JP4782831B2 - Ｌ−カルニチン生合成に関与する遺伝子を有する腸内細菌科の微生物および該微生物を使用したｌ−カルニチンの生産方法 - Google Patents

Description

技術分野
ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)由来のL-カルニチン生合成関連の遺伝子を含む腸内細菌科属微生物及びこれを利用したL-カルニチンの製造方法に関する。

背景技術
L-カルニチン(3-ヒドロキシ-4-トリメチルアミノブチレート)は、生物体内に通例存在し、活性化された長鎖脂肪酸をミトコンドリアの内膜を横切ってミトコンドリア基質に伝達する化合物であり、両性イオン型化合物(zwitterionic compound)である。人の生体内で、L-カルニチンは、リジンまたは蛋白質中のリジンから合成されると知られている。哺乳類動物では、一般的に蛋白質リジンがL-カルニチン生合成の前駆体として使われるが、ニューロスポラ・クラッサは、遊離リジンを使用することが特徴である。L-カルニチン生合成の生合成過程で、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N,N,N-トリメチル-β-ヒドロキシリジン、N,N,N-トリメチルアミノブチルアルデヒド中間体、及びγ-ブチロベタインが形成される。γ-ブチロベタインは、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼによってヒドロキシル化されてL-カルニチンになる。図1は、ニューロスポラ・クラッサで、L-カルニチンの推定生合成経路を示す図面である。

L-カルニチンは、化学合成法、酵素反応による半合成法、及び微生物を利用したL-カルニチンの生産によって生産されうる。しかし、化学合成法による場合、DL-カルニチンのラセミ体が得られるために、それらを分離せねばならないという問題点があった。酵素反応による半合成法であって、例えば、米国特許第4,221,869号明細書(特許文献1)には、助酵素としてNADを使用したカルニチンデヒドロゲナーゼ(EC 1.1.1.108)でもって、デヒドロカルニチンからL-カルニチンを製造する方法が開示されている。しかし、デヒドロカルニチンは非常に不安定であり、アセトニルトリメチルアンモニウムと二酸化炭素とに自発的に分解される。また、ドイツ特許DE-OS-3123975号公報(特許文献2)には、ニューロスポラ・クラッサから単離したγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(EC1.14.11.1)でもって、γ-ブチロベタインからL-カルニチンを製造する方法が開示されている。しかし、ヒドロキシル化反応の間に、α-ケトグルタレート及び還元剤(すなわち、アスコルベート)が反応物中に添加されねばならないという短所があった。

微生物を利用したL-カルニチンの生産方法として、米国特許第5,028,538号明細書(特許文献3)には、クロトノベタイン(4-N,N,N-トリエチルアミノクロトン酸)を含有する培地で大腸菌044 K 74を培養し、培養物からL-カルニチンを回収する方法が開示されている。また、米国特許第4,708,936号明細書(特許文献4)には、アクロモバクター・キシロソキシダンス(Achromobacter xylosoxydans)DSM 3225(HK 1331b)をクロトノベタイン及び/またはγ-ブチロベタインを含む培地で培養し、L-カルニチンを製造する方法が開示されている。しかし、それらの方法によれば、クロトノベタインのようなL-カルニチン生合成の前駆体または中間体ではない化合物を使用せねばならず、L-カルニチン生産効率も高くないという短所がある。従って、微生物を利用したL-カルニチンの製造方法において生産効率を改善させる必要性が残されている。

このために本発明者らは、廉価な前駆体を利用できつつも、L-カルニチンの生産効率が高い微生物を作成しようと努力していたなか、ニューロスポラ・クラッサ由来のL-カルニチン生合成経路に関与する遺伝子が腸内細菌科属の微生物で良好に発現されるということを発見し、本発明を完成に至った。

米国特許第4,221,869号 ドイツ特許DE-OS-3123975号 米国特許第5,028,538号 米国特許第4,708,936号

発明の詳細な説明
技術的課題
本発明の目的は、高効率でL-カルニチンを生産できる微生物を提供することである。

また、本発明の目的は、前記微生物を利用してL-カルニチンを製造する方法を提供することである。

技術的解決方法
本発明は、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ(LMT)活性をコードするポリヌクレオチド、3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)活性をコードするポリヌクレオチド、N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)活性をコードするポリヌクレオチド、γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)活性をコードするポリヌクレオチド、及びγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)活性をコードするポリヌクレオチドを有する腸内細菌科属に属する微生物を提供する。

本発明の微生物は、前記五種の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むものであり、いずれも含まれる。望ましくは、前記微生物は、腸内細菌科に属する微生物、大腸菌(Escherichia coli)で、さらに望ましくは大腸菌(アクセッション番号:KCCM-10638)である。

本発明の五種の蛋白質、すなわちLMT、TMLH、TMLA、TMABADH、及びBBHをそれぞれコードするポリヌクレオチドは、ベクターを介して、またはそれ自体でもって微生物に導入されたものでありうる。前記五種の蛋白質をコードするポリヌクレオチドがベクターを介して微生物に導入される場合、前記五種の蛋白質をコードするポリヌクレオチドが単一のベクターに含まれて導入されたものであるか、または一つ以上のベクターに含まれて導入されたものでありうる。本発明において、「ベクター」とは、当業界に周知の意味として使われる。ベクターとは、一般的に核酸を細胞内に導入するのに使われる核酸の構造体である。かかる核酸の構造体は、望ましくは、プラスミドまたはウイルス・ゲノム由来の核酸構造体である。

本発明で使われたニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジンメチルトランスフェラーゼ(LMT)をコードするポリヌクレオチドは、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニンリジンメチルトランスフェラーゼをコードする。S-アデノシルメチオニンリジンメチルトランスフェラーゼは、ニューロスポラ・クラッサ細胞でリジンにメチル基を付けて6-N-トリメチルリジンに転換する反応を触媒すると見られるが、本発明の範囲がかかる特定の作用メカニズムに限定されるものではない。前記由来のS-アデノシルメチオニンリジンメチルトランスフェラーゼをコードするポリヌクレオチドは、望ましくは配列番号:11のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに望ましくは、配列番号:16のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

本発明で使われたニューロスポラ・クラッサ由来のN-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)活性をコードするポリヌクレオチドは、ニューロスポラ・クラッサ由来のN-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)をコードする。N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)は、ニューロスポラ・クラッサ細胞でN-トリメチルリジンをβ-ヒドロキシ-ε-N-トリメチルリジンに転換する反応を触媒すると見られるが、本発明の範囲がかかる特定の作用メカニズムに限定されるものではない。前記N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは配列番号:12のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに望ましくは、配列番号:17のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

本発明で使われたニューロスポラ・クラッサ由来の3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)活性をコードするポリヌクレオチドは、ニューロスポラ・クラッサ由来の3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジン・アルドラーゼ(TMLA)をコードする。3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)は、ニューロスポラ・クラッサ細胞でβ-ヒドロキシ-ε-N-トリメチルリジンをγ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒドに転換する反応を触媒すると見られるが、本発明の範囲がかかる特定の作用メカニズムに限定されるものではない。前記3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは配列番号:13のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに望ましくは、配列番号:18のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

本発明で使われたニューロスポラ・クラッサ由来のγ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)活性をコードするポリヌクレオチドは、ニューロスポラ・クラッサ由来のγ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)活性をコードする。γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)は、ニューロスポラ・クラッサ細胞でγ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒドをγ-ブチロベタインに転換する反応を触媒すると見られるが、本発明の範囲がかかる特定の作用メカニズムに限定されるものではない。前記γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは配列番号:14のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに望ましくは、配列番号:19のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

本発明で使われたニューロスポラ・クラッサ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)活性をコードするポリヌクレオチドは、ニューロスポラ・クラッサ由来のγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)をコードする。γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)は、ニューロスポラ・クラッサ細胞でγ-ブチロベタインをL-カルニチンに転換する反応を触媒すると見られるが、本発明の範囲がかかる特定の作用メカニズムに限定されるものではない。前記γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)をコードするポリヌクレオチドは、望ましくは配列番号:15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。さらに望ましくは、配列番号:20のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドである。

本発明の別の局面に従い、前記本発明による微生物をL-リジン、N-トリメチルリジン、β-ヒドロキシ-N-トリメチルリジン、γ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ-ブチロベタイン、及びその混合物からなる群より選択される基質の存在下で培養し、L-カルニチンを培養物中に生産する段階を含むL-カルニチンの製造方法を提供する。

本発明のL-カルニチン製造方法において、前記L-リジン、N-トリメチルリジン、β-ヒドロキシ-N-トリメチルリジン、γ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ-ブチロベタイン及びその混合物からなる群より選択される基質の濃度は、特別に制限されるものではないが、好ましくは培養培地の重量に基づいて、0.1〜10重量%である。

本発明の方法において、培養物からL-カルニチンを回収する過程は、当業者に周知である。かかる方法には、例えば限外濾過、遠心分離、及び傾瀉(decantation)のように、培養物から細胞を単離して上清を得て、得られた上清を陽イオン交換クロマトグラフィ、または電気透析後に再結晶によってL-カルニチンを回収される方法が含まれるが、それらに限定されるものではない。

効果
本発明による微生物は、L-カルニチン生産能にすぐれ、発酵を介してL-カルニチンを生産する方法に有用にに利用できる。

本発明によるL-カルニチンの製造方法において、L-カルニチンは腸内細菌科属に属する微生物を利用してL-カルニチンを高効率で生産できる。

最良の形態
以下、本発明について実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。

実施例
本実施例では、ニューロスポラ・クラッサにおいてL-リジンからL-カルニチンの生合成に関連する五種の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを選抜し、これを含む核酸構造体を製造した。次に、それらの構造体で大腸菌を形質転換し、得られた形質転換された大腸菌をL-カルニチン生産経路の中間産物を含む培地で培養し、L-カルニチンを生産した後で回収した。

実施例1:ニューロスポラ・クラッサからLMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHをコードするポリヌクレオチドの単離
本実施例では、ニューロスポラ・クラッサからLMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHをコードするポリヌクレオチドを単離し、クローニングしてその塩基配列を分析した。

(1)ニューロスポラ・クラッサのcDNAライブラリの作成
ニューロスポラ・クラッサ菌体(胞子体を含む)を含む培養物から総mRNAを単離し、ポリTをプライマーとして逆転写反応を行った後、PCR反応を行ってcDNAを増幅した。増幅されたcDNAは、EcoRI及びXhoIで処理した後、λAD5クローニングベクターのEcoRI及びXhoI部位に挿入し、ニューロスポラ・クラッサ由来cDNAライブラリを作成した。

次に、前記cDNAライブラリを大腸菌BNN322に感染させた後、感染された大腸菌BNN322を培養して増幅した。まず、大腸菌BNN322をカナマイシン50μg/mlと0.2%の麦芽糖とを含むLB培地で一晩培養した。その結果として得られた培養物を遠心分離した後、上清を除去し、細胞ペレットを1mlの10mM MgSO4溶液に再懸濁した。得られた懸濁液と5x107PFUの前記λcDNAライブラリを30℃で30分間、振盪せずに培養した後、培養物に2mlのLB培地をさらに添加し、30℃で1時間振盪培養器で振盪した。培養された細胞をアンピシリン(75μg/ml)を含むLB培地プレートに塗抹し、37℃で8時間培養した。前記プレートのコロニーからウィザードキット(Wizard kit)を使用してcDNAライブラリプールを単離した。このように単離されたcDNAライブラリプールを含むλを、LMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHをコードするポリヌクレオチドを増幅するためのテンプレートとして使用した。

(2)LMTをコードするポリヌクレオチド(LMT遺伝子)の増幅、クローニング及びLMT生成の確認
(a)ニューロスポラ・クラッサからのLMT遺伝子の単離及び機能的発現確認
ニューロスポラ・クラッサを培養して細胞を回収した後、2mMのDTTと0.2mMのEDTAとが含まれた1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用して細胞を溶解、蛋白質を抽出した。得られた上清に最終飽和濃度が50%になるように、硫酸アンモニウムをゆっくり添加して蛋白質を沈殿させた後、遠心分離して沈殿された蛋白質に少量の0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を添加した。前記溶液に対してT1透析膜を利用して脱塩させた。脱塩された試料をDEAEカラムを利用して精製した。このとき、洗浄バッファとしては、0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用し、溶出バッファとして0.3MのNaClを含む0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用してプールした。その後、T1透析膜を利用して脱塩させた。脱塩された試料をCMカラムを利用して精製した。カラムの洗浄バッファは、0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用し、このとき、カラムに吸着されずに流れ出た試料をいずれもプールした。

前記の蛋白質試料を再びDEAEカラムにローディングした後、0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用し、NaCl濃度が0〜0.3Mになるように濃度勾配溶出を実施した。このようにして精製された試料を天然PAGE及びSDS-PAGEを利用して蛋白質分析を行った。

図2は、ニューロスポラ・クラッサ培養物を溶解し、溶解物に対してDEAEカラムクロマトグラフィを行った後で得られた溶出液を天然またはSDS-PAGE分析した結果を示すダイアグラムである。図2で、レーン1はマーカを表し、レーン2及び3はDEAE溶出ピーク2を天然PAGE分析した結果を表し、レーン4及び5はDEAE溶出ピーク3を天然PAGE分析した結果を表す。図2Bで、レーン1はマーカ、レーン2はDEAE溶出ピーク2を天然PAGE分析した結果、レーン3はDEAE溶出ピーク3を天然PAGE分析した結果、レーン4及び5はDEAE溶出ピーク2をSDS-PAGE分析した結果、レーン6及び7はDEAE溶出ピーク3をSDS-PAGE分析した結果を表す。

図2の結果から、バンドa、b及びcをLMT候補蛋白質として選定して各蛋白質の活性を測定した。まず、各バンドに該当するゲルを切り出した後、ホモジナイザで粉砕した後、1g/Lリジン5ml(最終濃度500mg/L)及びメチル供与体である1g/L S-アデノシルメチオニン2ml(最終濃度200mg/L)を添加し、28℃で24時間ゆっくり撹拌しつつ反応させた後、HPLCを利用してトリメチルリジン・ピークを分析した。

図3は、蛋白質バンドa、b及びcをリジン及びS-アデノシルメチオニンと共に反応させた後、トリメチルリジンをHPLCを介して測定した結果を示すグラフである。図3に示されているように、バンドaと反応させた試料で、滞留時間15分近くでトリメチルリジンと推定されるピークを確認した。図3で、1、2及び3は、それぞれバンドa、b及びcに対応する結果を示す。前記バンドをさらに正確に確認するために、バンドaと反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とを比較した。

図4は、蛋白質バンドと反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とをHPLCを介した分析した結果を示すグラフである。図4に示されているように、バンドaと反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とは正確に一致した。従って、バンドaは、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ(LMT)を含んでいるということを確認した。図4で、1及び2は、それぞれ標準品及びバンドaに対応する結果である。図2と図3は、別個のHPLCグラフを1つのグラフにして示したものである。

次に、LMT蛋白質のアミノ酸配列を確保するために、N末端配列を分析した。まず、SDS-PAGEゲルにある蛋白質をPVDF膜に移し、蛋白質バンドを切断してエドマン法を介してN末端配列を分析した。具体的には、フェニルイソチアシアネート(PTC)をpH8〜9、室温でペプチドと反応させ、N末端がチオカルバミル化されたPTC-ペプチドを得た。PTCペプチドを酸性条件下で反応させてN末端アミノ酸のみ遊離させた。遊離されたアミノ酸を酢酸エチルで抽出してHPLCで同定して分析した。その結果、N末端配列がAFGKL(配列番号:21)であることを確認した。このように、確認されたN末端アミノ酸配列を基に、既知のニューロスポラ・クラッサの全ゲノム配列を対象に検索を行った。その結果、前記LMTのN末端配列と一致するアミノ酸配列及びヌクレオチド配列を有する蛋白質及び遺伝子を確認した。

(b)LMT遺伝子を含む発現ベクター及び菌株の製造
培養されたニューロスポラ・クラッサ菌糸体を回収し、液体窒素を利用して溶解した後、RNA精製キットを利用してRNAを精製した。(a)で確認されたLMTのアミノ酸及び塩基配列情報を利用して配列番号:1及び2のプライマーを作成し、(1)で作成されたcDNAライブラリをテンプレートとして、前記プライマーセットをプライマーにしたPCRを介して、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子を増幅した(図5)。図5は、PCRによって増幅されたLMT遺伝子を電気泳動した結果を示すダイアグラムである。

得られたPCR産物とpT7-7ベクターとをそれぞれNdeI及びBamHIで処理し、T4DNAリガーゼを連結してpT7-7 LMTベクターを製造した(図6)。図6は、pT7-7 LMTベクターの作成過程を示す図面である。得られたpT7-7 LMTベクターを大腸菌BL21DE3に電気穿孔法によって形質転換した。大腸菌BL21DE3細胞40μlとpT7-7-LMTベクター1μlとを混合して冷たい2mm間隙のキューベットに入れ、2.5kV、200Ω、25μFの条件で電気穿孔法を利用して形質転換させた。得られた形質転換体をアンピシリンの含まれた固体平板培地に塗抹し、そこから選別された形質転換体からプラスミドを精製してNdeIとBamHIの制限酵素で切断し、挿入された遺伝子とプラスミドとの大きさ確認を介してpT7-7 LMTが導入されたことを確認し、BL21(DE3)/pT7-7 LMTと命名した。

(c)大腸菌でのS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの発現及びリジンからのトリメチルリジンの製造
大腸菌BL21(DE3)/pT7-7 LMTをLB培地中で、OD600 0.5まで培養した後、1mMのIPTGを入れて4時間さらに培養した。培養物を遠心分離して細胞を回収し、超音波を利用して細胞を溶解した。細胞溶解物にSDS-PAGEを行い、約25kDのS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを確認した(図7)。図7は、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを含む大腸菌をIPTG存在下で培養し、そこから得られる菌体を溶解し、上清にSDS-PAGEを行った結果を示すダイアグラムである。図7で、レーンMはマーカを表し、レーン1は陰性対照群を表し、レーン2及び3は細胞溶解物を表し、レーン2及び3で円で表示した部分は、LMTに該当する25kD位置のバンドを示すものである。

大腸菌BL21(DE3)/pT7-7 LMTを50mlのアンピシリンの添加されたLB培地が込められた250mlバッフルの装着されたフラスコでOD600 0.6まで培養した後で1mMのIPTGを入れ、正確な酵素の三次構造形成をなしつつ、封入体(inclusion body)の形成を防止するために、28℃で8時間以上培養した。培養時の反応液として500mg/L L-リジン、200mg/L S-アデノシルメチオニンを入れて培養液のトリメチルリジン含有量を測定した。その結果を表1に示した。

トリメチルリジンは、次のような条件でHPLCを介して測定した。カラムは、Supelco社のSUPELCOSIL LC-DABSカラムを使用し、Aバッファとしては、蒸溜水:アセトニトリルが8:2で混合されているバッファに、0.1%のトリフルオロ酢酸(TFA)を添加し、Bバッファとしては、蒸留水:アセトニトリルが2:8で混合されているバッファに0.1%のTFAを添加して利用した。流速は0.8ml/minに維持し、直線濃度勾配方法を利用してトリメチルリジンを分析した。

（表１）

表1に示されているように、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ遺伝子を大腸菌中から発現させ、そこからL-リジンをトリメチルリジンに転換させることができるということを確認することができた。

(3)TMLHをコードするポリヌクレオチド(TMLH遺伝子)の増幅、クローニング及びTMLH生成の確認
(a)TMLHをコードするポリヌクレオチド(TMLH遺伝子)の増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:3と4とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロースゲル電気泳動した。その結果、約1.4kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:3と4とのプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来TMLHの開始コドンと終結コドンとをコードすると推定される配列を含んでいる。公知のヒト及びラット由来TMLHのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来の可能なTMLHを推定し、配列番号:3および4のプライマーを推定TMLHのアミノ酸配列から設計した。

前記PCR産物をEcoRIとSalIとで消化し、同じ酵素で処理されたpBS KS＋(Stratagene Inc.)に連結し、得られるPCR産物の挿入されたpBS KS＋(TMLH)で大腸菌DH5αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌DH5αを37℃で8時間培養した後、pBS KS＋(TMLH)を単離してEcoRIとSalIとで処理し、PCR産物が適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記単離されたpBS KS＋(TMLH)をNdeIとSalIとで処理した後、アガロース・ゲルで電気泳動した後、NdeI及びSalIのセグメントを単離した。前記断片を同じ酵素で処理された発現ベクターpT7-7に連結してpT7-7 TMLHを得た(図8参照)。前記大腸菌BL21(DE3)でpT7-7(TMLH)を形質転換した。

(b)TMLH生成の確認
このように得られたpT7-7(TMLH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)を、アンピシリン(100μg/ml)の添加されたLB培地50mlが充填された250mlバッフル・フラスコで、OD600値が0.6になるまで37℃で培養した後、IPTG(1mM)を添加した後で4時間さらに培養した。培養物からpT7-7(TMLH)を単離してNdeI及びSalIで処理し、アガロース・ゲルで電気泳動した。その結果を図12に示した。図12に示されているように、NdeI及びSalIのセグメントに対応するバンドを確認することができた(レーン2)。次に、pT7-7(TMLH)を単離してTMLHのヌクレオチド配列を分析した。その結果、TMLHのヌクレオチド配列はNCBIのニューロスポラ・クラッサゲノムのデータベースに保存されている配列と同一であることを確認した(配列番号:17)。

また、pT7-7(TMLH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)の培養物中に、発現されたTMLHの蛋白質を確認した。まず、前記培養物を4,000xgで15分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。得られた細胞ペレットを1mlの溶解バッファ(10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中の140mM NaCl、200g/lグリセロール、及び1mM DTT)に添加して再懸濁した。前記細胞懸濁物を氷浴し、その超音波粉砕器を利用して10秒ずつ5回超音波を処理して細胞を溶解した。細胞溶解物を4℃で10,000gで20〜30分間遠心分離した後、細胞破片を除去して上清を回収し、細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取して8%のSDS-PAGEを行った(図13参照、レーン2)。SDS-PAGEを行った結果、約52KDaのTMLHに該当するバンドを確認することができた。

(3)3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)をコードするポリヌクレオチドの増幅、クローニング及びTMLA生成の確認
(a)3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)をコードするポリヌクレオチド(TMLA)の増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:5と6とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロースゲル電気泳動した。結果、約1.4kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:5と6とのプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来TMLAの開始コドンと終結コドンとをコードする配列と推定される配列を含んでいた。公知のヒト及びラット由来TMLAのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来TMLAを推定し、配列番号:5および6のプライマーを、推定TMLAのアミノ酸配列から設計した。

前記PCR産物をEcoRIとSalIとで消化し、同じ酵素で処理されたpBS KS＋(Stratagene Inc.)に連結し、得られるPCR産物の挿入されたpBS KS＋(TMLA)で大腸菌DH5αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌DH5αを37℃で8時間培養した後、pBS KS＋(TMLA)を単離してEcoRIとSalIとで処理し、PCR産物が適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記単離されたpBS KS＋(TMLA)をNdeIとSalIとで処理した後、アガロースゲルで電気泳動した後、NdeI及びSalI断片を単離した。前記断片を、同じ酵素で処理された発現ベクターpT7-7に連結してpT7-7(TMLA)を得た(図9参照)。前記pT7-7(TMLA)で大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。

(b)TMLA生成の確認
このように得られたpT7-7(TMLA)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)をアンピシリン(100μg/ml)の添加されたLB培地50mlが充填された250mlバッフル・フラスコで、OD600値が0.6になるまで37℃で培養した後、IPTG(1mM)を添加した後で4時間さらに培養した。培養物からpT7-7(TMLA)を単離してNdeI及びSalIで処理し、アガロース・ゲルで電気泳動した。その結果を図12に示す。図12に示されているように、NdeI及びSalI断片に対応するバンドを確認することができた(レーン3)。次に、pT7-7(TMLA)を単離してTMLAのヌクレオチド配列を分析した。結果、TMLAのヌクレオチド配列は、NCBIのニューロスポラ・クラッサゲノムデータベースに保存されている配列と同一であることを確認した(配列番号:18)。

また、pT7-7(TMLA)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)の培養物中に発現されたTMLAの蛋白質を確認した。まず、前記培養物を4,000xgで15分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。得られた細胞ペレットを1mlの溶解バッファ(10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中の140mM NaCl、200g/lグリセロール、及び1mM DTT)に添加して再懸濁した。前記細胞懸濁物を氷浴に漬浸し、超音波粉砕器を利用して10秒ずつ5回超音波を処理して細胞を溶解した。細胞溶解物を4℃で10,000gで20〜30分間遠心分離した後、細胞破片を除去し、上清を回収して細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取し、8%のSDS-PAGEを行った(図13参照、レーン3)。SDS-PAGEを行った結果、約53KDaのTMLAに該当するバンドを確認することができた。

(4)γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)をコードするポリヌクレオチド)の増幅、クローニング及びTMABADH生成の確認
(a)γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)をコードするポリヌクレオチドの増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:7と8とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロースゲル電気泳動した。結果、約1.5kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:7と8のプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来TMABDHの開始コドンと終結コドンとをコードする配列と推定される配列を含んでいた。公知のヒト及びラット由来TMABDHのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来の可能なTMABDHを推定し、配列番号:7および8のプライマーを、推定TMABADHのアミノ酸配列から設計した。前記PCR産物をEcoRIとSalIとで消化し、同じ酵素で処理されたpBS KS＋(Stratagene Inc.)に連結し、得られるPCR産物の挿入されたpBS KS＋(TMABADH)で大腸菌DH5αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌DH5αを37℃で8時間培養した後、pBS KS＋(TMABADH)を単離してEcoRIとSalIとで処理し、PCR産物が適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記単離されたpBS KS＋(TMABADH)をNdeIとSalIとで処理した後、アガロースゲルで電気泳動した後、NdeI及びSalIのセグメントを単離した。前記セグメントを、同じ酵素で処理された発現ベクターpT7-7に連結してpT7-7(TMABADH)を得た(図10参照)。前記pT7-7(TMABADH)で大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。

(b)TMABADH生成の確認
このように得られたpT7-7(TMABADH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)をアンピシリンの添加されたLB培地50mlが充填された250mlバッフル・フラスコでOD600値が0.6になるまで37℃で培養した後、IPTG(1mM)を添加した後で4時間さらに培養した。培養物からpT7-7(TMABADH)を単離してNdeI及びSalIで処理し、アガロース・ゲルで電気泳動した。その結果を図12に示す。図12に示されているように、NdeI及びSalIセグメントに対応するバンドを確認することができた(レーン4)。次に、pT7-7(TMABADH)を単離してTMABADHのヌクレオチド配列を分析した。結果、TMABADHのヌクレオチド配列は、NCBIのニューロスポラ・クラッサゲノムデータベースに保存されている配列と同一であることを確認した(配列番号:19)。

また、pT7-7(TMABADH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)の培養物中に、発現されたTMABADHの蛋白質を確認した。まず、前記培養物を4,000xgで15分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。得られた細胞ペレットを1mlの溶解バッファ(10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中の140mM NaCl、200g/lグリセロール、及び1mM DTT)に添加して再懸濁した。前記細胞懸濁物を氷浴に漬浸し、超音波粉砕器を利用して10秒ずつ5回超音波を処理して細胞を溶解した。細胞溶解物を4℃で10,000gで20〜30分間遠心分離した後、細胞破片を除去して上清を回収して細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取して8%のSDS-PAGEを行った(図13参照)。SDS-PAGEを行った結果、約55kDのTMABADHに該当するバンドを確認することができた。

(5)γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)をコードするポリヌクレオチドの増幅、クローニング及びBBH生産の確認
(a)γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)をコードするポリヌクレオチドの増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:9と10とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロース・ゲル電気泳動し、約1.3kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:9と10とのプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来BBHの開始コドンと終結コドンとをコードする配列と推定される配列を含んでいた。公知のヒト及びラット由来BBHのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来BBHを推定し、配列番号:9および10のプライマーを、推定BBHのアミノ酸配列から設計した。

前記PCR産物をEcoRIとSalIとで消化し、同じ酵素で処理されたpUC19に連結し、得られるPCR産物の挿入されたpUC19(BBH)で大腸菌DH5αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌DH5αをアンピシリン(100μg/ml)が添加されたLB培地で37℃で8時間培養した後、pUC19(BBH)を単離し、EcoRIとSalIとで処理してPCR産物が適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記単離されたpUC19(BBH)をNdeIとSalIとで処理した後、アガロース・ゲルで電気泳動した後、NdeI及びSalIのセグメントを単離した。前記セグメントを同じ酵素で処理された発現ベクターpT7-7に連結し、pT7-7(BBH)を得た(図11参照)。前記pT7-7(BBH)で大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。

このように得られたpT7-7(BBH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)を、アンピシリン(100μg/ml)の添加されたLB培地50mlが充填された250mlバッフル・フラスコでOD600値が0.6になるまで37℃で培養した後、IPTG(1mM)を添加した後で4時間さらに培養した。培養物からpT7-7(BBH)を単離してNdeI及びSalIで処理し、0.8%アガロース・ゲルで電気泳動した。その結果を図12に示す。図12に示されているように、NdeI及びSalIセグメントに対応するバンドを確認することができた(レーン5)。次に、pT7-7(BBH)を単離してBBHのヌクレオチド配列を分析した。結果、BBHのヌクレオチド配列は、NCBIのニューロスポラ・クラッサゲノムデータベースに保存されている配列と同一であることを確認した(配列番号:20)。

(b)BBH蛋白質生成確認
pT7-7(BBH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)の培養物中に、発現されたBBHの蛋白質を確認した。まず、前記培養物を4,000xgで15分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。得られた細胞ペレットを1mlの溶解バッファ(10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中の140mM NaCl、200g/lグリセロール、及び1mM DTT)に添加して再懸濁した。前記細胞懸濁物を氷浴に漬浸し、超音波粉砕器を利用して10秒ずつ5回超音波を処理して細胞を溶解した。細胞溶解物を4℃で10,000gで20〜30分間遠心分離した後、細胞破片を除去して上清を回収して細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取し、8%のSDS-PAGEを行った(図13参照、レーン5)。SDS-PAGEを行った結果、約49KDaのBBHを確認することができた。

実施例2:LMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHを同時に含有する宿主細胞の製造
本実施例では、実施例1で作成されたニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリからLMT、TMLH、BBHの遺伝子を増幅し、それら3つの遺伝子を同時に有するpT7-7 ABEを製造した。また、実施例1で作成されたニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリからTMLAとTMABADHとの遺伝子を増幅し、それら2つの遺伝子を同時に有するpACYC184-CarCDを製造した。このように作成されたpT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDとを大腸菌菌株に導入し、LMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHの遺伝子をいずれも有する形質転換された菌株細胞を製造した。前記菌株を大腸菌BL21(DE3)CJ2004-2と命名し、2004年12月13日国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託した(アクセッション番号:KCCM-10638)。

(1)LMT、TMLH、BBHの遺伝子を同時に有するpT7-7-CarABEの製造
まず、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:1及び2のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むlmtを増幅した。次に、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:3及び4のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むTMLHを増幅した。次に、配列番号:9及び10のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むBBHを増幅した。このように増幅されたLMT、TMLH、BBHの増幅産物をpT7-7に導入した。まず、BBH増幅産物を制限酵素BamHIとSalIとで処理してBamHI及びSalIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpT7-7と連結し、pT7-7 BBHを得た。次に、TMLH増幅産物をNdeIとEcoRIとで処理してNdeI及びEcoRIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpT7-7 BBHと連結し、pT7-7CarBEを得た。次に、LMT増幅産物をClaIで処理して断片を得て、これを同じ酵素で処理されたlmtと連結し、pT7-7CarABEを得た(図14参照)。

(2)TMLAとTMABADHとの遺伝子を同時に有するpACYC184 CarCD製造
まず、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:5及び6のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むTMLAを増幅した。次に、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:7及び8のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとしてT7プロモーターから停止コドンを含むTMABADHを増幅した。このように増幅されたTMLAとTMABADHとの増幅産物をpACYC184に導入した。まず、TMLA増幅産物をBamHIとHIndIIIとで処理してBamHI及びHindIIIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpACYC184と連結し、pACYC184 TMLAを得た。次に、TMABADH増幅産物をBamHIとSalIとで処理してBamHI及びSalIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpACYC184 TMLAと連結し、pACYC184 CarCDを得た。

実施例3:LMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHをコードするポリヌクレオチドを含む菌株を利用したL-カルニチンの生産
本実施例では、実施例2で作成されたpT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDとが同時に導入されている大腸菌BL21(DE3)をL-リジンの含まれた培地で培養し、L-カルニチン生産量を確認した。pT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDとの大腸菌BL21(DE3)への導入は、実施例1に示してあるような電気穿孔法(electroporation)を使用してなされた。

(1)実施例2で作成されたpT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDとで同時に形質転換された大腸菌BL21(DE3)の培養を介したL-カルニチンの生産
まず、pT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDの双方を用いて形質転換された大腸菌BL21(DE3)を、アンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(50μg/ml)が添加されたLB固体平板培地に塗抹して培養した。固体平板培地に現れた菌株のコロニーをアンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(50μg/ml)とがそれぞれ添加された20mlのLB培地を含むフラスコで37℃で12時間培養し、OD600が1.0になるまで培養した。このように培養された菌株の培養物0.1mlを、2mMのL-リジンを含むLB培地20mlを含んでいる250mlバッフル・フラスコに添加し、37℃でOD600値が0.6になるまで培養した。IPTGを添加する場合は、OD600値が0.6になった後、IPTG(1mM)を添加して4時間さらに培養した。対照群として、L-リジンが添加されていないLB培地を同じ方法でIPTGで誘導した培地と、L-リジンは添加されているが、IPTGで誘導していないLB培地とを使用して培養した。培養が終了した後、培養物中のL-カルニチンの含有量を前記(1)と同一に測定した。その結果を次の表2に示す。

(表２) 単一培養によるL-カルニチンの生産

表2に示されているように、LMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHをコードするポリヌクレオチドをいずれも含む菌株をL-リジンが含まれた培地で培養することによって、L-カルニチンを高効率で生産できた。また、表2に示したL-カルニチンの生産量を比較したとき、培地中にリジンを添加して培養する場合が生産効率がさらに高いということが分かった。

ニューロスポラ・クラッサで推定されるL-カルニチンの生合成経路を示す図面である。 ニューロスポラ・クラッサ培養物を溶解し、溶解物をDEAEカラムクロマトグラフィを行った後、得られた溶出液に対して天然PAGEまたはSDS-PAGE分析した結果を示すダイアグラムである。 図2の蛋白質バンドa、b及びcをリジン及びS-アデノシルメチオニンと共に反応させた後、トリメチルリジンをHPLCを介して測定した結果を示すグラフである。 バンドaと反応させて得られた試料とトリメチルリジン標準品とをHPLCを介して分析した結果を示すグラフである。 PCRによって増幅されたLMT遺伝子を電気泳動した結果を示すダイアグラムである。 pT7-7 LMTの作成過程を示す。 ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを含む大腸菌をIPTG存在下で培養し、そこから得られる菌体を溶解して上清をSDS-PAGEした結果を示すダイアグラムである。 pT7-7 TMLHの作成過程を示す。 pT7-7 TMLAの作成過程を示す。 pT7-7 TMABADHの作成過程を示す。 pT7-7 BBHの作成過程を示す。 pT7-7 TMLH、pT7-7 TMLA、pT7-7 TMABADH及びpT7-7 BBH中に挿入されている各遺伝子を電気泳動して確認したイメージである。レーン1はマーカ、レース2はpT7-7 TMLH、レーン3はpT7-7 TMLA、レーン4はpT7-7 TMABADH及びレーン5はpT7-7 BBHを表す。 pT7-7 TMLH、pT7-7 TMLA、pT7-7 TMABADH及びpT7-7 BBHでそれぞれ形質転換された大腸菌BL21(DE3)を培養して粗抽出物を得て、SDS-PAGEを行った結果を示す写真である。レーン1はマーカ、レーン2は陰性対照群、レーン3はpT7-7 TMLH(52KDa)、レーン4はpT7-7 TMLA(53KDa)、レーン5はpT7-7 TMABADH(55KDa)及びレーン6はpT7-7 BBH(49KDa)を表す。 pT7-7CarABEの作成過程を示す。 pACYC184 CarCDの作成過程を示す。

Claims (5)

1. ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジンメチルトランスフェラーゼ(LMT)活性をコードするポリヌクレオチド、ここで、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジンメチルトランスフェラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドは、配列番号:11のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、と、
   6-N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)活性をコードするポリヌクレオチド、ここで、6-N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドは、配列番号:12のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、と、
   3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)活性をコードするポリヌクレオチド、ここで、3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドは、配列番号:13のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、と、
   γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)活性をコードするポリヌクレオチド、ここで、γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をコードするポリヌクレオチドは、配列番号:14のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、と、
   γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)活性をコードするポリヌクレオチド、ここで、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドは、配列番号:15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、
   とを含む腸内細菌科に属する微生物。
2. 微生物が大腸菌である、請求項1記載の微生物。
3. 微生物が大腸菌(アクセッション番号:KCCM-10638)である、請求項1記載の微生物。
4. 請求項1から請求項3のいずれか一項記載の微生物を、L-リジン、N-トリメチルリジン、β-ヒドロキシ-N-トリメチルリジン、γ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ-ブチロベタイン、及びその混合物からなる群より選択される基質の存在下で培養し、L-カルニチンを培養物中に生産する段階を含む、L-カルニチンの製造方法。
5. L-リジン、N-トリメチルリジン、β-ヒドロキシ-N-トリメチルリジン、γ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ-ブチロベタイン、及びその混合物からなる群より選択される基質の濃度が、培養培地の重量に基づいて、0.1〜10重量%である、請求項4記載の方法。

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