KR20230106041A - 락토비온산 생산능을 갖는 신규한 엔테로박터 클로아케 균주 및 이를 이용한 락토비온산 생산 방법 - Google Patents

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KR20230106041A KR1020220001827A KR20220001827A KR20230106041A KR 20230106041 A KR20230106041 A KR 20230106041A KR 1020220001827 A KR1020220001827 A KR 1020220001827A KR 20220001827 A KR20220001827 A KR 20220001827A KR 20230106041 A KR20230106041 A KR 20230106041A
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장영아
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Abstract

본 발명은 토양으로부터 분리된 락토비온산 (Lactobionic acid) 생산능이 향상된 신규한 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) 균주 및 상기 신규한 균주를 이용하여 락토비온산 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

락토비온산 생산능을 갖는 신규한 엔테로박터 클로아케 균주 및 이를 이용한 락토비온산 생산 방법{Novel Enterobacter cloacae sp. producing lactobionic acid and method for production of lactobionic acid using the Same}
본 발명은 락토비온산 생산능을 갖는 신규한 엔테로박터 클로아케 균주 및 이를 이용한 락토비온산 생산 방법에 관한 것이다.　
유당 유도체 중 4-O-B-D-galactopyranosyl-D-gluconic acid로 명명된 알돈산(aldonic acid)인 락토비온산(LBA, lactobionic acid)은 유당(lactose) 의 산화로 생성되는 물질로 미국에서는 이미 FDA의 인가를 받아 식품보조제, 화장품 보습제로 이용되고 있다. 또한 상기 락토비온산은 당질배합체(glycoconjugates)로 갈렉틴1(GAL1)의 CDS부분에 결합하여 활성을 저해한다고 알려져 있으며(K.A. Stannard, Cancer Lett 299 (2010) 95-110) 장기이식시 장기보존제에도 함유되어 쓰이는 등 생체 내 안전성도 입증되어 있다 (J.H. Southard, F.O. Belzer, Organ preservation, Annu RevMed 46 (1995) 235-247).
상기 락토비온산은 화학적, 전기화학적, 불균일 촉매반응 또는 생물학적 산화에 의해 만들어지며, 이 중 락토비온산의 생물적 안정성을 위해 특히, 환경친화적인 생물학적 산화에 의한 락토비온산생산이 최근 많이 연구되고 있다.
현재까지 대표적인 락토비온산 생산 미생물 균주로 Pseudomonas taetrolens, Buckholderia cepacia, 및 Zymomonas mobilis 등이 보고되고 있다. 지금까지 보고된 락토비오산 생산성이 가장 높은 균주는 Buckholderiacepacia 이다. 하지만 이 균주는 병원성균주로 보고되어 있어 산업적인 활용이 불가능하다. 또한, Pseudomonas 속미생물로서 Pseudomanas fluorescence를 이용하여 락토비온산을 생산하고자 하는 시도도 있었지만 상기 균주 속 역시 병원균이고 특히 암 치료 환자와 같이 면역 체계가 손상된 환자에게 영향을 미치는 것으로알려져 있다.
따라서, 더 포괄적인 락토비온산 상업적 응용 및 안정적인 락토비온산 생산을 위해서는 비병원 균으로 속하며 고 효율로 락토비온산 생산에 적용될 수 있는 미생물이 필요한 시점이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 등록특허공보 제10-2030776　호
본 발명은 우수한 락토비온산 생산성을 보이는 비병원성 신규 미생물을 제공하고, 또한 상기 미생물을 이용하여 락토비온산을 고생산성으로 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
더 상세하게는 본 발명은 기존 락토비온산 생산능이 우수하다고 알려진 슈도모나스 속 미생물보다 생산성이 향상된 균주인 엔테로박터 속 균주를 배양하여 최적화된 배양 조건에서 락토비온산을 보다 고 생산성으로 생산하는 방법을 제공하며, 더 나아가 상기 균주의 글루코스 탈수소효소인 GDH 효소를 코딩하는 핵산 서열이 락토비온산 생산에 관여하는 함을 확인하였다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) 균주를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 배양하여 락토비온산을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 유효성분으로 포함하는 락토비온산 생산용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규한 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) 균주로부터 유래한 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 락토비온산을 생산하는 재조합 균주 제조용 재조합 벡터를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환된, 락토비온산 생산용 재조합 균주를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토비온산 생산용 재조합 균주의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 락토비온산 생산용 재조합 균주를 사용하여 락토비온산을 생산하는 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 락토비온산 (Lactobionic acid)을 생산하는 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 (기탁번호: KCTC18876P) 균주를 제공한다.
본 발명의 일시예에 있어서, 상기 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 균주는 토양에서 분리된 것이다.
또한, 본 발명은 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1를 배지에서 배양하는 단계: 및 이의 배양의 생산성을 최적화하는 단계를 포함하는 락토비온산 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에 있어서 배양배지는 질소원 및 솔트를 포함하는데, 상기 질소원은 효모추출물 (yeast extract), 펩톤 (peptone) 및 소고기추출물 (beef extract)로부터 선택되는 1 이상일 수 있고, 상기 솔트는 NaCl을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로 엔테로박터 클로아케 배양하는 단계에서는 1 내지 20 부피 % 농도의 젖당을 포함하고, 0.2% 효모추출물과 0.5% 펩톤 그리고 0.1% 소고기추출물을 포함하고, 0.5% NaCl을 포함한다. 상기 배양하는 단계는 NB 배지 50 ml 내지 2.0 L, 20 ℃내지 40 ℃에서 20 내지 48시간 동안 배양시키는 것일 수 있다.
필요에 따라, 상기 배양은 탄소원으로서 용존 젖당(dissolved lactose)이 포함된 배지에서 수행될 수 있는데, 배양은 젖당 농도에 따라 배양 할 수 있고, pH 보정물질인 CaCO3 존재 하의 배양 배지에서, 예를 들면 배지에 젖당 농도를 10 g/L 에서 200 g/L까지 다양하게 사용할 수 있고, CaCO3 첨가 또는 미첨가 상태로 수행될 수 있다.
바람직한 구현 예에서, 본 발명의 배양은 회분식 배양(batch culture) 방법에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 관점은 상기 신규한 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 균주를 유효성분으로 포함하는 락토비온산 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 신규한 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 (기탁번호: KCTC18876P) 균주로부터 유래한 GDH (quinoprotein glucose dehydrogenase) 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 락토비온산을 생산하는 재조합 균주 제조용 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 상기 균주의 글루코스 탈수소효소인 GDH (Quinoprotein glucose dehydrogenase)를 코딩하는 핵산 서열이 락토비온산 생산에 관여한다는 사실을 밝혀내었다.
상기 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 유래 GDH 효소는 두 가지 글루코스 탈수소효소인 GDH1 (Membrane bound quinoprotein glucose dehydrogenase, m-GDH) 및 GDH 2 (soluble quinoprotein glucose dehydrogenase, s-GDH)로부터 선택될 수 있고, 이를 대조군 대장균에 도입하여 GDH 발현 여부에 따른 락토비온산 생산능을 확인 및 재조합 균주를 제작하였다.
따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 (기탁번호: KCTC18876P) 균주로부터 유래한 GDH (quinoprotein glucose dehydrogenase) 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 수득하는 단계; 및 상기 재조합 벡터를 그람음성균에 도입하는 단계를 포함하는 락토비온산 생산용 재조합 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.
일 실시예에서, 본 발명의 재조합 미생물을 제조하기 위하여, 상기 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 유래 GDH 효소는 이를 코딩하는 유전자를 PCR을 통하여 특정 프라이머를 통하여 증폭시킬 수 있다.
이후, 상기 유전자를 플라스미드, 예컨대 pDSK519 플라스미드에 삽입하여 재조합 플라스미드 벡터를 제작할 수 있으며, 상기 재조합된 플라스미드 벡터를 대장균(E.coli)에 형질전환하여 재조합 대장균을 제작할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은 상기 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 균주 또는 상기 재조합 균주를 사용하여 락토비온산을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 균주 또는 상기 재조합 균주를 사용하여 락토비온산을 생산하는 경우 시간당 락토비온산 생산성은 5 g/L/h 이상, 6 g/L/h 이상, 7 g/L/h 이상, 8 g/L/h 이상, 9 g/L/h 이상, 또는 10 g/L/h 이상일 수 있다.
본 발명의 구현예에 있어서, 상기 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 균주 또는 상기 재조합 균주의 배양을 통한 생산성 향상 방법은 대한민국특허공개공보 10-2018-0047470에 개시된 내용과 같이 개발 될 수 있으며, 대한민국특허공개공보 10-2018-0047470에 개시된 내용 전체는 본원 명세서에 참고로써 포함된다.
본 발명의 신규 미생물은 비병원성 균주이며 락토비온산 생산능을 가진다. 또한 상기 미생물을 이용하 락토비온산을 고생산성으로 생산할 수 있어 기존 병원성 균주에 의해 생산된 락토비온산 보다 더 생리화학적으로 안전한 락토비온산을 생산할 수 있어, 이의 활용도가 더 증가될 것이며 상업화 기술에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 토양으로부터 분리된 미생물을 동정하는 단계의 사진으로 젖당 평판배지에서 락토비온산 생산능이 있는 미생물을 활성대의 형성 여부에 따라 동정하는 결과이다.
도 2는 기존 락토비온산 생산능이 우수하다고 알려진 슈도모나스 테트로렌스 (Psedomonas taetrolens) 균주와 신규 동정 된 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 균주의 플라스크 배양을 통한 A) 성장률 , B) 젖당 소모 농도 , C) 락토비온산 생산능을 비교한 결과이다. (검정동그라미: 엔테로박터클로아케, 하얀동그라미: 슈도모나스 테트로렌스)
도 3은 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 의 온도 변화에 따른 락토비온산 생산성을 비교하기 위한 배양을 진행한 결과를 나타낸것이다.
도 4는 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 의 5 L 발효기에서 락토비온산 생산을 위한 발효를 진행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 젖당 유래 하에 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 유래 GDH1 유전자와 GDH2 유전자의 락토비온산 전환 여부 가능 결과를 나타낸 HPLC 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 I. 균주의 분리 및 분리된 균주의 동정
실험예 1. 락토비온산 생산 균주 분리
락토비온산 생산능을 갖는 균주를 동정하기 위해서, 울산광역시 지역에서 샘플링한 토양을 사용하였고, 각 시료 1 g을 멸균한 생리식염수 10 mL에 첨가하고 이를 10 -1, 10 -2 배로 희석한 샘플을 볼텍스 (vortex)로 충분히 혼합한 후, 각 시료를 평판 배지에 100 μL씩 도말하고 30 ºC에서 2일간 배양하며 단일 콜로니를 순수 분리하였다. 본 발명에서 사용한 락토비온산 생산 능력 균주 선별용 평판 배지 성분은 영양배지(Nutrient broth), 젖당 (Lactose), 한천 (Agar), 탄산칼슘(CaCO3) 및 증류수로 이루어지는 것을 특징으로 하는 탄산칼슘이 포화되어 있어 락토비온산 생산시 CaCO3의 용해 여부를 확인하여 균주의 활성대 형성으로 활성을 선별가능하게 하는 평판 배지이며, 더욱 상세하게는 증류수 1L를 기준으로, 영양배지로써 비프추출물(Beef extract) 1 g, 효모추출물(yeast extract) 2 g, 펩톤 5 g, 염화나트륨(Nacl) 5 g 및 아가(agar) 파우더 15 g 비율로 첨가하여 용해시켜 autoclave 에서 121 ºC로 15분간 가압 멸균 후 따로 멸균된 5 g의 탄산칼슘 파우더를 혼합하여 준비하였다.
분리된 각 콜로니들은 상기 탄산칼슘 및 젖당 포함 혼탁 평판배지에서 분리되어 30 ºC에서 7일간 배양되었고, 락토비온산 생산에 따른 pH변화로 CaCO3가 용해되어 생성된 활성대를 띄는 균주는 락토비온산 생산능이 있는 것으로 선별되었다. 약 600 개 이상의 콜로니가 평판배지에서 성장하였으나, 도 1에서와 같이 마스터 평판배지에서는 약 8일 이후 5개의 콜로니만 CaCO3 용해에 따른 활성대를 나타내지는 것을 확인함으로써, 락토오스 옥시다이징 효소를 갖는 균주는 락토비온산 생산 시 pH변화에 따른 CaCO3의 용해 여부에 의해 활성대를 형성하는 것으로 락토비온산 생산능을 보유한 균주 동정하였다.
실험예 2. KRICT-1의 유전자 분석
동정된 5개의 균주를 젖당이 포함된 액체배지에서 배양하여 이중 가장 우수한 락토비온산 생산능을 갖는 균주의 16s rRNA염기서열 분석을 하였다. Wizard® Genomic DNA purification kit를 이용하여 genomic DNA를 추출한 후, 유니버셜 프라이머 27F (5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492 R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 증폭된 PCR산물을 정제한 후, Macrogen Corp (Korea)에서 염기 서열분석을 의뢰하여 16S rRNA gene sequencing 분석 데이터를 확보하고, 서열들은 BLAST(Basic Local Alignment and Search Tool) 알고리즘 (Altschul et al. 1990)으로 정렬시켰고, 가까운 친척을 찾기위해 NCBI GenBank에서 비교하였다. 이에 본 균주와 높은 상동성을 나타내는 균주는 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae)을 확인하였고, 본 특허에서 동정된 균주의 명명을 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) KRICT-1으로 표기하였다.
실시예 II. 균주의 락토비온산 생산능 비교
본 특허에서 동정된 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) KRICT-1의 락토비온산 생산능의 확인 및 높은 생산성을 확인하고자, 기존 락토비온산 생산능이 우수하다고 밝혀진 균주인 P. taetrolens(한국생명공학연구원 생물자원센터에서 P. taetrolens KCTC 12501 균주를 구매함)를 대조군으로 이용하여 락토비온산 생산능을 비교하였다. 배양에 사용한 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/LNaCl)을 사용하였다. 최적의 젖당 농도를 확인하기 위하여 배지에 각각 200 g/L 젖당을 첨가하여 배양하였다. 냉동보관 균주들을 NB plate에 streaking 하고 슈도모나스 테트로렌스는 25 ℃에서, 엔테로박터 클로아케 KRICT-1은 30 ℃에서 48 시간 배양 후 형성된 colony를 5 ml NB 배지에 접종하여 200 rpm으로 24 시간 진탕 배양 하였다. 배양된 seed culture를 최종 OD 0.2가 되도록 본 배지에 접종하였다. 배양은 250 ml round flask에 50 ml 배지를 첨가하여 25 ℃, 30 ℃에서 200 rpm으로 진행하였다.
젖당과 락토비온산의 분석은 Refractive Index Detector(RID)가 장착된 Agilent사의 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC 1260 모델)을 이용하였다. 컬럼은 Coregel ION 300 column을 사용하였고, 컬럼 온도는 70℃를 유지하였다. 이동상은 0.5mM H2SO4를 이용하였고, flow는 0.3 ml/min이었다. 슈도모나스의 경우 락토비온산 생산성은 7.75 g/L/h이였으나, 엔테로박터 클로아케 KRICT-1의 생산성은 8.37 g/L/h로 약 1.08배 생산성이 향상된 비병원성 균주를 확보하였음을 확인하였다.
실시예 III. 최적 배양 온도 및 발효기 배양
실험예 1. 최적 배양 온도 도출
본 발명의 재조합 엔테로박터 클로아케 KRICT-1의 락토비온산 생산성 향상을 위해 반응온도의 최적조건을 도출하였다. 반응 최적 온도를 결정하기 위해서 20℃~ 40℃ 범위에서 5℃ 간격으로 반응 조건을 설정하였으며, 초기 세포 접종 OD값(OD600nm)이 0.2가 되도록 설정하여 락토비온산 생산성을 확인하였다.
배양에 사용된 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/LNaCl)을 사용하였고, 상기 젖당 농도 변화와 pH 보정 실험결과를 바탕으로 200 g/L 젖당과 pH 보정을 위해 30g/L CaCO3를 첨가한 배지를 사용하였다. 배양은 250 ml round flask에 50 ml 배지를 첨가하여 200 rpm으로 진탕 배양 하였다. 배양은 25시간 진행되었으며, 분석은 약 1~4시간 간격으로 이루어졌고, 세포 생장, pH, 젖당 소모량 그리고 락토비온산 생산량을 측정하였다. 배양결과 세포 생장 및 락토비온산 생산성이 가장 높았던 온도 조건은 35 ℃로 이때의 락토비온산 생산성은 8.72 g/L/h로 확인되었다. 슈도모나스 테트로렌스의 최적 락토비온산 생산 온도가 25 ℃임에 반해, 엔테로박터 클로아케 KRICT-1은 25 ℃이하의 저온에서는 세포 성장과 락토비온산 생산이 매우 저조한 것으로 나타났다.
실험예 2. 발효기를 이용한 락토비온산 생산
상기 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 균주의 락토비온산 생산 증가를 위함으로 5L 발효를 진행 하였다.
균주를 NB plate에 streaking 하고 35 ℃에서 48 시간 배양 후 형성된 colony를 5 ml NB 배지에 접종하여 35 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 진탕 배양 하였다. 배양된 seed culture를 100 ml NB 배지에 lactose 20 g/L를 포함하여 접종하여 35 ℃에서 200 rpm으로 24 시간 진탕 배양 한 후 발효 시작 시 초기 OD값(OD600nm)이 0.2가 되도록 발효 배지에 접종하였다. 발효에 사용된 배지는 Nutrient broth (NB) (1 g/L beef extract, 2 g/L yeast extract, 5 g/L 펩톤, 5 g/L NaCl)을 사용하였고, 상기 젖당 농도 변화와 pH 보정 실험결과를 바탕으로 200 g/L 젖당과 pH 보정을 위해 30g/L CaCO3를 첨가하여 발효 시 pH 6.5이상을 유지하여 진행하였다. 배양은 5 L 발효조에 2 L 배지를 첨가하여 온도는 35 ℃에서 실시하였다. 용존산소농도 (Dissolved Oxygen, DO) 30% 로 지정하였으며, 용존산소 농도 유지를 위하여 교반 속도를 200 ~ 500 rpm까지 조절하며 발효를 실시하였다. 총 발효는 27시간 진행되었으며, 세포 성장, pH, 젖당 소모량 그리고 락토비온산 생산량을 측정하였다.
배양 결과 첨가된 젖당은 배양 21시간에 모두 소진되었으며 락토비온산 생산 농도는 209.3 g/L로 생산성은 9.97 g/L/h을 나타내었다. 이는 플라스크 배양보다 생산성이 약 1.14배 향상된 결과를 나타내었다. 이 결과는 현재까지 엔테로박터 클로아케 KRICT-1를 이용한 락토비온산 생산에 대한 최초 보고이다.
실시예 IV. Enterobacter cloacae KRICT-1 유래 GDH1 유전자와, GDH2 유전자의 락토비온산 전환 여부 가능 확인
선행연구를 통해 대장균 내 락토비온산 생산에 관여하는 유전자인 gcd(quinoprotein glucose dehydrogenase)가 Knock out 된 음성 대조군 대장균(E.coil △gcd)을 이용하여 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) KRICT-1유래 락토비온산을 생산에 관여하는 유전자를 선별하고자 다음과 같이 실험을 수행하였다.
실험예 1. 재조합 플라스미드 제조 및 재조합 균주 제조
젖당(락토오스, lactose) 산화반응을 통해 락토비온산 생산 능력이 우수한 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae) KRICT-1로부터 락토비온산 생산에 필수적일 것으로 예상된 두가지의 GDH(Quinoprotein glucose dehydrogenase)의 재조합 플라스미드를 각각 제조하고 이를 대조군 대장균(E.coil △gcd)에 도입하여 GDH 발현 여부에 따른 락토비온산 생산능을 확인 및 재조합 균주를 제작하였다. 두 가지 글루코스 탈수소효소인 GDH1(Membrane bound quinoprotein glucose dehydrogenase, m-GDH)와 GDH 2(soluble quinoprotein glucose dehydrogenase, s-GDH)를 각각 pDSK519 플라스미드에 도입하기 위해서, 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 게놈 유전자 주형으로부터 GDH1은 정방향 (5'- CGATCTAGAAGGAAGTGCCCATGGCTGAAACAAAAACTAAAC -3') 및 역방향 ( 5'- CAGTGAATTCTTACTTAGCGTCGTCAGGCAGTGCA -3'), GDH2은 정방향 (5'- CGATCTAGAAGGAAGTCCGTGTGTGCATAACGATAAGCATTATCC -3') 및 역방향 ( 5'- CAGTGAATTCTTATTCCGGCAACGCGTAGACAACCACC-3') 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응(94℃ 5분동안 1회; 94℃ 30초간, 55℃ 2분 20초간, 72℃ 30초간 반응을 30회; 72℃ 7분간 1회)을 통하여 정방향 프라이머에는 Xba°인식부위가 역방향프라이머에는 EcoR°인식 부위가 존재하여 GDH 유전자를 증폭시켰다. 증폭된 유전자를 한천 겔 전기영동법을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 DNA 단편을 Xba°와 EcoR°으로 절단한 후에, EcoR°와 EcoR°로 절단된 통상의 대장균용 플라스미드 벡터인 pDSK519에 도입하여 재조합 플라스미드를 제작하였다.
상기 제조된 플라스미드 pDSK-ECGDH1 과 pDSK-ECGDH2를 열충격(42℃) 방법에 의해 대장균 (E. coil competent cell)에 도입하여 형질전환시켰다. pDSK519 플라스미드는 선택표지로서 카나마이신 (kanamycin) 저항성 유전자를 가지고 있으며, 카나마이신이 들어있는 LB-agar배지에서 pDSK519이 도입된 콜로니들을 선별하였고, 선별된 콜로니들의 콜로니 PCR을 통해 PCR산물의 DNA 시퀀싱(Macrogen) 확인하여 GDH1, GDH2 유전자 형질전환을 확인하였으며,
대조군 대장균(E. coil △gcd)의 형질전환 방법에 있어서는 안정적 제조와 효율을 높이기 위해 전기천공법(electroporation)에 의한 형질전환방법을 사용하였다. 전기적 형질 전환용 세포는 다음과 같은 과정을 통해 제조하였다.
대조군 대장균(E. coil △gcd)를 LB (Luria-Bertani) 플레이트 (1% tryptone, 0.5 % yeast extract, 1% NaCl, 1.5% agar)에 도말하여 35℃정치배양기에서 24시간 동안 배양하였다. LB 플레이트에서 자란 균주의 콜로니를 LB 액체배지 200mL에 접종하고, 35℃ 교반배양기에서 150 rpm으로 OD(600nm)가 0.6 (분광광도계 (spectrophotometer)로 측정)이 될 때까지 배양하였다. 원심분리를 통해 배양액과 균주 세포를 분리하고 배양액을 버린 후 균주 세포를 10% 글리세롤 30 mL에 풀어서 세척하였다. 원심분리를 통해 10% 글리세롤과 균주세포를 분리하고, 분리된 10% 글리세롤은 버렸다. 위 과정을 3번 반복하였고, 원심분리를 통해 얻은 세척된 균주세포를 10% 글리세롤 3 mL에 풀어주었다. 상기 pDSK-ECGDH1 및 pDSK-ECGDH2 플라스미드를 미생물 세포에 전기적 충격으로 도입할 때에는 전기 충격 형질전환용 큐벳에 상기 전기적 형질전환용 세포 80 ul와 플라스미드 5 ul를 넣고, 1.8 kV 전압을 5ms 동안 가한 후, SOC 배지(2% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.05% NaCl, 0.0186% KCl, 0.095% MgCl2, 0.6% glucose) 1ml을 첨가하여 35℃ 교반배양기에서 100rpm으로 1시간동안 배양하여 재조합 균주를 제조하였다. 제작된 재조합 균주는 LB 플레이트에 도말해 25℃에서 배양하였다. 이를 통해 재조합 플라스미드인 pDSK-ECGDH1 및 pDSK-ECGDH2를 대조군 대장균(E. coil △gcd)에 형질 전환한 재조합 균주를 개발하였다.
실험예 2. GDH 도입된 재조합 대장균 제조 및 이를 이용한 락토비온산 생산 능력 확인
야생형 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 균주로부터 얻은 두가지의 GDH (Quinoprotein glucose dehydrogenase)는 피롤로퀴놀린퀴논(PQQ)을 조효소로 하는 글루코스 탈수소효소로써, 상기 유전자가 젖당으로부터 락토비온산 전환에 필수적인 효소를 코딩하는 유전자인지의 여부를 확인하기 위해 대조군의 대장균(E. coil △gcd)과 형질전환된 신규 GDH1이 도입된 대장균 (E. coil △gcd [pDSK-ECGDH1]) 및 GDH2이 도입된 대장균(E. coil △gcd [pDSK-ECGDH2] )을 PQQ 및 젖당이 포함된 LB배지에서 배양하고 균체 성장 및 락토비온산 전환 산물을 확인하였다
GDH1 및 GDH2 유전자를 도입한 대장균들과 대조균 대장균(E. coil △gcd)을 각각 2ml의 LB배지 (Tryptone 10g, Yeast Extract 5g, NaCl 5g) 에 온도 조건 35 C으로 16시간 배양하였다. 그 후, 각 균체를 초기 OD(600nm)가 0.2 가 되도록 대조군 대장균과 형질전환 대장균은 5ml의 영양배지 에 lactose 20 g/L, CaCO3 3 g/L 및 PQQ 20 μM을 접종하여 35 C, 200 rpm 조건으로 교반배양기에서 배양하고, 배양 개시로부터 4시간 후에 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드)를 최종 농도 1mM가 되도록 첨가하여 총 24시간 배양하였다.
젖당과 락토비온산의 HPLC분석결과에서 retention time은 도5에서 나타나는 것처럼 각각 19.8분, 21.4분으로 분리되어 확인되어지는데, 이와 같은 방법으로 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 유래 락토비온산 생산에 관여하는 GDH1, GDH2를 도입한 대장균에서만 대조균 대장균에서는 나타나지 않는 락토비온산 피크가 나타나는 것으로 확인 되었고 이에 본 발명에서 제조된 재조합 대장균은 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 유래 GDH 유전자의 도입에 의해 젖당을 대사하여 락토비온산 전환 능력이 있음을 확인하였다.
[서열목록 프리텍스트]
- 제1서열: PRT, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1로부터 유래한 GDH1 (Membrane bound quinoprotein glucose dehydrogenase, m-GDH)의 아미노산 서열
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- 제2서열: PRT, 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1로부터 유래한 GDH2 (soluble quinoprotein glucose dehydrogenase, s-GDH)의 아미노산 서열
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한국생명공학연구원 KCTC18876P 20201203
<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF CHEMICAL TECHNOLOGY <120> Novel Enterobacter cloacae sp. producing lactobionic acid and method for production of lactobionic acid using the Same <130> P21-247 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 796 <212> PRT <213> Enterobacter cloacae <400> 1 Met Ala Glu Thr Lys Thr Lys Gln Pro Arg Leu Leu Val Thr Leu Thr 1 5 10 15 Ala Ala Phe Ala Ala Phe Cys Ala Leu Tyr Leu Leu Ile Gly Gly Val 20 25 30 Trp Leu Val Ala Ile Gly Gly Ser Trp Tyr Tyr Pro Ile Ala Gly Leu 35 40 45 Val Met Val Gly Val Thr Val Leu Leu Leu Arg Arg Lys Gln Ser Ala 50 55 60 Leu Trp Leu Tyr Ala Ala Leu Leu Leu Ala Thr Met Ile Trp Gly Val 65 70 75 80 Trp Glu Val Gly Phe Asp Phe Trp Ala Leu Thr Pro Arg Ser Asp Ile 85 90 95 Leu Val Phe Phe Gly Ile Trp Leu Ile Leu Pro Phe Val Trp Arg Arg 100 105 110 Leu Ile Val Pro Ser Ser Gly Ala Val Ala Gly Leu Val Val Ala Leu 115 120 125 Leu Ile Ser Gly Gly Ile Leu Thr Trp Ala Gly Phe Asn Asp Pro Gln 130 135 140 Glu Ile His Gly Thr Leu Asn Thr Glu Ser Thr Pro Ala Ala Ala Ile 145 150 155 160 Ser Gln Val Ala Asp Gly Asp Trp Pro Ala Tyr Gly Arg Asn Gln Glu 165 170 175 Gly Gln Arg Tyr Ser Pro Leu Lys Gln Ile Asn Ala Asp Asn Val Lys 180 185 190 Asn Leu Lys Glu Ala Trp Val Phe Arg Thr Gly Asp Leu Lys Met Pro 195 200 205 Asn Asp Pro Gly Glu Leu Thr Asn Glu Val Thr Pro Ile Lys Val Gly 210 215 220 Asn Met Leu Tyr Leu Cys Thr Ala His Gln Arg Leu Phe Ala Leu Asp 225 230 235 240 Ala Ala Thr Gly Lys Glu Lys Trp His Phe Asp Pro Gln Leu Asn Ser 245 250 255 Asn Pro Ser Phe Gln His Ile Thr Cys Arg Gly Val Ser Tyr His Glu 260 265 270 Ala Arg Ala Asp Asn Ala Ser Pro Glu Val Ile Ala Asp Cys Pro Arg 275 280 285 Arg Ile Met Leu Pro Val Asn Asp Gly Arg Leu Phe Ala Ile Asn Ala 290 295 300 Glu Thr Gly Lys Leu Cys Glu Thr Phe Ala Asn Lys Gly Ile Leu Asn 305 310 315 320 Leu Gln Thr Asn Met Pro Asp Thr Thr Pro Gly Leu Tyr Glu Pro Thr 325 330 335 Ser Pro Pro Ile Ile Thr Asp Lys Thr Ile Val Ile Ala Gly Ser Val 340 345 350 Thr Asp Asn Phe Ser Thr Arg Glu Thr Ser Gly Val Ile Arg Gly Phe 355 360 365 Asp Val Asn Thr Gly Lys Leu Leu Trp Ala Phe Asp Pro Gly Ala Lys 370 375 380 Asp Pro Asn Ala Ile Pro Ser Asp Glu His Thr Phe Thr Phe Asn Ser 385 390 395 400 Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Ala Tyr Asp Ala Lys Leu Asp Leu Val 405 410 415 Tyr Leu Pro Met Gly Val Thr Thr Pro Asp Ile Trp Gly Gly Asn Arg 420 425 430 Thr Pro Glu Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ser Ile Val Ala Leu Asn Ala 435 440 445 Thr Thr Gly Lys Leu Ala Trp Ser Tyr Gln Thr Val His His Asp Leu 450 455 460 Trp Asp Met Asp Met Pro Ser Gln Pro Thr Leu Ala Asp Ile Thr Val 465 470 475 480 Asn Gly Lys Thr Val Pro Val Ile Tyr Ala Pro Ala Lys Thr Gly Asn 485 490 495 Ile Phe Val Leu Asp Arg Ser Asn Gly Lys Leu Val Val Pro Ala Pro 500 505 510 Glu Lys Pro Val Pro Gln Gly Ala Ala Lys Gly Asp Tyr Val Thr Lys 515 520 525 Thr Gln Pro Phe Ser Asp Leu Ser Phe Arg Pro Glu Lys Asp Leu Ser 530 535 540 Gly Ala Asp Met Trp Gly Ala Thr Met Phe Asp Gln Leu Val Cys Arg 545 550 555 560 Val Ile Phe His Gln Leu Arg Tyr Glu Gly Ile Phe Thr Pro Pro Ser 565 570 575 Glu Gln Gly Thr Leu Val Phe Pro Gly Asn Leu Gly Met Phe Glu Trp 580 585 590 Gly Gly Ile Ser Val Asp Pro Asn Arg Gln Val Ala Ile Ala Asn Pro 595 600 605 Met Ala Leu Pro Phe Val Ser Arg Leu Ile Pro Arg Gly Pro Gly Asn 610 615 620 Pro Met Glu Gln Pro Lys Asp Ala Lys Gly Ser Gly Thr Glu Ala Gly 625 630 635 640 Ile Gln Pro Gln Tyr Gly Val Pro Tyr Gly Val Thr Leu Asn Pro Phe 645 650 655 Leu Ser Pro Phe Gly Leu Pro Cys Lys Gln Pro Ala Trp Gly Tyr Ile 660 665 670 Ser Gly Leu Asp Leu Lys Thr Asn Lys Ile Val Trp Lys Lys Arg Ile 675 680 685 Gly Thr Pro Gln Asp Ser Met Pro Phe Pro Met Pro Val Pro Val Pro 690 695 700 Phe Asn Met Gly Met Pro Met Leu Gly Gly Pro Ile Ser Thr Ala Gly 705 710 715 720 Asn Val Leu Phe Ile Ala Ala Thr Ala Asp Asn Tyr Leu Arg Ala Tyr 725 730 735 Asn Met Thr Asn Gly Glu Lys Leu Trp Gln Gly Arg Leu Pro Ala Gly 740 745 750 Gly Gln Ala Thr Pro Met Thr Tyr Glu Val Asn Gly Lys Gln Tyr Val 755 760 765 Val Ile Ser Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Met Gly Asp 770 775 780 Tyr Ile Val Ala Tyr Ala Leu Pro Asp Asp Ala Lys 785 790 795 <210> 2 <211> 698 <212> PRT <213> Enterobacter cloacae <400> 2 Met His Asn Asp Lys His Tyr Pro Phe Ile Lys Val Ser Met Thr Ala 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Val Thr Pro Phe Ala Leu Gln Ala Gln Asp Lys Ala 20 25 30 Ala Glu Ala Ser Gln Gly Thr Gln Glu Ser Leu Asn Ile Asp Ala Ala 35 40 45 Asp Gln Gln Ala Pro Gly Thr Thr Lys Thr Thr Asp Asp Ala Ser Thr 50 55 60 Gly Ser Gly Asp Gly Lys Lys Val Ala Ser Ala Ser Gln Pro Ala Thr 65 70 75 80 Pro Leu Val Pro Gly Thr Pro Thr Trp Asp Ser Phe His Gly Gln Leu 85 90 95 Asn Ala Gln Lys Tyr Ser Pro Leu Thr Gln Ile Thr Ala Asp Asn Val 100 105 110 Ser Lys Leu Thr Lys Val Trp Glu Phe His Thr Gly Asp Val Ser Asp 115 120 125 Gly Lys Gly Asp Thr Pro Ala Thr Val Trp Ser Ala Thr Pro Ile Phe 130 135 140 Ala Asn Asp Thr Leu Tyr Ile Gly Thr Pro Phe Asp Arg Leu Ile Ala 145 150 155 160 Leu Asp Pro Gly Thr Gly Lys Glu Lys Trp His Tyr Asp Thr Lys Ser 165 170 175 Ser Arg Lys Ala Leu Thr Gln Pro Val Leu Lys Asn Arg Gly Val Ser 180 185 190 Tyr Trp Gln Ala Lys Asn Pro Val Lys Gly Glu Ala Cys Gln Lys Met 195 200 205 Val Tyr Met Gly Thr Val Asp Gly Lys Leu Phe Ala Leu Asp Ala Asp 210 215 220 Ser Gly Lys Pro Cys Ser Gly Phe Ala Asp Asn Gly Val Leu Asp Leu 225 230 235 240 Asn Gln Trp Asn Thr Val Asn Ala Lys Tyr Pro Leu Ser Val Leu Gln 245 250 255 Pro Pro Thr Val Val Gly Asn His Leu Leu Val Gly Trp Ala Gly Lys 260 265 270 Asp Trp Ala Tyr Ala Glu Ala Pro Pro Gly Thr Val Phe Ser Val Asn 275 280 285 Ala Gln Thr Gly Lys Leu Glu Trp Thr Phe Glu Ala Ile Pro Ala Glu 290 295 300 Ile Arg Lys Arg Thr Gly Thr Ala Asn Val Trp Thr His Met Ser Ala 305 310 315 320 Asp Glu Ala Asn Gly Leu Val Tyr Leu Pro Val Ser Ser Pro Ser Pro 325 330 335 Asn Tyr Trp Gly Gly Asn Arg Val Asp Ala Ile Pro Leu Gly Thr Ser 340 345 350 Thr Thr Ala Leu Asp Ile Asn Thr Gly Lys Val Val Trp Ser Arg Gln 355 360 365 Trp Val His His Asp Val Trp Asp Tyr Asp Ile Asn Ser Ala Pro Thr 370 375 380 Leu Met Asp Ile Thr Val Asp Gly Lys Gln Ile Pro Ala Leu Val Gln 385 390 395 400 Ala Thr Lys Gln Gly Phe Leu Phe Val Val Asn Arg Leu Thr Gly Glu 405 410 415 Asp Val Trp Pro Ile Glu Glu Arg Pro Val Pro Gln Gly Asp Gly Ser 420 425 430 Val Gln Gly Glu Val Leu Ser Pro Thr Gln Pro Phe Pro Thr Lys Pro 435 440 445 Ala Pro Leu Leu Asp Gln Ser Lys Lys Pro Glu Ile Trp Lys Leu Ala 450 455 460 Asp Ile Val Gly Gly Gly Gln Cys Ser Arg Leu Trp Asp Asn Leu Thr 465 470 475 480 Tyr Glu Gly Met Tyr Thr Pro Pro Thr Thr Lys Gly Glu Gly Thr Leu 485 490 495 Thr Tyr Pro Asp Ser Ala Gly Gly Val Gln Trp Gly Gly Val Ala Phe 500 505 510 Asp Pro Gln Lys Gln Ile Ala Ile Val Asn Thr Ser His Ile Val Gln 515 520 525 Tyr Val Lys Leu Tyr Ser Arg Glu Asp Tyr Asp Asn Ala Asp Lys Asp 530 535 540 Ser Gly Asn Glu Ser Gly Phe Ala Pro Gln Glu Gly Ala Pro Tyr Gly 545 550 555 560 Met Arg Leu Leu Val Ala Ser Asn Trp Leu Gly Met Pro Cys Trp Gln 565 570 575 Pro Pro Phe Gly Glu Ile Val Ala Ile Asp Met His Thr Gly Asp Val 580 585 590 Lys Trp Arg Arg Pro Val Gly Ala Ser Gln Gln Tyr Gly Phe Phe Met 595 600 605 Pro Glu Ser Trp Gly Ser Pro Thr Ile Gly Gly Pro Ala Val Thr Ala 610 615 620 Gly Gly Val Ile Phe Ile Gly Ala Ser Met Asp Ala Lys Val Arg Ala 625 630 635 640 Tyr Ser Val Glu Ser Gly Glu Glu Leu Trp Ser Asp Gln Ala Glu Ala 645 650 655 Pro Ala Val Ala Asn Pro Ser Val Tyr Glu Tyr Lys Gly Arg Gln Tyr 660 665 670 Val Ala Phe Val Ala Gly Gly Asn Thr Ile Leu Lys Asp Gln Val Gly 675 680 685 Asp Gln Val Val Val Tyr Ala Leu Pro Glu 690 695

Claims (12)

  1. 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 (기탁번호: KCTC18876P) 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 락토비온산(lactobionic acid) 생산능을 갖는 것을 특징으로 하는 균주.
  3. 제1항 또는 제2항의 균주를 배양하여 락토비온산을 생산하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배양은 20 내지 40 °C에서 수행되는 것을 특징으로 하는 락토비온산을 생산하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 배양은 탄소원으로서 용존 젖당(dissolved lactose)이 포함된 배지에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 또는 제2항의 엔테로박터 클로아케 KRICT-1 균주를 유효성분으로 포함하는 락토비온산 생산용 조성물.
  7. 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 (기탁번호: KCTC18876P) 균주로부터 유래한 GDH (quinoprotein glucose dehydrogenase) 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 락토비온산을 생산하는 재조합 균주 제조용 재조합 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 GDH 효소는 서열목록 제1서열로 표시되는 GDH1 (Membrane bound quinoprotein glucose dehydrogenase, m-GDH) 또는 서열목록 제2서열로 표시되는 GDH2 (soluble quinoprotein glucose dehydrogenase, s-GDH)인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  9. 제7항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된, 락토비온산 생산용 재조합 균주.
  10. 제9항에 있어서, 상기 균주는 재조합 대장균인 것을 특징으로 하는 재조합 균주.
  11. 엔테로박터 클로아케 (Enterobacter cloacae) KRICT-1 (기탁번호: KCTC18876P) 균주로부터 유래한 GDH (quinoprotein glucose dehydrogenase) 효소를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터를 수득하는 단계; 및
    상기 재조합 벡터를 그람음성균에 도입하는 단계
    를 포함하는 락토비온산 생산용 재조합 균주의 제조방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 따른 재조합 균주를 사용하여 락토비온산을 생산하는 방법.
KR1020220001827A 2022-01-05 2022-01-05 락토비온산 생산능을 갖는 신규한 엔테로박터 클로아케 균주 및 이를 이용한 락토비온산 생산 방법 KR20230106041A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR102030776B1 (ko) 2018-04-24 2019-10-10 한국화학연구원 최적화된 배양조건을 이용하여 슈도모나스 테트로렌스(Pseudomonas taetrolens)로부터 락토비온산을 생산하는 방법

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