WO2021039611A1 - ペントシジンの測定方法及び測定用キット - Google Patents

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WO2021039611A1
WO2021039611A1 PCT/JP2020/031553 JP2020031553W WO2021039611A1 WO 2021039611 A1 WO2021039611 A1 WO 2021039611A1 JP 2020031553 W JP2020031553 W JP 2020031553W WO 2021039611 A1 WO2021039611 A1 WO 2021039611A1
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WO
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amino acid
seq
pentosidine
activity
protein
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Application number
PCT/JP2020/031553
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English (en)
French (fr)
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和也 丸島
チェン，イーシン
カルティカサリ リアント，ディアン
佐藤　拓也
敦 一柳
康子 荒木
Original Assignee
キッコーマン株式会社
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring pentosidine and the like, and more specifically, to a method for measuring pentosidine and the like for reducing measurement errors and obtaining accurate measured values.
  • Pentosidine ((2S) -2-amino-6- [2-[[(4S) -4-amino-4-carboxybutyl] amino] imidazo [4,5-b] pyridin-4-yl] hexanoic acid) It has a structure in which pentos and equimolar lysine and arginine are crosslinked, and it is known that it accumulates in human skin in correlation with aging and the onset of diabetes, especially in the onset of diabetes and end-stage nephropathy. ing.
  • Pentosidine can be quantified by HPLC using its fluorescence (Ex: 335 nm, Em: 385 nm) as an index after acid hydrolysis, and an immunochemical method using a monoclonal antibody against pentosidine (for example, ELISA method) is used. It is known that it can be quantified.
  • Pentosidine is known to be associated with schizophrenia in addition to aging and diabetes.
  • a method for testing schizophrenia which comprises a step of measuring the amount of pentosidine in a biological sample, is disclosed ( For example, see Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a simple and inexpensive method for measuring pentosidine as compared with an immunochemical method or an instrumental analytical method using a novel enzyme, and in particular, it reduces measurement error and makes accurate measurement. It is an object of the present invention to provide a method for measuring pentosidine to obtain a value.
  • the present inventors have found that a novel enzyme identified from filamentous fungi is useful for the quantification of pentosidine, and found that the measurement error can be further reduced by using this enzyme in combination with an amino acid-degrading enzyme. Has been completed.
  • the outline of the present invention is as follows.
  • [1] A method for measuring pentosidine in a sample. The process of degrading a sample with an amino acid-degrading enzyme, A step of contacting the sample after the decomposition step with a protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine, and a step of detecting changes caused by the contact. The method for measuring the amino acid-degrading enzyme and the protein having an activity of oxidatively degrading the pentosidine.
  • [2] The measuring method according to [1], wherein a change in the amount of oxygen, hydrogen peroxide or ammonia is detected in the detection step.
  • the protein having the activity of oxidatively degrading pentosidine has the following physicochemical properties: (1) Action: Oxidative degradation of pentosidine; and (2) Molecular weight by SDS-PAGE: 75,000-85,000 The measuring method according to [1] or [2].
  • the proteins having the activity of oxidatively degrading the pentosidine are the following (a) to (f): (A) A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; (B) A protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6; (C) A protein consisting of an amino acid sequence having 75% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; (D) A protein encoded by a gene consisting of a base sequence having 75% or more identity with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6; (E) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 are deleted, substituted and
  • the protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine is pentosidine oxidase.
  • amino acid degrading enzyme according to any one of [1] to [7], wherein the amino acid degrading enzyme is selected from the group consisting of amino acid oxidase, amino acid dehydrogenase, amino acid aminotransferase, amino acid decarboxylase, amino acid ammonia lyase, amino acid oxygenase and amino acid hydrolase. Measuring method.
  • a kit for measuring pentosidine in a sample which comprises (i) an amino acid degrading enzyme; and (ii) a protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine.
  • the proteins having the activity of oxidatively degrading the pentosidine are the following (a) to (f): (A) A protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; (B) A protein encoded by a gene consisting of the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6; (C) A protein consisting of an amino acid sequence having 75% or more identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4; (D) A protein encoded by a gene consisting of a base sequence having 75% or more identity with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 6; (E) A protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 are deleted, substituted and
  • the amino acid degrading enzyme is an enzyme that degrades an amino acid selected from arginine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and tyrosine.
  • a method for producing a reaction product of pentosidine derived from a sample The process of degrading a sample with an amino acid-degrading enzyme, A method comprising contacting a sample after the degradation step with a protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine, wherein the amino acid degrading enzyme and the protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine are different.
  • the amino acid decomposition enzyme including California sea hare (Aplysia californica) derived Esukapin (Escapin) and / or Crotalus Adamanteus (Crotalus adamanteus) derived amino acid oxidase, measuring method according to any one of [1] to [8].
  • pentosidine can be easily and quickly detected and quantified by an enzymatic method, and at that time, measurement error is reduced and an accurate measured value can be obtained.
  • FIG. 1 shows the results of a substrate concentration-dependent test of a crude enzyme solution (Elution 1) fractionated from Sarocladium sp. Using anion exchange chromatography. The ⁇ OD (vertical axis) with respect to the final pentosidine concentration (horizontal axis) is plotted. The data 20 minutes after the start of the reaction was used.
  • FIG. 2 shows the results of a heat deactivation test of a crude enzyme solution (Elution 1). The result is an analysis of the inactivation of the enzyme activity due to the heat treatment, and corresponds to the data 20 minutes after the start of the reaction.
  • FIG. 3 shows the results of measuring the concentration of hydrogen peroxide produced by reacting pentosidine and pentosidine oxidase.
  • FIG. 4 shows the relationship between the final concentration of pentosidine and the amount of increase in A 658 ( ⁇ A) due to the oxidation of pentosidine.
  • FIG. 5 shows an estimation mechanism of the reaction in which pentosidine oxidase decomposes pentosidine. In the figure, it is described that each amino group of lysine and arginine constituting pentosidine is oxidatively deaminated to generate hydrogen peroxide and ammonia.
  • FIG. 6A shows the sequences of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
  • FIG. 6B shows the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4.
  • FIG. 6C shows the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6.
  • FIG. 6D shows the sequences of SEQ ID NO: 7 to SEQ ID NO: 11.
  • FIG. 6E shows the sequences of SEQ ID NO: 12 to SEQ ID NO: 14.
  • FIG. 7 shows the optimum pH range of PenOX2.
  • FIG. 8 shows the optimum temperature range of PenOX2.
  • FIG. 9 shows the range of thermal stability of PenOX2.
  • FIG. 10 shows the stable pH range of PenOX2.
  • FIG. 11 shows the Km value of PenOX2 with respect to pentosidine.
  • FIG. 12 shows the molecular weight of PenOX2.
  • FIG. 13 shows the substrate specificity of the amino acid degrading enzyme 1 measured in Example 13.
  • FIG. 14 shows the substrate specificity of the amino acid degrading enzyme 2 measured in Example 14.
  • FIG. 15 shows the substrate specificity of pentosidine oxidase measured in Example 15.
  • the present embodiment a method for measuring pentocidin, which is one aspect of the present invention (hereinafter, also referred to as “the present embodiment”), will be described, but the technical scope of the present invention is limited only by the matters of this item. However, the present invention may take various aspects as long as the object is achieved.
  • the present embodiment relates to a method for measuring pentosidine in a sample.
  • pentosidine has a structure in which equimolar lysine and arginine are crosslinked with pentose.
  • the "protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine" used in the measuring method of the present embodiment is not limited as long as it is a protein having such a degrading activity, and pentosidine oxidase and pentosidine dehydrogenase having pentosidine oxidase activity. Includes active pentosidine dehydrogenase.
  • pentosidine oxidase activity refers to the activity of oxidatively degrading pentosidine, more specifically, the oxidation of pentosidine and its deamination products, hydrogen peroxide, and ammonia. It means the activity of producing or consuming oxygen.
  • pentocidin dehydrogenase activity refers to the activity of oxidatively degrading pentocidin, more specifically, the deamination product of oxidizing pentocidin and its reduced coenzyme. It means the activity of producing ammonia or the activity of consuming oxidized coenzyme.
  • coenzyme referred to here include flavin adenine dinucleotide (FAD), flavin mononucleotide (FMN), nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP).
  • the reduced coenzyme may further reduce the mediator.
  • the mediator is not particularly limited as long as it can transfer electrons to and from the coenzyme contained in the pentosidine dehydrogenase of the present invention.
  • Mediators include, for example, quinones, phenazines, ferricianides, osmium salts or complexes, ruthenium salts or complexes, nitrosanilines, aminoanilines, viologens, cytochromes, phenoxazines, phenothiazines, ferredoxins, ferrocenes. Types, derivatives thereof, etc., but are not limited to these.
  • quinones include naphthoquinones and derivatives thereof (for example, naphthoquinone-4-sulfonic acid), phenanthroline quinones and derivatives thereof, phenanthrenquinone and derivatives thereof, and phenazines include, for example, phenazinemethsulfate (PMS) and its derivatives.
  • PMS phenazinemethsulfate
  • the ferricianide can be, for example, potassium ferricyanide
  • the osmium salt or complex can be, for example, osmium chloride, hexaammine osmium, ruthenium.
  • Examples of the salt or complex include ruthenium chloride and hexaammine ruthenium, and examples of nitrosoanilines include, for example, N, N-dimethyl-4-nitrosoaniline, N, N-bis-hydroxyethyl-4-nitrosoaniline and them. , But not limited to.
  • Other mediators also known to those skilled in the art can be mentioned. In the present specification, unless otherwise specified, the term mediator does not include oxygen and hydrogen peroxide.
  • any protein and a gene encoding the same are intended to be included in the scope of the present embodiment.
  • the proteins having an activity of oxidatively degrading pentosidine the nucleotide sequence and amino acid sequence of pentosidine oxidase will be described below by taking an enzyme derived from a filamentous fungus of the genus Sarocladium as an example.
  • amino acid sequence of pentosidine oxidase is not particularly limited as long as it has the above-mentioned enzymatic activity.
  • a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 can be mentioned.
  • the proteins having the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 may be referred to as pentosidine oxidase 1 (or PenOX1) and pentosidine oxidase 2 (or PenOX2), respectively.
  • the gene encoding pentosidine oxidase 1 (g4462) is expected to be composed of 6 exons and 5 introns, while the gene encoding pentosidine oxidase 2 (g10122) is composed of 2 exons and 1 intron. It is expected that.
  • the pentosidine oxidase having the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 is derived from a filamentous fungus of the genus Sarocladium.
  • the base sequences of the genes encoding these enzymes are the base sequences shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively.
  • FIG. 6 shows the amino acid sequence and the base sequence of the enzyme.
  • amino acid sequence of pentocidin oxidase has the above-mentioned enzymatic activity of pentocidin oxidase
  • one to a plurality of amino acid sequences of wild-type enzymes such as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, for example, in the amino acid sequence.
  • the number of amino acids is 100 as one unit, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, etc., per unit. It may consist of an amino acid sequence having 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25, preferably several amino acid deletions, substitutions, additions and the like.
  • the range of "1 to several” in “deletion, substitution, addition of one to several amino acids” of the amino acid sequence is not particularly limited, but one unit is preferably 1, 2, 3, 4 per unit. It means about 5, 6, 7, 8, 9 or 10, more preferably about 1, 2, 3, 4 or 5.
  • amino acid deletion means that an amino acid residue in the sequence is missing or eliminated
  • amino acid substitution means that an amino acid residue in the sequence is replaced with another amino acid residue.
  • addition of amino acid means that a new amino acid residue is added to the sequence so as to be inserted.
  • amino acid deletion, substitution, addition there is an embodiment in which an amino acid is replaced with another chemically similar amino acid as long as the pentosidine oxidase activity is maintained.
  • an amino acid is replaced with another chemically similar amino acid as long as the pentosidine oxidase activity is maintained.
  • a case where one hydrophobic amino acid is replaced with another hydrophobic amino acid a case where a certain polar amino acid is replaced with another polar amino acid having the same charge, and the like can be mentioned.
  • Such chemically similar amino acids are known in the art for each amino acid.
  • non-polar (hydrophobic) amino acids such as alanine, valine, isoleucine, leucine, proline, tryptophan, phenylalanine, and methionine.
  • polar (neutral) amino acids include glycine, serine, threonine, tyrosine, glutamine, asparagine, and cysteine.
  • positively charged basic amino acids include arginine, histidine, and lysine.
  • negatively charged acidic amino acids include aspartic acid and glutamic acid.
  • amino acid sequence of pentocidin oxidase an amino acid sequence having a certain degree of sequence identity with the amino acid sequence of wild-type enzymes such as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 can be mentioned, for example, the amino acid sequence of pentocidin oxidase.
  • amino acid sequence of pentocidin oxidase examples thereof include amino acid sequences having 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more identity.
  • pentosidine oxidase gene The gene encoding pentosidine oxidase (hereinafter, may be referred to as “pentosidine oxidase gene”) is not particularly limited as long as it contains a base sequence encoding the amino acid sequence possessed by the above-mentioned enzyme having pentosidine oxidase activity.
  • pentosidine oxidase is produced by expressing the pentosidine oxidase gene in the transformant.
  • Gene expression in the present specification means that the enzyme encoded by the gene is produced in a manner having the original catalytic activity through transcription, translation, or the like.
  • gene expression includes high expression of a gene, that is, that the insertion of a gene produces an enzyme encoded by the gene in excess of the amount originally expressed by the host organism. To do.
  • pentosidine oxidase gene is a gene that can generate pentosidine oxidase via splicing after transcription of the gene when introduced into a host organism, pentosidine oxidase can be produced without passing through splicing after transcription of the gene. It may be a gene that can be produced.
  • the pentosidine oxidase gene does not have to be exactly the same as the gene originally possessed by the origin organism such as Salocladium filamentous fungus (that is, the wild-type gene), as long as it is a gene encoding the above-mentioned enzyme having pentosidine oxidase activity.
  • DNA having a base sequence complementary to the base sequence of the wild-type gene and a base sequence that hybridizes under stringent conditions may be used.
  • base sequence that hybridizes under stringent conditions refers to a colony using DNA corresponding to a part of the base sequence of a wild-type gene such as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 3. It means the base sequence of DNA obtained by using a hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern blot hybridization method, or the like.
  • stringent condition is a condition in which a specific hybrid signal is clearly distinguished from a non-specific hybrid signal, and the hybridization system to be used, the type and sequence of the probe. And depends on the length. Such conditions can be determined by varying the hybridization temperature, washing temperature and salt concentration.
  • the specificity when a non-specific hybrid signal is strongly detected, the specificity can be increased by raising the temperature of hybridization and washing and, if necessary, lowering the salt concentration of washing. If no specific hybrid signal is also detected, the hybrid can be stabilized by lowering the hybridization and wash temperatures and, if necessary, increasing the wash salt concentration.
  • specific examples of stringent conditions include: For example, a DNA probe is used as a probe, and hybridization is performed with 5 ⁇ SSC, 1.0% (w / v) nucleic acid hybridization blocking reagent (manufactured by Boehringer Manheim), 0.1% (w / v) N. -Lauroyl sarcosine and 0.02% (w / v) SDS are used overnight (about 8 to 16 hours). Washing was performed twice with 0.1 to 0.5 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% (w / v) SDS for 15 minutes. Do. The temperature at which hybridization and washing are performed is 65 ° C. or higher, preferably 68 ° C. or higher.
  • the DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions for example, a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or plaque or a filter in which a fragment of the DNA is immobilized is used to use the above-mentioned string.
  • a DNA having a base sequence of a wild-type gene derived from a colony or plaque or a filter in which a fragment of the DNA is immobilized is used to use the above-mentioned string.
  • a 0.1 to 1 ⁇ SSC solution 150 mM sodium chloride, 15 mM sodium citrate for the 1 ⁇ SSC solution was used, and the filter was filtered under 65 ° C. conditions.
  • Examples of the DNA containing the base sequence that hybridizes under stringent conditions include DNA having a certain degree of sequence identity with the base sequence of the DNA having the base sequence of the wild-type gene used as a probe. Examples thereof include DNA having a sequence identity of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more with the base sequence of the type gene.
  • the base sequence of the wild-type gene As a base sequence that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence of a wild-type gene under stringent conditions, for example, if the number of bases in the base sequence is 500 as one unit, the base sequence of the wild-type gene , 1 to plural, for example, 1 to 125, 1 to 100, 1 to 75, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 20, preferably 1 to several, per unit. For example, it contains a base sequence having 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 base deletions, substitutions, additions, and the like.
  • base deletion means that a base in the sequence is missing or lost
  • base substitution means that the base in the sequence is replaced with another base.
  • Additional of base means that a new base has been added to be inserted.
  • Enzymes encoded by a base sequence complementary to the base sequence of a wild-type gene and a base sequence that hybridizes under stringent conditions are one to more than one in the amino acid sequence of the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene. It is likely that the enzyme has an amino acid sequence having deletions, substitutions, additions, etc. of several amino acids, preferably several amino acids, but has the same enzymatic activity as the enzyme encoded by the base sequence of the wild-type gene. ..
  • the gene encoding the enzyme is a base sequence encoding an amino acid sequence that is the same as or similar to the amino acid sequence possessed by the enzyme encoded by the wild-type gene by utilizing the fact that there are several types of codons corresponding to one amino acid. It may contain a base sequence different from that of the wild-type gene. Examples of the base sequence obtained by modifying the base sequence of such a wild-type gene include the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 (penox1) in which the codon of g4462 is modified, and the sequence in which the codon of g10122 is modified. No. 6 (penox2) and the like can be mentioned (FIG. 6C).
  • the codon-modified base sequence is preferably, for example, a codon-modified base sequence so that it can be easily expressed in a host organism.
  • the method for determining the sequence identity of a base sequence or an amino acid sequence is not particularly limited, but for example, a commonly known method is used to target the amino acid sequence of a wild-type gene or an enzyme encoded by a wild-type gene. It is obtained by aligning the base sequence and amino acid sequence and using a program for calculating the matching rate of both sequences.
  • a person skilled in the art can search a database for a sequence showing high sequence identity for a given sequence, for example, by using the above program. These are available, for example, on the website (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) on the Internet of the National Center for Biotechnology Information in the United States.
  • Each of the above methods can be usually used to search a database for sequences showing sequence identity, but as a means for determining the sequence identity of individual sequences, Genetyx network version version 12.0. Homology analysis of 1 (manufactured by Genetics) can also be used. This method is based on the Lipman-Pearson method (Science 227: 1435-1441, 1985). When analyzing the sequence identity of the base sequence, the region encoding the protein (CDS or ORF) is used if possible.
  • CDS or ORF region encoding the protein
  • the gene encoding the enzyme is derived from a species capable of producing pentosidine oxidase.
  • examples of the organism from which the gene encoding the enzyme is derived include microorganisms such as filamentous fungi.
  • microorganisms capable of producing pentosidine oxidase include the genus Sarocladium .
  • the organism from which the gene encoding the enzyme is derived is not particularly limited, but the enzyme expressed in the transformant is preferably not inactivated by the growth conditions of the host organism and exhibits activity. Therefore, the organism from which the gene encoding the enzyme is derived is preferably a microorganism whose growth conditions are similar to those of the host organism to be transformed by inserting the gene encoding the enzyme.
  • pentosidine oxidase activity When stored at 40 ° C. for 10 minutes, pentosidine oxidase activity is retained at 50% or more.
  • -PH stability Pentosidine oxidase activity is maintained at 60% or more in the range of pH 4.0 to 9.0.
  • -Km value The Km value for pentosidine is 1 mM or less.
  • the Km value is a Michaelis constant, and the specific calculation method thereof is not particularly limited, and a known method can be freely selected and calculated.
  • the Km value can be calculated according to the Michaelis-Menten formula drawn by the Lineweaver-Burk plot method, as in the method described in Example 9 described later.
  • the gene encoding the enzyme can be inserted into a variety of suitable known vectors. Furthermore, this vector can be introduced into a suitable known host organism to prepare a transformant into which a recombinant vector (recombinant DNA) containing a gene encoding an enzyme has been introduced.
  • the method for obtaining the gene encoding the enzyme, the base sequence of the gene encoding the enzyme, the method for obtaining the amino acid sequence information of the enzyme, the method for producing various vectors, the method for producing the transformant, etc. should be appropriately selected by those skilled in the art. Can be done.
  • the transformant and the transformant include the transductant and the transduced substance, respectively. An example of cloning a gene encoding an enzyme will be described later without limitation.
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted from a microorganism or various cells capable of producing an enzyme by a conventional method, for example, the method described in the reference technical literature (above).
  • CDNA can be synthesized using the extracted mRNA as a template.
  • a library of chromosomal DNA and cDNA can be prepared.
  • the gene encoding the enzyme can be obtained by cloning using the chromosomal DNA or cDNA of the organism of origin carrying the gene as a template.
  • the organism from which the gene encoding the enzyme is derived is not particularly limited, and examples thereof include the above-mentioned Sarocladium sp.
  • Sarocladium sp For example, by culturing Sarocladium sp., Removing water from the obtained cells, and physically grinding them in a mortar while cooling in liquid nitrogen, the cells are in the form of fine powder.
  • the chromosomal DNA fraction is extracted from the bacterial cell piece by a usual method.
  • a commercially available chromosomal DNA extraction kit such as DNeasy Plant Mini Kit (manufactured by Qiagen) can be used.
  • the DNA is amplified by performing a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as "PCR") using the chromosomal DNA as a template and primers complementary to the 5'end sequence and the 3'end sequence.
  • the primer is not particularly limited as long as it can amplify a DNA fragment containing the gene.
  • a DNA containing the gene fragment of interest can be amplified by appropriate PCR such as the 5'RACE method or the 3'RACE method, and these can be ligated to obtain a DNA containing the full-length target gene.
  • the method for obtaining the gene encoding the enzyme is not particularly limited, and it is possible to construct the gene encoding the enzyme by using, for example, a chemical synthesis method without using a genetic engineering method.
  • the base sequence of the amplified product amplified by PCR or the chemically synthesized gene can be confirmed, for example, as follows. First, a recombinant DNA is prepared by inserting the DNA whose sequence is to be confirmed into an appropriate vector according to a usual method.
  • kits such as TA Cloning Kit (Invitrogen); pUC19 (Takarabio), pUC18 (Takarabio), pBR322 (Takarabio), plasmid SK + (Stratagene)
  • plasmid vector DNA such as (manufactured by Invitrogen), pYES2 / CT (manufactured by Invitrogen); commercially available bacteriophage vector DNA such as ⁇ EMBL3 (manufactured by Stratagene) can be used.
  • the recombinant DNA is used to transform a host organism, such as Escherichia coli , preferably Escherichia coli JM109 strain (Takara Bio Inc.) or Escherichia coli DH5 ⁇ strain (Takara Bio Inc.). To do. Recombinant DNA contained in the obtained transformant may be purified using QIAGEN Plasmamid Mini Kit (manufactured by Qiagen) or the like.
  • the base sequence of each gene inserted into the recombinant DNA can be determined by the dideoxy method (Methods in Enzymology, 101, 20-78, 1983) or the like.
  • the sequence analyzer used for determining the base sequence is not particularly limited, and for example, Li-COR MODEL 4200L sequencer (manufactured by Aloka), 370 DNA sequence system (manufactured by PerkinElmer), CEQ2000XL DNA analysis system (manufactured by Beckman). ) And so on. Then, based on the determined base sequence, the amino acid sequence of the protein to be translated, that is, the enzyme can be known.
  • a recombinant vector (recombinant DNA) containing a gene encoding an enzyme binds a PCR amplification product containing any of the genes encoding the enzyme with various vectors in a form capable of expressing the gene encoding the enzyme. It can be constructed by doing. For example, it can be constructed by cutting out a DNA fragment containing any of the genes encoding the enzyme with an appropriate restriction enzyme and ligating the DNA fragment with a plasmid cleaved with an appropriate restriction enzyme.
  • a DNA fragment containing the gene having a sequence homologous to the plasmid added to both ends and a DNA fragment derived from the plasmid amplified by inverse PCR can be obtained from a commercially available product such as In-Fusion HD Cloning Kit (manufactured by Clontech). It can be obtained by ligating using a recombinant vector preparation kit.
  • the method for producing the transformant is not particularly limited, and examples thereof include a method of inserting the transformant into the host organism in a manner in which the gene encoding the enzyme is expressed according to a conventional method.
  • a method of inserting the transformant into the host organism in a manner in which the gene encoding the enzyme is expressed according to a conventional method.
  • by creating a DNA construct in which any of the genes encoding the enzyme is inserted between the expression-inducing promoter and the terminator and then transforming the host organism with a DNA construct containing the gene encoding the enzyme. , A transformant overexpressing the gene encoding the enzyme is obtained.
  • a DNA fragment consisting of an expression-inducing promoter-a gene encoding an enzyme-a terminator prepared for transforming a host organism and a recombinant vector containing the DNA fragment are collectively referred to as a DNA construct.
  • the method of inserting into the host organism in a manner in which the gene encoding the enzyme is expressed is not particularly limited, but for example, a method of directly inserting into the host organism's chromosome by utilizing homologous recombination or non-homologous recombination. ; Examples include a method of introducing into a host organism by linking on a plasmid vector.
  • a DNA construct can be ligated between the sequences homologous to the upstream and downstream regions of the recombination site on the chromosome and inserted into the genome of the host organism.
  • the homologous sequence can be inserted into the genome of the host organism even when the homologous sequence is not linked to the DNA construct.
  • the highly expressed promoter is not particularly limited, but for example, the promoter region of the TEF1 gene (tef1), which is a translation elongation factor, the promoter region of the ⁇ -amylase gene (amy), the alkaline protease gene (alp) promoter region, and glyceraldehyde-3.
  • TEF1 gene tef1
  • my ⁇ -amylase gene
  • alp alkaline protease gene
  • glyceraldehyde-3 glyceraldehyde-3.
  • gpd phosphate dehydrogenase
  • the DNA construct can be incorporated into a plasmid vector used for transformation of a host organism by a conventional method, and the corresponding host organism can be transformed by a conventional method.
  • Such a suitable vector-host system is not particularly limited as long as it can produce an enzyme in the host organism, and is, for example, pUC19 and a filamentous fungus system, pSTA14 (Mol. Gen. Genet. 218,). 99-104, 1989) and filamentous fungal systems and the like.
  • the DNA construct is preferably used by introducing it into the chromosome of the host organism, but as another method, the DNA construct is added to an autonomous replication type vector (Ozeki et al. Bioscii. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)). By incorporating it, it can be used without being introduced into the chromosome.
  • an autonomous replication type vector Zeki et al. Bioscii. Biotechnol. Biochem. 59, 1133 (1995)
  • the DNA construct may contain a marker gene that allows selection of transformed cells.
  • the marker gene is not particularly limited, and examples thereof include genes that complement the auxotrophy of the host organism, such as pyrG, niaD, and adeA; drug resistance genes to drugs such as pyrithiamine, hygromycin B, and oligomycin.
  • the DNA construct also preferably contains a promoter, terminator or other regulatory sequence (eg, enhancer, polyadenylation sequence, etc.) that allows the gene encoding the enzyme to be overexpressed in the host organism.
  • the promoter is not particularly limited, and examples thereof include an appropriate expression-inducing promoter and a constitutive promoter, and examples thereof include a tef1 promoter, an alp promoter, an amy promoter, and a gpd promoter.
  • the terminator is also not particularly limited, and examples thereof include an alp terminator, an amy terminator, and a tef1 terminator.
  • the expression control sequence of the gene encoding the enzyme is not always necessary when the DNA fragment containing the gene encoding the enzyme to be inserted contains a sequence having an expression control function.
  • the DNA construct may not have a marker gene.
  • the DNA construct can be tagged for purification.
  • purification using a nickel column can be enabled by appropriately connecting a linker sequence upstream or downstream of the gene encoding the enzyme and connecting 6 or more codons of the base sequence encoding histidine.
  • the DNA construct may contain homologous sequences required for marker recycling.
  • the pyrG marker adds a sequence homologous to the sequence upstream of the insertion site (5'homologous recombination region) downstream of the pyrG marker, or the insertion site (3'homologous recombination region) upstream of the pyrG marker.
  • the pyrG marker can be shed on a medium containing 5-fluoroorothic acid (5FOA).
  • the length of the homologous sequence suitable for marker recycling is preferably 0.5 kb or more.
  • DNA construct is, for example, a DNA construct in which the tef1 gene promoter, the gene encoding the enzyme, the alp gene terminator, and the pyrG marker gene are linked to the In-Fusion Cloning Site at the multi-cloning site of pUC19.
  • One aspect of the DNA construct when inserting a gene by homologous recombination is to link a 5'homologous recombination sequence, a tef1 gene promoter, a gene encoding an enzyme, an alp gene terminator and a pyrG marker gene, and a 3'homologous recombination sequence. It is a DNA construct.
  • DNA construct when a gene is inserted by homologous recombination and the marker is recycled is a 5'homologous recombination sequence, a tef1 gene promoter, a gene encoding an enzyme, an alp gene terminator, and a homologous marker for marker recycling. It is a DNA construct in which a sequence, a pyrG marker gene, and a 3'homologous recombination sequence are linked.
  • the host organism is a filamentous bacterium
  • a method known to those skilled in the art can be appropriately selected as a method for transformation into the filamentous bacterium.
  • polyethylene glycol and calcium chloride are used after preparing a protoplast of the host organism.
  • the protoplast PEG method to be used see, for example, Mol. Gen. Genet. 218, 99-104, 1989 (above), JP-A-2007-22255, etc.
  • the medium for regenerating the transformant an appropriate medium is used depending on the host organism to be used and the transformant marker gene. For example, when Aspergillus oryzae ( A. oryzae ) and Aspergillus sojae (A.
  • sojae are used as host organisms and the pyrG gene is used as a transformant marker gene, the regeneration of the transformant is, for example, 0.5. It can be carried out with Czapek-Dox minimal medium (manufactured by Diffco) containing% agar and 1.2M sorbitol.
  • the promoter of the gene encoding the enzyme originally possessed by the host organism on the chromosome may be replaced with a highly expressed promoter such as tef1 by using homologous recombination.
  • a transformation marker gene such as pyrG in addition to the highly expressed promoter.
  • a transformation cassette composed of parts can be used. In this case, the upstream region of the gene encoding the enzyme and all or part of the gene encoding the enzyme are utilized for homologous recombination.
  • All or part of the gene encoding the enzyme can be used that includes a region in the middle from the start codon.
  • the length of the region suitable for homologous recombination is preferably 0.5 kb or more.
  • Confirmation that the transformant has been produced can be performed by culturing the transformant under conditions in which the enzymatic activity of the enzyme is observed, and then detecting the target product in the culture obtained after the culture. ..
  • chromosomal DNA was extracted from the transformant, PCR was performed using this as a template, and it was confirmed that a PCR product capable of amplification was produced when transformation occurred. You may do it by doing. In this case, for example, PCR is performed with a combination of a forward primer for the base sequence of the promoter used and a reverse primer for the base sequence of the transforming marker gene, and it is confirmed that a product of the expected length is produced.
  • PCR is performed by combining a forward primer located upstream of the homologous region on the upstream side used and a reverse primer located downstream from the homologous region on the downstream side used. It is preferable to confirm that a product of the expected length is produced when homologous recombination occurs.
  • the host organism is not particularly limited as long as it is an organism capable of producing an enzyme by transformation with a DNA construct containing a gene encoding the enzyme.
  • microorganisms or plants examples of the microorganisms, Aspergillus (Aspergillus) microorganisms belonging to the genus, Escherichia (Escherichia) microorganism belonging to the genus Saccharomyces (Saccharomyces) microorganisms belonging to the genus Pichia (Pichia) sp microorganism, Schizosaccharomyces (Schizosaccharomyces) a microorganism belonging to the genus , Gigot Saccharomyces Seth (Zygosaccharomyces) microorganism belonging to the genus Trichoderma (Trichoderuma) microorganism belonging to the genus, Penicillium (Penicillium) microorganism belonging to the genus,
  • microorganisms Fusarium (Fusarium) a microorganism belonging to the genus, Neosartorya (Neosartorya) microorganism belonging to the genus, Bissokuramisu (Byssochlamys) microorganism belonging to the genus, Talaromyces (Talaromyces) microorganism belonging to the genus, Ajeromisesu (Ajellomyces) a microorganism belonging to the genus, para cock Sidi Oy death (Paracoccidioides) microorganism belonging to the genus, Anshinokarupusu ( Uncinocarpus) a microorganism belonging to the genus, cock Sidi Oy death (Coccidioides) microorganism belonging to the genus, Arufuroderuma (Arthroderma) microorganism belonging to the genus, Trichophyton (Trichophyton) microorganism belonging to the genus,
  • Aspergillus oryzae Aspergillus soya, Aspergillus niger ( A. niger), Aspergillus tamari ( A. tamarii ), Aspergillus awamori ( A. Aspergillus microorganisms such as awamori ), Aspergillus aspergillus ( A. usami ), Aspergillus kawachi ( A. kawachii ), and Aspergillus saitoi ( A. saitoi) are preferable.
  • the expression of the protein is not limited to the implementation using the host organism as described above.
  • the cell-free protein expression system in vitro can be suitably used especially when the purpose is not mass production such as production on a commercial scale.
  • the cell-free protein expression system does not require cell culture, and has the advantage that the protein can be easily purified.
  • a gene corresponding to a desired protein and a reaction solution containing a molecular mechanism of transcription and translation such as cell lysate are mainly used.
  • genes encoding enzymes include genes g4462 and g10122 having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOs: 1 and 3, respectively.
  • the amino acid sequences of the pentosidine oxidase 1 protein (PenOX1) and the pentosidine oxidase 2 protein (PenOX2) are shown as SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4, respectively.
  • the method for obtaining a gene encoding an enzyme from an organism other than the genus Salocladium and the genus Salocladium is not particularly limited, and for example, the genomic DNA of the target organism is based on the nucleotide sequences of the genes g4462 and g10122 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3). Can be obtained by performing a BLAST homology search and identifying a gene having a base sequence having high sequence identity with the base sequences of genes g4462 and g10122.
  • a protein having an amino acid sequence having high sequence identity with the amino acid sequences (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4) of the pentocidin oxidase 1 and pentocidin oxidase 2 proteins was identified, and the proteins were encoded. It can be obtained by specifying the gene to be used.
  • a gene encoding an enzyme obtained from the genus Salocladium or a gene encoding an enzyme having sequence identity with the enzyme can be introduced into an arbitrary host cell such as an Aspergillus genus microorganism as a host organism and transformed.
  • Transformant One aspect of the transformant is a trait in which any one of the genes or a combination thereof is inserted and transformed so as to express the inserted gene, using a microorganism, a plant, or the like as a host organism. It is a transformant.
  • transformant is a gene (including a promoter sequence other than ORF) containing all or a part of the gene g4462 or g10122, and transcription of the gene, using a microorganism, a plant, or the like as a host organism.
  • the host organism is an organism that is capable of producing pentocidin oxidase, such as the genus Salocladium
  • the inserted gene should be constitutively expressed higher than forced or endogenous expression, or after cell proliferation. It is desirable to express the conditions in the late stage of culture. Such a transformant is not produced in the host organism, or even if it is produced, by culturing or growing under conditions suitable for the host organism or the transformant by the action of a transcription factor whose expression level has changed. Can be produced more than can be detected.
  • Pentosidine oxidase can be produced by culturing the transformant under the culture conditions suitable for the growth of the transformant using the medium suitable for the growth of the transformant described above.
  • the culturing method is not particularly limited, and examples thereof include a solid culturing method and a liquid culturing method performed under aerated or non-aerated conditions when the host organism is a filamentous fungus.
  • the production method when the host organism or the wild-type organism is a filamentous fungus will be described, but the present embodiment is not limited to the following description.
  • the medium is a normal medium for culturing host organisms and wild-type organisms (hereinafter collectively referred to as "host organisms, etc.”), that is, an appropriate ratio of carbon source, nitrogen source, inorganic substances, and other nutrients. As long as it is contained in, either a synthetic medium or a natural medium can be used.
  • host organism or the like is a microorganism of the genus Aspergillus, a YMG medium, a PPY medium, or the like as described in Examples described later can be used, but the present invention is not particularly limited.
  • the culture conditions for the transformant the culture conditions for a host organism or the like usually known by those skilled in the art may be adopted.
  • the initial pH of the medium is adjusted to 5 to 10.
  • the culture temperature can be appropriately set to 20 to 40 ° C., the culture time to be several hours to several days, preferably 1 to 7 days, more preferably 2 to 4 days, and the like.
  • the culturing means is not particularly limited, and aeration-stirring deep culture, shaking culture, static culture, and the like can be adopted, but culturing is preferably performed under conditions that provide sufficient dissolved oxygen.
  • the method for extracting pentosidine oxidase from the culture after the completion of the culture is not particularly limited.
  • the bacterial cells recovered from the culture by an operation such as filtration or centrifugation may be used as they are, or the bacterial cells dried after recovery or further crushed may be used.
  • the method for drying the cells is not particularly limited, and examples thereof include freeze drying, sun drying, hot air drying, vacuum drying, aeration drying, and vacuum drying.
  • a method of destroying cells using a destructive means such as an ultrasonic crusher, a French press, a dynomill, or a dairy pot; lysing the cell wall using a cell wall-lysing enzyme such as yatarase. Method; It may be subjected to a cell crushing treatment such as a method of dissolving a cell using a surfactant such as SDS or Triton X-100. These methods can be used alone or in combination.
  • the obtained extract is centrifuged, filter filtered, ultrafiltered, gel filtered, separated by solubility difference, solvent extraction, chromatography (adsorption chromatography, hydrophobic chromatography, cation exchange chromatography, anion exchange chromatography). , Reverse phase chromatography, etc.), crystallization, activated charcoal treatment, membrane treatment, and other purification treatments to purify the target product.
  • the protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine of the present embodiment has a high degrading activity (substrate specificity) for pentosidine and may have a degrading activity for other amino acids.
  • the protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine of the present embodiment includes, but is not limited to, arginine, leucine, methionine, when the activity against pentosidine is 100%.
  • Relative activity to 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more amino acids selected from phenylalanine, tryptophan and tyrosine, or all of these amino acids is 40% or more, 50% or more or 60% or more.
  • the protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine of the present embodiment is one or more or two or more amino acids selected from asparagine, glutamine and histidine when the activity against pentosidine is 100%.
  • the activity for all of them has a relative activity of 10% or more or 20% or more.
  • the method for measuring relative activity and substrate specificity can be carried out using a method known to those skilled in the art under the same or similar methods and conditions as the measurement for pentosidine, and for example, the method described in Examples described later. Can be measured using the reaction rate with reference to.
  • the method for measuring pentosidine is: The process of degrading a sample with an amino acid-degrading enzyme, It includes a step of contacting the sample after the decomposition step with a protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine, and a step of detecting a change caused by the contact.
  • a "specimen” is a subject, eg, a pentosidine solution for which a quantification of pentosidine is to be attempted; a biological fluid such as blood, blood components (serum, plasma, blood cells, etc.), body fluids, excreta, etc. Examples include components and solid components.
  • the specimen is derived from a subject who has or is suspected of having a pentosidine-related disease.
  • the sample is preferably blood or a blood component, and particularly preferably plasma.
  • the sample does not necessarily contain pentosidine, and even when the sample does not contain pentosidine, the measurement method according to the present embodiment can be used for analysis of the presence or absence of pentosidine (qualitative analysis).
  • a sample derived from any living body such as human, mouse, rat, and monkey can be used. It may be used as it is collected from a living body, or may be used after arbitrary treatment.
  • the measuring method of the present embodiment includes a step of decomposing a sample with an amino acid degrading enzyme.
  • Degradation by an amino acid-degrading enzyme prior to contact with a protein that has the activity of oxidatively degrading pentosidine results in the reaction of the protein that has the activity of oxidatively degrading pentosidine with other amino acids. It reduces measurement errors and enables more accurate measurement of pentosidine.
  • the amino acid degrading enzyme is an enzyme different from the above-mentioned protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine, and is an enzyme capable of preferentially degrading amino acids other than pentosidine.
  • Examples of the amino acid degrading enzyme include amino acid oxidase, amino acid dehydrogenase, amino acid aminotransferase, amino acid decarboxylase, amino acid ammonia lyase, amino acid oxygenase (hydrosilase), amino acid hydrolase, etc., and any of them may be selected in consideration of its substrate specificity. Can be used.
  • the amino acid degrading enzyme may be used alone or in combination of two or more.
  • the amino acid-degrading enzyme is not particularly limited, and a known enzyme can be used, and a commercially available product may be used.
  • a reagent such as a commercially available amino acid quantification kit can be used as an amino acid degrading enzyme.
  • the production method thereof is also not limited, and for example, a gene encoding an amino acid degrading enzyme (as an example, Escapin (SEQ ID NO:) shown in Example 11 described later) is used for the production of pentocidin oxidase using the same method as described above.
  • amino acid degrading enzyme for example, those shown in the following table can be used alone or in combination in consideration of substrate specificity.
  • Amino acid degrading enzyme is an enzyme capable of degrading a desired amino acid under conditions that do not react with pentosidine.
  • the amino acid degrading enzyme has a relative activity to pentosidine of 30% or less, preferably 20%, under the same conditions, where the activity for the most active (most degraded) amino acid is 100%. Below, it is more preferably 10% or less, still more preferably 5% or less.
  • the amino acid-degrading enzyme can be selected in consideration of the type of amino acid considered to be contained in the sample to be measured and the substrate specificity of the protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine used for the measurement. In one embodiment, when the activity of the protein having the activity of oxidatively degrading pentosidine to pentosidine is 100%, the protein having the activity of oxidatively degrading pentosidine is 5% or more, 10% or more, and 20%. As described above, an amino acid degrading enzyme that decomposes an amino acid having a relative activity of 40% or more or 60% or more can be used.
  • the protein having the activity of oxidatively degrading pentothionine is pentothionine oxidase (preferably pentothionine oxidase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a variant thereof, more preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4. 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more or 5 or more amino acids selected from arginine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and tyrosine, or preferably all of them, in the case of pentocidin oxidase or a variant thereof.
  • Amino acid degrading enzymes that break down amino acids can be used.
  • an amino acid degrading enzyme for example, the following amino acid degrading enzyme can be used. -When the activity against one or more amino acids selected from arginine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and tyrosine is 100%, the relative activity against pentosidine under the same conditions is 30% or less, preferably 20%. Below, an amino acid degrading enzyme, more preferably 10% or less, still more preferably 5% or less.
  • -A combination of amino acid-degrading enzymes where the activity of the combined enzymes against any amino acid among arginine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and tyrosine is 100%, the relative activity against pentocidin under the same conditions. However, a combination of 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 10% or less, still more preferably 5% or less.
  • Escapin or its variants showing similar substrate specificity and L-amino acid oxidase derived from Higashidia rattle snake or its variants showing similar substrate specificity, and further, histidine decarboxylase, aspartate, aspartate. 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more selected from decarboxylase, glutaminase and glutamate decarboxylase, or a combination in which all of these enzymes are added.
  • the protein having the activity of oxidatively degrading pentidine is pentidine oxidase (preferably pentidine oxidase having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 4 or a variant thereof, more preferably the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4.
  • pentocidin oxidase or a variant thereof in addition to arginine, leucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and tyrosine, one or more or two or more amino acids selected from asparagine, glutamine and histidine, or all of these amino acids Amino acid degrading enzymes that degrade can be used.
  • the conditions for decomposing the sample with the amino acid degrading enzyme are not particularly limited as long as the desired amino acids can be decomposed and the amino acid degrading enzyme does not react with pentosidine, and the conditions should be appropriately set according to the amino acid degrading enzyme used. Can be done.
  • amino acid oxidase is used as the amino acid degrading enzyme, the amount thereof can be appropriately selected depending on the amount of amino acids contained in the sample, reaction conditions, etc., and is 0.001 to 50 U / ml, preferably 0.01 to. It is 10 U / ml.
  • the pH can be adjusted to, for example, pH 3 to 12, preferably pH 4 to 11, in consideration of the range of action of the amino acid oxidase used.
  • any known pH adjuster and buffer solution can be used depending on the sample and the adjusted pH.
  • the reaction temperature may be, for example, 15 to 65 ° C., preferably 20 to 60 ° C. in consideration of the optimum temperature range of the amino acid oxidase used.
  • the reaction time may be a time sufficient to decompose the desired amino acid, and the reaction can be carried out, for example, for 1 to 120 minutes, preferably 2 to 60 minutes.
  • the sample after the decomposition step is brought into contact with a protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine, as it is or, if necessary, through steps such as heating, centrifugation, concentration, and dilution. Let me.
  • the conditions for contacting the sample with the protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine are not particularly limited as long as they can decompose pentosidine.
  • pentosidine oxidase when used as a protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine, the amount thereof is appropriately selected depending on the amount of pentosidine that can be contained in the sample, reaction conditions, etc., and is 0.001 to 50 U / U /. ml, preferably 0.01-10 U / ml.
  • the pH can be adjusted to, for example, pH 4 to 10, preferably pH 5.5 to 9, in consideration of the range of action of the pentosidine oxidase used.
  • any known pH adjuster and buffer solution can be used depending on the sample and the adjusted pH.
  • the reaction temperature may be, for example, 20 to 60 ° C., preferably 30 to 55 ° C. in consideration of the optimum temperature range of the pentosidine oxidase to be used.
  • the reaction time may be a time sufficient to decompose the desired amino acid, and the reaction can be carried out, for example, for 1 to 120 minutes, preferably 2 to 60 minutes.
  • change caused by contact is a reaction product or reaction product with a starting substance such as pentosidine contained in a sample or a protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine. It means the presence or absence of such substances, or changes in their amounts over time.
  • the method for measuring pentosidine is: It may include (A) the step of allowing the sample to act on the pentosidine oxidase in the presence of water and oxygen; and (B) the step of measuring at least one amount of the reaction product or reaction consumer due to the action of the pentosidine oxidase.
  • Examples of the reaction product measured in the above step (B) include deamination products of hydrogen peroxide, ammonia and pentosidine.
  • the amount of hydrogen peroxide which is a reaction product can be measured by, for example, a peroxidase reaction.
  • the amount of ammonia as a reaction product can be determined by, for example, a method using an indophenol method or a Nessler's reagent, or a method of measuring the amount of NADH using an enzyme using ammonia as a substrate such as glutamate dehydrogenase or NAD synthase. Can be measured.
  • deamination product means, for example, that one or both of the amino groups of lysine and arginine that make up pentosidine are removed and replaced with oxygen, with at least one end becoming keto acid.
  • An example of such a deamination product is shown in FIG.
  • Oxygen can be mentioned as the reaction consumer measured in the above step (B).
  • the amount of oxygen reduced by the enzymatic reaction can be measured by, for example, an oxygen electrode.
  • colorimetric quantification can be performed by oxidizing manganese ions with oxygen based on the Winkler method.
  • the concentration of pentosidine in plasma is said to be about 70% higher in, for example, schizophrenia patients (68.4 ng / mL) than in healthy subjects (mean ⁇ SD 39.6 ⁇ 7.8 ng / mL).
  • a protein having an activity of oxidatively decomposing pentosidine is produced by decomposing with an amino acid-degrading enzyme prior to contact with a protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine.
  • Diseases associated with pentosidine by reducing the measurement error due to reaction with other amino acids to less than 70%, preferably less than 60%, more preferably less than 50%, allowing more accurate measurement of pentosidine. It is also very useful for diagnosing.
  • the present embodiment provides a kit for measuring pentosidine in a sample, which comprises an amino acid degrading enzyme and a protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine.
  • the kit according to this embodiment can be used to detect a reaction product or reaction product of pentosidine and a protein having an activity of oxidatively degrading pentosidine.
  • the kit according to this embodiment further includes a reaction buffer and a reagent for detecting a reaction product, for example, a reagent for detecting hydrogen peroxide, a reagent for detecting ammonia and a reagent for detecting a deamination product of pentocidin, or a reagent for detecting a reaction consumer.
  • kit of this embodiment can also be used as an in vitro diagnostic agent, and can be suitably used for diagnosing, for example, pentosidine or a disease related to a reaction product of pentosidine and pentosidine oxidase, such as diabetes and nephropathy. ..
  • Reagents for detecting hydrogen peroxide include 10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -phenociazine (DA-67) and N- (carboxymethylamino), which can detect hydrogen peroxide with high sensitivity.
  • color-developing reagents such as known Trinder reagents can be mentioned.
  • the ammonia detection reagent include a combination of phenol / nitroprusside sodium and an oxidizing agent such as sodium hypochlorite (indophenol method), Nessler's reagent, and the like.
  • the oxygen detection reagent include a combination of manganese ion, sodium hydroxide and sulfuric acid.
  • Detection of reaction products using color reaction is extremely simple and inexpensive compared to immunochemical methods and instrumental analytical methods.
  • the detection of the reaction product or the reaction consumer does not exclude other known quantitative and qualitative methods other than the detection reagent, and may be appropriately adopted.
  • detection can be performed using a device such as an enzyme sensor provided with a dedicated detection electrode.
  • the above-mentioned method for detecting a reaction product or a reaction consumer can also be used for a method for detecting a disease directly or indirectly related to pentosidine or each reaction product or the reaction consumer, and thus for a diagnostic method. ..
  • the present embodiment is a method for producing a reaction product of pentosidine derived from a sample.
  • the process of degrading a sample with an amino acid-degrading enzyme also relates to a method comprising contacting the sample after the degradation step with a protein having the activity of oxidatively degrading pentosidine, the amino acid degrading enzyme and the protein having the activity of oxidatively degrading the pentosidine are different. ..
  • Each step can be carried out with reference to the description of the method for measuring pentosidine.
  • Example 1 Culture of Sarocladium sp. And method for preparing enzyme solution- Medium used MEA medium: Malt extract agar (manufactured by Oxoid) was dissolved in distilled water to a concentration of 50 g / L.
  • YMG medium Yeast extract 0.4%, Malt extract 1%, glucose 0.4%, pH 5.5
  • the YMG medium in which the cells were cultured was filtered using Miracloth (manufactured by Merck Millipore) to remove the cells, and a culture supernatant was obtained. Small molecules are removed by repeating the steps of concentrating the culture supernatant using an ultrafiltration membrane (Vivaspin 20-3k, manufactured by GE Healthcare) and diluting with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) multiple times. At the same time, the YMG medium was replaced with potassium phosphate buffer.
  • the crude enzyme solution was loaded on a column equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), the enzyme was adsorbed on the column, and then the column was washed with 5 mL of potassium phosphate buffer to unadsorbed protein. Was eluted.
  • the solution eluted from the column when the crude enzyme solution was loaded is "Flow through”, the solution eluted during washing with a buffer is “Start buffer”, and the solution eluted with a buffer containing sodium chloride is “Elution 1" and “Elution 2", respectively. , "Elution 3" and “Elution 4", and collected in different containers.
  • Example 2 Method for measuring pentosidine oxidase activity-Measurement of activity of crude enzyme solution The activity was measured using a solution eluted from a column for ion exchange chromatography as a sample. 4 mM pentosidine (free form equivalent) in which 50 ⁇ L of a sample was dissolved in 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) (using 3 trifluoroacetic acid (TFA) salt manufactured by Peptide Institute) and 25 ⁇ L of an oxidase coloring reagent (4U).
  • pentosidine free form equivalent
  • a 96-well microwell plate (manufactured by Nunc) was used for the reaction.
  • the blank was prepared by adding 100 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) instead of the substrate solution.
  • the absorbance of the reaction solution and the blank solution at 555 nm was measured, and the strength of the enzyme activity was evaluated based on the difference in absorbance ( ⁇ OD).
  • the pentosidine oxidase activity of the crude enzyme solution was measured using substrates of various concentrations to evaluate the transition of the activity with respect to the concentration of the substrate.
  • the concentrations of the substrate solution used are 0.13 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1.0 mM, 2.0 mM and 4.0 mM.
  • Example 3 Analysis of pentosidine oxidase activity of Sarocladium sp. Enzyme solution Reaction of a sample obtained by fractionating the culture supernatant of Sarocladium sp. With a column for ion exchange chromatography with pentosidine. Gender was analyzed. As a result, strong activity was observed in Elution 1 eluted with potassium phosphate buffer containing 0.25M sodium chloride, suggesting that pentosidine oxidase was contained. When a substrate concentration-dependent test (Fig. 1) and a heat deactivation test (Fig. 2) were conducted on this Elution 1, the enzyme activity increased in a substrate concentration-dependent manner, and further, it was found that the enzyme activity was completely deactivated by heat treatment. It became clear. From this, it was shown that the pentosidine oxidase activity observed in Elution 1 was derived from the enzyme.
  • Example 4 Sequence determination of pentosidine oxidase derived from Sarocladium sp. Based on the above results and the whole genome sequence information of Sarocladium sp., It is presumed to be pentosidine oxidase.
  • Kind of genes SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3
  • amino acid sequences SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 4 were identified.
  • Example 5 Heterogeneous recombination expression of pentocidin oxidase derived from Sarocladium sp. In Aspergillus sojae Aspergillus sojae In order to analyze the enzymatic activity of the two pentocidin oxidases identified above. Heterogeneous recombination was performed using Aspergillus soya as a host.
  • Ptef upstream 748bp of the tef1 gene, SEQ ID NO: 7
  • Talp 800 bp downstream of the alp gene, SEQ ID NO: 8
  • SEQ ID NO: 8 a terminator sequence of the alkaline promoter gene alp
  • a transformation marker gene pyrG3 (upstream 56 bp, coding region 896 bp and downstream 535 bp, 1,487 bp, SEQ ID NO: 9) that complements the uracil / uridine requirement and enables the introduction of multiple copies of the gene is used. It was used (see JP-A-2018-068292). These Ptef, Talp, and pyrG3 were obtained by a PCR reaction using the genomic DNA of Aspergillus sojae NBRC4239 as a template.
  • In-Fusion HD Cloning Kit manufactured by Clontech
  • Ptef uses the reverse primer of SEQ ID NO: 10
  • Talp uses the forward primer of SEQ ID NO: 11 to amplify the DNA fragment by PCR reaction.
  • 15 bp of a sequence complementary to the 5'end of the penox1 gene (SEQ ID NO: 5) is added to the 5'end of the reverse primer for Ptef amplification of SEQ ID NO: 10 for Talp amplification of SEQ ID NO: 11.
  • the control experiment was carried out by adding 20 ⁇ L of ion-exchanged water in place of 20 ⁇ L of 60 mM L-arginine solution.
  • the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute at 37 ° C. was defined as 1 unit (U) and calculated according to the following formula.
  • the maximum L-arginine oxidation activity of the crude enzyme solutions of the As-penox1 strain and the As-penox2 strain is 0.009 U / mL (As-penox 1-15 strain) and 5.1 U / mL (As-penox 2-16), respectively. It was a stock).
  • Example 6 Purification of mycelium-extracted recombinant penox2 A crude enzyme solution of As-penox2-16 strain was buffer-substituted with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), and then an anion exchange chromatography column (HiScreen CaptoQ) was used. , GE Healthcare) was used for fractionation. First, the crude enzyme solution was loaded on a column equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), the enzyme was adsorbed on the column, and then the column was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). The unadsorbed protein was eluted.
  • the concentration of sodium chloride contained in the 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) was linearly increased from 0 mM to 40 mM to elute the protein adsorbed on the column.
  • Fractions showing L-arginine oxidizing activity were analyzed by SDS-PAGE, and fractions free of contaminating proteins were recovered as purified PenOX2.
  • the recovered purified PenOX2 solution was concentrated using an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 15-30k, manufactured by Merck & Co., Inc.) until the L-arginine oxidizing activity reached 24 U / mL, and used for a pentosidine quantitative test.
  • Example 7 Quantitative test of pentosidine The following reagents were prepared, and pentosidine was measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL Ltd.). (Sample: Pentosidine solution) 0.2 ⁇ M, 0.4 ⁇ M, 0.6 ⁇ M, 1.0 ⁇ M, 2.0 ⁇ M or 4.0 ⁇ M pentosidine solution (adjusted with the same pentosidine as in Example 2)
  • FIG. 3 shows the relationship between the elapsed time from mixing the sample (4.0 ⁇ M pentosidine solution) and the first reagent and the absorbance (A 658). Immediately after the addition of the second reagent containing PenOX2, an increase in A 658 was confirmed.
  • ⁇ A (absorbance 5 minutes after the addition of the second reagent)-(absorbance immediately before the addition of the second reagent ⁇ 0.75) (Since the concentration of the composition in the reaction solution becomes 0.75 times (75/100 times) due to the addition of the second reagent, The value obtained by multiplying the absorbance immediately before the addition of the second reagent by 0.75 was regarded as the absorbance immediately after the addition of the second reagent. )
  • Example 8 Purification of hyphal secretory recombinant penox2
  • the hyphal culture solution of the As-penox2 strain was filtered using Miracloth (manufactured by Merck Millipore), and the hyphal culture supernatant was collected. 75 mL of the obtained hyphal culture supernatant was filtered through a syringe filter having a pore size of 0.2 ⁇ m and then concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 15-30 k, manufactured by Merck & Co., Inc.).
  • Ammonium sulfate was gradually added to the concentrate so as to be 70% saturated, left at 4 ° C for 2 hours, and then centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C, 5 minutes) to precipitate excess protein, and the supernatant was obtained. Was recovered. The recovered supernatant was concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 0.5-30k, manufactured by Merck & Co., Inc.).
  • the crude enzyme solution was loaded on a column equilibrated with a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 2 M ammonium sulfate, the enzyme was adsorbed on the column, and then a 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.) containing 2 M ammonium sulfate was adsorbed. 5) The column was washed with 10 mL to elute the unadsorbed protein.
  • the solution eluted from the column when the crude enzyme solution was loaded was "Flow throughh1", and the solution eluted when washed with a buffer containing ammonium sulfate 2M was "Elution 1", ammonium sulfate 1.5M, 1.3M, 1.15M, 1M.
  • the liquids eluted with the buffer containing the mixture were designated as “Elution 2", “Elution 3", “Elution 4", "Elution 5", and the liquid eluted with the buffer containing ammonium sulfate was designated as "Elution 6", and were collected in different containers.
  • the crude enzyme solution was loaded on a column equilibrated with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5), the enzyme was adsorbed on the column, and then the column was washed with 5 mL of 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5). Then, the unadsorbed protein was eluted.
  • Example 9 Physical and chemical properties of PenOX2 produced by the Aspergillus sawyer transformant As-penox2 strain The following method for measuring enzyme activity was used to determine the physicochemical properties of PenOX2. Incubate 600 ⁇ L of arbitrary buffer, 3.99 U / mL peroxidase dissolved in deionized water, 1.8 mM 4-aminoantipyrine, 2 mM TOOS solution 400 ⁇ L, and 150 ⁇ L of deionized water at an arbitrary temperature for 10 minutes, and then store on ice.
  • the physicochemical properties of penox2 were as follows.
  • (A) Optimal pH range Final concentration 50 mM citric acid-100 mM potassium phosphate buffer (pH 4.0-7.5), final concentration 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5-8.0), final concentration 100 mM glycine Each buffer was prepared so as to be a buffer (pH 8.0-11.0), and using these, an enzymatic reaction was carried out at a temperature of 37 ° C. at each pH. The results are shown in FIG. PenOX2 showed the highest activity at pH 7.5.
  • the optimum pH of PenOX2 was pH 6.5-8.0, which was the most preferable, because it showed 70% or more of the activity value in the vicinity of the potassium phosphate buffer pH 7.5.
  • the optimum pH was determined to be pH 7.5.
  • D Range of stable pH As a buffer solution, 100 mM citric acid-200 mM potassium phosphate buffer (pH 3.0-6.5), 200 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5-8.0), 200 mM glycine buffer (pH 8). After treatment at 25 ° C. for 20 hours at each pH using .0-10.0), the residual activity of PenOX2 was measured.
  • Mini-PROTEN TGX Stein-Free Precast Gels 4-20% (manufactured by Bio-rad) was used, and as a molecular weight marker, Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Stands was used. The results are shown in FIG. The molecular weight of PenOX2 was about 80,000.
  • PenOX1 and PenOX2 had pentosidine oxidase activity.
  • the amino acid sequence homology between the two was 38.2%.
  • the following three enzymes were purchased, and the pentosidine oxidase activity was examined in the above-mentioned activity measuring method at a final concentration of 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) at 37 ° C.
  • the amino acid sequence homology with PenOX1 and PenOX2, respectively, and the pentosidine oxidase activity were as follows.
  • Example 11 Aspergillus sojae, aspergillus sojae, in which a gene encoding a signal peptide of the genus Aspergillus is added to the 5'end of a gene encoding heterologous recombinant expression mature Escapin of Aspergillus. Heterogeneous recombination expression was performed using Soya as a host.
  • a gene encoding a signal peptide of the genus Aspergillus linked to the 5'end of a gene encoding mature Escapin (SEQ ID NO: 16 linked to the 5'end of SEQ ID NO: 18; hereinafter, gene sequence A) is used as a plasmid.
  • gene sequence A a gene sequence consisting of 12 base pairs (SEQ ID NO: 20) is added to the 5'end side of gene sequence A, and a gene sequence consisting of 12 base pairs (SEQ ID NO: 21) is added to the 3'end side (hereinafter).
  • Gene sequence A' was obtained by artificial gene synthesis.
  • Ptef upstream 748 bp of the tef1 gene, SEQ ID NO: 7
  • Talp Talp, which is the terminator sequence of the alkaline protease gene alp
  • 800 bp downstream of the alp gene, SEQ ID NO: 8 was used as the terminator.
  • a transformation marker gene pyrG3 (upstream 56 bp, coding region 896 bp and downstream 535 bp, 1,487 bp, SEQ ID NO: 9) that complements the uracil / uridine requirement and enables the introduction of multiple copies of the gene is used. It was used (see JP-A-2018-068292). These Ptef, Talp, and pyrG3 were obtained by a PCR reaction using the genomic DNA of Aspergillus sojae NBRC4239 as a template.
  • In-Fusion HD Cloning Kit manufactured by Clontech
  • Ptef uses the reverse primer of SEQ ID NO: 22
  • Talp uses the forward primer of SEQ ID NO: 23 to amplify the DNA fragment by PCR reaction. ..
  • SEQ ID NO: 22 a 15 bp sequence complementary to the 5'end of the reverse primer for Ptef amplification (SEQ ID NO: 22) (CAT sequence and sequence complementary to the starting codon ATG of AoCDHss).
  • Example 12 Measurement of pentosidine combined with amino acid-degrading enzyme-Preparation of a solution containing one amino acid-degrading enzyme solution (Escapin, SEQ ID NO: 15) Ultrafiltration of the culture supernatant of the transformant obtained in Example 11 Concentrated by membrane (Amino Ultra 15-30k, manufactured by Merck). An ice-cooled ammonium sulfate saturated aqueous solution is added to the ice-cooled concentrate so as to be 70% saturated with ammonium sulfate, left at 4 ° C for 2 hours, and then centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C, 15 minutes) to precipitate. It was recovered and redissolved in 0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.8.
  • the A. sojae recombinant strain As-penox2 obtained in the sections of "Preparation of expression vector” and “Preparation and culture of aspergillus soybean expression strain” in Example 5 was used in a sterilized PPY medium. , 180 rpm, 30 ° C., and shake culture for 5 days.
  • the obtained culture supernatant was concentrated by an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 15-30k, manufactured by Merck & Co., Inc.). Ammonium sulfate was gradually added to the concentrate so as to be 70% saturated, left at 4 ° C for 2 hours, and then centrifuged (15,000 rpm, 4 ° C, 15 minutes) to recover the supernatant.
  • the recovered supernatant was concentrated with an ultrafiltration membrane (Amicon Ultra 0.5-30 k, manufactured by Merck) and replaced with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.8.
  • Pentosidine free form equivalent
  • 3TFA salt manufactured by Peptide Institute
  • Comparative Example 1 The value obtained by subtracting data 1 from data 2 ( ⁇ OD) was used as the measured value.
  • Comparative Example 1 a solution containing no contaminants, that is, a solution in which the contaminant solution of (2) above was replaced with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.8 was also measured.
  • Comparative Example 2 a system containing contaminants but not erasing contaminants, that is, a solution in which the contaminant erasing reagent (3B) was replaced with 0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.8 was also measured. ..
  • Table 3 shows the relative values of Comparative Example 2 and Examples when the measured value of Comparative Example 1 is 100%.
  • FIG. 13 shows the reaction rates for various amino acids and pentosidine, that is, the substrate specificity, when the reaction rate for arginine, which is the substrate having the highest reaction rate, is 100.
  • Example 14 Substrate specificity analysis of amino acid scavenging enzyme 2 Substrate specificity of amino acid scavenging enzyme 2 with respect to various amino acids and pentosidine was analyzed.
  • FIG. 14 shows the reaction rates for various amino acids and pentosidine, that is, the substrate specificity, when the reaction rate for leucine, which had the highest reaction rate, was set to 100.
  • Example 15 Substrate specificity analysis of an enzyme for measuring pentosidine The substrate specificity of an enzyme for measuring pentosidine to various amino acids and pentosidine was analyzed.
  • Example 12 amino acids having a high reactivity with the enzyme for measuring pentocidin were eliminated by the amino acid degrading enzyme 1 solution and the amino acid degrading enzyme 2 solution, and the influence of the contaminants causing a measurement error. It was considered that the amount of pentocidin was reduced and accurate measurement of pentocidin could be performed.

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Abstract

検体中のペントシジンの測定方法であって、検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程、前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる工程、及び前記接触により生じた変化を検出する工程、含み、前記アミノ酸分解酵素と前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は異なる、測定方法を提供する。

Description

ペントシジンの測定方法及び測定用キット
　本発明は、ペントシジンの測定方法等に関し、より詳細には、測定誤差を低減させ、正確な測定値を得るためのペントシジンの測定方法等に関する。
　ペントシジン（（２Ｓ）－２－ａｍｉｎｏ－６－［２－［［（４Ｓ）－４－ａｍｉｎｏ－４－ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｉｍｉｄａｚｏ［４，５－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ］ｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ）は、ペントースと等モルのリジンとアルギニンが架橋した構造を有し、加齢や糖尿病の発症に相関してヒトの皮膚に蓄積すること、特に糖尿病の発症や末期の腎症において増加することが知られている。
　ペントシジンは、酸加水分解後にその蛍光性（Ｅｘ：３３５ｎｍ、Ｅｍ：３８５ｎｍ）を指標としてＨＰＬＣで定量ができること、また、ペントシジンに対するモノクローナル抗体を用いた免疫化学的な方法（例えば、ＥＬＩＳＡ法）を用いて定量できることが知られている。
　ペントシジンは加齢や糖尿病以外にも統合失調症との関連が知られており、例えば、生体試料を対象として、ペントシジンの量を測定する工程を有する統合失調症の検査方法が開示されている（例えば、特許文献１を参照）。
特許第５７３８３４６号
　免疫化学的な方法や機器分析的手法によるペントシジンの定量は煩雑で費用がかかる場合がある。本発明は、新規酵素を用いた、免疫化学的な方法や機器分析的手法と比べ安価で簡易的なペントシジンの測定方法を提供することを目的とし、特に、測定誤差を低減させ、正確な測定値を得るためのペントシジンの測定方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、糸状菌から同定した新規酵素がペントシジンの定量に有用であることを見出し、この酵素をアミノ酸分解酵素と組み合わせて用いることで、より測定誤差が低減することを見出し、本発明を完成するに至った。
　本発明の概要は、以下のとおりである。
［１］
　検体中のペントシジンの測定方法であって、
　検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程、
　前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる工程、及び
　前記接触により生じた変化を検出する工程、
を含み、前記アミノ酸分解酵素と前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は異なる、測定方法。
［２］
　前記検出工程において、酸素、過酸化水素又はアンモニアの量の変化が検出される、［１］に記載の測定方法。
［３］
　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が、以下の理化学的性質：
（１）作用：ペントシジンを酸化的に分解する活性；及び
（２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量：７５，０００～８５，０００
を有する、［１］又は［２］に記載の測定方法。
［４］
　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が以下の（ａ）～（ｆ）：
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；あるいは
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質；
からなる群から選択されるいずれかのタンパク質である、［１］～［３］のいずれかに記載の測定方法。
［５］
　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が、糸状菌に由来する、［１］～［４］のいずれかに記載の測定方法。
［６］
　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質がペントシジンオキシダーゼであり、
　前記アミノ酸分解酵素が、検体に含まれるアミノ酸を分解し、前記アミノ酸が、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択される、［１］～［５］のいずれかに記載の測定方法。
［６’］
　前記アミノ酸分解酵素が、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択されるアミノ酸を分解する、［１］～［５］のいずれかに記載の測定方法。
［７］
　前記アミノ酸分解酵素が分解するアミノ酸が、前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質の、ペントシジンに対する活性を１００％とした場合に、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が４０％以上の相対的活性を有するアミノ酸である、［１］～［６］のいずれかに記載の測定方法。
［８］
　前記アミノ酸分解酵素が、アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、アミノ酸アンモニアリアーゼ、アミノ酸オキシゲナーゼ及びアミノ酸ヒドロラーゼからなる群から選択される、［１］～［７］のいずれかに記載の測定方法。
［９］
（ｉ）アミノ酸分解酵素；及び
（ｉｉ）ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質
を含む、検体中のペントシジン測定用キット。
［１０］
　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が以下の（ａ）～（ｆ）：
（ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；あるいは
（ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質；
からなる群から選択されるいずれかのタンパク質である［９］に記載のキット。
［１１］
　前記アミノ酸分解酵素が、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択されるアミノ酸を分解する酵素である、［９］又は［１０］に記載のキット。
［１２］
　検体由来のペントシジンの反応生成物の製造方法であって、
　検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程、
　前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる工程
を含み、前記アミノ酸分解酵素と前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は異なる、方法。
［１３］
　前記アミノ酸分解酵素が、ジャンボアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来エスカピン（Ｅｓｃａｐｉｎ）及び／又はヒガシダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）由来アミノ酸オキシダーゼを含む、［１］～［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１４］
　前記アミノ酸分解酵素が、検体に含まれるアミノ酸を分解し、前記アミノ酸が、アスパラギン、グルタミン及びヒスチジンから選択される、［１］～［８］のいずれかに記載の測定方法。
［１４’］
　前記アミノ酸分解酵素が、アスパラギン、グルタミン及びヒスチジンから選択されるアミノ酸を分解する、［１］～［７］のいずれかに記載の測定方法。
［１５］
　さらに、（ｉｉｉ）過酸化水素検出用試薬、アンモニア検出試薬、ペントシジンの脱アミノ化生成物検出用試薬及び酸素検出用試薬から選択される少なくとも一つを含む、［９］～［１１］のいずれかに記載のキット。
　本発明によれば、ペントシジンを酵素法によって簡便で迅速に検出及び定量することが可能となり、その際、測定誤差が低減され、正確な測定値が得られる。
図１は、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）から、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて分画した酵素粗精製液（Ｅｌｕｔｉｏｎ　１）の基質濃度依存性試験の結果を示す。ペントシジン終濃度（横軸）に対するΔＯＤ（縦軸）がプロットされている。反応開始から２０分後のデータを使用した。 図２は、酵素粗精製液（Ｅｌｕｔｉｏｎ　１）の熱失活試験の結果を示す。当該結果は加熱処理による酵素活性の失活を解析したものであり、反応開始から２０分後のデータに相当する。 図３は、ペントシジンとペントシジンオキシダーゼとを反応して生成した過酸化水素の濃度を測定した結果を示す。過酸化水素の濃度は６５８ｎｍの吸光度で測定した。 図４は、ペントシジンの終濃度とペントシジンの酸化に起因するＡ658上昇量（ΔＡ）との関係を示す。 図５は、ペントシジンオキシダーゼがペントシジンを分解する反応の推定機構を示す。図では、ペントシジンを構成するリジンとアルギニンの各アミノ基が酸化的脱アミノ化され、過酸化水素とアンモニアが生成される様子が記載されている。 図６Ａは、配列番号１及び配列番号２の配列を示す。 図６Ｂは、配列番号３及び配列番号４の配列を示す。 図６Ｃは、配列番号５及び配列番号６の配列を示す。 図６Ｄは、配列番号７～配列番号１１の配列を示す。 図６Ｅは、配列番号１２～配列番号１４の配列を示す。 図７は、ＰｅｎＯＸ２の至適ｐＨの範囲を示す。 図８は、ＰｅｎＯＸ２の至適温度の範囲を示す。 図９は、ＰｅｎＯＸ２の熱安定性の範囲を示す。 図１０は、ＰｅｎＯＸ２の安定ｐＨの範囲を示す。 図１１は、ＰｅｎＯＸ２のペントシジンに対するＫｍ値を示す。 図１２は、ＰｅｎＯＸ２の分子量を示す。 図１３は、実施例１３で測定したアミノ酸分解酵素１の基質特異性を示す。 図１４は、実施例１４で測定したアミノ酸分解酵素２の基質特異性を示す。 図１５は、実施例１５で測定したペントシジンオキシダーゼの基質特異性を示す。
　以下、本発明の一態様（以下、「本実施形態」ともいう。）であるペントシジンの測定方法等の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
（ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質）
　一態様において、本実施形態は、検体中のペントシジンの測定方法に関する。
　ペントシジンは、上記のとおり、ペントースと等モルのリジンとアルギニンが架橋した構造を有する。本実施形態の測定方法において用いられる、「ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質」は、そのような分解活性を有するタンパク質であれば限定されず、ペントシジンオキシダーゼ活性を有するペントシジンオキシダーゼ及びペントシジンデヒドロゲナーゼ活性を有するペントシジンデヒドロゲナーゼを含む。
　後述の実施例に示す、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は新規酵素であり、少なくとも、ペントシジンオキシダーゼ活性を有する。本明細書で使用する場合、「ペントシジンオキシダーゼ活性」とは、ペントシジンを酸化的に分解する活性、より具体的には、ペントシジンを酸化して、その脱アミノ化生成物や、過酸化水素、アンモニアを生成する活性、又は酸素を消費する活性を意味する。
　本明細書で使用する場合、「ペントシジンデヒドロゲナーゼ活性」とは、ペントシジンを酸化的に分解する活性、より具体的には、ペントシジンを酸化して、その脱アミノ化生成物や、還元型補酵素、アンモニアを生成する活性、又は酸化型補酵素を消費する活性を意味する。ここでいう補酵素としては、例えば、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）等が挙げられる。還元型補酵素はさらにメディエータを還元してもよい。メディエータは、本発明のペントシジンデヒドロゲナーゼに含まれる補酵素との間で電子を授受できるものであれば特に限定されない。メディエータとしては、例えばキノン類、フェナジン類、フェリシアン化物、オスミウム塩又は錯体、ルテニウム塩又は錯体、ニトロソアニリン類、アミノアニリン類、ビオロゲン類、シトクロム類、フェノキサジン類、フェノチアジン類、フェレドキシン類、フェロセン類、及びその誘導体等などが挙げられるがこれらに限定されない。キノン類としては、例えばナフトキノン及びその誘導体（例えば、ナフトキノン－４－スルホン酸）、フェナントロリンキノン及びその誘導体、フェナントレンキノン及びその誘導体が挙げられ、フェナジン類としては、例えばフェナジンメトサルフェート（ＰＭＳ）及びその誘導体（例えば、１－メトキシＰＭＳ、１－エトキシＰＭＳ）が挙げられ、フェリシアン化物としては、例えばフェリシアン化カリウムが挙げられ、オスミウム塩又は錯体としては、例えば塩化オスミウム、ヘキサアンミンオスミウムが挙げられ、ルテニウム塩又は錯体としては、例えば塩化ルテニウム、ヘキサアンミンルテニウムが挙げられ、ニトロソアニリン類としては、例えばＮ，Ｎ－ジメチル－４－ニトロソアニリン、Ｎ，Ｎ－ビス－ヒドロキシエチル－４－ニトロソアニリン及びそれらの誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。その他のメディエータについても、当業者に公知のものが挙げられる。本願明細書では、特に断らない限り、メディエータという用語には酸素、過酸化水素は含まれないものとする。
　上記のような酵素活性を有する限り、特定の配列に限定されず、あらゆるタンパク質及びそれをコードする遺伝子が本実施形態の範囲に含まれるものとして意図される。ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質のうち、ペントシジンオキシダーゼの塩基配列とアミノ酸配列について、サロクラディウム属（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ属）糸状菌に由来する酵素を例に以下に説明する。
（ペントシジンオキシダーゼのアミノ酸配列）
　ペントシジンオキシダーゼは、上記した酵素活性を有するものであれば、アミノ酸配列については特に限定されない。例えば、上記したペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素の一態様として配列番号２、配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタンパク質が挙げられる。以降、配列番号２及び配列番号４で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質をそれぞれペントシジンオキシダーゼ１（又はＰｅｎＯＸ１）及びペントシジンオキシダーゼ２（又はＰｅｎＯＸ２）という場合がある。ペントシジンオキシダーゼ１をコードする遺伝子（ｇ４４６２）は６つのエキソン及び５つのイントロンで構成されると予想され、一方、ペントシジンオキシダーゼ２をコードする遺伝子（ｇ１０１２２）は２つのエキソン及び１つのイントロンで構成されることが予想される。
　配列番号２及び配列番号４に示すアミノ酸配列を有するペントシジンオキシダーゼは、サロクラディウム属（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ属）糸状菌に由来する。また、これらの酵素をコードする遺伝子の塩基配列は、それぞれ配列番号１及び配列番号３に示す塩基配列である。図６に当該酵素のアミノ酸配列及び塩基配列を示す。
　ペントシジンオキシダーゼのアミノ酸配列は、それぞれ上記したペントシジンオキシダーゼの酵素活性を有するものであれば、配列番号２や配列番号４のような野生型酵素が有するアミノ酸配列において１から複数個、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４又は２５個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、上記一単位あたり、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　　「アミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、ペントシジンオキシダーゼ活性を維持する限度でアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。
　具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　また、ペントシジンオキシダーゼのアミノ酸配列において、配列番号２や配列番号４のような野生型酵素が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、ペントシジンオキシダーゼが有するアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
（ペントシジンオキシダーゼをコードする遺伝子）
　ペントシジンオキシダーゼをコードする遺伝子（以下、「ペントシジンオキシダーゼ遺伝子」とよぶ場合がある。）は、上記したペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素が有するアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものでれば特に限定されない。一部の態様において、ペントシジンオキシダーゼ遺伝子を形質転換体内で発現させることによりペントシジンオキシダーゼが生産される。
　本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされる酵素が本来の触媒活性を有する態様で生産されることを意味する。また、「遺伝子の発現」には、遺伝子の高発現、すなわち、遺伝子が挿入されたことにより、宿主生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされる酵素が生産されることを包含する。
　ペントシジンオキシダーゼ遺伝子は、宿主生物に導入された際に、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由してペントシジンオキシダーゼを生成し得る遺伝子であっても、該遺伝子の転写後にスプライシングを経由せずにペントシジンオキシダーゼを生成し得る遺伝子であってもよい。
　ペントシジンオキシダーゼ遺伝子は、サロクラディウム属糸状菌のような由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、上記したペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡであってもよい。
　本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、配列番号１又は配列番号３のような野生型遺伝子の塩基配列の一部に相当するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
　本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。
　例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
　一部の態様において、ストリンジェントな条件の具体例としては以下のものを含む。例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ベーリンガ・マンハイム社製）、０．１％（ｗ／ｖ）Ｎ－ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、一晩（８～１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１～０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーション及び洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５～２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０～７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１～１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ　塩化ナトリウム、１５ｍＭ　クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ－Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　１－３８，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７－１９９７（以下、これらの文献を「参考技術文献」ともよぶ。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。
　なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
　ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。
　野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数５００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から複数個、例えば、１から１２５個、１から１００個、１から７５個、１から５０個、１から３０個、１から２０個、好ましくは１から数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。
　ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
　野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされる酵素は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素が有するアミノ酸配列において１から複数個、好ましくは数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有する酵素である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされる酵素と同じ酵素活性を有するものである。
　また、酵素をコードする遺伝子は、１つのアミノ酸に対応するコドンが数種類あることを利用して、野生型遺伝子がコードする酵素が有するアミノ酸配列と同一又は近似するアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、野生型遺伝子と異なる塩基配列を含むものであってもよい。このような野生型遺伝子の塩基配列に対してコドン改変が施された塩基配列としては、例えば、ｇ４４６２のコドンを改変した配列番号５（ｐｅｎｏｘ１）に記載の塩基配列、ｇ１０１２２のコドンを改変した配列番号６（ｐｅｎｏｘ２）などが挙げられる（図６Ｃ）。コドン改変が施された塩基配列としては、例えば、宿主生物において発現し易いようにコドン改変が施された塩基配列であることが好ましい。
（配列同一性を算出するための手段）
　塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られている方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子によってコードされる酵素のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
　２つのアミノ酸配列や塩基配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８７：２２６４－２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．　ＵＳＡ９０：５８７３－５８７７、１９９３）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、１９９０）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ　ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．　２５：３３８９－３４０２、１９９７）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
　上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版　ｖｅｒｓｉｏｎ　１２．０．１（ゼネティックス社製）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２７：１４３５－１４４１、１９８５）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
（酵素をコードする遺伝子の由来）
　酵素をコードする遺伝子は、ペントシジンオキシダーゼ生産能がある生物種に由来する。酵素をコードする遺伝子の由来生物としては、例えば、糸状菌などの微生物などが挙げられる。ペントシジンオキシダーゼ生産能を有する微生物の具体例としては、サロクラディウム属（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ属）などが挙げられる。
　上記のとおり、酵素をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換体において発現される酵素は、宿主生物の生育条件によって不活化せず、活性を示すことが好ましい。そこで、酵素をコードする遺伝子の由来生物は、酵素をコードする遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。
　ペントシジンオキシダーゼ活性を有する酵素の理化学的特性質のうち、特徴的なものを以下に例示する。
・ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量：７５，０００～８５，０００
・至適ｐＨ：ｐＨ約６．５～８．０
　なお、至適ｐＨは酵素が最も好適に作用するｐＨであって、ペントシジンオキシダーゼは上記範囲以外のｐＨでも作用し得る。
・至適温度：約３７～５０℃
　なお、至適温度は酵素が最も好適に作用する温度であって、ペントシジンオキシダーゼは上記温度範囲以外の温度でも作用し得る。
・温度安定性：３０℃で１０分間保存した場合、ペントシジンオキシダーゼ活性が９０％以上保持される。４０℃で１０分間保存した場合、ペントシジンオキシダーゼ活性が５０％以上保持される。
・ｐＨ安定性：ｐＨ４．０～９．０の範囲でペントシジンオキシダーゼ活性が６０％以上保持される。
・Ｋｍ値：ペントシジンに対するＫｍ値が１ｍＭ以下である。
　Ｋｍ値とはミカエリス定数であって、その具体的な算出方法は特に限定されず、公知の方法を自由に選択して算出することができる。例えば、後述する実施例９に記載の方法のように、ラインウェーバー・バークプロットによる方法で描かれるミカエリス－メンテンの式に従ってＫｍ値を算出することができる。
（遺伝子工学的手法による酵素をコードする遺伝子のクローニング）
　酵素をコードする遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主生物に導入して、酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）が導入された形質転換体を作製できる。酵素をコードする遺伝子の取得方法や、酵素をコードする遺伝子の塩基配列、酵素のアミノ酸配列情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換体の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書で使用する場合、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体が包含される。酵素をコードする遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
　酵素をコードする遺伝子をクローニングするには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法を適宜用いることができる。例えば、酵素の生産能を有する微生物や種々の細胞から、常法、例えば、参考技術文献（上掲）に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　一部の態様において、酵素をコードする遺伝子は、該遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。酵素をコードする遺伝子の由来生物は特に限定されないが、上記したサロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）などを挙げることができる。例えば、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットが利用できる。
　次いで、前記染色体ＤＮＡを鋳型として、５'末端配列及び３'末端配列に相補的なプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（以下、「ＰＣＲ」と表記する。）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、該遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。別の方法として、５'ＲＡＣＥ法や３'ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることができる。
　また、酵素をコードする遺伝子を取得する方法は特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて酵素をコードする遺伝子を構築することが可能である。
　ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、ＴＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（インビトロジェン社製）などの市販のキット；ｐＵＣ１９（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社製）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ＋（ストラタジーン社製）、ｐＹＥＳ２／ＣＴ（インビトロジェン社製）などの市販のプラスミドベクターＤＮＡ；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社製）などの市販のバクテリオファージベクターＤＮＡが使用できる。一部の態様において、該組換え体ＤＮＡを用いて、宿主生物、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌　ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）や大腸菌　ＤＨ５α株（タカラバイオ社製）を形質転換する。得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（キアゲン社製）などを用いて精製してもよい。
　組換え体ＤＮＡに挿入された各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０－７８、１９８３）などにより行うことができる。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ－ＣＯＲ　ＭＯＤＥＬ　４２００Ｌシークエンサー（アロカ社製）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社製）、ＣＥＱ２０００ＸＬ　ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社製）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質、すなわち、酵素のアミノ酸配列を知り得る。
（酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクターの構築）
　酵素をコードする遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、酵素をコードする遺伝子のいずれかを含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、酵素をコードする遺伝子の発現が可能な形で結合することにより構築することができる。例えば、適当な制限酵素で酵素をコードする遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドと連結することにより構築することができる。または、プラスミドと相同的な配列を両末端に付加した該遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
（形質転換体の作製方法）
　形質転換体の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、酵素をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法などが挙げられる。一部の態様において、酵素をコードする遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトで宿主生物を形質転換することにより、酵素をコードする遺伝子を過剰発現する形質転換体が得られる。本明細書では、宿主生物を形質転換するために作製された、発現誘導プロモーター－酵素をコードする遺伝子－ターミネーターからなるＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を含む組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
　酵素をコードする遺伝子が発現する態様で宿主生物に挿入する方法は、特に限定されないが、例えば、相同組換えや非相同組換えを利用することにより宿主生物の染色体上に直接的に挿入する手法；プラスミドベクター上に連結することにより宿主生物内に導入する手法などが挙げられる。
　相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。非相同組換えを利用する方法では、該相同配列をＤＮＡコンストラクトと連結していない場合でも、宿主生物のゲノム中に挿入することができる。高発現プロモーターは特に限定されないが、例えば、翻訳伸長因子であるＴＥＦ１遺伝子（ｔｅｆ１）のプロモーター領域、α－アミラーゼ遺伝子（ａｍｙ）のプロモーター領域、アルカリプロテアーゼ遺伝子（ａｌｐ）プロモーター領域、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）プロモーター領域などが挙げられる。
　ベクターを利用する方法では、ＤＮＡコンストラクトを、常法により、宿主生物の形質転換に用いられるプラスミドベクターに組み込み、対応する宿主生物を常法により形質転換することができる。
　そのような、好適なベクター－宿主系としては、宿主生物中で酵素を生産させ得る系であれば特に限定されず、例えば、ｐＵＣ１９及び糸状菌の系、ｐＳＴＡ１４（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９）及び糸状菌の系などが挙げられる。
　ＤＮＡコンストラクトは宿主生物の染色体に導入して用いることが好ましいが、この他の方法として、自律複製型のベクター（Ｏｚｅｋｉ　ｅｔ　ａｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９，１１３３　（１９９５））にＤＮＡコンストラクトを組み込むことにより、染色体に導入しない形で用いることもできる。
　ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ｐｙｒＧ、ｎｉａＤ、ａｄｅＡのような、宿主生物の栄養要求性を相補する遺伝子；ピリチアミン、ハイグロマイシンＢ、オリゴマイシンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。また、ＤＮＡコンストラクトは、宿主生物中で酵素をコードする遺伝子を過剰発現することを可能にするプロモーター、ターミネーターその他の制御配列（例えば、エンハンサー、ポリアデニル化配列など）を含むことが好ましい。プロモーターは特に限定されないが、適当な発現誘導プロモーターや構成的プロモーターが挙げられ、例えば、ｔｅｆ１プロモーター、ａｌｐプロモーター、ａｍｙプロモーター、ｇｐｄプロモーターなどが挙げられる。ターミネーターもまた特に限定されないが、例えば、ａｌｐターミネーター、ａｍｙターミネーター、ｔｅｆ１ターミネーターなどが挙げられる。
　ＤＮＡコンストラクトにおいて、酵素をコードする遺伝子の発現制御配列は、挿入する酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡ断片が、発現制御機能を有している配列を含む場合は必ずしも必要ではない。また、共形質転換法により形質転換を行う場合には、ＤＮＡコンストラクトはマーカー遺伝子を有しなくてもよい場合がある。
　ＤＮＡコンストラクトには精製のためのタグをつけることができる。例えば、酵素をコードする遺伝子の上流又は下流に適宜リンカー配列を接続し、ヒスチジンをコードする塩基配列を６コドン以上接続することにより、ニッケルカラムを用いた精製を可能にすることができる。
　ＤＮＡコンストラクトにはマーカーリサイクリングに必要な相同配列が含まれていてもよい。例えば、ｐｙｒＧマーカーは、ｐｙｒＧマーカーの下流に挿入部位（５'相同組換え領域）の上流の配列と相同な配列を付加すること、又はｐｙｒＧマーカーの上流に挿入部位（３'相同組換え領域）の下流の配列と相同な配列を付加することで、５－フルオロオロチン酸（５ＦＯＡ）を含んだ培地上でｐｙｒＧマーカーを脱落させることが可能となる。マーカーリサイクリングに適した該相同配列の長さは０．５ｋｂ以上が好ましい。
　ＤＮＡコンストラクトの一態様は、例えば、ｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｉｔｅに、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
　相同組換えにより遺伝子を挿入する場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５'相同組換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター及びｐｙｒＧマーカー遺伝子、３'相同組換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
　相同組換えにより遺伝子を挿入し、かつ、マーカーをリサイクルする場合のＤＮＡコンストラクトの一態様は、５'相同組換え配列、ｔｅｆ１遺伝子プロモーター、酵素をコードする遺伝子、ａｌｐ遺伝子ターミネーター、マーカーリサイクリング用相同配列、ｐｙｒＧマーカー遺伝子、３'相同組換え配列を連結させたＤＮＡコンストラクトである。
　宿主生物が糸状菌である場合、糸状菌への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、宿主生物のプロトプラストを調製した後に、ポリエチレングリコール及び塩化カルシウムを用いるプロトプラストＰＥＧ法（例えば、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１８、９９－１０４、１９８９（上掲）、特開２００７－２２２０５５号公報などを参照）を用いることができる。形質転換体を再生させるための培地は、用いる宿主生物と形質転換マーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主生物としてアスペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａ．ｓｏｊａｅ）を用い、形質転換マーカー遺伝子としてｐｙｒＧ遺伝子を用いた場合は、形質転換体の再生は、例えば、０．５％寒天及び１．２Ｍソルビトールを含むＣｚａｐｅｋ－Ｄｏｘ最少培地（ディフコ社製）で行うことができる。
　また、例えば、形質転換体を得るために、相同組換えを利用して、宿主生物が本来染色体上に有する酵素をコードする遺伝子のプロモーターをｔｅｆ１などの高発現プロモーターへ置換してもよい。この際も、高発現プロモーターに加えて、ｐｙｒＧなどの形質転換マーカー遺伝子を挿入することが好ましい。例えば、この目的のために、特開２０１１－２３９６８１号公報に記載の実施例を参照して、酵素をコードする遺伝子の上流領域－形質転換マーカー遺伝子－高発現プロモーター－酵素をコードする遺伝子の全部又は部分からなる形質転換用カセットなどが利用できる。この場合、酵素をコードする遺伝子の上流領域及び酵素をコードする遺伝子の全部又は部分が相同組換えのために利用される。
　酵素をコードする遺伝子の全部又は部分は、開始コドンから途中の領域を含むものが使用できる。相同組換えに適した領域の長さは０．５ｋｂ以上あることが好ましい。
　形質転換体が作製されたことの確認は、酵素の酵素活性が認められる条件下で形質転換体を培養し、次いで培養後に得られた培養物における目的産物が検出されることにより行うことができる。
　また、形質転換体が作製されたことの確認は、形質転換体から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることを確認することにより行ってもよい。この場合、例えば、用いたプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、形質転換マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
　相同組換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。
（宿主生物）
　宿主生物としては、酵素をコードする遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトによる形質転換により、酵素を生産することができる生物であれば特に限定されない。例えば、微生物や植物などが挙げられ、微生物としては、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属微生物、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属微生物、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属微生物、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、ジゴサッカロマイセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｕｍａ）属微生物、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属微生物、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属微生物、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属微生物、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属微生物、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属微生物、ネオサルトリア（Ｎｅｏｓａｒｔｏｒｙａ）属微生物、ビッソクラミス（Ｂｙｓｓｏｃｈｌａｍｙｓ）属微生物、タラロミセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）属微生物、アジェロミセス（Ａｊｅｌｌｏｍｙｃｅｓ）属微生物、パラコッシディオイデス（Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アンシノカルプス（Ｕｎｃｉｎｏｃａｒｐｕｓ）属微生物、コッシディオイデス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）属微生物、アルフロデルマ（Ａｒｔｈｒｏｄｅｒｍａ）属微生物、トリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属微生物、エクソフィラ（Ｅｘｏｐｈｉａｌａ）属微生物、カプロニア（Ｃａｐｒｏｎｉａ）属微生物、クラドフィアロフォラ（Ｃｌａｄｏｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａ）属微生物、マクロホミナ（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ）属微生物、レプトスファエリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、ビポラリス（Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ）属微生物、ドチストローマ（Ｄｏｔｈｉｓｔｒｏｍａ）属微生物、ピレノフォラ（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ）属微生物、ネオフシコッカム（Ｎｅｏｆｕｓｉｃｏｃｃｕｍ）属微生物、セトスファエリア（Ｓｅｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属微生物、バウドイニア（Ｂａｕｄｏｉｎｉａ）属微生物、ガエウマノミセス（Ｇａｅｕｍａｎｎｏｍｙｃｅｓ）属微生物、マルッソニナ（Ｍａｒｓｓｏｎｉｎａ）属微生物、スファエルリナ（Ｓｐｈａｅｒｕｌｉｎａ）属微生物、スクレロチニア（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ）属微生物、マグナポルセ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属微生物、ヴェルチシリウム（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）属微生物、シュードセルコスポラ（Ｐｓｅｕｄｏｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ）属微生物、コレトトリカム（Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ）属微生物、オフィオストーマ（Ｏｐｈｉｏｓｔｏｍａ）属微生物、メタルヒジウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属微生物、スポロスリックス（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）属微生物、ソルダリア（Ｓｏｒｄａｒｉａ）属微生物、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）属植物などが挙げられ、微生物及び植物が好ましい。ただし、どのような場合であっても、宿主生物からヒトは除かれる。
　糸状菌の中では、安全性や培養の容易性を加味すれば、アスペルギルス・オリゼ、アスペルギルス・ソーヤ、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・タマリ（Ａ．ｔａｍａｒｉｉ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・ウサミ（Ａ．ｕｓａｍｉ）、アスペルギルス・カワチ（Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ）、アスペルギルス・サイトイ（Ａ．ｓａｉｔｏｉ）などのアスペルギルス属微生物などが好ましい。
　本実施形態においてタンパク質の発現は、上記のような宿主生物を用いた実施に限定されない。例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏにおける無細胞タンパク質発現系は、特に商業規模での生成のように大量生産を目的としない場合などに好適に用いることができる。無細胞タンパク質発現系は、細胞培養を必要とせず、また、タンパク質の精製も簡便に行うことができるという利点もある。無細胞タンパク質発現系においては、主に、所望とするタンパク質に対応する遺伝子と、セルライセートのような転写と翻訳の分子機構を含む反応液とが使用される。
（酵素をコードする遺伝子の具体例）
　サロクラディウム属由来の酵素をコードする遺伝子としては、例えば、配列番号１及び３に記載の塩基配列をそれぞれ有する遺伝子ｇ４４６２及びｇ１０１２２が挙げられる。なお、ペントシジンオキシダーゼ１タンパク質（ＰｅｎＯＸ１）及びペントシジンオキシダーゼ２タンパク質（ＰｅｎＯＸ２）のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号２及び配列番号４として示す。
　サロクラディウム属及びサロクラディウム属以外の生物から酵素をコードする遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、遺伝子ｇ４４６２及びｇ１０１２２の塩基配列（配列番号１及び配列番号３）に基づいて、対象生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、遺伝子ｇ４４６２及びｇ１０１２２の塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、対象生物の総タンパク質を基に、ペントシジンオキシダーゼ１及びペントシジンオキシダーゼ２タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２及び配列番号４）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質をコードする遺伝子を特定することにより得ることができる。
　サロクラディウム属から得られた酵素をコードする遺伝子、又は酵素と配列同一性を有する酵素をコードする遺伝子を、宿主生物としてアスペルギルス属微生物等の任意の宿主細胞に導入して形質転換することができる。
（形質転換体）
　形質転換体の一態様は、微生物や植物などを宿主生物として、遺伝子のいずれか一つ、又はこれらの組み合わせが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体である。
　形質転換体の別の一態様は、微生物や植物などを宿主生物として、遺伝子ｇ４４６２又はｇ１０１２２のすべて又は一部を含む、遺伝子（ＯＲＦ以外のプロモーター配列等も含む。）、及び、該遺伝子の転写を制御する転写因子を高発現又は低発現するように設計されたＤＮＡコンストラクトが挿入されており、かつ、該挿入された遺伝子を発現するように形質転換した形質転換体である。
　宿主生物が、サロクラディウム属などのペントシジンオキシダーゼの産生能が認められる生物である場合は、挿入された遺伝子は恒常的に強制発現若しくは内在性の発現よりも高発現にすること、又は細胞増殖後の培養後期で条件発現させることが望ましい。このような形質転換体は、発現量の変化した転写因子の作用によって、宿主生物又は形質転換体に適した条件で培養又は生育することにより、宿主生物では生産しない、又は生産したとしてもペントシジンオキシダーゼを検出可能以上に生産することができる。
　上記の形質転換体の生育に適した培地を用いて、形質転換体の生育に適した培養条件下で形質転換体を培養することによって、ペントシジンオキシダーゼを製造することができる。培養方法は特に限定されず、例えば、宿主生物が糸状菌である場合は、通気又は非通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。以下では、主として宿主生物や野生型生物が糸状菌である場合の製造方法について記載するが、本実施形態は下記記載に限定されない。
　培地は、宿主生物や野生型生物（以下では、これらを総称して「宿主生物等」ともよぶ。）を培養する通常の培地、すなわち炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主生物等がアスペルギルス属微生物である場合は、後述する実施例に記載があるようなＹＭＧ培地やＰＰＹ培地などを利用することができるが、特に限定されない。
　形質転換体の培養条件は、当業者により通常知られる宿主生物等の培養条件を採用すればよく、例えば、宿主生物等が糸状菌である場合、培地の初発ｐＨは５～１０に調整し、培養温度は２０～４０℃、培養時間は数時間～数日間、好ましくは１～７日間、より好ましくは２～４日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静地培養などを採用することができるが、溶存酸素が十分になるような条件で培養することが好ましい。例えば、アスペルギルス属微生物を培養する場合の培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるＹＭＧ培地やＰＰＹ培地を用いた、３０℃、１６０ｒｐｍでの３～５日間の振盪培養が挙げられる。
　培養終了後に培養物からペントシジンオキシダーゼを抽出する方法は特に限定されない。抽出には、培養物から濾過、遠心分離などの操作により回収した菌体をそのまま用いてもよく、回収した後に乾燥した菌体やさらに粉砕した菌体を用いてもよい。菌体の乾燥方法は特に限定されず、例えば、凍結乾燥、天日乾燥、熱風乾燥、真空乾燥、通気乾燥、減圧乾燥などが挙げられる。
　また、上記処理に代えて、例えば、超音波破砕機、フレンチプレス、ダイノミル、乳鉢などの破壊手段を用いて菌体を破壊する方法；ヤタラーゼなどの細胞壁溶解酵素を用いて菌体細胞壁を溶解する方法；ＳＤＳ、トリトンＸ－１００などの界面活性剤を用いて菌体を溶解する方法などの菌体破砕処理に供してもよい。これらの方法は単独又は組み合わせて使用することができる。
　得られた抽出液は、遠心分離、フィルターろ過、限外ろ過、ゲルろ過、溶解度差による分離、溶媒抽出、クロマトグラフィー（吸着クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーなど）、結晶化、活性炭処理、膜処理などの精製処理に供することにより目的産物を精製することができる。
（基質特異性）
　本実施形態のペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は、ペントシジンに対して高い分解活性（基質特異性）を有し、その他のアミノ酸に対する分解活性を有し得る。例えば、以下に限定されるものではないが、一態様において、本実施形態のペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は、ペントシジンに対する活性を１００％とした場合に、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択される１以上、２以上、３以上、４以上又は５以上のアミノ酸あるいはこれら全てのアミノ酸に対する相対的な活性が、４０％以上、５０％以上又は６０％以上である。さらに、一態様において、本実施形態のペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は、ペントシジンに対する活性を１００％とした場合に、アスパラギン、グルタミン及びヒスチジンから選択される１以上又は２以上のアミノ酸あるいはこれら全てに対する活性が、１０％以上又は２０％以上の相対的活性を有する。
　相対的活性及び基質特異性の測定方法は、当業者に公知の手法を用いて、ペントシジンに対する測定と同一又は類似の手法及び条件で実施することができ、例えば、後述の実施例に記載の手法を参照して反応速度を用いて測定することができる。
（測定方法）
　本実施形態に係るペントシジンの測定方法は：
　検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程、
　前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる工程、及び
　前記接触により生じた変化を検出する工程、を含む。
　本明細書で使用する場合、「検体」とは、被験者、例えば、ペントシジンの定量をしようとするペントシジン溶液；血液、血液成分（血清、血漿、血球等）、体液、排せつ物等の生体由来の液体成分及び固体成分等が挙げられる。一態様において、検体は、ペントシジンに関連する疾患に罹患しているか、罹患していると疑われる対象に由来する。検体は、好ましくは血液又は血液成分であり、特に好ましくは血漿である。検体はペントシジンを必ずしも含んでいなくてもよく、ペントシジンを含まない場合であっても、本実施形態に係る測定方法はペントシジン含有の有無の分析（定性分析）に使用することができる。検体が生体由来である場合、ヒト、マウス、ラット、サル等任意の生物由来のものを使用することができる。生体から採取されたものをそのまま使用しても、任意の処理後に使用してもよい。
（アミノ酸分解酵素）
　本実施形態の測定方法は、検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程を含む。ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質との接触に先立って、アミノ酸分解酵素による分解を行うことで、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が他のアミノ酸と反応することに起因する測定誤差を減少させ、より正確なペントシジンの測定が可能となる。
　アミノ酸分解酵素は、上記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とは異なる酵素であり、ペントシジン以外のアミノ酸を優先的に分解することができる酵素である。アミノ酸分解酵素としては、アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、アミノ酸アンモニアリアーゼ、アミノ酸オキシゲナーゼ（ヒドロシラーゼ）、アミノ酸ヒドロラーゼ等が挙げられ、任意のものを、その基質特異性を考慮して用いることができる。アミノ酸分解酵素は、単独で用いても、２種以上を混合又は併用してもよい。
　アミノ酸分解酵素としては、特に限定されず、公知の酵素を用いることができ、市販品を用いてもよい。例えば、市販のアミノ酸定量キット等の試薬をアミノ酸分解酵素として用いることもできる。その製造方法も限定されず、例えば、ペントシジンオキシダーゼの製造について上述したのと同様の手法を用いて、アミノ酸分解酵素をコードする遺伝子（一例として、後述の実施例１１に示すエスカピン（Ｅｓｃａｐｉｎ、配列番号１５：ジャンボアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）由来Ｅｓｃａｐｉｎの成熟ペプチドのアミノ酸配列）をコードする遺伝子）を導入した形質転換体を作製し、これを培養した培地からアミノ酸分解酵素を得ることもできる。
　アミノ酸分解酵素として、例えば下記表に示すものを、基質特異性を考慮して単独又は組み合わせて用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　アミノ酸分解酵素は、ペントシジンと反応しない条件で所望のアミノ酸を分解可能な酵素である。一態様において、アミノ酸分解酵素は、最も活性の高い（最も分解される）アミノ酸に対する活性を１００％とした場合に、同条件下でのペントシジンに対する相対的活性が、３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である。
　アミノ酸分解酵素は、測定対象の検体に含まると考えられるアミノ酸の種類や、測定に用いるペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質の基質特異性を考慮して選択することができる。
　一態様において、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質の、ペントシジンに対する活性を１００％とした場合に、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が５％以上、１０％以上、２０％以上、４０％以上又は６０％以上の相対的活性を有するアミノ酸を分解するアミノ酸分解酵素を用いることができる。
　一態様において、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質がペントシジンオキシダーゼ（好ましくは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を有するペントシジンオキシダーゼ又はその改変体、より好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有するペントシジンオキシダーゼ又はその改変体）である場合、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択される１以上、２以上、３以上、４以上又は５以上のアミノ酸あるいは好ましくはこれら全てのアミノ酸を分解するアミノ酸分解酵素を用いることができる。このようなアミノ酸分解酵素として、例えば、以下のアミノ酸分解酵素を用いることができる。
・アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択される１以上のアミノ酸に対する活性を１００％とした場合に、同条件下でのペントシジンに対する相対的活性が、３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下であるアミノ酸分解酵素。
・アミノ酸分解酵素の組み合わせであって、組み合わせた酵素のアルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンのうち任意のアミノ酸に対する活性を１００％とした場合に、同条件下でのペントシジンに対する相対的活性が、３０％以下、好ましくは２０％以下、より好ましくは１０％以下、さらに好ましくは５％以下である組み合わせ。
・Ｅｓｃａｐｉｎ又はこれと同様の基質特異性を示すその改変体と、ヒガシダイヤガラガラヘビ由来Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ又はこれと同様の基質特異性を示すその改変体との組み合わせ。
・Ｅｓｃａｐｉｎ又はこれと同様の基質特異性を示すその改変体と、ヒガシダイヤガラガラヘビ由来Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ又はこれと同様の基質特異性を示すその改変体に、さらに、ヒスチジンデカルボキシラーゼ、アスパラギナーゼ、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ、グルタミナーゼ及びグルタミン酸デカルボキシラーゼから選択される１以上、２以上、３以上、４以上又はこれら全ての酵素を加えた組み合わせ。
　一態様において、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質がペントシジンオキシダーゼ（好ましくは、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸配列を有するペントシジンオキシダーゼ又はその改変体、より好ましくは配列番号４のアミノ酸配列を有するペントシジンオキシダーゼ又はその改変体）である場合、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンに加えて、アスパラギン、グルタミン及びヒスチジンから選択される１以上又は２以上のアミノ酸あるいはこれら全てのアミノ酸を分解するアミノ酸分解酵素を用いることができる。
　検体をアミノ酸分解酵素で分解する条件は、所望のアミノ酸を分解することができ、アミノ酸分解酵素がペントシジンと反応しない条件であれば特に限定されず、使用するアミノ酸分解酵素に応じて適宜設定することができる。
　例えば、アミノ酸分解酵素としてアミノ酸オキシダーゼを用いる場合、その量は、検体中に含まれるアミノ酸の量や反応条件などにより適宜選択することができ、０．００１～５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１～１０Ｕ／ｍｌである。ｐＨは、使用するアミノ酸オキシダーゼが作用する範囲を考慮して、例えば、ｐＨ３～１２、好ましくはｐＨ４～１１に調整することができる。ｐＨ調整剤及び緩衝液としては、検体及び調節ｐＨに応じて公知の任意のものを用いることができる。反応温度は、使用するアミノ酸オキシダーゼの至適温度範囲を考慮して、例えば、１５～６５℃、好ましくは２０～６０℃を採用することができる。反応時間は、所望のアミノ酸を分解するのに十分な時間であればよく、例えば１～１２０分間、好ましくは２～６０分間反応を行なうことができる。
　上記アミノ酸分解酵素による分解後、そのまま、あるいは必要により適宜、加熱、遠心分離、濃縮、希釈等の工程を経て、前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる。
　検体と、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる条件は、ペントシジンを分解することができる条件であれば特に限定されない。
　例えば、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質としてペントシジンオキシダーゼを用いる場合、その量は、検体中に含まれ得るペントシジンの量や反応条件などにより適宜選択されるが、０．００１～５０Ｕ／ｍｌ、好ましくは０．０１～１０Ｕ／ｍｌである。ｐＨは、使用するペントシジンオキシダーゼが作用する範囲を考慮して、例えば、ｐＨ４～１０、好ましくはｐＨ５．５～９に調整することができる。ｐＨ調整剤及び緩衝液としては、検体及び調節ｐＨに応じて公知の任意のものを用いることができる。反応温度は、使用するペントシジンオキシダーゼの至適温度範囲を考慮して、例えば、２０～６０℃、好ましくは３０～５５℃を採用することができる。反応時間は、所望のアミノ酸を分解するのに十分な時間であればよく、例えば１～１２０分間、好ましくは２～６０分間、反応を行なうことができる。
　その後、前記接触により生じた変化を検出する。本明細書で使用する場合、「接触により生じた変化」とは、検体中に含まれるペントシジンなどの出発物質や、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質との反応生成物又は反応消費物などの有無、又はそれらの量の経時的な変化を意味する。
　より具体的な態様において、ペントシジンの測定方法は：
　（Ａ）水と酸素の存在下、検体にペントシジンオキシダーゼを作用させる工程；及び
　（Ｂ）上記ペントシジンオキシダーゼの作用による反応生成物又は反応消費物の少なくとも一種の量を計測する工程
　を含み得る。
　上記工程（Ｂ）において測定する反応生成物としては、過酸化水素、アンモニア及びペントシジンの脱アミノ化生成物を挙げることができる。また、反応生成物である過酸化水素の量は、例えば、ペルオキシダーゼ反応により計測することができる。また、反応生成物であるアンモニアの量は、例えば、インドフェノール法やネスラー試薬を用いる方法、もしくは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼやＮＡＤシンターゼ等のアンモニアを基質とする酵素を用いてＮＡＤＨ量を測定する方法等により計測することができる。本明細書で使用する場合、「脱アミノ化生成物」とは、例えば、ペントシジンを構成するリジンとアルギニンのアミノ基の一方又は両方が外れて酸素に置き換わり、少なくとも一方の末端がケト酸となっている生成物を意味する。このような脱アミノ化生成物の例を図５に示す。上記工程（Ｂ）において測定する反応消費物としては、酸素を挙げることができる。酵素反応により減少する酸素量は、例えば、酸素電極により測定することができる。または、Ｗｉｎｋｌｅｒ手法に基づいて、酸素によりマンガンイオンの酸化させることで、比色定量することもできる。
　血漿中のペントシジン濃度は、健常者（平均±Ｓ．Ｄ．３９．６±７．８ｎｇ／ｍＬ）と比較して、例えば統合失調症患者（６８．４ｎｇ／ｍＬ）において、７０％程度高いという報告がある（新井ら，精神神経学雑誌(2012), 114巻2号, pp. 101-107；Arai, M., et al. Arch Gen Psychiat, 67; 589-597, 2010)。本実施形態の測定方法によれば、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質との接触に先立って、アミノ酸分解酵素による分解を行うことで、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が他のアミノ酸と反応することに起因する測定誤差を７０％未満、好ましくは６０％未満、より好ましくは５０％未満に減少させ、より正確なペントシジンの測定が可能となるため、ペントシジンが関連する疾患の診断にも非常に有用である。
　別の態様において、本実施形態は、アミノ酸分解酵素及びペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質を含む、検体中のペントシジン測定用キットを提供する。本実施形態に係るキットは、ペントシジンとペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質との反応生成物又は反応消費物を検出するために使用され得る。本実施形態に係るキットはさらに、反応用緩衝液、並びに反応生成物検出用試薬、例えば過酸化水素検出用試薬、アンモニア検出試薬及びペントシジンの脱アミノ化生成物検出用試薬、又は反応消費物検出用試薬、例えば酸素検出用試薬の少なくとも一つを含むものであってもよい。本実施形態のキットは体外診断薬としても使用可能であり、例えば、ペントシジン又は、ペントシジンとペントシジンオキシダーゼとの反応生成物に関連している疾患、例えば糖尿病や腎症の診断に好適に使用され得る。
　過酸化水素検出用試薬としては、過酸化水素を高感度で検出できる１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノシアジン（ＤＡ-６７）やＮ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４'－ビス（ジメチルアミノ）-ジフェニルアミン（ＤＡ－６４）に加え、公知のトリンダー試薬などの呈色試薬が挙げられる。アンモニア検出用試薬としては、フェノール・ニトロプルシッドナトリウムと、次亜塩素酸ナトリウム等の酸化剤との組み合わせ（インドフェノール法）、ネスラー試薬等が挙げられる。酸素検出用試薬としては、例えば、マンガンイオン、水酸化ナトリウム及び硫酸の組み合わせが挙げられる
　呈色反応を利用した反応生成物の検出は免疫化学的な方法や機器分析的手法と比較して極めて簡便で安価に行うことができる。しかしながら、反応生成物又は反応消費物の検出は、検出試薬以外の他公知の定量・定性方法を排除するものではなく、適宜採用してもよい。例えば、過酸化水素やアンモニアの検出試薬に代えて、専用の検出電極を備えた酵素センサなどの装置を使用して検出を行うこともできる。
　上記反応生成物又は反応消費物の検出方法は、ペントシジン又は各反応生成物又は反応消費物と直接的又は間接的に関連している疾患の検出方法、延いては診断方法にも使用可能である。
　さらに、本実施形態は、検体由来のペントシジンの反応生成物の製造方法であって、
　検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程、
　前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる工程
を含み、前記アミノ酸分解酵素と前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は異なる、方法にも関する。
　各工程は、ペントシジンの測定方法に関する記載を参照して実施することができる。
　以下、本実施形態を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
（実施例１）サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）の培養及び酵素液調製方法
・使用培地
　ＭＥＡ培地：Ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ社製）を５０ｇ／Ｌとなるよう蒸留水に溶解した。
　ＹＭＧ培地：Ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　０．４％、Ｍａｌｔ　ｅｘｔｒａｃｔ　１％、グルコース　０．４％、ｐＨ５．５
・菌株の培養
　－８０℃で保存されたサロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）　Ｆ１００１２株をＭＥＡ培地に塗布し、２４℃で７～１０日間、十分量の菌糸が得られるまで静置培養した。得られた菌糸を１Ｌフラスコ中のＹＭＧ培地２５０ｍＬに接種し、３０℃で３日間振とう培養した。
・粗酵素液の調製
　菌体を培養したＹＭＧ培地を、Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア社製）を用いてろ過することで菌体を取り除き、培養上清を取得した。培養上清を限外ろ過膜（Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－３ｋ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて濃縮し、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で希釈する工程を複数回繰り返すことで低分子を除去するとともに、ＹＭＧ培地をリン酸カリウムバッファーに置換した。
・目的酵素の粗精製
　バッファー置換した粗酵素液を、イオン交換クロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。具体的な手順は、以下のとおりである。
　まず、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、５ｍＬのリン酸カリウムバッファーでカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。
　その後、リン酸カリウムバッファーに０．２５Ｍ、０．５Ｍ、０．７５Ｍ、１．０Ｍの塩化ナトリウムを溶解したバッファーを５ｍＬずつ順次カラムに通すことで、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。
　粗酵素液をロードした際にカラムから溶出した液を「Ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ」、バッファーによる洗浄時に溶出した液を「Ｓｔａｒｔ　ｂｕｆｆｅｒ」、塩化ナトリウムを含むバッファーで溶出した液をそれぞれ「Ｅｌｕｔｉｏｎ１」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ４」とし、それぞれ異なる容器に回収した。
（実施例２）ペントシジンオキシダーゼ活性の測定方法
・酵素粗精製液の活性測定
　イオン交換クロマトグラフィー用のカラムより溶出した液をサンプルとし、活性を測定した。サンプル５０μＬを、１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解した４ｍＭ　ペントシジン（遊離体換算）（ペプチド研究所社製、３トリフルオロアセテート（ＴＦＡ）塩を使用。）２５μＬ及びオキシダーゼ発色試薬（４Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ社製）、１．８ｍＭ　４－アミノアンチピリン（Ｆｌｕｋａ社製）、２ｍＭ　ＴＯＯＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製））２５μＬと混合し、室温で反応させた。
　反応には、９６穴のマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を用いた。ブランクは、基質溶液のかわりに１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）を加えたものとした。反応液及びブランク溶液の５５５ｎｍにおける吸光度を測定し、吸光度の差（ΔＯＤ）をもとに酵素活性の強さを評価した。
・基質濃度依存性試験
　酵素粗精製液のペントシジンオキシダーゼ活性を、様々な濃度の基質を用いて測定することで、基質の濃度に対する活性の推移を評価した。用いた基質溶液の濃度は、０．１３ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１．０ｍＭ、２．０ｍＭ及び４．０ｍＭである。
・熱失活試験
　酵素粗精製液を８０℃で１時間熱処理をすることにより、タンパク質を変性させた。この加熱処理サンプルのペントシジンオキシダーゼ活性を上述の活性測定方法にのっとって測定し、未加熱のサンプルの活性と比較した。
（実施例３）サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）酵素液のペントシジンオキシダーゼ活性解析
　サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）の培養上清をイオン交換クロマトグラフィー用カラムで分画したサンプルについて、ペントシジンとの反応性を解析した。その結果、０．２５Ｍ　塩化ナトリウムを含むリン酸カリウムバッファーで溶出したＥｌｕｔｉｏｎ１に強い活性が認められ、ペントシジンオキシダーゼが含まれていることが示唆された。このＥｌｕｔｉｏｎ１に対し、基質濃度依存性試験（図１）及び熱失活試験（図２）を行ったところ、酵素活性は基質濃度依存的に上昇し、さらに加熱処理により完全に失活することが明らかとなった。このことから、Ｅｌｕｔｉｏｎ１にみられるペントシジンオキシダーゼ活性は、酵素由来のものであることが示された。
（実施例４）サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）由来のペントシジンオキシダーゼの配列決定
　上記結果と、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）の全ゲノム配列情報に基づき、ペントシジンオキシダーゼであると推測される、２種類の遺伝子（配列番号１及び配列番号３）とそのアミノ酸配列（配列番号２及び配列番号４）が特定された。
（実施例５）麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）における、サロクラディウム・エスピー（Ｓａｒｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．）由来ペントシジンオキシダーゼの異種組換発現
　上記で特定された２種のペントシジンオキシダーゼについて、酵素活性を解析するために麹菌アスペルギルス・ソーヤを宿主として異種組換発現を行った。
・発現ベクターの作製
　配列番号２と配列番号４のアミノ酸配列を基に麹菌発現用にコドン改変した配列番号５と６の塩基配列を人工遺伝子合成によりそれぞれ取得した。
　配列番号５及び配列番号６のペントシジンオキシダーゼ遺伝子（ｐｅｎｏｘ１、ｐｅｎｏｘ２）を発現させるための発現カセットとしては、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号７）をプロモーターとして、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号８）をターミネーターとして用いた。
　また、選択マーカーとしてはウラシル／ウリジン要求性を相補し、遺伝子の多コピー導入を可能とする形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ３（上流５６ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５３５ｂｐを含む１，４８７ｂｐ、配列番号９）を用いた（特開２０１８－０６８２９２号公報参照）。これらのＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ、ｐｙｒＧ３は、麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ　ＮＢＲＣ４２３９株）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により取得した。
　次に、それぞれのＤＮＡを連結するためにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用した。例えば、Ｐｔｅｆとｐｅｎｏｘ１遺伝子及びＴａｌｐとを連結させる場合には、Ｐｔｅｆは配列番号１０のリバースプライマーを用いて、Ｔａｌｐは配列番号１１のフォワードプライマーを用いてＰＣＲ反応によりＤＮＡ断片を増幅させている。このとき、配列番号１０のＰｔｅｆ増幅用のリバースプライマーには、５'末端にｐｅｎｏｘ１遺伝子（配列番号５）の５'末端と相補的な配列が１５ｂｐ付加されており、配列番号１１のＴａｌｐ増幅用のフォワードプライマーには、５'末端にｐｅｎｏｘ１遺伝子（配列番号５）の３'末端と相同な配列が１５ｂｐ付加されているため、Ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により、Ｐｔｅｆ、ｐｅｎｏｘ１遺伝子及びＴａｌｐとの連結が可能となる。このようにして、Ｐｔｅｆ、ｐｅｎｏｘ１遺伝子又はｐｅｎｏｘ２遺伝子、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧ３が順に連結されたＰｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ１－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３、Ｐｔｅｆ－ｐｅｎｏｘ２－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている発現ベクターｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ１及びｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ２を作製した。
・麹菌発現株の作製及び培養
　上記で取得した形質転換用プラスミドｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ１及びｐ１９－ｐＧ３－ｐｅｎｏｘ２を用いて、アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧ遺伝子破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）に対しプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、ｐｅｎｏｘ１及びｐｅｎｏｘ２の発現カセットが多コピーで挿入されたアスペルギルス・ソーヤ形質転換株Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株を９株、Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株を６株取得した。
　取得したアスペルギルス・ソーヤ形質転換株Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株及びＡｓ－ｐｅｎｏｘ２株を５０ｍＬ三角フラスコに入れた１５ｍＬのＰＰＹ液体培地（２％（ｗ／ｖ）パインデックス、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で４～５日間振とう培養を行った。
・菌糸抽出液の調製
　各Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株及びＡｓ－ｐｅｎｏｘ２株の培養液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア社製）を用いてろ過し、培養上清を取り除いて菌体を取得した。１５ｍＬの１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に再懸濁した後、Ｍｉｃｒｏ　Ｓｍａｓｈ　ＭＳ－１００Ｒ（トミー精工社製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して、上清を粗酵素液として回収した。
・菌糸抽出液のＬ－アルギニン酸化活性の測定
　各粗酵素液２００μＬを、１５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ　７．０）に溶解した７．１Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ、　０．７０ｍＭ　４－アミノアンチピリン、０．７９ｍＭ　ＴＯＯＳ溶液３８０μＬと混合して３７℃で５分間インキュベートした後、６０ｍＭ　Ｌ－アルギニン溶液２０μＬを添加して撹拌し、３７℃で５分間反応させた。反応中のＡ555の経時変化を分光光度計（Ｕ－３９００、日立ハイテクサイエンス社製）で測定した。対照実験は、２０μＬの６０　ｍＭ　Ｌ－アルギニン溶液の代わりに２０μＬのイオン交換水を添加して実施した。３７℃で１分間あたりに１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義し、下記の式に従って算出した。
　　活性　（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ΔＡｓ－ΔＡ０）×０．６×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．２）
　　　ΔＡｓ：反応液の１分間あたりのＡ555変化量
　　　ΔＡ０：対照実験の１分間あたりのＡ555変化量
　　　３９．２：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数　（ｍＭ-1・ｃｍ-1）
　　　０．５：１ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
　　　０．６：反応液全体の容量（ｍＬ）
　　　ｄｆ：希釈係数
　　　０．２：酵素液の容量（ｍＬ）
　Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１株、Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株の粗酵素液のＬ－アルギニン酸化活性は、最大で、それぞれ０．００９Ｕ／ｍＬ（Ａｓ－ｐｅｎｏｘ１－１５株）、５．１Ｕ／ｍＬ（Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２－１６株）であった。
（実施例６）菌糸抽出型組換えｐｅｎｏｘ２の精製
　Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２－１６株の粗酵素液を、１０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）にバッファー置換した後、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（ＨｉＳｃｒｅｅｎ　ＣａｐｔｏＱ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。まず、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。その後、１０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ　７．５）に含まれる塩化ナトリウム濃度を０ｍＭから４０ｍＭまで直線的に上昇させ、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。Ｌ－アルギニン酸化活性を示す画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析し、夾雑タンパク質を含まない画分を精製ＰｅｎＯＸ２として回収した。回収した精製ＰｅｎＯＸ２溶液は、限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋ、メルク社製）を用いて、Ｌ－アルギニン酸化活性が２４Ｕ／ｍＬになるまで濃縮し、ペントシジン定量試験に用いた。
（実施例７）ペントシジン定量試験
　以下の試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子社製）を利用してペントシジンを測定した。
（試料：ペントシジン溶液）
　０．２μＭ、０．４μＭ、０．６μＭ、１．０μＭ、２．０μＭ又は４．０μＭペントシジン溶液（実施例２と同様のペントシジンを用いて調整）
（第１試薬：Ｌｅｕｃｏ色素、ペルオキシダーゼ溶液）
　１２０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
　０．２ｍＭ　ＤＡ－６７（１０－（Ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｃａｒｂｏｎｙｌ）－３，７－ｂｉｓ（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｏｔｈｉａｚｉｎｅ，　ｓｏｄｉｕｍ　ｓａｌｔ）（和光純薬工業社製）
　３．０Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ
（第２試薬：ＰｅｎＯＸ２溶液）
　１２０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．０）
　２４Ｕ／ｍＬ　ＰｅｎＯＸ２
　試料２５μＬを５０μＬの第１試薬に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２５μＬの第２試薬を添加して、ＰｅｎＯＸ２によるペントシジン酸化反応と、前記反応によって生成される過酸化水素の検出反応を３７℃で５分間進行させた。
　過酸化水素の検出反応では、ペルオキシダーゼが消費されると同時にＤＡ－６７が酸化されてメチレンブルーとなって呈色し、吸光度（Ａ658）が上昇する。一例として、試料（４．０μＭ　ペントシジン溶液）と第１試薬を混合してからの経過時間と吸光度（Ａ658）の関係を図３に示した。ＰｅｎＯＸ２を含む第２試薬の添加直後からＡ658の上昇が確認できた。
　続いて、ペントシジンの酸化に起因するＡ658上昇量（ΔＡ）を下記の式に従って算出した。
　ΔＡ＝（第２試薬添加５分後の吸光度）－（第２試薬添加直前の吸光度×０．７５）
　（第２試薬の添加により反応液中の組成物の濃度は０．７５倍（７５／１００倍）となるため、
　　第２試薬添加直前の吸光度を０．７５倍した値を第２試薬添加直後の吸光度とみなした。）
　ペントシジン終濃度とΔＡとの間には相関関係が成立した（図４）。したがって、ＰｅｎＯＸ２はペントシジン酸化活性を示し、ペントシジンの定量に利用できることが示された。結果は示さないが、ＰｅｎＯＸ１も同様にペントシジン酸化活性を示した。
（実施例８）菌糸分泌型組換えｐｅｎｏｘ２の精製
　Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株の菌糸培養液をＭｉｒａｃｌｏｔｈ（メルクミリポア社製）を用いてろ過し、菌糸培養上清を回収した。得られた菌糸培養上清７５ｍＬを、ポアサイズ０．２μｍのシリンジフィルターでフィルターろ過したのち限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋ、メルク社製）で濃縮した。濃縮液に、硫酸アンモニウムを７０％飽和となるように徐々に添加し、２時間、４℃で放置後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、４℃、５分）し、余分なタンパク質を沈殿させ、上清を回収した。回収した上清を、限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　０．５－３０ｋ、メルク社製）で濃縮した。
　これに、２Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を添加した後、疎水性相互作用クロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｂｕｔｙｌ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。具体的な手順は、以下のとおりである。
　まず、２Ｍ　硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、２Ｍ　硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）　１０ｍＬでカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。
　その後、１．５Ｍ、１．３Ｍ、１．１５Ｍ　硫酸アンモニウムをそれぞれ含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５ｍＬずつ、さらに１Ｍ　硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を１０ｍＬ、硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を５ｍＬ、順次カラムに通すことで、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。
　粗酵素液をロードした際にカラムから溶出した液を「Ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ１」、硫酸アンモニウム２Ｍを含むバッファーによる洗浄時に溶出した液を「Ｅｌｕｔｉｏｎ１」、硫酸アンモニウム１．５Ｍ、１．３Ｍ、１．１５Ｍ、１Ｍを含むバッファーで溶出した液をそれぞれ「Ｅｌｕｔｉｏｎ２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ４」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ５」、硫酸アンモニウムを含まないバッファーで溶出した液を「Ｅｌｕｔｉｏｎ６」とし、それぞれ異なる容器に回収した。
　分画したサンプルについて、ペントシジンとの反応性を解析した。その結果、１Ｍ　硫酸アンモニウムを含むリン酸カリウムバッファーで溶出したＥｌｕｔｉｏｎ５に強い活性が認められ、ペントシジンオキシダーゼ（ＰｅｎＯＸ２）が含まれていることが示唆された。このＥｌｕｔｉｏｎ５を、限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋ、メルク社製）で濃縮し、硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）にバッファー置換したのち再度限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋ、メルク社製）で濃縮した。これを、イオン交換クロマトグラフィー用カラム（ＨｉＴｒａｐ　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ　１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）を用いて分画した。具体的な手順は、以下のとおりである。
　まず、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）で平衡化したカラムに粗酵素液をロードし、酵素をカラムに吸着させた後に、５ｍＬの５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）でカラムを洗浄し、未吸着のタンパク質を溶出させた。
　その後、５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）に０．１Ｍの塩化ナトリウムを溶解した液を１ｍＬ　５回、同バッファーに０．１７５Ｍの塩化ナトリウムを溶解した液を１ｍＬ　５回、同バッファーに１Ｍの塩化ナトリウムを溶解した液を５ｍＬ　１回、順次カラムに通すことで、カラムに吸着したタンパク質を溶出させた。
　粗酵素液をロードした際にカラムから溶出した液を「Ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ２」、バッファーによる洗浄時に溶出した液を「Ｅｌｕｔｉｏｎ７」、塩化ナトリウムを含むバッファーで溶出した液をそれぞれ「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－１」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－４」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ８－５」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－１」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－２」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－３」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－４」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ９－５」、「Ｅｌｕｔｉｏｎ１０」とし、それぞれ異なる容器に回収した。
　分画したサンプルについて、ペントシジンとの反応性を解析した。その結果、０．１７５Ｍ　塩化ナトリウムを含むリン酸カリウムバッファーで溶出したＥｌｕｔｉｏｎ９－１及びＥｌｕｔｉｏｎ９－２に強い活性が認められ、ペントシジンオキシダーゼが含まれていることが示唆された。活性画分Ｅｌｕｔｉｏｎ９－１及びＥｌｕｔｉｏｎ９－２を等量ずつ混合したものをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析したところ、ほぼ単一のバンドが得られた（分子量約８０，０００）。得られたこの活性画分を、以下の理化学的性質を決定するのに用いた。
（実施例９）アスペルギルス・ソーヤ形質転換株Ａｓ－ｐｅｎｏｘ２株により生産されたＰｅｎＯＸ２の理化学的性質
　ＰｅｎＯＸ２の理化学的性質を決定するために、以下の酵素活性の測定方法を用いた。
　任意のバッファー６００μＬ、脱イオン水に溶解した３．９９Ｕ／ｍＬ　ペルオキシダーゼ、１．８ｍＭ　４－アミノアンチピリン、２ｍＭ　ＴＯＯＳ溶液４００μＬ、脱イオン水１５０μＬを任意の温度で１０分間インキュベートした後、氷上で保存していた酵素液５０μＬ、任意の温度で１０分間インキュベートした１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ８．０）に溶解させた２ｍＭ　ペントシジン溶液４００μＬを添加して撹拌し、任意の温度で３分間反応させた。反応中のＡ555の経時変化を分光光度計（Ｕ－３９００、日立ハイテクサイエンス社製）で測定した。２０秒から６０秒までの測定開始後経過時間－Ａ555変化量を活性値とみなした。
　さらに、３７℃で１分間あたりに１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１ｕｎｉｔ（Ｕ）と定義し、下記の式に従って算出した。
　　活性　（Ｕ／ｍＬ）＝｛（ΔＡｓ－ΔＡ０）×１．６×ｄｆ｝÷（３９．２×０．５×０．０５）
　　　ΔＡｓ：反応液の１分間あたりのＡ555変化量
　　　ΔＡ０：対照実験の１分間あたりのＡ555変化量
　　　１．６：反応液全体の容量（ｍＬ）
　　　ｄｆ：希釈係数
　　　３９．２：反応により生成されるキノンイミン色素のミリモル吸光係数　（ｍＭ-1・ｃｍ-1）
　　　０．５：１ｍｏｌの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のｍｏｌ数
　　　０．０５：酵素液の容量（ｍＬ）
　ｐｅｎｏｘ２の理化学的性質は、以下の通りであった。
（ａ）至適ｐＨの範囲
　終濃度５０ｍＭ　クエン酸－１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ４．０－７．５）、終濃度１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５－８．０）、終濃度１００ｍＭ　グリシンバッファー（ｐＨ８．０－１１．０）となるように夫々のバッファーを調製し、これらを用いて、夫々のｐＨにおいて、温度３７℃にて酵素反応を行なった。結果を図７に示す。ＰｅｎＯＸ２は、ｐＨ７．５において最も高い活性を示した。また、ｐＨ６．５－８．０でもリン酸カリウムバッファーｐＨ７．５付近における活性値の７０％以上を示したことから、ＰｅｎＯＸ２の至適ｐＨはｐＨ６．５－８．０であり、最も好ましい至適ｐＨはｐＨ７．５であると判断した。
（ｂ）至適温度の範囲
　終濃度５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）を用いて、種々の温度にてＰｅｎＯＸ２の活性測定を行なった。結果を図８に示す。最も高い活性を示した温度である、５０℃付近での活性に対して、８０％以上の活性を示す温度範囲は３７℃～５０℃であった。以上から、ＰｅｎＯＸ２の至適温度の範囲は３７℃～５０℃であると判断した。
（ｃ）熱安定性
　酵素液を各温度で１０分間処理した時の残存活性を、終濃度１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（活性測定時最終ｐＨ７．５）を用い温度３７℃にて前記活性測定を行なうことで評価した。熱安定性の結果は、図９に示す通りであり、ＰｅｎＯＸ２は、３０℃付近まで安定であった。
（ｄ）安定ｐＨの範囲
　緩衝液として、１００ｍＭ　クエン酸－２００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ３．０－６．５）、２００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．５－８．０）、２００ｍＭ　グリシンバッファー（ｐＨ８．０－１０．０）を用いて、夫々のｐＨにおいて２５℃で２０時間処理した後、ＰｅｎＯＸ２の残存活性を測定した。結果を図１０に示す。４℃で保存しておいたＰｅｎＯＸ２の活性に対して９０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ４．５－７．５、６０％以上の活性を示すｐＨ範囲はｐＨ４．０－９．０であった。
（ｅ）ペントシジンに対する活性値
　前記活性測定方法において、終濃度５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（活性測定時最終ｐＨ７．５）、３７℃で活性測定を行ない、上記の計算式を用いて活性値（Ｕ／ｍＬ）を求めた。活性値は７．８Ｕ／ｍＬ、比活性は２９．１Ｕ／ｍｇ（ブラッドフォード法）であることが判った。
（ｆ）ペントシジンに対するＫｍ値
　前記活性測定方法において、終濃度５０ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、３７℃で、基質ペントシジンの濃度を変化させて活性測定を行ない、ラインウェーバー・バークプロットから、ミカエリス定数（Ｋｍ）を求めた。結果を図１１に示す。ペントシジン（遊離体）に対するＫｍ値は０．０７０ｍＭであることが判った。
（ｇ）分子量
　Ｌａｅｍｍｌｉの方法に従って行なったＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により分子量を求めた。電気泳動ゲルとしてはＭｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ　ＴＧＸ　Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ　Ｐｒｅｃａｓｔ　Ｇｅｌｓ　４－２０％（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用い、分子量マーカーとしてはＰｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｐｌｕｓ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｌｌ　Ｂｌｕｅ　Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｔａｎｄａｒｄｓを用いた。結果を図１２に示す。ＰｅｎＯＸ２の分子量は、約８０，０００であった。
（実施例１０）ＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２と配列相同性を持つ酵素のペントシジンオキシダーゼ活性測定
　前述の通りＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２はいずれもペントシジンオキシダーゼ活性を有していた。ＢＬＡＳＴプログラムを用いてアミノ酸配列の一致率を調べると、両者のアミノ酸配列相同性は３８．２％であった。続いて以下の３酵素を購入し、前記活性測定方法において、終濃度１００ｍＭ　リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、３７℃で、ペントシジンオキシダーゼ活性を調べた。夫々のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性、並びにペントシジンオキシダーゼ活性は以下の通りであった。
（ａ）Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｄａｍａｎｔｅｕｓ由来アミノ酸オキシダーゼＴｙｐｅ　ＶＩ（メルク社製）（配列番号１２）
分子量：１３０，０００
　本酵素のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性は、夫々２６．８％及び２３．５％であった。酵素濃度が１ｍｇ／ｍＬ（ビュレット法）になるよう脱イオン水で希釈して活性測定に用いた。本酵素のペントシジンオキシダーゼ活性は０．５５５（Ｕ／ｍＬ）、比活性は０．５５５（Ｕ／ｍｇ）であった。
（ｂ）Ｃｒｏｔａｌｕｓ　ａｔｒｏｘ由来アミノ酸オキシダーゼＴｙｐｅ　Ｉ（メルク社製）（配列番号１３）
分子量：５９，０００（アミノ酸配列に基づく計算値）
　本酵素のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性は、夫々２６．３％及び２３．４％であった。酵素粉末１ｍｇを１ｍＬの脱イオン水で溶解して活性測定に用いた。本酵素のペントシジンオキシダーゼ活性は０．０２２（Ｕ／ｍＬ）、比活性は参考値として０．０２２（Ｕ／ｍｇ）であった。
（ｃ）Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ由来リジンオキシダーゼ（メルク社製）（配列番号１４）
分子量：１１６，０００
　本酵素のＰｅｎＯＸ１及びＰｅｎＯＸ２とのアミノ酸配列相同性は、夫々２４．０％及び２３．３％であった。酵素粉末１ｍｇを１ｍＬの脱イオン水で溶解して活性測定に用いた。本酵素のペントシジンオキシダーゼ活性は０．０６３（Ｕ／ｍＬ）、比活性は参考値として０．０６３（Ｕ／ｍｇ）であった。本実施例で使用した酵素間の配列相同性を以下の表に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（実施例１１）麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）における、Ｅｓｃａｐｉｎの異種組換発現
　成熟Ｅｓｃａｐｉｎをコードする遺伝子の５’末端にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のシグナルペプチドをコードする遺伝子を付加したものについて、麹菌アスペルギルス・ソーヤを宿主として異種組換え発現を行った。
・発現ベクターの作製
　成熟Ｅｓｃａｐｉｎ遺伝子配列としては、文献（Yang et al, J Exp Biol, 208(18):3609-22, 2005）に記載のジャンボアメフラシ（Ａｐｌｙｓｉａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の由来の、配列番号１５のアミノ酸配列（塩基配列は配列番号１７）を基に麹菌発現用にコドン改変した１，５５４塩基対（配列番号１８）を用いた。
　シグナルペプチドをコードする遺伝子としては、６９塩基対からなるＡｏＣＤＨｓｓ（アスペルギルス・オリゼ由来セルロースデヒドロゲナーゼのシグナルペプチドをコードする遺伝子のエキソン領域。配列番号１６）を用いた。
　成熟Ｅｓｃａｐｉｎをコードする遺伝子の５’末端にＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属のシグナルペプチドをコードする遺伝子を連結したもの（配列番号１８の５’末端に配列番号１６を連結したもの。以下、遺伝子配列Ａ）をプラスミドに組み込むために、遺伝子配列Ａの５’末端側に１２塩基対からなる遺伝子配列（配列番号２０）を、３’末端側に１２塩基対からなる遺伝子配列（配列番号２１）を付加したもの（以下、遺伝子配列Ａ'）を人工遺伝子合成により取得した。
　遺伝子配列Ａを発現させるための発現カセットとしては、翻訳伸長因子遺伝子ｔｅｆ１のプロモーター配列であるＰｔｅｆ（ｔｅｆ１遺伝子の上流７４８ｂｐ、配列番号７）をプロモーターとして、アルカリプロテアーゼ遺伝子ａｌｐのターミネーター配列であるＴａｌｐ（ａｌｐ遺伝子の下流８００ｂｐ、配列番号８）をターミネーターとして用いた。
　また、選択マーカーとしてはウラシル／ウリジン要求性を相補し、遺伝子の多コピー導入を可能とする形質転換マーカー遺伝子ｐｙｒＧ３（上流５６ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ及び下流５３５ｂｐを含む１，４８７ｂｐ、配列番号９）を用いた（特開２０１８－０６８２９２号公報参照）。これらのＰｔｅｆ、Ｔａｌｐ、ｐｙｒＧ３は、麹菌アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ　ＮＢＲＣ４２３９株）のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により取得した。
　次に、それぞれのＤＮＡを連結するためにＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（クロンテック社製）を使用した。例えば、Ｐｔｅｆと遺伝子配列Ａ及びＴａｌｐとを連結させる場合には、Ｐｔｅｆは配列番号２２のリバースプライマーを用いて、Ｔａｌｐは配列番号２３のフォワードプライマーを用いてＰＣＲ反応によりＤＮＡ断片を増幅させている。このとき、遺伝子配列Ａ'の５'末端には、Ｐｔｅｆ増幅用のリバースプライマー（配列番号２２）の５'末端と相補的な１５ｂｐの配列（ＡｏＣＤＨｓｓの開始コドンＡＴＧに相補的なＣＡＴ配列及び配列番号２０）があり、また、遺伝子配列Ａ’の３’末端には、Ｔａｌｐ増幅用のフォワードプライマー（配列番号２３）の５'末端と相補的な１５ｂｐの配列（Ｅｓｃａｐｉｎの終止コドンＴＧＡ配列及び配列番号２１）があるため、Ｉｎ　ｆｕｓｉｏｎ反応により、Ｐｔｅｆ、遺伝子配列Ａ及びＴａｌｐとの連結が可能となる。このようにして、Ｐｔｅｆ、ＡｏＣＤＨｓｓ、成熟Ｅｓｃａｐｉｎ、Ｔａｌｐ及びｐｙｒＧ３が順に連結されたＰｔｅｆ－ＡｏＣＤＨｓｓ－Ｅｓｃａｐｉｎ－Ｔａｌｐ－ｐｙｒＧ３がｐＵＣ１９プラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されている発現ベクターｐ１９－ｐＧ３－ＡｏＣＤＨｓｓ－Ｅｓｃａｐｉｎを作製した。
・麹菌発現株の作製及び培養
　上記で取得した形質転換用プラスミドｐ１９－ｐＧ３－ＡｏＣＤＨｓｓ－Ｅｓｃａｐｉｎを用いて、アスペルギルス・ソーヤのｐｙｒＧ遺伝子破壊株（ｐｙｒＧ遺伝子の上流４８ｂｐ、コード領域８９６ｂｐ、下流２４０ｂｐ欠損株）に対しプロトプラストＰＥＧ法により形質転換を行い、ＡｏＣＤＨｓｓ－Ｅｓｃａｐｉｎの発現カセットが多コピーで挿入されたアスペルギルス・ソーヤ形質転換株ＡｏＣＤＨｓｓ－Ｅｓｃａｐｉｎ株を２株取得した。
　取得したアスペルギルス・ソーヤ形質転換株ＡｏＣＤＨｓｓ－Ｅｓｃａｐｉｎ株を５０ｍＬ三角フラスコに入れた１５ｍＬのＰＰＹ液体培地（２％（ｗ／ｖ）パインデックス、１％（ｗ／ｖ）ポリペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）酵母エキス、０．５％（ｗ／ｖ）リン酸２水素１カリウム、０．０５％（ｗ／ｖ）硫酸マグネシウム・７水和物）に植菌し、３０℃で４～５日間振とう培養を行った。
（実施例１２）アミノ酸分解酵素と組み合わせたペントシジンの測定
・アミノ酸分解酵素１液（Ｅｓｃａｐｉｎ、配列番号１５）を含む溶液の調製
　実施例１１で得られた形質転換株の培養上清を限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋ、メルク社製）によって濃縮した。
　氷冷した濃縮液に、氷冷した硫酸アンモニウム飽和水溶液を硫酸アンモニウム７０％飽和となるように添加し、２時間、４℃で放置後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、沈殿を回収し、０．１Ｍ　リン酸カリウムバッファーｐＨ６．８に再溶解した。
・アミノ酸分解酵素２液（ヒガシダイヤガラガラヘビ（Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ）由来Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（配列番号１９）を含む溶液）の調製
　ヒガシダイヤガラガラヘビ由来Ｌ－アミノ酸オキシダーゼ（Ｌ-Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ Ｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ｃｒｏｔａｌｕｓ ａｄａｍａｎｔｅｕｓ） Ｔｙｐｅ Ｉ（メルク社製）を１ｍｇ/ｍｌになるように０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ６．８に溶解した。これを限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １５－３０ｋ、メルク社製）によって濃縮した。
・ペントシジン測定用酵素液の調製
　実施例５の「発現ベクターの作製」及び「麹菌発現株の作製及び培養」の項で得たＡ.ｓｏｊａｅ組換え株Ａｓ-ｐｅｎｏｘ２を、滅菌済みＰＰＹ培地にて、１８０ｒｐｍ、３０℃、５日間振盪培養した。得られた培養上清を限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　１５－３０ｋ、メルク社製）によって濃縮した。濃縮液に、硫酸アンモニウムを７０％飽和となるように徐々に添加し、２時間、４℃で放置後、遠心（１５，０００ｒｐｍ、４℃、１５分）し、上清を回収した。回収した上清を限外ろ過膜（Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　０．５－３０ｋ、メルク社製）によって濃縮し、０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ６．８で置換した。
・ペントシジン測定における夾雑物質消去試験
　ペントシジンオキシダーゼによりペントシジンを測定する系において、測定対象溶液に夾雑物質として各種アミノ酸を人為的に添加したモデル系を使用し、ペントシジン測定における本発明の測定方法の効果を検証した。
（１）ペントシジン溶液の調製
　０．１ｍＭ、０．２ｍＭ、０．３ｍＭ、０．４ｍＭ又は０．５ｍＭとなるようにペントシジン（遊離体換算）（ペプチド研究所社製、３ＴＦＡ塩を使用。）を脱イオン水で溶解した。
（２）夾雑物質溶液の調製
　Ｌ-アラニン２９０μＭ、Ｌ-システイン４８μＭ、Ｌ-アスパラギン酸４μＭ、Ｌ-グルタミン酸５７μＭ、Ｌ-フェニルアラニン４０μＭ、グリシン２４５μＭ、Ｌ-イソロイシン５４μＭ、Ｌ-リジン１２８μＭ、Ｌ-ロイシン９２μＭ、Ｌ-メチオニン２２μＭ、Ｌ-プロリン１８４μＭ、Ｌ-アルギニン６０μＭ、Ｌ-セリン９４μＭ、Ｌ-スレオニン１１６μＭ、Ｌ-バリン１５５μＭ、Ｌ-トリプトファン３９μＭ及びＬ-チロシン４５μＭとなるように終濃度０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ６．８に溶解した。アミノ酸濃度は、文献値（Mayo Clinic Laboratories Neurology Catalogの "Plasma Amino Acid Reference Values" (https://neurology.testcatalog.org/show/AAQP, アクセス日２０１８年１０月１０日。https://www.mayomedicallaboratories.com/test-catalog/Clinical+and+Interpretive/9265, アクセス日：２０２０年６月２４日）における18歳以上の血液中のアミノ酸量の各データ（上限値の半分の値）を参照して設定した。
（３）試薬の調製
　測定に使用する試薬を以下のように調製した。
３Ａ.  発色試薬
　３．９９Ｕ/ｍｌ　ペルオキシダーゼ(ＴＯＹＯＢＯ社製)、１．８ｍＭ　４-アミノアンチピリン(Ｆｌｕｋａ社製)、２ｍＭ　ＴＯＯＳ(Ｄｏｊｉｎｄｏ社製)となるよう脱イオン水に溶解した。
３Ｂ.  夾雑物質消去試薬
　アミノ酸分解酵素１液（１．６３Ｕ／ｍｌ）と、アミノ酸分解酵素２液（２．４０Ｕ／ｍｌ）を、液量が５:３の割合になるように混合した。
３Ｃ.  ペントシジン測定用試薬
　ペントシジン測定用酵素液（３．３１Ｕ／ｍｌ）を用いた。
（４）測定
　測定は、特に言及のないかぎり、すべて室温で行った。反応には、９６穴のマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を用いた。上記（１）のペントシジン溶液５μｌに対し、上記（２）の夾雑物質溶液２０μｌ、上記（３Ａ）の発色試薬２５μｌ、上記（３Ｂ）の夾雑物質消去試薬５０μｌを順に添加し、５５５ｎｍにおける１０分後の吸光度を測定し、データ１とした。
　続いて上記（３Ｃ）のペントシジン測定用試薬２５μｌを添加し、５５５ｎｍにおける１０分後の吸光度を測定し、データ２とした。データ２からデータ１を減じた値（ΔＯＤ）を測定値とした。比較例１として、夾雑物質を含まない溶液、すなわち上記（２）の夾雑物質溶液を０．１Ｍリン酸カリウムバッファーｐＨ６．８に置換した溶液の測定も行なった。
　また、比較例２として、夾雑物質を含むが夾雑物質消去を行なわない系、すなわち上記（３Ｂ）の夾雑物質消去試薬を０．１Ｍ　リン酸カリウムバッファーｐＨ６．８に置換した溶液の測定も行なった。
　３回の測定の平均値を以下の表３に示す。また、比較例１の測定値を１００％とした場合の比較例２及び実施例の相対値を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　上記表に示すとおり、夾雑物質の消去を行なわないペントシジン測定（比較例２）においては、夾雑物質の添加を反映して、夾雑物質添加なしの測定（比較例１）よりもペントシジン濃度が顕著に高く測定され、正確な値が得られなかった。
　これに対し、夾雑物質消去試薬を用いた消去工程を含む測定においては、夾雑物質に起因する測定値が小さくなり、比較例１の夾雑物質を添加しない系で得られたペントシジン濃度と近い値が得られ、測定誤差となる夾雑物質の影響が低減されて正確な測定を行うことができた。
（実施例１３）アミノ酸分解酵素１の基質特異性解析
　アミノ酸消去酵素１の、各種アミノ酸及びペントシジンに対する基質特異性を解析した。
（１）酵素液の調製
　実施例１２で得られたアミノ酸消去酵素１液を、０．１Ｍ　リン酸カリウムバッファーｐＨ６．８で希釈し、０．１３４Ｕ/ｍｌとした。
（２）各種アミノ酸及びペントシジン溶液の調製
　ペントシジン（実施例１２と同様）は２ｍＭとなるように脱イオン水で溶解した。各種アミノ酸は４ｍＭとなるように脱イオン水で溶解した。
（３）発色試薬の調製
　３．９９Ｕ/ｍｌペルオキシダーゼ(ＴＯＹＯＢＯ社製)、１．８ｍＭ ４-アミノアンチピリン(Ｆｌｕｋａ社製)、２ｍＭ ＴＯＯＳ（Ｄｏｊｉｎｄｏ社製）となるよう脱イオン水に溶解した。
（４）測定
　測定は、特に言及のないかぎり、すべて室温で行った。反応には、９６穴のマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を用いた。
　上記（１）の酵素液５０μｌに対し、上記（２）の各種アミノ酸又はペントシジン溶液２５μｌ、上記（３）の発色試薬２５μｌを順に添加し、５５５ｎｍにおける開始時及び１０分後の吸光度を測定し、吸光度上昇の傾きを以って対象基質に対する反応速度とみなした。
　最も反応速度の高かった基質であるアルギニンに対する反応速度を１００としたときの各種アミノ酸及びペントシジンに対する反応速度、すなわち基質特異性を図１３に示す。
（実施例１４）アミノ酸消去酵素２の基質特異性解析
　アミノ酸消去酵素２の、各種アミノ酸及びペントシジンに対する基質特異性を解析した。
（１）酵素液の調製
　実施例１２で得られたアミノ酸消去酵素２液を、０．１Ｍ　リン酸カリウムバッファー　ｐＨ６．８で希釈し、０．１２Ｕ/ｍｌとした。
（２）各種アミノ酸及びペントシジン溶液及び（３）発色試薬は、実施例１３と同様に調整した。
（４）測定
　測定は、特に言及のないかぎり、すべて室温で行った。反応には、９６穴のマイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ社製）を用いた。上記（１）の酵素液５０μｌに対し、上記（２）の各種アミノ酸又はペントシジン溶液２５μｌ、上記（３）の発色試薬２５μｌを順に添加し、５５５ｎｍにおける開始時及び１０分後の吸光度を測定し、吸光度上昇の傾きを以って対象基質に対する反応速度とみなした。最も反応速度の高かったロイシンに対する反応速度を１００としたときの各種アミノ酸及びペントシジンに対する反応速度、すなわち基質特異性を図１４に示した。
（実施例１５）ペントシジン測定用酵素の基質特異性解析
　ペントシジン測定用酵素の、各種アミノ酸及びペントシジンに対する基質特異性を解析した。
（１）酵素液の調製
　実施例１２で得られたペントシジン測定用酵素液を、０．１Ｍリン酸カリウムバッファー ｐＨ６．８で希釈し、０．０８３Ｕ/ｍｌとした。
　（２）各種アミノ酸及びペントシジン溶液及び（３）発色試薬は、実施例１３と同様に調整した。
(４)測定
　測定は、特に言及のないかぎり、すべて室温で行った。反応には、９６穴のマイクロウェルプレート(Ｎｕｎｃ社製)を用いた。上記（１）の酵素液５０μｌに対し、上記（２）の各種アミノ酸又はペントシジン溶液２５μｌ、上記（３）の発色試薬２５μｌを順に添加し、５５５ｎｍにおける開始時及び１０分後の吸光度を測定し、吸光度上昇の傾きを以って対象基質に対する反応速度とみなした。
　ペントシジンに対する反応速度を１００としたときの各種アミノ酸に対する反応速度、すなわち基質特異性を図１５に示した。
　実施例１３～１５の結果から、実施例１２においては、ペントシジン測定用酵素と反応性の高いアミノ酸が、アミノ酸分解酵素１液及びアミノ酸分解酵素２液によって消去され、測定誤差となる夾雑物質の影響が低減されてペントシジンの正確な測定を行うことができたと考えられた。

Claims (12)

  1. 　検体中のペントシジンの測定方法であって、
    　検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程、
    　前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる工程、及び
    　前記接触により生じた変化を検出する工程、
    を含み、前記アミノ酸分解酵素と前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は異なる、測定方法。
  2. 　前記検出工程において、酸素、過酸化水素又はアンモニアの量の変化が検出される、請求項１に記載の測定方法。
  3. 　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が、以下の理化学的性質：
    （１）作用：ペントシジンを酸化的に分解する活性；及び
    （２）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量：７５，０００～８５，０００
    を有する、請求項１又は２に記載の測定方法。
  4. 　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が以下の（ａ）～（ｆ）：
    （ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；あるいは
    （ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質；
    からなる群から選択されるいずれかのタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の測定方法。
  5. 　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が、糸状菌に由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載の測定方法。
  6. 　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質がペントシジンオキシダーゼであり、
    　前記アミノ酸分解酵素が、検体に含まれるアミノ酸を分解し、前記アミノ酸が、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の測定方法。
  7. 　前記アミノ酸分解酵素が分解するアミノ酸が、前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質の、ペントシジンに対する活性を１００％とした場合に、ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が４０％以上の相対的活性を有するアミノ酸である、請求項１～６のいずれか一項に記載の測定方法。
  8. 　前記アミノ酸分解酵素が、アミノ酸オキシダーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸アミノトランスフェラーゼ、アミノ酸デカルボキシラーゼ、アミノ酸アンモニアリアーゼ、アミノ酸オキシゲナーゼ及びアミノ酸ヒドロラーゼからなる群から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の測定方法。
  9. （ｉ）アミノ酸分解酵素；及び
    （ｉｉ）ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質
    を含む、検体中のペントシジン測定用キット。
  10. 　前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質が以下の（ａ）～（ｆ）：
    （ａ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｃ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列と７５％以上の同一性を有する塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｅ）配列番号２又は配列番号４に記載のアミノ酸配列の１若しくは複数のアミノ酸が欠失、置換及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質；あるいは
    （ｆ）配列番号１、配列番号３、配列番号５又は配列番号６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質；
    からなる群から選択されるいずれかのタンパク質である、請求項９に記載のキット。
  11. 　前記アミノ酸分解酵素が、アルギニン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンから選択されるアミノ酸を分解する酵素である、請求項９又は１０に記載のキット。
  12. 　検体由来のペントシジンの反応生成物の製造方法であって、
    　検体をアミノ酸分解酵素で分解する工程、
    　前記分解工程後の検体とペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質とを接触させる工程
    を含み、前記アミノ酸分解酵素と前記ペントシジンを酸化的に分解する活性を有するタンパク質は異なる、方法。
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