JP2009500014A - L−カルニチン生合成に関与する遺伝子を有する腸内細菌科属の微生物および該微生物を使用したl−カルニチンの生産方法 - Google Patents
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Abstract
Description
ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)由来のL-カルニチン生合成関連の遺伝子を含む腸内細菌科属微生物及びこれを利用したL-カルニチンの製造方法に関する。
L-カルニチン(3-ヒドロキシ-4-トリメチルアミノブチレート)は、生物体内に通例存在し、活性化された長鎖脂肪酸をミトコンドリアの内膜を横切ってミトコンドリア基質に伝達する化合物であり、両性イオン型化合物(zwitterionic compound)である。人の生体内で、L-カルニチンは、リジンまたは蛋白質中のリジンから合成されると知られている。哺乳類動物では、一般的に蛋白質リジンがL-カルニチン生合成の前駆体として使われるが、ニューロスポラ・クラッサは、遊離リジンを使用することが特徴である。L-カルニチン生合成の生合成過程で、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N,N,N-トリメチル-β-ヒドロキシリジン、N,N,N-トリメチルアミノブチルアルデヒド中間体、及びγ-ブチロベタインが形成される。γ-ブチロベタインは、γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼによってヒドロキシル化されてL-カルニチンになる。図1は、ニューロスポラ・クラッサで、L-カルニチンの推定生合成経路を示す図面である。
技術的課題
本発明の目的は、高効率でL-カルニチンを生産できる微生物を提供することである。
本発明は、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼ(LMT)活性をコードするポリヌクレオチド、3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)活性をコードするポリヌクレオチド、N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)活性をコードするポリヌクレオチド、γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)活性をコードするポリヌクレオチド、及びγ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)活性をコードするポリヌクレオチドを有する腸内細菌科属に属する微生物を提供する。
本発明による微生物は、L-カルニチン生産能にすぐれ、発酵を介してL-カルニチンを生産する方法に有用にに利用できる。
以下、本発明について実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がそれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例では、ニューロスポラ・クラッサにおいてL-リジンからL-カルニチンの生合成に関連する五種の蛋白質をコードするポリヌクレオチドを選抜し、これを含む核酸構造体を製造した。次に、それらの構造体で大腸菌を形質転換し、得られた形質転換された大腸菌をL-カルニチン生産経路の中間産物を含む培地で培養し、L-カルニチンを生産した後で回収した。
本実施例では、ニューロスポラ・クラッサからLMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHをコードするポリヌクレオチドを単離し、クローニングしてその塩基配列を分析した。
ニューロスポラ・クラッサ菌体(胞子体を含む)を含む培養物から総mRNAを単離し、ポリTをプライマーとして逆転写反応を行った後、PCR反応を行ってcDNAを増幅した。増幅されたcDNAは、EcoRI及びXhoIで処理した後、λAD5クローニングベクターのEcoRI及びXhoI部位に挿入し、ニューロスポラ・クラッサ由来cDNAライブラリを作成した。
(a)ニューロスポラ・クラッサからのLMT遺伝子の単離及び機能的発現確認
ニューロスポラ・クラッサを培養して細胞を回収した後、2mMのDTTと0.2mMのEDTAとが含まれた1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用して細胞を溶解、蛋白質を抽出した。得られた上清に最終飽和濃度が50%になるように、硫酸アンモニウムをゆっくり添加して蛋白質を沈殿させた後、遠心分離して沈殿された蛋白質に少量の0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を添加した。前記溶液に対してT1透析膜を利用して脱塩させた。脱塩された試料をDEAEカラムを利用して精製した。このとき、洗浄バッファとしては、0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用し、溶出バッファとして0.3MのNaClを含む0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用してプールした。その後、T1透析膜を利用して脱塩させた。脱塩された試料をCMカラムを利用して精製した。カラムの洗浄バッファは、0.1Mのリン酸カリウムバッファpH7.4を利用し、このとき、カラムに吸着されずに流れ出た試料をいずれもプールした。
培養されたニューロスポラ・クラッサ菌糸体を回収し、液体窒素を利用して溶解した後、RNA精製キットを利用してRNAを精製した。(a)で確認されたLMTのアミノ酸及び塩基配列情報を利用して配列番号:1及び2のプライマーを作成し、(1)で作成されたcDNAライブラリをテンプレートとして、前記プライマーセットをプライマーにしたPCRを介して、S-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼの遺伝子を増幅した(図5)。図5は、PCRによって増幅されたLMT遺伝子を電気泳動した結果を示すダイアグラムである。
大腸菌BL21(DE3)/pT7-7 LMTをLB培地中で、OD600 0.5まで培養した後、1mMのIPTGを入れて4時間さらに培養した。培養物を遠心分離して細胞を回収し、超音波を利用して細胞を溶解した。細胞溶解物にSDS-PAGEを行い、約25kDのS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを確認した(図7)。図7は、ニューロスポラ・クラッサ由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジン-メチルトランスフェラーゼを含む大腸菌をIPTG存在下で培養し、そこから得られる菌体を溶解し、上清にSDS-PAGEを行った結果を示すダイアグラムである。図7で、レーンMはマーカを表し、レーン1は陰性対照群を表し、レーン2及び3は細胞溶解物を表し、レーン2及び3で円で表示した部分は、LMTに該当する25kD位置のバンドを示すものである。
(a)TMLHをコードするポリヌクレオチド(TMLH遺伝子)の増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:3と4とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロースゲル電気泳動した。その結果、約1.4kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:3と4とのプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来TMLHの開始コドンと終結コドンとをコードすると推定される配列を含んでいる。公知のヒト及びラット由来TMLHのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来の可能なTMLHを推定し、配列番号:3および4のプライマーを推定TMLHのアミノ酸配列から設計した。
このように得られたpT7-7(TMLH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)を、アンピシリン(100μg/ml)の添加されたLB培地50mlが充填された250mlバッフル・フラスコで、OD600値が0.6になるまで37℃で培養した後、IPTG(1mM)を添加した後で4時間さらに培養した。培養物からpT7-7(TMLH)を単離してNdeI及びSalIで処理し、アガロース・ゲルで電気泳動した。その結果を図12に示した。図12に示されているように、NdeI及びSalIのセグメントに対応するバンドを確認することができた(レーン2)。次に、pT7-7(TMLH)を単離してTMLHのヌクレオチド配列を分析した。その結果、TMLHのヌクレオチド配列はNCBIのニューロスポラ・クラッサゲノムのデータベースに保存されている配列と同一であることを確認した(配列番号:17)。
(a)3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)をコードするポリヌクレオチド(TMLA)の増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:5と6とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロースゲル電気泳動した。結果、約1.4kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:5と6とのプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来TMLAの開始コドンと終結コドンとをコードする配列と推定される配列を含んでいた。公知のヒト及びラット由来TMLAのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来TMLAを推定し、配列番号:5および6のプライマーを、推定TMLAのアミノ酸配列から設計した。
このように得られたpT7-7(TMLA)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)をアンピシリン(100μg/ml)の添加されたLB培地50mlが充填された250mlバッフル・フラスコで、OD600値が0.6になるまで37℃で培養した後、IPTG(1mM)を添加した後で4時間さらに培養した。培養物からpT7-7(TMLA)を単離してNdeI及びSalIで処理し、アガロース・ゲルで電気泳動した。その結果を図12に示す。図12に示されているように、NdeI及びSalI断片に対応するバンドを確認することができた(レーン3)。次に、pT7-7(TMLA)を単離してTMLAのヌクレオチド配列を分析した。結果、TMLAのヌクレオチド配列は、NCBIのニューロスポラ・クラッサゲノムデータベースに保存されている配列と同一であることを確認した(配列番号:18)。
(a)γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)をコードするポリヌクレオチドの増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:7と8とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロースゲル電気泳動した。結果、約1.5kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:7と8のプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来TMABDHの開始コドンと終結コドンとをコードする配列と推定される配列を含んでいた。公知のヒト及びラット由来TMABDHのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来の可能なTMABDHを推定し、配列番号:7および8のプライマーを、推定TMABADHのアミノ酸配列から設計した。前記PCR産物をEcoRIとSalIとで消化し、同じ酵素で処理されたpBS KS+(Stratagene Inc.)に連結し、得られるPCR産物の挿入されたpBS KS+(TMABADH)で大腸菌DH5αを形質転換した。前記形質転換された大腸菌DH5αを37℃で8時間培養した後、pBS KS+(TMABADH)を単離してEcoRIとSalIとで処理し、PCR産物が適切に挿入されているか否かを確認した。次に、前記単離されたpBS KS+(TMABADH)をNdeIとSalIとで処理した後、アガロースゲルで電気泳動した後、NdeI及びSalIのセグメントを単離した。前記セグメントを、同じ酵素で処理された発現ベクターpT7-7に連結してpT7-7(TMABADH)を得た(図10参照)。前記pT7-7(TMABADH)で大腸菌BL21(DE3)を形質転換した。
このように得られたpT7-7(TMABADH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)をアンピシリンの添加されたLB培地50mlが充填された250mlバッフル・フラスコでOD600値が0.6になるまで37℃で培養した後、IPTG(1mM)を添加した後で4時間さらに培養した。培養物からpT7-7(TMABADH)を単離してNdeI及びSalIで処理し、アガロース・ゲルで電気泳動した。その結果を図12に示す。図12に示されているように、NdeI及びSalIセグメントに対応するバンドを確認することができた(レーン4)。次に、pT7-7(TMABADH)を単離してTMABADHのヌクレオチド配列を分析した。結果、TMABADHのヌクレオチド配列は、NCBIのニューロスポラ・クラッサゲノムデータベースに保存されている配列と同一であることを確認した(配列番号:19)。
(a)γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)をコードするポリヌクレオチドの増幅及びクローニング
前記(1)のcDNAライブラリプールを含むλをテンプレートとして、配列番号:9と10とをプライマーとしてPCRを行った。その結果として得られるPCR産物をアガロース・ゲル電気泳動し、約1.3kbの所望の産物を確認した。前記配列番号:9と10とのプライマーは、ニューロスポラ・クラッサ由来BBHの開始コドンと終結コドンとをコードする配列と推定される配列を含んでいた。公知のヒト及びラット由来BBHのアミノ酸配列とニューロスポラ・クラッサゲノムから発現される総蛋白質のアミノ酸配列との相同性検索を行うことによって、ニューロスポラ・クラッサ由来BBHを推定し、配列番号:9および10のプライマーを、推定BBHのアミノ酸配列から設計した。
pT7-7(BBH)で形質転換された大腸菌BL21(DE3)の培養物中に、発現されたBBHの蛋白質を確認した。まず、前記培養物を4,000xgで15分間遠心分離して細胞ペレットを回収した。得られた細胞ペレットを1mlの溶解バッファ(10mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4中の140mM NaCl、200g/lグリセロール、及び1mM DTT)に添加して再懸濁した。前記細胞懸濁物を氷浴に漬浸し、超音波粉砕器を利用して10秒ずつ5回超音波を処理して細胞を溶解した。細胞溶解物を4℃で10,000gで20〜30分間遠心分離した後、細胞破片を除去して上清を回収して細胞粗抽出物を得た。得られた細胞粗抽出物から試料を採取し、8%のSDS-PAGEを行った(図13参照、レーン5)。SDS-PAGEを行った結果、約49KDaのBBHを確認することができた。
本実施例では、実施例1で作成されたニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリからLMT、TMLH、BBHの遺伝子を増幅し、それら3つの遺伝子を同時に有するpT7-7 ABEを製造した。また、実施例1で作成されたニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリからTMLAとTMABADHとの遺伝子を増幅し、それら2つの遺伝子を同時に有するpACYC184-CarCDを製造した。このように作成されたpT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDとを大腸菌菌株に導入し、LMT、TMLH、TMLA、TMABADH及びBBHの遺伝子をいずれも有する形質転換された菌株細胞を製造した。前記菌株を大腸菌BL21(DE3)CJ2004-2と命名し、2004年12月13日国際寄託機関である韓国微生物保存センターに寄託した(アクセッション番号:KCCM-10638)。
まず、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:1及び2のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むlmtを増幅した。次に、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:3及び4のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むTMLHを増幅した。次に、配列番号:9及び10のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むBBHを増幅した。このように増幅されたLMT、TMLH、BBHの増幅産物をpT7-7に導入した。まず、BBH増幅産物を制限酵素BamHIとSalIとで処理してBamHI及びSalIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpT7-7と連結し、pT7-7 BBHを得た。次に、TMLH増幅産物をNdeIとEcoRIとで処理してNdeI及びEcoRIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpT7-7 BBHと連結し、pT7-7CarBEを得た。次に、LMT増幅産物をClaIで処理して断片を得て、これを同じ酵素で処理されたlmtと連結し、pT7-7CarABEを得た(図14参照)。
まず、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:5及び6のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとして、T7プロモーターから停止コドンを含むTMLAを増幅した。次に、ニューロスポラ・クラッサcDNAライブラリをテンプレートとして、配列番号:7及び8のオールオリゴヌクレオチドをプライマーとしてT7プロモーターから停止コドンを含むTMABADHを増幅した。このように増幅されたTMLAとTMABADHとの増幅産物をpACYC184に導入した。まず、TMLA増幅産物をBamHIとHIndIIIとで処理してBamHI及びHindIIIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpACYC184と連結し、pACYC184 TMLAを得た。次に、TMABADH増幅産物をBamHIとSalIとで処理してBamHI及びSalIセグメントを得て、これを同じ酵素で処理されたpACYC184 TMLAと連結し、pACYC184 CarCDを得た。
本実施例では、実施例2で作成されたpT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDとが同時に導入されている大腸菌BL21(DE3)をL-リジンの含まれた培地で培養し、L-カルニチン生産量を確認した。pT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDとの大腸菌BL21(DE3)への導入は、実施例1に示してあるような電気穿孔法(electroporation)を使用してなされた。
まず、pT7-7-CarABEとpACYC184-CarCDの双方を用いて形質転換された大腸菌BL21(DE3)を、アンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(50μg/ml)が添加されたLB固体平板培地に塗抹して培養した。固体平板培地に現れた菌株のコロニーをアンピシリン(100μg/ml)とクロラムフェニコール(50μg/ml)とがそれぞれ添加された20mlのLB培地を含むフラスコで37℃で12時間培養し、OD600が1.0になるまで培養した。このように培養された菌株の培養物0.1mlを、2mMのL-リジンを含むLB培地20mlを含んでいる250mlバッフル・フラスコに添加し、37℃でOD600値が0.6になるまで培養した。IPTGを添加する場合は、OD600値が0.6になった後、IPTG(1mM)を添加して4時間さらに培養した。対照群として、L-リジンが添加されていないLB培地を同じ方法でIPTGで誘導した培地と、L-リジンは添加されているが、IPTGで誘導していないLB培地とを使用して培養した。培養が終了した後、培養物中のL-カルニチンの含有量を前記(1)と同一に測定した。その結果を次の表2に示す。
Claims (10)
- ニューロスポラ・クラッサ(Neurospora crassa)由来のS-アデノシルメチオニン-6-N-リジンメチルトランスフェラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドと、
6-N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドと、
3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ活性をコードするポリヌクレオチドと、
γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性をコードするポリヌクレオチドと、
γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ活性をコードするポリヌクレオチド
とを含む腸内細菌科属に属する微生物。 - 微生物が大腸菌である、請求項1記載の微生物。
- 微生物が大腸菌(アクセッション番号:KCCM-10638)である、請求項1記載の微生物。
- S-アデノシルメチオニン-6-N-リジンメチルトランスフェラーゼ(LMT)活性をコードするポリヌクレオチドが、配列番号:11のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項1記載の微生物。
- 6-N-トリメチルリジンヒドロキシラーゼ(TMLH)活性をコードするポリヌクレオチドが、配列番号:12のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項1記載の微生物。
- 3-ヒドロキシ-6-N-トリメチルリジンアルドラーゼ(TMLA)活性をコードするポリヌクレオチドが、配列番号:13のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項1記載の微生物。
- γ-トリメチルアミノアルデヒドデヒドロゲナーゼ(TMABADH)活性をコードするポリヌクレオチドが、配列番号:14のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項1記載の微生物。
- γ-ブチロベタインヒドロキシラーゼ(BBH)活性をコードするポリヌクレオチドが、配列番号:15のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項1記載の微生物。
- 請求項1から請求項8のいずれか一項記載の微生物を、L-リジン、N-トリメチルリジン、β-ヒドロキシ-N-トリメチルリジン、γ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ-ブチロベタイン、及びその混合物からなる群より選択される基質の存在下で培養し、L-カルニチンを培養物中に生産する段階を含む、L-カルニチンの製造方法。
- L-リジン、N-トリメチルリジン、β-ヒドロキシ-N-トリメチルリジン、γ-N-トリメチルアミノブチルアルデヒド、γ-ブチロベタイン、及びその混合物からなる群より選択される基質の濃度が、培養培地の重量に基づいて、0.1〜10重量%である、請求項9記載の方法。
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