルミジン
１０．０ ジアセチルスペルミン
１５．１ ─────────────────────────
────────── ＊Ｎ１ −アセチルスペルミジン生成 ３． 至適 ｐＨ： ｐＨ ７．０〜８．０（第５
図）。 ４． ｐＨ安定性 ３０℃で３０分間保存した時、ｐＨ５．５〜１１．３に
おいて９０％以上の残存活性を有する（第６図）。 ５． 至適温度 ｐＨ７．５、１５分間の反応において３７〜４２℃であ
る（第７図）。 ６． 温度安定性 ｐＨ７．５、３０分間の処理条件下において、３２℃ま
での温度で９０％以上の残存活性を有し、５５℃、３０
分間の処理で完全に失活する（第８図）。 【００２６】本発明におけるジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼの酵素活性測定方法及び、酵素活性の表
示方法は以下の通りである。 【００２７】２０ｍＭのジアセチルプトレッシン１．０
ｍｌと、アシルポリアミンアミドヒドロラーゼ（特公昭
５９−７４３５）６．８ユニット、プトレッシンオキシ
ダーゼ０．２８ユニット、パーオキシダーゼ０．９ユニ
ット、２．４−ジクロロフェノール０．７５ｍｇ、４−
アミノアンチピリン０．０６ｍｇを含む０．１Ｍトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１．０ｍｌジアセチルポリア
ミンアミドヒドロラーゼを含有する被検体５０μｌ を
混合し、３０℃で１時間反応させた後、５１０ｎｍにお
ける吸光度を測定することによって行われる。 【００２８】酵素活性値は、１分間当り１μｍｏｌｅの
モノアセチルプトレッシンを生成させる酵素量を１ユニ
ット（μｍｏｌｅ／ｍｉｎ）として表示する。 【００２９】 【実施例】実施例１〜１６ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．１
％食塩、０．２％ジアセチルプトレッシン、０．０５％
リン酸第一カリウム、０．１５％リン酸第二カリウム（
ｐＨ７．０）の培地各１０ｍｌを大型試験管に分注し、
１２０℃で１５分間オートクレーブしたものに、第２表
に示す各種微生物を斜面培養から、１白金耳接種し、２
８℃で２４〜１２０時間振とう培養した。培養終了後遠
心分離により菌体を集め、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．５）５ｍｌで洗浄した後、１０ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７．５）５ｍｌに懸濁して氷冷下で超音波処理（１
８０Ｗ、５〜１０分）した。この超音波処理液を遠心分
離して粗酵素抽出液を得た。粗酵素抽出液０．２ｍｌに
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１．０ｍｌ、お
よび２０ｍＭジアセチルプトレッシン０．８ｍｌを加え
て３０℃で３時間反応させた。５０％トリクロロ酢酸０
．２ｍｌを添加して反応を停止させた後、生成したモノ
アセチルプトレッシンを高速液体クロマトグラフィーに
より定量した。結果を第２表に示した。表中の生成モノ
アセチルプトレッシン（μｍｏｌｅ）は、３０℃、３時
間の反応で、０．２ｍｌの粗酵素抽出液の作用により生
成したモノアセチルプトレッシン量であり、培地１ｍｌ
当りの活性とは、粗酵素抽出液の酵素活性を元の培養液
の１ｍｌ当りに換算したものである。 【００３０】 【表１】 【００３１】実施例１７ ０．５％ポリペプトン、０．０１％酵母エキス、０．１
％食塩、０．０５％リン酸第一カリウム、０．１５％リ
ン酸第二カリウム、０．２％ジアセチルプトレッシン、
０．０２％消泡剤を含む培地（ｐＨ７．０）０．５Ｌを
２Ｌの三角フラスコに入れ１２０℃で２０分間オートク
レーブした後、アルカリゲネス・フェカリス（ Ａｌｃ
ａｌｉｇｅｎｅｓｆａｅｃａｌｉｓ ＩＦＯ １４４７
９）を植菌した。２８℃で４８時間振とう培養を行った
後、この培養液を予め上記と同様の組成を有する培地２
０Ｌを仕込み滅菌しておいたジャーファメンターに加え
て本培養を行った。培養条件は２８℃、攪拌回転数１０
０ｒｐｍ、通気２０Ｌ／ｍｉｎ で４８時間培養の後培
養液を遠心分離機にかけて菌体を採取した。 【００３２】得られた菌体の約２００ｇ（湿菌体重量）
を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１Ｌに懸濁し、
その懸濁液を超音波破砕機により菌体破砕を行った（２
２０Ｗ、８０ｍｉｎ ）。その破砕液を遠心分離機を使
用して遠心分離し、粗酵素抽出液を得、前記の酵素活性
の測定法により、活性測定を行わた。その結果、粗酵素
抽出液の酵素活性は、０．７１Ｕ／ｍｌであった。また
酵素活性値より３０℃１時間、粗酵素抽出液０．０５ｍ
ｌでモノアセチルプトレッシン２．１μｍｏｌｅを生成
したことになる。 【００３３】実施例１８ 実施例１７において、アルカリゲネス・フェカリス（
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓＩＦＯ
１４４７９）を培養した菌体から得られた粗酵素抽出液
を、予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したＤＥＡＥ−セルロースカラム（６００ｍｌ）に吸着
させ、食塩（０．１〜０．７Ｍ）の直線濃度勾配溶出を
行った。活性画分を集め限外濾過により脱塩した後、硫
酸アンモニウムを２０％となるように添加し、次いで予
め２０％の硫酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７．５）で平衡したブチルトヨパール６５０Ｍ
（東ソー社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸
アンモニウム（２０〜０％）の逆直線濃度勾配溶出を行
った。活性画分を集め、限外濾過により脱塩した後、次
いでセファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）カラ
ム（１．８Ｌ）のゲル濾過を行った。活性画分を集め、
次いで予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡
化したＥＡＨ−セファロース（ファルマシア社製）カラ
ム（４０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．６Ｍ）の直
線濃度勾配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過に
より脱塩した後、次いで予め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ
（東ソー社製）カラム（７０ｍｌ）に吸着させ、食塩（
０〜０．３５Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画
分を集め、限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウ
ムを１５％となるように添加し、次いで予め１５％の硫
酸アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸酸緩衝液（ｐＨ７
．５）で平衡化したフェニル−セファロース４Ｂ（ファ
ルマシア社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸
アンモニウム（１５〜０％）の逆直線濃度勾配溶出を行
った。活性画分を集め、限外濾過により脱塩を行い、タ
ンパク質３８．５ｍｇ含む精製酵素溶液３７ｍｌを得た
。該酵素の理化学的性質は前述のとおりである。この精
製酵素溶液０．０５ｍｌを用いた以外は、実施例１７と
全く同様にジアセチルプトレッシンの加水分解反応を行
った。その結果、精製酵素溶液の酵素活性は１３．０ユ
ニット／ｍｌ、比活性は、１２．５ユニット／ｍｇ−タ
ンパクであった。また酵素活性値より、３０℃、１時間
、精製酵素溶液０．０５ｍｌで、モノアセチルプトレッ
シン３９μｍｏｌｅ生成したことになる。 【００３４】実施例１９ キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌ
ｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩＦＯ ０４５４）を植菌するこ
と、培養時間が２４時間であること、およびダイノミル
により菌体破砕を行うこと以外は、実施例１７と全く同
様に粗酵素抽出液を得、酵素活性の測定を行った。その
結果、粗酵素抽出液の酵素活性は０．１１ユニット／ｍ
ｌであった。また酵素活性値より３０℃１時間、粗酵素
抽出液０．０５ｍｌでモノアセチルプトレッシン０．３
２μｍｏｌｅを生成しこたとになる。 【００３５】実施例２０ 実施例１９において、キャンディダ・ギラモンジ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉＩＦＯ ０
４５４）を培養した菌体から得られた粗酵素抽出液を予
め２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡したＤＥ
ＡＥ−セルロースカラム（１．５Ｌ）に吸着させ、食塩
（０〜０．５Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画
分を集め限外濾過により脱塩した後、硫酸アンモニウム
を２５％となるように添加し、次いで予め２５％の硫酸
アンモニウムを含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５
）で平衡化したフェニル−セファロース４Ｂ（ファルマ
シア社製）カラム（１００ｍｌ）に吸着させ、硫酸アン
モニウム（２５〜０％）の逆直線濃度勾配溶出を行った
。活性画分を集め、限外濾過により脱塩した後、次いで
セファクリルＳ−３００（ファルマシア社製）カラム（
１．８Ｌ）のゲル濾過を行った。活性画分を集め、次い
で予め２０ｍＭリン酸酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化
したＥＡＨ−セファロース（ファルマシア社製）カラム
（４０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０〜０．２５Ｍ）の直
線濃度勾配溶出を行った。活性画分を集め、限外濾過に
より脱塩した後、次いで予め２０ｍＭリン酸酸緩衝液（
ｐＨ７．５）で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０
Ｓ（東ソー社製）カラム（１０ｍｌ）に吸着させ、食塩
（０〜０．２Ｍ）の直線勾配溶出を行った。活性画分を
集め、限外濾過により脱塩した後、次いで予め１０ｍＭ
リン酸酸緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した、ＤＥＡＥ
−セルロースカラム（２０ｍｌ）に吸着させ、食塩（０
〜０．２Ｍ）の直線濃度勾配溶出を行った。活性画分を
集め、限外濾過により脱塩を行い、タンパク質１．９ｍ
ｇを含む精製酵素溶液７．０ｍｌを得た。該酵素の理化
学的性質は前述のとおりである。この精製酵素溶液０．
０５ｍｌを用いた他は、実施例１７と全く同様にジアセ
チルプトレッシンの加水分解反応を行った。その結果、
精製酵素溶液の酵素活性は３．６ユニット／ｍｌ、比活
性は１３．２ユニット／ｍｇ−タンパクであった。また
酵素活性値により、３０℃、１時間、精製酵素活性０．
０５ｍｌで、モノアセチルプトレッシン１１μｍｏｌｅ
生成したことになる。 【００３６】実施例２１ 実施例１８で得られた精製酵素溶液０．０５ｍｌを各種
ジアセチルポリアミンの１００ｍＭ溶液０．１ｍｌ、０
．１Ｍ炭酸酸緩衝液（ｐＨ９．０）０．８５ｍｌから成
る反応液に添加し、３７℃で１５分間反応を行った。５
０％トリクロロ酢酸０．１ｍｌを添加して反応を停止さ
せた後、生成したモノアセチルポリアミンを高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量した。結果を第３表に示す
。 【００３７】 第３表 ───────────────────────
─────────── ジアセチルポ
リアミン モノアセチルポリア
ミン生成量
（１０３ ×μｍｏｌｅ） ──────────
────────────────────────
ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
１１．７ ジアセチル−１，３−
ジアミノプロパン １３５ ジア
セチルプトレッシン
９０２ ジアセチルカダベリン
７１０
ジアセチル−１，６−ジアミノヘキサン
８６６ ジアセチル−１，８−ジアミ
ノオクタン １８９ ジアセチル
スペルミジン
４９．６＊ ジアセチルスペルミン
３４．３ ──────────────────
──────────────── ＊Ｎ１ −
アセチルスペルミジン生成 【００３８】実施例２２ 実施例２０で得られた精製酵素溶液０．０５ｍｌを各種
ジアセチルポリアミンの１００ｍＭ溶液０．１ｍｌ、０
．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）０．８５ｍｌから成
る反応液に添加し、３７℃で１５分間反応を行った。５
０％トリクロロ酢酸０．１ｍｌを添加して反応を停止さ
せた後、生成したモノアセチルポリアミンを高速液体ク
ロマトグラフィーにより定量した。結果を第４表に示す
。 【００３９】 第４表 ───────────────────────
─────────── ジアセチルポ
リアミン モノアセチルポリア
ミン生成量
（１０３ ×μｍｏｌｅ） ──────────
────────────────────────
ジアセチル−１，２−ジアミノエタン
６８２ ジアセチル−１，３
−ジアミノプロパン １３２
ジアセチルプトレッシン
７４２ ジアセ
チルカダベリン
４８２ ジアセチル−１，
６−ジアミノヘキサン ２９２
ジアセチル−１，８−ジアミノオクタン
１９５ ジアセチルスペルミ
ジン
４７．２＊ ジアセチルスペルミン
１１２ ─────────────────
───────────────── ＊Ｎ１
−アセチルスペルミジン生成 【００４０】実施例２３ 実施例１７および１９で得られた菌体各０．５ｇを２０
％ジアセチルプトレッシンを含む５０ｍＭリン酸酸緩衝
液（ｐＨ７．５）２．０ｍｌに添加し、３０℃で２０時
間反応させた後、遠心分離により菌体を取り除いた。上
清液に５０％トリクロロ酢酸０．２ｍｌを加えて反応を
停止した後、生成したモノアセチルプトレッシンを高速
液体クロマトグラフィーにより定量した。結果を第５表
に示す。 【００４１】 第５表 ───────────────────────
─────────── 微
生 物 名
モノアセチルプトレッシン
（μｍｏｌｅ） ───
─────────────────────────
────── アルカリゲネス・フェカリス
６８０
キャンディダ・ギラモンジ
５３６ ───────
─────────────────────────
── 【００４２】実施例２４〜３９ 実施例１〜１６で得られた各種微生物の培養液を用いた
以外は、実施例１〜１６と全く同様にしてジアセチルプ
トレッシンの加水分解を行った。結果を第６表に示す。 表中の生成モノアセチルプトレッシン量は、３０℃、３
時間の反応で０．２ｍｌの培養液の作用により生成した
量である。 【００４３】 【表２】 【００４４】 【発明の効果】本発明により、医農薬中間体として有用
なモノアセチルポリアミンを、穏和な条件で、収率よく
製造することができる。また、ジアセチルポリアミンに
作用するアミドヒドロラーゼを工業的に利用できる技術
を提供する。 【００４５】実施例により本発明をさらに具体的に以下
に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるも
のではない。
【図１】アルカリゲネス属由来ジアセルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。
ドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。
【図２】同酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図３】同酵素の温度活性曲線を示す図である。
【図４】同酵素の温度安定性を示す図である。
【図５】キャンディダ属由来ジアセチルポリアミンアミ
ドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。
ドヒドロラーゼのｐＨ活性曲線を示す図である。
【図６】同酵素のｐＨ安定性を示す図である。
【図７】同酵素の温度活性曲線を示す図である。
【図８】同酵素の温度安定性を示す図である。
Claims (2)
- 【請求項１】 ジアセチルポリアミンを、ジアセチル
ポリアミンアミドヒドロラーゼの存在下に加水分解する
ことを特徴とするモノアセチルポリアミンの製造方法。 - 【請求項２】 ジアセチルポリアミンを、アルカリゲ
ネス属、シュードモナス属、エシエリヒア属、アエロバ
クター属、セラチア属、ストレプトミセス属、ノカルデ
ィア属、ミコバクテリウム属、アスペルギルス属、ムコ
ール属、フザリウム属、ケトミウム属、デバリオミセス
属、キャンディダ属、ロドトルラ属、およびトリコスポ
ロンよりなる群から選ばれた属に属する微生物の培養液
、菌体、又は菌体処理物の存在下に加水分解することを
特徴とするモノアセチルポリアミンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41529090A JP2793720B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | モノアセチルポリアミンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP41529090A JP2793720B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | モノアセチルポリアミンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04234992A true JPH04234992A (ja) | 1992-08-24 |
| JP2793720B2 JP2793720B2 (ja) | 1998-09-03 |
Family
ID=18523664
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP41529090A Expired - Fee Related JP2793720B2 (ja) | 1990-12-27 | 1990-12-27 | モノアセチルポリアミンの製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2793720B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4847456B2 (ja) * | 2005-08-26 | 2011-12-28 | キッコーマン株式会社 | 新規な酵素及びその製造方法並びに該酵素を用いるモノアセチルポリアミンの製造方法 |
-
1990
- 1990-12-27 JP JP41529090A patent/JP2793720B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP4847456B2 (ja) * | 2005-08-26 | 2011-12-28 | キッコーマン株式会社 | 新規な酵素及びその製造方法並びに該酵素を用いるモノアセチルポリアミンの製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2793720B2 (ja) | 1998-09-03 |
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