JP2001245662A - 多環芳香族分解経路上流に関与する遺伝子群およびタンパク質群 - Google Patents
多環芳香族分解経路上流に関与する遺伝子群およびタンパク質群Info
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- JP2001245662A JP2001245662A JP2000059523A JP2000059523A JP2001245662A JP 2001245662 A JP2001245662 A JP 2001245662A JP 2000059523 A JP2000059523 A JP 2000059523A JP 2000059523 A JP2000059523 A JP 2000059523A JP 2001245662 A JP2001245662 A JP 2001245662A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 多環芳香族分解経路上流に関与する遺伝子群
およびタンパク質群の提供。 【解決手段】 配列番号２,４,６,８で表わされるアミ
ノ酸配列若しくは配列番号２,４,６,８のアミノ酸配列
において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコー
ドする遺伝子群、または配列番号２,４,６,８で表わさ
れるアミノ酸配列若しくは配列番号２,４,６,８のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク
質群。
およびタンパク質群の提供。 【解決手段】 配列番号２,４,６,８で表わされるアミ
ノ酸配列若しくは配列番号２,４,６,８のアミノ酸配列
において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若し
くは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコー
ドする遺伝子群、または配列番号２,４,６,８で表わさ
れるアミノ酸配列若しくは配列番号２,４,６,８のアミ
ノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、
置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク
質群。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、フェナントレンお
よびアントラセン等の多環芳香族の分解経路上流に関与
する遺伝子群、即ちベンゼン環水酸化酵素（経路第１段
階）により生成される多環芳香族のジヒドロジオール化
合物を脱水素化して芳香族ジオール化合物を生成する芳
香族ジヒドロジオール脱水素酵素、芳香族ジオール化合
物を酸化開裂させる芳香族ジオール酸素添加（メタ開
裂）酵素、環開裂産物を芳香族アルデヒドとピルビン酸
に変換するヒドラターゼ-アルドラーゼおよび芳香族ア
ルデヒドを芳香族カルボン酸に変換するアルデヒド・デ
ヒドロゲナーゼを構成する遺伝子群に関する。
よびアントラセン等の多環芳香族の分解経路上流に関与
する遺伝子群、即ちベンゼン環水酸化酵素（経路第１段
階）により生成される多環芳香族のジヒドロジオール化
合物を脱水素化して芳香族ジオール化合物を生成する芳
香族ジヒドロジオール脱水素酵素、芳香族ジオール化合
物を酸化開裂させる芳香族ジオール酸素添加（メタ開
裂）酵素、環開裂産物を芳香族アルデヒドとピルビン酸
に変換するヒドラターゼ-アルドラーゼおよび芳香族ア
ルデヒドを芳香族カルボン酸に変換するアルデヒド・デ
ヒドロゲナーゼを構成する遺伝子群に関する。
【０００２】
【従来の技術】芳香族化合物の多くは毒性および発癌性
を持ち、環境中においては汚染物質となる。その一方で
環境中には芳香族化合物を栄養源として利用し、資化す
る微生物が存在する。従来、環境汚染物質となりうる芳
香族化合物の細菌による分解、浄化の研究は、環境問題
への関心の高まりとあいまって精力的に行われてきた。
こうした研究の方向性としては、特定の化合物を特異的
に分解する細菌の探索、分解経路の解明、また分解に関
与する遺伝子の単離等が挙げられる。その結果、多岐に
わたる細菌種が芳香族化合物を資化する能力を持つもの
として単離されてきた。また、芳香族化合物は複雑な過
程を経て水と二酸化炭素にまで分解されることや、この
分解に必要な遺伝子は多数存在し、これらは大きなプラ
スミド上又は染色体ＤＮＡ上にオペロンを形成する場合
が多いこと等が明らかになってきた。現在、多環芳香族
化合物を分解代謝する酵素をコードする遺伝子群の塩基
配列としては、幾つかのものが知られている。これら
は、２つのベンゼン環を持つナフタレンまたはビフェニ
ルを分解する一連の酵素の遺伝子群に関するものであ
る。しかし、ベンゼン環が３つ又はそれ以上の化合物を
基質として増殖できる細菌より、一連の分解遺伝子をク
ローニングし、塩基配列を決定した例は無い。
を持ち、環境中においては汚染物質となる。その一方で
環境中には芳香族化合物を栄養源として利用し、資化す
る微生物が存在する。従来、環境汚染物質となりうる芳
香族化合物の細菌による分解、浄化の研究は、環境問題
への関心の高まりとあいまって精力的に行われてきた。
こうした研究の方向性としては、特定の化合物を特異的
に分解する細菌の探索、分解経路の解明、また分解に関
与する遺伝子の単離等が挙げられる。その結果、多岐に
わたる細菌種が芳香族化合物を資化する能力を持つもの
として単離されてきた。また、芳香族化合物は複雑な過
程を経て水と二酸化炭素にまで分解されることや、この
分解に必要な遺伝子は多数存在し、これらは大きなプラ
スミド上又は染色体ＤＮＡ上にオペロンを形成する場合
が多いこと等が明らかになってきた。現在、多環芳香族
化合物を分解代謝する酵素をコードする遺伝子群の塩基
配列としては、幾つかのものが知られている。これら
は、２つのベンゼン環を持つナフタレンまたはビフェニ
ルを分解する一連の酵素の遺伝子群に関するものであ
る。しかし、ベンゼン環が３つ又はそれ以上の化合物を
基質として増殖できる細菌より、一連の分解遺伝子をク
ローニングし、塩基配列を決定した例は無い。
【０００３】一方、ノカルディオイデス（Nocardioide
s）種 KP7株はフェナントレンを唯一の炭素源として生
育することが知られており（Iwabuchiら、J. Mar. Biot
echnol., 6,86-90 (1998)）、フェナントレン分解経路
において 1-ヒドキシ-2-ナフトエ酸を o-フタル酸まで
変換する反応を担う各種酵素1-ヒドロキシ-2-ナフトエ
酸ジオキシゲナーゼ(PhdI）、トランス-2-カルボキシベ
ンザルピルビン酸ヒドラターゼ-アルドラーゼ（PhdJ）
及び2-カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（PhdK）の遺伝子構造が明らかにされている（Iwabuchi
および Harayama, J.Biol. Chem., 273, 8332-8336 (1
998); Iwabuchi および Harayama, J. Bacteriol., 18
0, 945-949 (1998); Iwabuchi および Harayama, J. Ba
cteriol., 179,6488-6494 (1997)）。
s）種 KP7株はフェナントレンを唯一の炭素源として生
育することが知られており（Iwabuchiら、J. Mar. Biot
echnol., 6,86-90 (1998)）、フェナントレン分解経路
において 1-ヒドキシ-2-ナフトエ酸を o-フタル酸まで
変換する反応を担う各種酵素1-ヒドロキシ-2-ナフトエ
酸ジオキシゲナーゼ(PhdI）、トランス-2-カルボキシベ
ンザルピルビン酸ヒドラターゼ-アルドラーゼ（PhdJ）
及び2-カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナーゼ
（PhdK）の遺伝子構造が明らかにされている（Iwabuchi
および Harayama, J.Biol. Chem., 273, 8332-8336 (1
998); Iwabuchi および Harayama, J. Bacteriol., 18
0, 945-949 (1998); Iwabuchi および Harayama, J. Ba
cteriol., 179,6488-6494 (1997)）。
【０００４】更には、分解経路第１段階の変換反応を担
うベンゼン環水酸化酵素を構成する４種のサブユニット
をコードする遺伝子の塩基配列配列も明らかになってい
る（特願平10-259413を参照されたい）。これらの酵素
に関しては、既知の類似酵素とのアミノ酸配列の類似性
のみでなく、それぞれ分解活性を有することも確かめら
れている。
うベンゼン環水酸化酵素を構成する４種のサブユニット
をコードする遺伝子の塩基配列配列も明らかになってい
る（特願平10-259413を参照されたい）。これらの酵素
に関しては、既知の類似酵素とのアミノ酸配列の類似性
のみでなく、それぞれ分解活性を有することも確かめら
れている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、遺伝子工学
的手法を用いて多環芳香族分解の経路上流に関与する一
連の酵素又はそれを発現する組換え体を生産すべく、そ
の生産のもととなる遺伝子を解析し、提供することを目
的とする。
的手法を用いて多環芳香族分解の経路上流に関与する一
連の酵素又はそれを発現する組換え体を生産すべく、そ
の生産のもととなる遺伝子を解析し、提供することを目
的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、芳香族化合物
を分解代謝する一連の酵素をコードする遺伝子群はクラ
スターを形成する場合が多いとの知見に基づき、ノカル
ディオイデス(Nocardioides)種・KP7株ゲノムＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングを行ったところ、ベンゼン
環水酸化酵素、ジヒドロジオール脱水素酵素、芳香族ジ
オール酸素添加（メタ開裂）酵素、ヒドラターゼ-アル
ドラーゼ及びアルデヒド・デヒドロゲナーゼ遺伝子の全
長をコードするクローンを取得するに至り、本発明を完
成した。
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、芳香族化合物
を分解代謝する一連の酵素をコードする遺伝子群はクラ
スターを形成する場合が多いとの知見に基づき、ノカル
ディオイデス(Nocardioides)種・KP7株ゲノムＤＮＡラ
イブラリーのスクリーニングを行ったところ、ベンゼン
環水酸化酵素、ジヒドロジオール脱水素酵素、芳香族ジ
オール酸素添加（メタ開裂）酵素、ヒドラターゼ-アル
ドラーゼ及びアルデヒド・デヒドロゲナーゼ遺伝子の全
長をコードするクローンを取得するに至り、本発明を完
成した。
【０００７】すなわち、本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【０００８】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
【０００９】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１０】さらに本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１１】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
のタンパク質である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００１２】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
のタンパク質である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
【００１３】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
のタンパク質である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１４】さらに本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）のタンパク質である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコ
ードする遺伝子である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質をコ
ードする遺伝子である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００１６】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
【００１７】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
【００１８】さらに本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）のタンパク質をコードする遺伝子である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００１９】本発明の遺伝子は、例えば以下の手順で得
ることができる。先ず、ノカルディオイデス種・KP7株
のゲノムＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断後、適
当なベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチク
ローニングサイトに挿入して連結し、ゲノムＤＮＡライ
ブラリーを作成する。ノカルディオイデス種・KP7株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM
P-16955として寄託されている（寄託日平成１０年８月
２５日）。
ることができる。先ず、ノカルディオイデス種・KP7株
のゲノムＤＮＡを調製し、適当な制限酵素で切断後、適
当なベクターＤＮＡの制限酵素切断部位またはマルチク
ローニングサイトに挿入して連結し、ゲノムＤＮＡライ
ブラリーを作成する。ノカルディオイデス種・KP7株
は、工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM
P-16955として寄託されている（寄託日平成１０年８月
２５日）。
【００２０】適切な制限酵素としては、例えば EcoRI、
BamHI、PstIを使用することができるが、これらに限定
されない。適当なベクターとしては、λファージ由来の
各種ベクター、例えばλgt10やλZap11等、コスミドベ
クターpRAFR3等、又はpUC18やpBR322等のプラスミドベ
クターを用いることができるが、これらに限定されな
い。
BamHI、PstIを使用することができるが、これらに限定
されない。適当なベクターとしては、λファージ由来の
各種ベクター、例えばλgt10やλZap11等、コスミドベ
クターpRAFR3等、又はpUC18やpBR322等のプラスミドベ
クターを用いることができるが、これらに限定されな
い。
【００２１】目的の遺伝子を保持するクローンの選択に
は、適当なプローブを用いてハイブリダイゼーションを
行い、これに強く結合するクローンを選択すればよい。
このプローブは、例えば、以下の２つのステップを経て
作ることができる。 (1)先ず、既知のベンゼン環水酸化酵素のアミノ酸配列
において、保存度の高い部分２ヵ所の配列をもとに、２
つのプライマーを設計する。 (2) この２つのプライマーおよびノカルディオイデス種
・KP7株ＤＮＡを用いてＰＣＲを行うことにより増幅さ
れるＤＮＡ断片をプローブとして用いることができる。
また、菌体から何れかの芳香族分解酵素を精製し、N末
端のアミノ酸配列を決定し、その配列に基づいてプロー
ブを合成してもよい。
は、適当なプローブを用いてハイブリダイゼーションを
行い、これに強く結合するクローンを選択すればよい。
このプローブは、例えば、以下の２つのステップを経て
作ることができる。 (1)先ず、既知のベンゼン環水酸化酵素のアミノ酸配列
において、保存度の高い部分２ヵ所の配列をもとに、２
つのプライマーを設計する。 (2) この２つのプライマーおよびノカルディオイデス種
・KP7株ＤＮＡを用いてＰＣＲを行うことにより増幅さ
れるＤＮＡ断片をプローブとして用いることができる。
また、菌体から何れかの芳香族分解酵素を精製し、N末
端のアミノ酸配列を決定し、その配列に基づいてプロー
ブを合成してもよい。
【００２２】一連の芳香族分解酵素をコードする遺伝子
群はクラスターを形成する場合が多いことが知られてい
る。それゆえ、上記の適切なプローブを用いて選択され
たクローン及びそのクローンの持つＤＮＡと重複するＤ
ＮＡ断片を持つクローンの塩基配列を、サンガー法やマ
キサム−ギルバート法等の一般的な手法により決定する
ことによって、ベンゼン環水酸化酵素、および本発明の
芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素、芳香族ジオール酸
素添加（メタ開裂）酵素、ヒドラターゼ-アルドラーゼ
及びアルデヒド・デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ
の全長を単離することができる。これらの遺伝子をコー
ドするＤＮＡを導入した形質転換体は、フェナントレン
およびアントラセン等多環芳香族化合物の代謝中間体を
含む培養液中で培養することにより、容易に基質となる
代謝中間体を変換し、その産物を培養物中に蓄積する。
群はクラスターを形成する場合が多いことが知られてい
る。それゆえ、上記の適切なプローブを用いて選択され
たクローン及びそのクローンの持つＤＮＡと重複するＤ
ＮＡ断片を持つクローンの塩基配列を、サンガー法やマ
キサム−ギルバート法等の一般的な手法により決定する
ことによって、ベンゼン環水酸化酵素、および本発明の
芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素、芳香族ジオール酸
素添加（メタ開裂）酵素、ヒドラターゼ-アルドラーゼ
及びアルデヒド・デヒドロゲナーゼをコードするＤＮＡ
の全長を単離することができる。これらの遺伝子をコー
ドするＤＮＡを導入した形質転換体は、フェナントレン
およびアントラセン等多環芳香族化合物の代謝中間体を
含む培養液中で培養することにより、容易に基質となる
代謝中間体を変換し、その産物を培養物中に蓄積する。
【００２３】また、本発明は以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
のタンパク質である： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。
【００２４】また本発明は、以下の（ａ）または（ｂ）
のタンパク質である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
のタンパク質である： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。
【００２５】さらに本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）のタンパク質である： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。
【００２６】さらにまた本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）のタンパク質である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
（ｂ）のタンパク質である： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
【００２７】上記に記載の全てのアミノ酸の欠失、置
換、付加は、公知技術(例えば、固相合成法)により実施
することができる。本発明のタンパク質は、上記におい
て単離したＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、得ら
れた組換えベクターを宿主に導入して発現させることに
より得ることができる。
換、付加は、公知技術(例えば、固相合成法)により実施
することができる。本発明のタンパク質は、上記におい
て単離したＤＮＡを適当な発現ベクターに挿入し、得ら
れた組換えベクターを宿主に導入して発現させることに
より得ることができる。
【００２８】ＤＮＡを挿入する発現ベクターは、宿主中
で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、λ
ファージ由来の各種ベクター、例えばλgt10やλZap11
等、コスミドベクターpRAFR3等、又はpUC18やpBR322等
のプラスミドベクターを用いることができる。
で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、λ
ファージ由来の各種ベクター、例えばλgt10やλZap11
等、コスミドベクターpRAFR3等、又はpUC18やpBR322等
のプラスミドベクターを用いることができる。
【００２９】組換えベクターを導入する宿主としては、
例えば、大腸菌(Escherichia coli)BL21(DE3)株、大腸
菌K-12株、Pseudomonas属の細菌、Batillus属の細菌、S
treptomyces属の細菌、Saccharomyces cerevisiae、CHO
細胞、Hela細胞等を使用することができるが、本発明の
遺伝子を発現できるものであればこれらに限定されな
い。ベクターの導入方法としては、導入する宿主に適し
た手法であれば特に限定されないが、例えば大腸菌等の
細菌に導入する場合、カルシウム法、エレクトロポレー
ション法を用いることができる。
例えば、大腸菌(Escherichia coli)BL21(DE3)株、大腸
菌K-12株、Pseudomonas属の細菌、Batillus属の細菌、S
treptomyces属の細菌、Saccharomyces cerevisiae、CHO
細胞、Hela細胞等を使用することができるが、本発明の
遺伝子を発現できるものであればこれらに限定されな
い。ベクターの導入方法としては、導入する宿主に適し
た手法であれば特に限定されないが、例えば大腸菌等の
細菌に導入する場合、カルシウム法、エレクトロポレー
ション法を用いることができる。
【００３０】本発明の遺伝子は、その機能が発揮される
ようにベクターに導入されることが必要である。そこ
で、発現ベクターは、本発明の遺伝子、プロモーターの
他に、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、
スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マ
ーカー、リボソーム結合配列(ＳＤ配列)等を連結するこ
とができる。
ようにベクターに導入されることが必要である。そこ
で、発現ベクターは、本発明の遺伝子、プロモーターの
他に、所望によりエンハンサーなどのシスエレメント、
スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マ
ーカー、リボソーム結合配列(ＳＤ配列)等を連結するこ
とができる。
【００３１】上記選択マーカーとしては、例えばアンピ
シリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ロイ
シン合成遺伝子、ウラシル合成遺伝子、チミジン・キナ
ーゼ遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ
る。プロモーターとしては、宿主中で発現できるもので
あれば特に限定されないが、例えば宿主が大腸菌である
場合、lacプロモーター、tacプロモーター、T7プロモー
ターを使用することができる。
シリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ロイ
シン合成遺伝子、ウラシル合成遺伝子、チミジン・キナ
ーゼ遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等が挙げられ
る。プロモーターとしては、宿主中で発現できるもので
あれば特に限定されないが、例えば宿主が大腸菌である
場合、lacプロモーター、tacプロモーター、T7プロモー
ターを使用することができる。
【００３２】上記の方法によりベクターを導入して宿主
を形質転換し、この形質転換体を培養することにより、
その培養物から本発明のタンパク質を採取することがで
きる。培養は、通常、振とう培養または通気攪拌等の好
気条件下、例えば20℃から37℃で5時間から72時間、pH5
からpH9の範囲で行なう。培養期間中、必要に応じてア
ンピシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
を形質転換し、この形質転換体を培養することにより、
その培養物から本発明のタンパク質を採取することがで
きる。培養は、通常、振とう培養または通気攪拌等の好
気条件下、例えば20℃から37℃で5時間から72時間、pH5
からpH9の範囲で行なう。培養期間中、必要に応じてア
ンピシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
【００３３】培養後、本発明のタンパク質が菌体内もし
くは細胞内に生産される場合には、この菌体または細胞
を破砕することにより本発明のタンパク質を抽出する。
また、本発明のタンパク質が菌体外もしくは細胞外に生
産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心
分離等により菌体もしくは細胞を除去する。その後、タ
ンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方
法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフ
ィー等を単独で、または適宜組合わせて用いることによ
り、前記培養物中から本発明のタンパク質を回収するこ
とができる。
くは細胞内に生産される場合には、この菌体または細胞
を破砕することにより本発明のタンパク質を抽出する。
また、本発明のタンパク質が菌体外もしくは細胞外に生
産される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心
分離等により菌体もしくは細胞を除去する。その後、タ
ンパク質の単離精製に用いられる一般的な生化学的方
法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフ
ィー等を単独で、または適宜組合わせて用いることによ
り、前記培養物中から本発明のタンパク質を回収するこ
とができる。
【００３４】本発明のタンパク質の粗抽出液又は精製物
は、フェナントレンおよびアントラセン等の多環芳香族
化合物の代謝中間体を変換する酵素試薬として利用する
ことができる。また、上記形質転換体および該形質転換
体により産生される上記タンパク質は、バイオリアクタ
ーの反応体としても利用することができる。
は、フェナントレンおよびアントラセン等の多環芳香族
化合物の代謝中間体を変換する酵素試薬として利用する
ことができる。また、上記形質転換体および該形質転換
体により産生される上記タンパク質は、バイオリアクタ
ーの反応体としても利用することができる。
【００３５】
【実施例】以下、実施例により本発明について具体的に
説明するが、本発明はこれにより限定されるものではな
い。 ［実施例１］ ノカルディオイデス種・KP7株ＤＮＡライブラリーの作
製 ノカルディオイデス種・KP7株を、0.1% (w/v) のフェナ
ントレンを含む3リットルのマリンブロース（Difco
社）に植菌し、30℃で2日間培養した。培養の後に集菌
し、KP7株の長鎖（ゲノム）ＤＮＡを調整した（Ausubel
ら、(編), Current Protocols in Molecular Biology,
Chap.2 (1994)）。50 mgのKP7株ＤＮＡに250ユニットの
制限酵素Sau3AIを添加して37℃で30秒間反応させ、部分
切断を行った。このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に
より分画し、15kbから30kbの範囲のＤＮＡ 断片を回収
した。
説明するが、本発明はこれにより限定されるものではな
い。 ［実施例１］ ノカルディオイデス種・KP7株ＤＮＡライブラリーの作
製 ノカルディオイデス種・KP7株を、0.1% (w/v) のフェナ
ントレンを含む3リットルのマリンブロース（Difco
社）に植菌し、30℃で2日間培養した。培養の後に集菌
し、KP7株の長鎖（ゲノム）ＤＮＡを調整した（Ausubel
ら、(編), Current Protocols in Molecular Biology,
Chap.2 (1994)）。50 mgのKP7株ＤＮＡに250ユニットの
制限酵素Sau3AIを添加して37℃で30秒間反応させ、部分
切断を行った。このＤＮＡをアガロースゲル電気泳動に
より分画し、15kbから30kbの範囲のＤＮＡ 断片を回収
した。
【００３６】一方、コスミドベクター pLAFR3（Staskaw
iczら、J. Bacteriol., 169, 5789-5794 (1987)）を制
限酵素BamHIとEcoRIで切断したもの、およびBamHIとHin
dIIIで切断したものを用意した。 KP7株ＤＮＡのSau3AI
部分切断断片と上記２種のコスミドベクターＤＮＡを混
合し、Takara ligation kit Ver.2により連結し、Gigap
ackTMIII Gold Packaging Extract（Stratagene Clonin
g Systems 社）を用いてパッケージングした後、Escher
ichia coli S17-1株 に感染させた。形質転換したポピ
ュレーションのうち2304クローンを維持管理し、これを
ノカルディオイデス種・KP7株ＤＮＡライブラリーとし
た。
iczら、J. Bacteriol., 169, 5789-5794 (1987)）を制
限酵素BamHIとEcoRIで切断したもの、およびBamHIとHin
dIIIで切断したものを用意した。 KP7株ＤＮＡのSau3AI
部分切断断片と上記２種のコスミドベクターＤＮＡを混
合し、Takara ligation kit Ver.2により連結し、Gigap
ackTMIII Gold Packaging Extract（Stratagene Clonin
g Systems 社）を用いてパッケージングした後、Escher
ichia coli S17-1株 に感染させた。形質転換したポピ
ュレーションのうち2304クローンを維持管理し、これを
ノカルディオイデス種・KP7株ＤＮＡライブラリーとし
た。
【００３７】［実施例２］ＰＣＲによるベンゼン環水酸
化酵素のαサブユニット遺伝子断片の増幅 公知のベンゼン環水酸化酵素のαサブユニットのアミノ
酸配列のアラインメントから、このグループのタンパク
質間で良く保存された領域を特定し、そのアミノ酸配列
から以下の２種のデジェネレートＤＮＡプライマーを設
計し合成した。
化酵素のαサブユニット遺伝子断片の増幅 公知のベンゼン環水酸化酵素のαサブユニットのアミノ
酸配列のアラインメントから、このグループのタンパク
質間で良く保存された領域を特定し、そのアミノ酸配列
から以下の２種のデジェネレートＤＮＡプライマーを設
計し合成した。
【００３８】 （合成したプライマー） OD-1s ：TG(TC)AG(TC)T(AT)(TC)CA(TC)GG(GATC)TGG （配列番号９） OD-1a ：TC(GATC)(GA)C(GATC)GC(AG)AA(TC)TTCCA(AG)TT（配列番号１０）
【００３９】上記 OD-1sはαサブユニットのN末端に近
い鉄硫黄クラスターの形成に関与すると考えられる Cys
残基と His残基を含む領域のアミノ酸配列に基づいて設
計した18mer のプライマーであり、OD-1aはαサブユニ
ットの中央部の相同領域のアミノ酸配列に基づいて設計
した20mer のプライマーである。
い鉄硫黄クラスターの形成に関与すると考えられる Cys
残基と His残基を含む領域のアミノ酸配列に基づいて設
計した18mer のプライマーであり、OD-1aはαサブユニ
ットの中央部の相同領域のアミノ酸配列に基づいて設計
した20mer のプライマーである。
【００４０】実施例１で調製したKP7株のＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲ反応の結果、予想されたとおり約300 bpの
ＤＮＡ断片が増幅された。この断片を pCR-ScriptTMSK
(+) cloning kit（Stratagene Cloning Systems 社）を
用いてpCR-Script SK(+) のSrfI部位にクローニング
し、pK11-300-5を作製した。 pCR-Script SK(+)のマル
チクローニング部位の両サイドにはT7プロモーター及び
T3プロモーターが配備されている。クローニングされた
増幅断片の塩基配列を決定するため、それぞれのプロモ
ーターの塩基配列に基づいた以下のＤＮＡプライマーを
設計し合成した。
としてＰＣＲ反応の結果、予想されたとおり約300 bpの
ＤＮＡ断片が増幅された。この断片を pCR-ScriptTMSK
(+) cloning kit（Stratagene Cloning Systems 社）を
用いてpCR-Script SK(+) のSrfI部位にクローニング
し、pK11-300-5を作製した。 pCR-Script SK(+)のマル
チクローニング部位の両サイドにはT7プロモーター及び
T3プロモーターが配備されている。クローニングされた
増幅断片の塩基配列を決定するため、それぞれのプロモ
ーターの塩基配列に基づいた以下のＤＮＡプライマーを
設計し合成した。
【００４１】 （合成したプライマー） T7 プライマー：GAA TTG TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG（配列番号１１） T3 プライマー：GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG G（配列番号１２）
【００４２】これらのプライマーを用いて塩基配列を決
定したところ、クローニングされた増幅断片は302 bp
で、そのコードしうるアミノ酸配列は、公知のベンゼン
環水酸化酵素・αサブユニットのアミノ酸配列と有意な
相同性を示した。これは増幅断片が、ノカルディオイデ
ス種・KP7株のαサブユニット遺伝子の一部であること
を示唆する。
定したところ、クローニングされた増幅断片は302 bp
で、そのコードしうるアミノ酸配列は、公知のベンゼン
環水酸化酵素・αサブユニットのアミノ酸配列と有意な
相同性を示した。これは増幅断片が、ノカルディオイデ
ス種・KP7株のαサブユニット遺伝子の一部であること
を示唆する。
【００４３】なお、PCR反応は、PCR-増幅キット（宝酒
造）を用い、Takara PCR thermal cycler MPにて94℃30
秒、55℃1分、72℃1分で30サイクル行なった。シークエ
ンス反応は、Dye terminator cycle sequencing kit
（パーキンエルマー社）を用い、Takara PCR thermal c
ycler MPにて96℃10秒、50℃5秒、60℃4分で25サイクル
行なった。塩基配列の解析は、373A DNA sequencer（パ
ーキンエルマー社）で行なった。
造）を用い、Takara PCR thermal cycler MPにて94℃30
秒、55℃1分、72℃1分で30サイクル行なった。シークエ
ンス反応は、Dye terminator cycle sequencing kit
（パーキンエルマー社）を用い、Takara PCR thermal c
ycler MPにて96℃10秒、50℃5秒、60℃4分で25サイクル
行なった。塩基配列の解析は、373A DNA sequencer（パ
ーキンエルマー社）で行なった。
【００４４】［実施例３］ベンゼン環水酸化酵素・αサ
ブユニットをコードするコスミドクローンの同定 実施例２で得られたαサブユニット遺伝子の一部と考え
られる増幅断片をプローブとして用い、2304クローンの
KP7株ＤＮＡライブラリーのすべてのコロニーとハイブ
リダイゼーションを行った。
ブユニットをコードするコスミドクローンの同定 実施例２で得られたαサブユニット遺伝子の一部と考え
られる増幅断片をプローブとして用い、2304クローンの
KP7株ＤＮＡライブラリーのすべてのコロニーとハイブ
リダイゼーションを行った。
【００４５】その結果、pMKT177、pMKT201、pMKT202お
よびpMKT203の４クローンに関して明らかにポジティブ
なシグナルが認められた。このうちpMKT177は、1-ヒド
キシ-2-ナフトエ酸を o-フタル酸まで変換する反応を担
う各種酵素の遺伝子phdI（1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸
ジオキシゲナーゼ）、phdJ（トランス-2'-カルボキシベ
ンザルピルビン酸ヒドラターゼ-アルドラーゼ）およびp
hdK（2-カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ）をコードしていることが知られている（Iwabuchi
および Harayama, J. Biol. Chem., 273, 8332-8336 (1
998); Iwabuchi および Harayama, J. Bacteriol., 18
0, 945-949 (1998); Iwabuchi および Harayama, J. Ba
cteriol., 179,6488-6494 (1997)）。
よびpMKT203の４クローンに関して明らかにポジティブ
なシグナルが認められた。このうちpMKT177は、1-ヒド
キシ-2-ナフトエ酸を o-フタル酸まで変換する反応を担
う各種酵素の遺伝子phdI（1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸
ジオキシゲナーゼ）、phdJ（トランス-2'-カルボキシベ
ンザルピルビン酸ヒドラターゼ-アルドラーゼ）およびp
hdK（2-カルボキシベンズアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ）をコードしていることが知られている（Iwabuchi
および Harayama, J. Biol. Chem., 273, 8332-8336 (1
998); Iwabuchi および Harayama, J. Bacteriol., 18
0, 945-949 (1998); Iwabuchi および Harayama, J. Ba
cteriol., 179,6488-6494 (1997)）。
【００４６】制限酵素マッピングの結果、これら４クロ
ーンはお互いにオーバーラップしており、 pMKT177とpM
KT203との組合せで最も広い領域をカバーすることが分
かった。以後、各種領域のサブクローニングおよび塩基
配列の決定には、この２クローンを用いた。なお、プロ
ーブのラベル、ハイブリダイゼーションおよびシグナル
の検出にはECLTM direct nucleic acid labelling and
detection systems（Amersham）を用いた。
ーンはお互いにオーバーラップしており、 pMKT177とpM
KT203との組合せで最も広い領域をカバーすることが分
かった。以後、各種領域のサブクローニングおよび塩基
配列の決定には、この２クローンを用いた。なお、プロ
ーブのラベル、ハイブリダイゼーションおよびシグナル
の検出にはECLTM direct nucleic acid labelling and
detection systems（Amersham）を用いた。
【００４７】［実施例４］芳香族ジヒドロジオール脱水
素酵素、芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵素、ヒ
ドラターゼ-アルドラーゼ及びアルデヒド・デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子群の塩基配列の決定 上記クローンpMKT177及びpMKT203に含まれるノカルディ
オイデス種・KP7株由来ＤＮＡの種々の部分領域を制限
酵素 EcoRI、BamHI、BglII、MluI、XbaI、NcoI、KpnIで
処理して切り出し、各制限断片をクローニングベクター
pSL301（Brosius, ＤＮＡ, 8, 759-777 (1989)）にサブ
クローニングした。このベクターのマルチクローニング
部位の両サイドにはT7プロモーターおよびT3プロモータ
ーが配備されている。
素酵素、芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵素、ヒ
ドラターゼ-アルドラーゼ及びアルデヒド・デヒドロゲ
ナーゼをコードする遺伝子群の塩基配列の決定 上記クローンpMKT177及びpMKT203に含まれるノカルディ
オイデス種・KP7株由来ＤＮＡの種々の部分領域を制限
酵素 EcoRI、BamHI、BglII、MluI、XbaI、NcoI、KpnIで
処理して切り出し、各制限断片をクローニングベクター
pSL301（Brosius, ＤＮＡ, 8, 759-777 (1989)）にサブ
クローニングした。このベクターのマルチクローニング
部位の両サイドにはT7プロモーターおよびT3プロモータ
ーが配備されている。
【００４８】クローニングされたＤＮＡ断片の塩基配列
を決定するため、それぞれのプロモーターの塩基配列に
基づく２つのプライマー：T7プライマー(上掲、配列番
号１１)及びＴ３プライマー（上掲、配列番号１２）を
使用した。先ず、各種のサブクローン（pSL301由来）を
鋳型とし、上記のT7プライマー及びT3プライマーを用い
てシークエンス反応を行なった。塩基配列の解析が進む
にしたがって順次新たなプライマーを設計・合成して解
析を進めた。なお、シークエンス反応は、Dye terminat
or cycle sequencing kit（パーキンエルマー社）を用
い、Takara PCR thermal cycler MPにて96℃10秒、50℃
5秒、60℃4分で25サイクル行なった。塩基配列の解析
は、373A DNA sequencer（パーキンエルマー社）で行な
った。解析に伴い順次新たに設計・合成したプライマー
の塩基配列は下記のとおりである。
を決定するため、それぞれのプロモーターの塩基配列に
基づく２つのプライマー：T7プライマー(上掲、配列番
号１１)及びＴ３プライマー（上掲、配列番号１２）を
使用した。先ず、各種のサブクローン（pSL301由来）を
鋳型とし、上記のT7プライマー及びT3プライマーを用い
てシークエンス反応を行なった。塩基配列の解析が進む
にしたがって順次新たなプライマーを設計・合成して解
析を進めた。なお、シークエンス反応は、Dye terminat
or cycle sequencing kit（パーキンエルマー社）を用
い、Takara PCR thermal cycler MPにて96℃10秒、50℃
5秒、60℃4分で25サイクル行なった。塩基配列の解析
は、373A DNA sequencer（パーキンエルマー社）で行な
った。解析に伴い順次新たに設計・合成したプライマー
の塩基配列は下記のとおりである。
【００４９】（使用した各プライマー） KP101: TCC GAG ACC CTG GCC AAC GC（配列番号１３） KP102: GCG GTG CCT CGG GTA TCG GA（配列番号１４） KP103: GAT CGC GTC GAC GAC GCG CT（配列番号１５） KP104: CGG CCT CTA CGT GCT GCT CG（配列番号１６） KP105: CGA CGT GCA GGA CCC GGT AG（配列番号１７） KP106: GGA TGG ACC CCG AAG GTG CG（配列番号１８） KP107: TCT GGA TCG CGG GGT GCC AG（配列番号１９） KP108: AAC CCG CTG CAG ACC GCG CA（配列番号２０） KP109: TCG TGG GTG TCC TCG CGC AC（配列番号２１） KP110: GGC ACT GAG CCG AGA TCT CC（配列番号２２） KP111: CGG ACG GCC GAT GTC CCG AT（配列番号２３） KP112: CCG GAG GAG ATG ATC GAG GG（配列番号２４） KP113: CGA GAT GGG GCT GAA CGT GC（配列番号２５） KP114: GCC CGA GCT CGC GAT CAT GA（配列番号２６） KP115: CCG ACC AGA TGC AGG CTC CG（配列番号２７） KP116: AGG AGA CGT CGG ACC GCA CA（配列番号２８） KP117: GGA CAT CAA GCG GGT GAC CC（配列番号２９） KP118: CGC GTA CTG CAC GAC ATC GG（配列番号３０） KP119: GTT GGC GAT CGA GGT GCC GA（配列番号３１） KP120: TTC GAG CTC GGC CGC AGG CT（配列番号３２） KP121: GTG CTG CTG GTC TCC GCG GA（配列番号３３） KP122: CCG CCG GGT TAT GGA TCG TG（配列番号３４） KP123: GCT CGG GCT CGA AGT CAC CG（配列番号３５） KP124: CGA CGA GCA CGT ATG GCG CC（配列番号３６） KP125: CGC CAT GGC CGC GAG CTG AT（配列番号３７） KP126: CGA GAT CAA GCA GGG GGA GG（配列番号３８） KP127: CCC GAC CTC GAC ACC TAC AT（配列番号３９） KP128: GTA GGT GAA CCC AGC CCA GG（配列番号４０） KP129: CCC GTG GAG CCG CAT CTT GC（配列番号４１） KP130: GCA CTT GTC TCC GTC CGC CG（配列番号４２） KP131: GCG CTC TAG CCA CAT CGC CA（配列番号４３） KP132: TGG CGG GCG TCC AAC AGG CA（配列番号４４） KP133: GCT GCC ACT CGA CGT CCT GC（配列番号４５） KP134: CGG TCG GCA ATC GCG GTG TC（配列番号４６） KP135: TCC GAG GTA GCG GCG GCC TT（配列番号４７） KP136: GAT GAA GTC CTG CGC GCG GT（配列番号４８） KP137: TCT CTC GAT GCC CGT CGG CG（配列番号４９） KP138: CGC AGG TCA GCC GCC AGA AC（配列番号５０） KP139: CCT GCT CCA GCT GCT CGT TC（配列番号５１） KP140: GGG GTG AAG TTC TAC CGC GG（配列番号５２） KP141: ACT GGT CGT GGC GCC CGA AC（配列番号５３） KP142: CTC ACC CGT CGT CAG GCG GT（配列番号５４） KP143: GTG GGG GTT GAT GCG CTC TG（配列番号５５） KP144: GGA TCA GGT GCA CCA CGC AG（配列番号５６） KP145: GAC CAA CTG CGG GCT GAA CG（配列番号５７） KP146: GGT GAC CCG CAC CGA CAC CT（配列番号５８） KP201: AGC TCG CCC GCT GCG AGA TC（配列番号５９） KP202: GCG CAG ACA CTC CGC GGA AC（配列番号６０） KP203: TGA CCG CCT TGA TCA CGC CG（配列番号６１） KP204: GCG AGA AGA CGT CCT TCC GC（配列番号６２） KP205: CGG ACC TGG ACA GCG AGG AG（配列番号６３） KP206: CCA CCG GAG GTG TAG AAG CC（配列番号６４） KP207: GCC GAG CAC ACC CTG CAG GA（配列番号６５） KP208: ACG GCG GCA TCT CGT AGC CG（配列番号６６） KP209: TTC GCC ATC GCG CGC ACC GA（配列番号６７） KP210: AGA CGG TTA GGT CGA CTC CG（配列番号６８） KP211: TCG AGA GCG TCC ACC GAG AC（配列番号６９） KP212: CCG AAC TGC TCC TGC TCG AC（配列番号７０） KP213: CGC GTA GGA GAT CCT TGG CC（配列番号７１） KP214: GCC GAG TGG TTC GTG CGC CA（配列番号７２） KP215: CCG GTT CCT GCC GTG GGT CT（配列番号７３） KP216: CCG ACG GCT TGA GCA CCA CG（配列番号７４） KP216-2: GGT TGA CCG CGC GAT GCG CA（配列番号７
５） KP217: CGT CGA GCG ACC CGA CAA CC（配列番号７６） KP218: TCC GTA TGT CGC CGC GAC GG（配列番号７７） KP219: CCA GTA GCG CTC GTT CGG CT（配列番号７８） KP220: GAC TTC GCC GAC ACC CGC CA（配列番号７９） KP221: ACC CCT TGA GGT TCT CCG CG（配列番号８０） KP222: ACC GGT GGA CAG GGT CCG TC（配列番号８１） KP223: GTA CGA GGC GAA CGC AGC CG（配列番号８２） KP224: TCG GAT CGC CGC AGG ACC GT（配列番号８３） KP225: GGA CGA TCC ACT GTG GTC GC（配列番号８４） KP226: CAA CGT CGG GCC GGC AAG GT（配列番号８５） KP227: TCA ACC ACC CCG ACC GAG TG（配列番号８６） KP228: AGT GCT CCT GCA GGT CGG CG（配列番号８７） KP229: AAG GGC AGC CGC CGA CTC TC（配列番号８８） KP230: TAC GAG GTC CGC CTC GCC TC（配列番号８９） KP231: CTG CGT GGT GCA CCT GAT CC（配列番号９０） KP232: GCG CAT CGT ACC TGC GAT CG（配列番号９１） KP233: CCC CCA CCT CTG ACA ACC GG（配列番号９２） KP234: GAT CCG GCG CTC CAT CCA GG（配列番号９３） KP235: GGG CGG ACC GAT CTA CGG AC（配列番号９４） KP236: TCC GCC CAC TTT CCG CCC AC（配列番号９５） KP237: CTC GTC GGC CGT GAT GTC GG（配列番号９６） KP238: CGG TTC GCT GTA CCC CGA GT（配列番号９７） KP239: TTC GTC ACC AGC GAC GCC CA（配列番号９８） KP240: CGG CGA GGA GGT GAC CGA AC（配列番号９９） KP241: ACG GGC GTT TGC AGG ACG TC（配列番号１０
０） KP301: CTC TCG TCG TCG GCG TCC TC（配列番号１０
１） KP302: GCT CGA CGA CCA TGG CGC AC（配列番号１０
２） KP303: GTG CCG GAG GCT GGC GAC TA（配列番号１０
３） KP304: GTA CTC CTC GCT CCA CGG AC（配列番号１０
４）
５） KP217: CGT CGA GCG ACC CGA CAA CC（配列番号７６） KP218: TCC GTA TGT CGC CGC GAC GG（配列番号７７） KP219: CCA GTA GCG CTC GTT CGG CT（配列番号７８） KP220: GAC TTC GCC GAC ACC CGC CA（配列番号７９） KP221: ACC CCT TGA GGT TCT CCG CG（配列番号８０） KP222: ACC GGT GGA CAG GGT CCG TC（配列番号８１） KP223: GTA CGA GGC GAA CGC AGC CG（配列番号８２） KP224: TCG GAT CGC CGC AGG ACC GT（配列番号８３） KP225: GGA CGA TCC ACT GTG GTC GC（配列番号８４） KP226: CAA CGT CGG GCC GGC AAG GT（配列番号８５） KP227: TCA ACC ACC CCG ACC GAG TG（配列番号８６） KP228: AGT GCT CCT GCA GGT CGG CG（配列番号８７） KP229: AAG GGC AGC CGC CGA CTC TC（配列番号８８） KP230: TAC GAG GTC CGC CTC GCC TC（配列番号８９） KP231: CTG CGT GGT GCA CCT GAT CC（配列番号９０） KP232: GCG CAT CGT ACC TGC GAT CG（配列番号９１） KP233: CCC CCA CCT CTG ACA ACC GG（配列番号９２） KP234: GAT CCG GCG CTC CAT CCA GG（配列番号９３） KP235: GGG CGG ACC GAT CTA CGG AC（配列番号９４） KP236: TCC GCC CAC TTT CCG CCC AC（配列番号９５） KP237: CTC GTC GGC CGT GAT GTC GG（配列番号９６） KP238: CGG TTC GCT GTA CCC CGA GT（配列番号９７） KP239: TTC GTC ACC AGC GAC GCC CA（配列番号９８） KP240: CGG CGA GGA GGT GAC CGA AC（配列番号９９） KP241: ACG GGC GTT TGC AGG ACG TC（配列番号１０
０） KP301: CTC TCG TCG TCG GCG TCC TC（配列番号１０
１） KP302: GCT CGA CGA CCA TGG CGC AC（配列番号１０
２） KP303: GTG CCG GAG GCT GGC GAC TA（配列番号１０
３） KP304: GTA CTC CTC GCT CCA CGG AC（配列番号１０
４）
【００５０】その結果、これまでに決定されていた16.8
kb領域（EMBL/GenBank/DDBJ 受託番号AB000735）に加
え、この領域に隣接し且つpMKT177およびpMKT203に包含
される24.7kb領域の塩基配列を明らかにした。得られた
塩基配列を、BLAST2.0（Altschulら、Nucleic Acid Re
s., 25, 3389-3402 (1997)）を用いて解析し、公知のタ
ンパク質及びオープンリーディングフレームのアミノ酸
配列（SwissProt, DDBJ/GenBank/EMBL）との相同性を調
べた結果、この24.7kbの領域には、公知の芳香族ジヒド
ロジオール脱水素酵素、芳香族ジオール酸素添加（メタ
開裂）酵素、ヒドラターゼ-アルドラーゼ及びアルデヒ
ド・デヒドロゲナーゼとそれぞれ有意な相同性を示す産
物をコードし得る遺伝子が見い出された。
kb領域（EMBL/GenBank/DDBJ 受託番号AB000735）に加
え、この領域に隣接し且つpMKT177およびpMKT203に包含
される24.7kb領域の塩基配列を明らかにした。得られた
塩基配列を、BLAST2.0（Altschulら、Nucleic Acid Re
s., 25, 3389-3402 (1997)）を用いて解析し、公知のタ
ンパク質及びオープンリーディングフレームのアミノ酸
配列（SwissProt, DDBJ/GenBank/EMBL）との相同性を調
べた結果、この24.7kbの領域には、公知の芳香族ジヒド
ロジオール脱水素酵素、芳香族ジオール酸素添加（メタ
開裂）酵素、ヒドラターゼ-アルドラーゼ及びアルデヒ
ド・デヒドロゲナーゼとそれぞれ有意な相同性を示す産
物をコードし得る遺伝子が見い出された。
【００５１】そこで、芳香族ジヒドロジオール脱水素酵
素遺伝子と相同の産物をコードし得る遺伝子をphdE（そ
の塩基配列を配列番号１、産物であるタンパク質のアミ
ノ酸配列を配列番号２とする）、芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素と相同の産物をコードし得る遺伝子
をphdF（塩基配列：配列番号３、アミノ酸配列：配列番
号４）、ヒドラターゼ-アルドラーゼと相同の産物をコ
ードし得る遺伝子をphdG（塩基配列：配列番号５、アミ
ノ酸配列：配列番号６）、そしてアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼと相同の産物をコードし得る遺伝子をphdH（塩
基配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号８）と名
付けた。
素遺伝子と相同の産物をコードし得る遺伝子をphdE（そ
の塩基配列を配列番号１、産物であるタンパク質のアミ
ノ酸配列を配列番号２とする）、芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素と相同の産物をコードし得る遺伝子
をphdF（塩基配列：配列番号３、アミノ酸配列：配列番
号４）、ヒドラターゼ-アルドラーゼと相同の産物をコ
ードし得る遺伝子をphdG（塩基配列：配列番号５、アミ
ノ酸配列：配列番号６）、そしてアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼと相同の産物をコードし得る遺伝子をphdH（塩
基配列：配列番号７、アミノ酸配列：配列番号８）と名
付けた。
【００５２】さらに、配列番号２のアミノ酸配列で表わ
されるタンパク質について、既知のタンパク質とのホモ
ロジー検索を行なったところ、最も相同性の高いものは
Burkholderia sp. RP007の PhnBであり、その相同性は
５６％であった。同様にして、配列番号４のアミノ酸配
列で表わされるタンパク質と最も相同性が高いものはRh
odococcus erythropolis TA421の BphC5で４１％、配列
番号６のアミノ酸配列で表わされるタンパク質と最も相
同性が高いものは Alcaligenes faecalis AFK2の PhnE
で３８％、さらに配列番号８のアミノ酸配列で表わされ
るタンパク質と最も相同性が高いものは Streptomyces
coelicolor A3(2)の SC9B5.08遺伝子産物で４２％であ
った。
されるタンパク質について、既知のタンパク質とのホモ
ロジー検索を行なったところ、最も相同性の高いものは
Burkholderia sp. RP007の PhnBであり、その相同性は
５６％であった。同様にして、配列番号４のアミノ酸配
列で表わされるタンパク質と最も相同性が高いものはRh
odococcus erythropolis TA421の BphC5で４１％、配列
番号６のアミノ酸配列で表わされるタンパク質と最も相
同性が高いものは Alcaligenes faecalis AFK2の PhnE
で３８％、さらに配列番号８のアミノ酸配列で表わされ
るタンパク質と最も相同性が高いものは Streptomyces
coelicolor A3(2)の SC9B5.08遺伝子産物で４２％であ
った。
【００５３】［実施例５］芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素（PhdE）産生プラス
ミドの作製 コスミドクローンpMKT203を制限酵素BamHIとMluIで切断
して得た2.1 kb のBamHI-MluI ＤＮＡ断片（phdE遺伝子
及びphdF遺伝子全領域を含む）（配列を図１及び図２に
示す）を、BamHIとMluIで切断したベクターpSL301に連
結してpKM222を作製した。
ミドの作製 コスミドクローンpMKT203を制限酵素BamHIとMluIで切断
して得た2.1 kb のBamHI-MluI ＤＮＡ断片（phdE遺伝子
及びphdF遺伝子全領域を含む）（配列を図１及び図２に
示す）を、BamHIとMluIで切断したベクターpSL301に連
結してpKM222を作製した。
【００５４】phdE遺伝子の開始コドンにNdeI部位を導入
し、終止コドンの下流にEcoRI部位を導入するため、下
記のプライマー PE528(配列番号１０５)とPE331（配列
番号１０６）を用いて、MluIで切断したpKM222を鋳型と
してＰＣＲ反応を行った。使用したＰＣＲ条件は次の通
りである：Takara PCR thermal cycler MPにて96℃1
分、60℃1分、72℃2分、30サイクル。増幅した0.86 kb
断片をNdeIとEcoRIで切断して0.84 kbの断片とし、NdeI
とEcoRIで切断したT7発現ベクターpT7-7(BglIIX) に連
結させてpHE121を作製した。
し、終止コドンの下流にEcoRI部位を導入するため、下
記のプライマー PE528(配列番号１０５)とPE331（配列
番号１０６）を用いて、MluIで切断したpKM222を鋳型と
してＰＣＲ反応を行った。使用したＰＣＲ条件は次の通
りである：Takara PCR thermal cycler MPにて96℃1
分、60℃1分、72℃2分、30サイクル。増幅した0.86 kb
断片をNdeIとEcoRIで切断して0.84 kbの断片とし、NdeI
とEcoRIで切断したT7発現ベクターpT7-7(BglIIX) に連
結させてpHE121を作製した。
【００５５】また、phdE遺伝子配列中４番目のMetコド
ンが主要な開始コドンである可能性もあるので、これを
開始コドンとする発現プラスミド(pHE113)も作製した：
即ち、下記のプライマー PE527(配列番号１０７)とPE33
1(配列番号１０６)を用いて、MluIで切断したpKM222を
鋳型にＰＣＲ反応を行った。使用したＰＣＲ条件は上記
pHE121作製時と同様である。増幅した0.85 kb断片をNde
IとEcoRIで切断して0.83 kbの断片とし、NdeIとEcoRIで
切断したT7発現ベクターpT7-7(BglIIX) に連結させてpH
E113を作製した。
ンが主要な開始コドンである可能性もあるので、これを
開始コドンとする発現プラスミド(pHE113)も作製した：
即ち、下記のプライマー PE527(配列番号１０７)とPE33
1(配列番号１０６)を用いて、MluIで切断したpKM222を
鋳型にＰＣＲ反応を行った。使用したＰＣＲ条件は上記
pHE121作製時と同様である。増幅した0.85 kb断片をNde
IとEcoRIで切断して0.83 kbの断片とし、NdeIとEcoRIで
切断したT7発現ベクターpT7-7(BglIIX) に連結させてpH
E113を作製した。
【００５６】大腸菌BL21(DE3)株（Studierら、Methods
Enzymol., 185, 60-89 (1991)）にpHE121またはpHE113
をカルシウム法にて導入し、37℃で100 μg/mlのアンピ
シリンを添加したLB液体培地で振とう培養した。菌体濃
度がOD600nm = 0.5の時、IPTG（isopropyl s-D-thiogal
actopyranoside）を添加（最終濃度1 mM）し、更に37℃
で5時間培養した。集菌して全菌体タンパク質をSDS-PAG
E（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elect
rophoresis）にて分画し、コマジー・ブリリアント・ブ
ルーで染色すると、各々の菌体において、phdE遺伝子産
物（芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素）と予想される
分子量を持つタンパク質のバンドの出現が認められた。
従って、pHE121及びpHE113はT7プロモーターの支配下で
phdE遺伝子を発現する。一方、pT7-7(BglIIX)を導入し
たBL21(DE3)株では、このバンドは認められなかった。
尚、T7発現ベクターpT7-7(BglIIX) は、pT7-7（Ausubel
ら、(編), Current Protocols in Molecular Biology,
Chap. 16 (1990)）をBglIIで切断し、T4 ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理した後に自己連結させてBglII部位を破壊
したものである。
Enzymol., 185, 60-89 (1991)）にpHE121またはpHE113
をカルシウム法にて導入し、37℃で100 μg/mlのアンピ
シリンを添加したLB液体培地で振とう培養した。菌体濃
度がOD600nm = 0.5の時、IPTG（isopropyl s-D-thiogal
actopyranoside）を添加（最終濃度1 mM）し、更に37℃
で5時間培養した。集菌して全菌体タンパク質をSDS-PAG
E（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel elect
rophoresis）にて分画し、コマジー・ブリリアント・ブ
ルーで染色すると、各々の菌体において、phdE遺伝子産
物（芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素）と予想される
分子量を持つタンパク質のバンドの出現が認められた。
従って、pHE121及びpHE113はT7プロモーターの支配下で
phdE遺伝子を発現する。一方、pT7-7(BglIIX)を導入し
たBL21(DE3)株では、このバンドは認められなかった。
尚、T7発現ベクターpT7-7(BglIIX) は、pT7-7（Ausubel
ら、(編), Current Protocols in Molecular Biology,
Chap. 16 (1990)）をBglIIで切断し、T4 ＤＮＡポリメ
ラーゼで処理した後に自己連結させてBglII部位を破壊
したものである。
【００５７】pHE121及びpHE113のＰＣＲ断片に由来する
領域の塩基配列をT7プライマー及びT3プライマーを用い
て確認したところ、予想されたとおりの配列であり変異
は認められなかった。なお、シークエンス反応は、Dye
terminator cycle sequencing kit（パーキンエルマー
社）を用い、Takara PCR thermal cycler MPにて96℃10
秒、50℃5秒、60℃4分で25サイクル行なった。塩基配列
の解析は、373A DNA sequencer（パーキンエルマー社）
で行なった。
領域の塩基配列をT7プライマー及びT3プライマーを用い
て確認したところ、予想されたとおりの配列であり変異
は認められなかった。なお、シークエンス反応は、Dye
terminator cycle sequencing kit（パーキンエルマー
社）を用い、Takara PCR thermal cycler MPにて96℃10
秒、50℃5秒、60℃4分で25サイクル行なった。塩基配列
の解析は、373A DNA sequencer（パーキンエルマー社）
で行なった。
【００５８】
【００５９】［実施例６］芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵素（PhdF）産生
プラスミドの作製 phdF遺伝子の開始コドンにNdeI部位を導入し、終止コド
ンの下流にBamHI部位を導入するため、下記のプライマ
ー PF547(配列番号１０８)とPF330(配列番号１０９)を
用いて、実施例５と同様にMluIで切断したpKM222を鋳型
としてＰＣＲ反応を行った。
プラスミドの作製 phdF遺伝子の開始コドンにNdeI部位を導入し、終止コド
ンの下流にBamHI部位を導入するため、下記のプライマ
ー PF547(配列番号１０８)とPF330(配列番号１０９)を
用いて、実施例５と同様にMluIで切断したpKM222を鋳型
としてＰＣＲ反応を行った。
【００６０】増幅した0.93 kb断片をNdeIとBamHIで切断
して0.9 kbの断片とし、NdeIとBamHIで切断したT7発現
ベクターpT7-7(BglIIX)に連結させてpHF111を作製し
た。このプラスミドはT7プロモーターの支配下でphdF遺
伝子を発現する。発現の確認は実施例５と同様にして行
なった。pHF111のＰＣＲ断片に由来する領域の塩基配列
を実施例５と同様にして確認したところ、予想されたと
おりの配列であり、変異は認められなかった。
して0.9 kbの断片とし、NdeIとBamHIで切断したT7発現
ベクターpT7-7(BglIIX)に連結させてpHF111を作製し
た。このプラスミドはT7プロモーターの支配下でphdF遺
伝子を発現する。発現の確認は実施例５と同様にして行
なった。pHF111のＰＣＲ断片に由来する領域の塩基配列
を実施例５と同様にして確認したところ、予想されたと
おりの配列であり、変異は認められなかった。
【００６１】
【００６２】［実施例７］芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵素の多量産生 大腸菌BL21(DE3)株（Studierら、Methods Enzymol., 18
5, 60-89 (1991)）に実施例６で作製したpHF111をカル
シウム法により導入し、100 μg/mLのアンピシリンを添
加したLB液体培地で振とう培養（37℃24時間）した。培
養の後に集菌し、全菌体タンパク質をSDS-PAGE（ドデシ
ル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
にて分画し、コマジー・ブリリアント・ブルーで染色す
ると、phdF遺伝子産物（芳香族ジオール酸素添加（メタ
開裂）酵素）と予想される分子量の位置に太いバンドが
認められた。一方、pT7-7(BglIIX)を導入したBL21(DE3)
株では、このバンドは認められなかった。また、菌体濃
度がOD 600 nm = 0.5の時、IPTG（イソプロピル-D-チオ
ガラクトピラノシド）を添加（最終濃度1 mM）すると、
前記酵素の産生量は更に増加した。
5, 60-89 (1991)）に実施例６で作製したpHF111をカル
シウム法により導入し、100 μg/mLのアンピシリンを添
加したLB液体培地で振とう培養（37℃24時間）した。培
養の後に集菌し、全菌体タンパク質をSDS-PAGE（ドデシ
ル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動）
にて分画し、コマジー・ブリリアント・ブルーで染色す
ると、phdF遺伝子産物（芳香族ジオール酸素添加（メタ
開裂）酵素）と予想される分子量の位置に太いバンドが
認められた。一方、pT7-7(BglIIX)を導入したBL21(DE3)
株では、このバンドは認められなかった。また、菌体濃
度がOD 600 nm = 0.5の時、IPTG（イソプロピル-D-チオ
ガラクトピラノシド）を添加（最終濃度1 mM）すると、
前記酵素の産生量は更に増加した。
【００６３】［実施例８］芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵素遺伝子の芳香
族ジオール変換活性 pHF111（実施例６）を導入した大腸菌BL21(DE3)株を100
μg/mLのアンピシリンを添加した100 mlのLB液体培地
に植菌し、37℃で24時間振とう培養した。10,000×gで5
分間遠心して集菌し、この菌体を20 mMリン酸緩衝液（p
H7.0）に浮遊させた。再度10,000×gで5分間遠心して集
菌した後、新たな20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮遊さ
せ、菌体濃度をOD 600 nm = 30とした。
族ジオール変換活性 pHF111（実施例６）を導入した大腸菌BL21(DE3)株を100
μg/mLのアンピシリンを添加した100 mlのLB液体培地
に植菌し、37℃で24時間振とう培養した。10,000×gで5
分間遠心して集菌し、この菌体を20 mMリン酸緩衝液（p
H7.0）に浮遊させた。再度10,000×gで5分間遠心して集
菌した後、新たな20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮遊さ
せ、菌体濃度をOD 600 nm = 30とした。
【００６４】この菌体浮遊液10 mlに3,4-ジヒドロキシ
フェナントレンを最終濃度が10 mMとなるように加え、2
5℃で20分反応させた。等量のメタノールを加えてよく
混ぜた後、12,000×gで10分間遠心した。さらに、この
遠心上清を逆相カラムTSKゲル ODS-80Ts（東ソー）を用
いてHPLCにて分画（流速, 1 ml/分; 移動相, 20分まで6
0%メタノール, 以後90％メタノール）したところ、3,4-
ジヒドロキシフェナントレンから変換され、生成したと
考えられる多量の産物が認められ、一方、3,4-ジヒドロ
キシフェナントレンは認められなかった。一方、pT7-7
(BglIIX)を導入したBL21(DE3)株ではこの変換活性は認
められなかった。
フェナントレンを最終濃度が10 mMとなるように加え、2
5℃で20分反応させた。等量のメタノールを加えてよく
混ぜた後、12,000×gで10分間遠心した。さらに、この
遠心上清を逆相カラムTSKゲル ODS-80Ts（東ソー）を用
いてHPLCにて分画（流速, 1 ml/分; 移動相, 20分まで6
0%メタノール, 以後90％メタノール）したところ、3,4-
ジヒドロキシフェナントレンから変換され、生成したと
考えられる多量の産物が認められ、一方、3,4-ジヒドロ
キシフェナントレンは認められなかった。一方、pT7-7
(BglIIX)を導入したBL21(DE3)株ではこの変換活性は認
められなかった。
【００６５】この新たに生成した物質は、3,4-ジヒドロ
キシフェナントレンよりリテンションタイムが明らかに
短くなっており、容易に分取精製することができた。
（フラコレを使わず手で分取）この画分を乾燥させた
後、d4-メタノールに溶解させて、1H NMRおよび13C NMR
等にて解析したところ、新規物質2-ヒドロキシ-2H-ナフ
トール[1,2-b]ピラン-2-カルボン酸であることが明らか
になった。
キシフェナントレンよりリテンションタイムが明らかに
短くなっており、容易に分取精製することができた。
（フラコレを使わず手で分取）この画分を乾燥させた
後、d4-メタノールに溶解させて、1H NMRおよび13C NMR
等にて解析したところ、新規物質2-ヒドロキシ-2H-ナフ
トール[1,2-b]ピラン-2-カルボン酸であることが明らか
になった。
【００６６】なお、pHF111を導入したBL21(DE3)株は、
1,2-ジヒドロキシナフタレン、2,3-ジヒドロキシビフェ
ニル、カテコール、3-メチルカテコール、4-メチルカテ
コール及び4-エチルカテコールに対する開裂変換活性を
も示した。
1,2-ジヒドロキシナフタレン、2,3-ジヒドロキシビフェ
ニル、カテコール、3-メチルカテコール、4-メチルカテ
コール及び4-エチルカテコールに対する開裂変換活性を
も示した。
【００６７】［実施例９］ヒドラターゼ-アルドラーゼ（PhdG）産生プラスミドの
作製 pMKT203をBglIIとXbaIで切断して得た2.6 kbのBglII-Xb
aI ＤＮＡ断片（phdG遺伝子及びphdH遺伝子全領域を含
む）(配列を図３および図４に示す)を、BglIIとXbaIで
切断したpSL301に連結してpKX3251を作製した。phdG遺
伝子の開始コドン上流にBamHI部位、開始コドンにNdeI
部位そして終止コドンの下流にXbaI部位を導入するた
め、下記のプライマー PG551(配列番号１１０)とPG333
(配列番号１１１)を用いて、pKX3251を鋳型として実施
例５と同様にＰＣＲ反応を行った。
作製 pMKT203をBglIIとXbaIで切断して得た2.6 kbのBglII-Xb
aI ＤＮＡ断片（phdG遺伝子及びphdH遺伝子全領域を含
む）(配列を図３および図４に示す)を、BglIIとXbaIで
切断したpSL301に連結してpKX3251を作製した。phdG遺
伝子の開始コドン上流にBamHI部位、開始コドンにNdeI
部位そして終止コドンの下流にXbaI部位を導入するた
め、下記のプライマー PG551(配列番号１１０)とPG333
(配列番号１１１)を用いて、pKX3251を鋳型として実施
例５と同様にＰＣＲ反応を行った。
【００６８】増幅した 1.12 kb断片をBamHIとXbaIで切
断して 1.11 kbの断片とし、BamHIとXbaIで切断したT7
発現ベクターpT7-7(BgXX) に連結させてpHG101xを作製
した。pT7-7(BgXX) はpT7-7(BglIIX)（実施例５）を改
変したもので、2箇所あるXbaI部位のうちT7プロモータ
ー近傍のXbaI部位のみを破壊したものであり、マルチク
ローニング部位内のXbaI部位は存在している。
断して 1.11 kbの断片とし、BamHIとXbaIで切断したT7
発現ベクターpT7-7(BgXX) に連結させてpHG101xを作製
した。pT7-7(BgXX) はpT7-7(BglIIX)（実施例５）を改
変したもので、2箇所あるXbaI部位のうちT7プロモータ
ー近傍のXbaI部位のみを破壊したものであり、マルチク
ローニング部位内のXbaI部位は存在している。
【００６９】次に、pHG101xをNdeIとHindIIIで切断し、
phdG遺伝子を含む1.11 kbのNdeI-HindIII ＤＮＡ断片
を、NdeIとHindIIIで切断したpT7-7(BglIIX)（実施例
５）に連結してpHG111を作製した。このプラスミドはT7
プロモーターの支配下でphdG遺伝子を発現する。発現の
確認は実施例５と同様にして行なった。pHG111のＰＣＲ
断片に由来する領域の塩基配列を実施例５と同様にして
確認したところ、予想されたとおりの配列であり変異は
認められなかった。
phdG遺伝子を含む1.11 kbのNdeI-HindIII ＤＮＡ断片
を、NdeIとHindIIIで切断したpT7-7(BglIIX)（実施例
５）に連結してpHG111を作製した。このプラスミドはT7
プロモーターの支配下でphdG遺伝子を発現する。発現の
確認は実施例５と同様にして行なった。pHG111のＰＣＲ
断片に由来する領域の塩基配列を実施例５と同様にして
確認したところ、予想されたとおりの配列であり変異は
認められなかった。
【００７０】
【００７１】［実施例１０］ヒドラターゼ-アルドラーゼの多量産生 大腸菌BL21(DE3)株に実施例９で作製したpHG111をカル
シウム法により導入し、100 μg/mLのアンピシリンを添
加したLB液体培地で振とう培養（37℃24時間）した。培
養の後に集菌し、全菌体タンパク質をSDS-PAGEにて分画
し、コマジー・ブリリアント・ブルーで染色すると、ph
dG遺伝子産物（ヒドラターゼ-アルドラーゼ）と予想さ
れる分子量の位置に太いバンドが認められた。一方、pT
7-7(BglIIX)を導入したBL21(DE3)株では、このバンドは
認められなかった。また、菌体濃度がOD 600 nm = 0.5
の時、IPTGを添加（最終濃度1 mM）すると産生量は更に
増加した。
シウム法により導入し、100 μg/mLのアンピシリンを添
加したLB液体培地で振とう培養（37℃24時間）した。培
養の後に集菌し、全菌体タンパク質をSDS-PAGEにて分画
し、コマジー・ブリリアント・ブルーで染色すると、ph
dG遺伝子産物（ヒドラターゼ-アルドラーゼ）と予想さ
れる分子量の位置に太いバンドが認められた。一方、pT
7-7(BglIIX)を導入したBL21(DE3)株では、このバンドは
認められなかった。また、菌体濃度がOD 600 nm = 0.5
の時、IPTGを添加（最終濃度1 mM）すると産生量は更に
増加した。
【００７２】［実施例１１］ヒドラターゼ-アルドラーゼ遺伝子の環開裂産物に対す
る変換活性 ヒドラターゼ-アルドラーゼの環開裂産物に対する変換
活性を調べるため、実施例８の記載にしたがって得られ
る菌体浮遊液(メタノールを加えていない残りの反応
液：反応生成物 2-ヒドロキシ-2H-ナフトール[1,2-b]ピ
ラン-2-カルボン酸を含有する)を12,000×gで10分間遠
心して上清を採取した。
る変換活性 ヒドラターゼ-アルドラーゼの環開裂産物に対する変換
活性を調べるため、実施例８の記載にしたがって得られ
る菌体浮遊液(メタノールを加えていない残りの反応
液：反応生成物 2-ヒドロキシ-2H-ナフトール[1,2-b]ピ
ラン-2-カルボン酸を含有する)を12,000×gで10分間遠
心して上清を採取した。
【００７３】pHG111（実施例９）またはpT7-7(BglII)
（実施例５）を導入した大腸菌BL21(DE3)株を100 μg/m
Lのアンピシリンを添加した100 mlのLB液体培地に植菌
し、37℃で24時間振とう培養した。10,000×gで5分間遠
心して集菌し、菌体を50 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮
遊させ、菌体濃度をOD 600 nm = 5とした。
（実施例５）を導入した大腸菌BL21(DE3)株を100 μg/m
Lのアンピシリンを添加した100 mlのLB液体培地に植菌
し、37℃で24時間振とう培養した。10,000×gで5分間遠
心して集菌し、菌体を50 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮
遊させ、菌体濃度をOD 600 nm = 5とした。
【００７４】この菌体浮遊液10 mlを遠心管に取り、12,
000×gで10分間遠心した。得られた菌体を、上記の 2-
ヒドロキシ-2H-ナフトール[1,2-b]ピラン-2-カルボン酸
を含む遠心上清 5 mlに浮遊させ（OD 600 nm = 10）、2
5℃で6時間反応させた。等量のメタノールを加えてよく
混ぜた後、12,000×gで10分間遠心した。さらに、この
遠心上清を逆相カラムTSKゲル ODS-80Tsを用いてHPLCに
て分画（流速, 1 ml/分; 移動相, 40分まで60%メタノー
ル, 以後90％メタノール）したところ、pHG111を持つ株
では新たに生成された物質のピークが認められ、これを
分取した。
000×gで10分間遠心した。得られた菌体を、上記の 2-
ヒドロキシ-2H-ナフトール[1,2-b]ピラン-2-カルボン酸
を含む遠心上清 5 mlに浮遊させ（OD 600 nm = 10）、2
5℃で6時間反応させた。等量のメタノールを加えてよく
混ぜた後、12,000×gで10分間遠心した。さらに、この
遠心上清を逆相カラムTSKゲル ODS-80Tsを用いてHPLCに
て分画（流速, 1 ml/分; 移動相, 40分まで60%メタノー
ル, 以後90％メタノール）したところ、pHG111を持つ株
では新たに生成された物質のピークが認められ、これを
分取した。
【００７５】この精製画分について1H NMRおよび13C NM
Rにて解析したところ、2-ヒドロキシ-2H-ナフトール[1,
2-b]ピラン-2-カルボン酸から1-ヒドロキシ-2-ナフトア
ルデヒドが生成されたことが確認された。なお、pT7-7
(BglIIX)を持つ株では、有意な変換活性は認められなか
った。
Rにて解析したところ、2-ヒドロキシ-2H-ナフトール[1,
2-b]ピラン-2-カルボン酸から1-ヒドロキシ-2-ナフトア
ルデヒドが生成されたことが確認された。なお、pT7-7
(BglIIX)を持つ株では、有意な変換活性は認められなか
った。
【００７６】［実施例１２］アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（PhdH）産生プラスミド
の作製 phdH遺伝子の開始コドンにNdeI部位そして終止コドンの
下流にXbaI部位を導入するため、下記のプライマー PH5
36(配列番号１１２)とPH330(配列番号１１３)を用い
て、pKX3251（実施例９）を鋳型として実施例５と同様
にＰＣＲ反応を行った。
の作製 phdH遺伝子の開始コドンにNdeI部位そして終止コドンの
下流にXbaI部位を導入するため、下記のプライマー PH5
36(配列番号１１２)とPH330(配列番号１１３)を用い
て、pKX3251（実施例９）を鋳型として実施例５と同様
にＰＣＲ反応を行った。
【００７７】増幅した 1.49 kb断片をNdeIとXbaIで切断
して 1.47 kbの断片とし、NdeIとXbaIで切断したT7発現
ベクターpT7-7(BgXX) （実施例９）に連結させてpHH104
xxを作製した。このプラスミドはT7プロモーターの支配
下でphdH遺伝子を発現する。発現の確認は実施例５と同
様にして行なった。pHH104xxのＰＣＲ断片に由来する領
域の塩基配列を確認したところ、予想されたとおりの配
列であり変異は認められなかった。
して 1.47 kbの断片とし、NdeIとXbaIで切断したT7発現
ベクターpT7-7(BgXX) （実施例９）に連結させてpHH104
xxを作製した。このプラスミドはT7プロモーターの支配
下でphdH遺伝子を発現する。発現の確認は実施例５と同
様にして行なった。pHH104xxのＰＣＲ断片に由来する領
域の塩基配列を確認したところ、予想されたとおりの配
列であり変異は認められなかった。
【００７８】
【００７９】［実施例１３］アルデヒド・デヒドロゲナーゼの多量産生 大腸菌BL21(DE3)株に実施例１２で作製したpHH104xxを
カルシウム法により導入し、100 μg/mLのアンピシリン
を添加したLB液体培地で振とう培養（37℃24時間）し
た。培養の後に集菌し、全菌体タンパク質をSDS-PAGEに
て分画し、コマジー・ブリリアント・ブルーで染色する
と、phdH遺伝子産物（アルデヒド・デヒドロゲナーゼ）
と予想される分子量の位置に太いバンドが認められた。
一方、pT7-7(BglIIX)を導入したBL21(DE3)株では、この
バンドは認められなかった。また、菌体濃度がOD 600 n
m = 0.5の時、IPTGを添加（最終濃度1 mM）すると産生
量は更に増加した。
カルシウム法により導入し、100 μg/mLのアンピシリン
を添加したLB液体培地で振とう培養（37℃24時間）し
た。培養の後に集菌し、全菌体タンパク質をSDS-PAGEに
て分画し、コマジー・ブリリアント・ブルーで染色する
と、phdH遺伝子産物（アルデヒド・デヒドロゲナーゼ）
と予想される分子量の位置に太いバンドが認められた。
一方、pT7-7(BglIIX)を導入したBL21(DE3)株では、この
バンドは認められなかった。また、菌体濃度がOD 600 n
m = 0.5の時、IPTGを添加（最終濃度1 mM）すると産生
量は更に増加した。
【００８０】［実施例１４］pHH104xx（実施例１２）を
導入した大腸菌HB101株（Boyer および Roulland-Dusso
ix, J. Mol. Biol., 41, 459 (1969)）を100 μg/mLの
アンピシリンを添加した100 mlのLB液体培地に植菌し、
37℃で24時間振とう培養した。10,000×gで5分間遠心し
て集菌し、この菌体を20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮
遊させた。再度10,000×gで5分間遠心して集菌した後、
新たな20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮遊させ、菌体濃
度をOD600nm = 30とした。この菌体浮遊液10mlに1-ヒド
ロキシ-2-ナフトアルデヒドを最終濃度が5 mMとなるよ
うに加え、25℃で60時間反応させた。等量のメタノール
を加えてよく混ぜた後、12,000×gで10分間遠心した。
さらに、この遠心上清を逆相カラムTSKgel ODS-80Tsを
用いてHPLCにて分画（流速, 1 ml/分; 移動相, 40分ま
で60%メタノール, 以後90％メタノール）したところ、1
-ヒドロキシ-2-ナフトアルデヒドが有意に減少し、変換
産物と考えられる新たなピークが認められた。この生成
物質を分取・精製して、1HNMRおよび13C NMR等にて解析
したところ、明らかに1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸の特
徴を示した。なお、pT7-7(BglIIX)（実施例５）を導入
したHB101株では、有意な変換活性は認められなかっ
た。
導入した大腸菌HB101株（Boyer および Roulland-Dusso
ix, J. Mol. Biol., 41, 459 (1969)）を100 μg/mLの
アンピシリンを添加した100 mlのLB液体培地に植菌し、
37℃で24時間振とう培養した。10,000×gで5分間遠心し
て集菌し、この菌体を20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮
遊させた。再度10,000×gで5分間遠心して集菌した後、
新たな20 mMリン酸緩衝液（pH7.0）に浮遊させ、菌体濃
度をOD600nm = 30とした。この菌体浮遊液10mlに1-ヒド
ロキシ-2-ナフトアルデヒドを最終濃度が5 mMとなるよ
うに加え、25℃で60時間反応させた。等量のメタノール
を加えてよく混ぜた後、12,000×gで10分間遠心した。
さらに、この遠心上清を逆相カラムTSKgel ODS-80Tsを
用いてHPLCにて分画（流速, 1 ml/分; 移動相, 40分ま
で60%メタノール, 以後90％メタノール）したところ、1
-ヒドロキシ-2-ナフトアルデヒドが有意に減少し、変換
産物と考えられる新たなピークが認められた。この生成
物質を分取・精製して、1HNMRおよび13C NMR等にて解析
したところ、明らかに1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸の特
徴を示した。なお、pT7-7(BglIIX)（実施例５）を導入
したHB101株では、有意な変換活性は認められなかっ
た。
【００８１】
【発明の効果】本発明により、ノカルディオイデス属の
微生物に由来する芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素遺
伝子、芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵素遺伝
子、ヒドラターゼ-アルドラーゼ遺伝子及びアルデヒド
・デヒドロゲナーゼ遺伝子が提供される。また、本発明
の遺伝子を導入して得られる形質転換体を培養すること
により、本発明のタンパク質を得ることができる。この
タンパク質の粗抽出液又は精製物は、フェナントレンお
よびアントラセン等の多環芳香族化合物の代謝中間体を
変換する酵素試薬として極めて有用である。さらに、上
記形質転換体およびタンパク質は、バイオリアクターの
反応体としても利用することができる。
微生物に由来する芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素遺
伝子、芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵素遺伝
子、ヒドラターゼ-アルドラーゼ遺伝子及びアルデヒド
・デヒドロゲナーゼ遺伝子が提供される。また、本発明
の遺伝子を導入して得られる形質転換体を培養すること
により、本発明のタンパク質を得ることができる。この
タンパク質の粗抽出液又は精製物は、フェナントレンお
よびアントラセン等の多環芳香族化合物の代謝中間体を
変換する酵素試薬として極めて有用である。さらに、上
記形質転換体およびタンパク質は、バイオリアクターの
反応体としても利用することができる。
【００８２】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Marine Biotechnology Institute Co. Ltd. <120> Genes and Proteins Involved in the Polycyclic Aromatic Compound d egradation upper pathway. <130> P00-0144 <160> 113 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 831 <212> DNA <213> Nocardioides sp. KP7 strain <220> <221> CDS <222> (1)..(828) <223> Aromatic-dihydrodiol dehydrogenase coding gene. <400> 1 atg gag gta gct atg ggc tgg ttg gac gga cgg gta gcg ctc gtc acg 48 Met Glu Val Ala Met Gly Trp Leu Asp Gly Arg Val Ala Leu Val Thr 1 5 10 15 ggc ggt gcc tcg ggt atc gga ctg tcg gtg gtc gaa cgg ttc ctg gcc 96 Gly Gly Ala Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Val Glu Arg Phe Leu Ala 20 25 30 gag ggt gcc cga gtg gcg gtt ctc gac cgt tcg aag gag ggc gtg gag 144 Glu Gly Ala Arg Val Ala Val Leu Asp Arg Ser Lys Glu Gly Val Glu 35 40 45 aag ctc cag gac gag cat ccc ggc gcc gtc gcg ttc acc ggg gac gtg 192 Lys Leu Gln Asp Glu His Pro Gly Ala Val Ala Phe Thr Gly Asp Val 50 55 60 acc tcg ttc gag gac aat cag cag gcc gtc acg ggc gtg gtc gcc gcg 240 Thr Ser Phe Glu Asp Asn Gln Gln Ala Val Thr Gly Val Val Ala Ala 65 70 75 80 ttc ggg aag ttg gat gtc ttc gtt ggg aat gcg ggg atc ttc gac tac 288 Phe Gly Lys Leu Asp Val Phe Val Gly Asn Ala Gly Ile Phe Asp Tyr 85 90 95 ttc gcc tcg ctc gtc agc ttc gag ggg gac aag ctc ggt gcc gcg ttc 336 Phe Ala Ser Leu Val Ser Phe Glu Gly Asp Lys Leu Gly Ala Ala Phe 100 105 110 gac gag atc ttc gcg gtg aac gtc aag gcc tac ctg ctc ggg gcc agg 384 Asp Glu Ile Phe Ala Val Asn Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Ala Arg 115 120 125 gcg gcc gtc cct gaa ctg ctt aag agc gac gcc ccg agc atg atc ttc 432 Ala Ala Val Pro Glu Leu Leu Lys Ser Asp Ala Pro Ser Met Ile Phe 130 135 140 acg gtc tcg aac tca ggc ttc tac acc tcc ggt ggg ggg ccg ctg tac 480 Thr Val Ser Asn Ser Gly Phe Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Pro Leu Tyr 145 150 155 160 acg gcc tcg aag cac gcg gtg gtc ggt gtc gtg cga gaa ctg gcc tac 528 Thr Ala Ser Lys His Ala Val Val Gly Val Val Arg Glu Leu Ala Tyr 165 170 175 gag ctg gcg ccg aag atc cgg gtg aac ggg gtg gcg ccc ggc ggc acc 576 Glu Leu Ala Pro Lys Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Gly Thr 180 185 190 gtg acg gag ttg cgc ggc atc gag aag ttg ggt cag ggc aac atc gtc 624 Val Thr Glu Leu Arg Gly Ile Glu Lys Leu Gly Gln Gly Asn Ile Val 195 200 205 ctg tcg acc gtc ccc gac atc gag gac ctg atg cgc acg aac ccg ctg 672 Leu Ser Thr Val Pro Asp Ile Glu Asp Leu Met Arg Thr Asn Pro Leu 210 215 220 cag acc gcg cag cac ccg gcc gac cac gcc ggc ctc tac gtg ctg ctc 720 Gln Thr Ala Gln His Pro Ala Asp His Ala Gly Leu Tyr Val Leu Leu 225 230 235 240 gcg tcc gcc gag aac tcc agg gcc gtc acg gga gtg gtc atc aac agc 768 Ala Ser Ala Glu Asn Ser Arg Ala Val Thr Gly Val Val Ile Asn Ser 245 250 255 gac ggc ggc ctc ggc atc cgg ggc atg acc cag ctc gcc ggc gga gtc 816 Asp Gly Gly Leu Gly Ile Arg Gly Met Thr Gln Leu Ala Gly Gly Val 260 265 270 gac cta acc gtc taa 831 Asp Leu Thr Val 275 <210> 2 <211> 276 <212> PRT <213> Nocardioides sp. KP7 strain <400> 2 Met Glu Val Ala Met Gly Trp Leu Asp Gly Arg Val Ala Leu Val Thr 1 5 10 15 Gly Gly Ala Ser Gly Ile Gly Leu Ser Val Val Glu Arg Phe Leu Ala 20 25 30 Glu Gly Ala Arg Val Ala Val Leu Asp Arg Ser Lys Glu Gly Val Glu 35 40 45 Lys Leu Gln Asp Glu His Pro Gly Ala Val Ala Phe Thr Gly Asp Val 50 55 60 Thr Ser Phe Glu Asp Asn Gln Gln Ala Val Thr Gly Val Val Ala Ala 65 70 75 80 Phe Gly Lys Leu Asp Val Phe Val Gly Asn Ala Gly Ile Phe Asp Tyr 85 90 95 Phe Ala Ser Leu Val Ser Phe Glu Gly Asp Lys Leu Gly Ala Ala Phe 100 105 110 Asp Glu Ile Phe Ala Val Asn Val Lys Ala Tyr Leu Leu Gly Ala Arg 115 120 125 Ala Ala Val Pro Glu Leu Leu Lys Ser Asp Ala Pro Ser Met Ile Phe 130 135 140 Thr Val Ser Asn Ser Gly Phe Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Pro Leu Tyr 145 150 155 160 Thr Ala Ser Lys His Ala Val Val Gly Val Val Arg Glu Leu Ala Tyr 165 170 175 Glu Leu Ala Pro Lys Ile Arg Val Asn Gly Val Ala Pro Gly Gly Thr 180 185 190 Val Thr Glu Leu Arg Gly Ile Glu Lys Leu Gly Gln Gly Asn Ile Val 195 200 205 Leu Ser Thr Val Pro Asp Ile Glu Asp Leu Met Arg Thr Asn Pro Leu 210 215 220 Gln Thr Ala Gln His Pro Ala Asp His Ala Gly Leu Tyr Val Leu Leu 225 230 235 240 Ala Ser Ala Glu Asn Ser Arg Ala Val Thr Gly Val Val Ile Asn Ser 245 250 255 Asp Gly Gly Leu Gly Ile Arg Gly Met Thr Gln Leu Ala Gly Gly Val 260 265 270 Asp Leu Thr Val 275 <210> 3 <211> 891 <212> DNA <213> Nocardioides sp. KP7 strain <220> <221> CDS <222> (1)..(888) <223> Aromatic- diol oxygenase coding gene. <400> 3 atg cta gcg aga tcg ttg gga tat gtg gcc gtt gcg tct ccg gac gcc 48 Met Leu Ala Arg Ser Leu Gly Tyr Val Ala Val Ala Ser Pro Asp Ala 1 5 10 15 aag cag tgg ctc gag ttc ggc ccc gag gtc ctc ggg atg cag gcg gtc 96 Lys Gln Trp Leu Glu Phe Gly Pro Glu Val Leu Gly Met Gln Ala Val 20 25 30 gag gcg gac gct ggc aca gtg cta ctg cgg atg gac gac acc gac cat 144 Glu Ala Asp Ala Gly Thr Val Leu Leu Arg Met Asp Asp Thr Asp His 35 40 45 cgc atc gcc gtg cac cat ggt gag cgc aac cgt atg ttg tac gcg ggt 192 Arg Ile Ala Val His His Gly Glu Arg Asn Arg Met Leu Tyr Ala Gly 50 55 60 tgg gac gtc ggc agc gag gac gcg ctc gac gcc gcc ggc gag ctc ctg 240 Trp Asp Val Gly Ser Glu Asp Ala Leu Asp Ala Ala Gly Glu Leu Leu 65 70 75 80 cgt gag cgg ggt atc gcg ttc gag acc ggt acc gac gag gag cgg gcc 288 Arg Glu Arg Gly Ile Ala Phe Glu Thr Gly Thr Asp Glu Glu Arg Ala 85 90 95 gcg cgc ggg gtg ctt gga ttc ctc gcg atc gag gac ccg tcg ggg ctg 336 Ala Arg Gly Val Leu Gly Phe Leu Ala Ile Glu Asp Pro Ser Gly Leu 100 105 110 cgg cac gag ctg ttc tac ggg cag aag gtc gtg ccc ggg tcc ttc cag 384 Arg His Glu Leu Phe Tyr Gly Gln Lys Val Val Pro Gly Ser Phe Gln 115 120 125 ccc gga cgg ccg atg tcc cga ttt atc acc ggt ccg cag ggc ctc ggc 432 Pro Gly Arg Pro Met Ser Arg Phe Ile Thr Gly Pro Gln Gly Leu Gly 130 135 140 cat ctg gta ctc gcc acg cct gac ctc aag cgg tcc gac cgg ttc ctg 480 His Leu Val Leu Ala Thr Pro Asp Leu Lys Arg Ser Asp Arg Phe Leu 145 150 155 160 cag ggt gtg ctc ggc ttc aag aag agc gat gag atc tac acg ttc att 528 Gln Gly Val Leu Gly Phe Lys Lys Ser Asp Glu Ile Tyr Thr Phe Ile 165 170 175 gac ctg tgg ttc tat cac tgc aat ccc cgc cat cac agc ctc gcc ctg 576 Asp Leu Trp Phe Tyr His Cys Asn Pro Arg His His Ser Leu Ala Leu 180 185 190 acc ccc atg ccc ggc gtg cgc gga ctg cac cac gtg atg gtc gag gtg 624 Thr Pro Met Pro Gly Val Arg Gly Leu His His Val Met Val Glu Val 195 200 205 gcc gag ttc gac gac gtc ggg atc gcc tac gac ctc tgt atg tct cgg 672 Ala Glu Phe Asp Asp Val Gly Ile Ala Tyr Asp Leu Cys Met Ser Arg 210 215 220 aag atc ccg ctg agc atg acg ctc ggc cgc cac gtg aac gac cgg atg 720 Lys Ile Pro Leu Ser Met Thr Leu Gly Arg His Val Asn Asp Arg Met 225 230 235 240 gtc tcg ttc tac gtg cgg acg ccg ggt ggg ttc gac ctc gag tac ggc 768 Val Ser Phe Tyr Val Arg Thr Pro Gly Gly Phe Asp Leu Glu Tyr Gly 245 250 255 tgg ggc gcg gtc acc gtc gac gac gag acg tgg acg gtc gcc cag tac 816 Trp Gly Ala Val Thr Val Asp Asp Glu Thr Trp Thr Val Ala Gln Tyr 260 265 270 gac cga ccg agt gtg tgg ggc cac cag atg gtg gcc cag acg ccg ccg 864 Asp Arg Pro Ser Val Trp Gly His Gln Met Val Ala Gln Thr Pro Pro 275 280 285 ggg gct ctc gag gcc gta acg acg tga 891 Gly Ala Leu Glu Ala Val Thr Thr 290 295 <210> 4 <211> 296 <212> PRT <213> Nocardioides sp. KP7 strain <400> 4 Met Leu Ala Arg Ser Leu Gly Tyr Val Ala Val Ala Ser Pro Asp Ala 1 5 10 15 Lys Gln Trp Leu Glu Phe Gly Pro Glu Val Leu Gly Met Gln Ala Val 20 25 30 Glu Ala Asp Ala Gly Thr Val Leu Leu Arg Met Asp Asp Thr Asp His 35 40 45 Arg Ile Ala Val His His Gly Glu Arg Asn Arg Met Leu Tyr Ala Gly 50 55 60 Trp Asp Val Gly Ser Glu Asp Ala Leu Asp Ala Ala Gly Glu Leu Leu 65 70 75 80 Arg Glu Arg Gly Ile Ala Phe Glu Thr Gly Thr Asp Glu Glu Arg Ala 85 90 95 Ala Arg Gly Val Leu Gly Phe Leu Ala Ile Glu Asp Pro Ser Gly Leu 100 105 110 Arg His Glu Leu Phe Tyr Gly Gln Lys Val Val Pro Gly Ser Phe Gln 115 120 125 Pro Gly Arg Pro Met Ser Arg Phe Ile Thr Gly Pro Gln Gly Leu Gly 130 135 140 His Leu Val Leu Ala Thr Pro Asp Leu Lys Arg Ser Asp Arg Phe Leu 145 150 155 160 Gln Gly Val Leu Gly Phe Lys Lys Ser Asp Glu Ile Tyr Thr Phe Ile 165 170 175 Asp Leu Trp Phe Tyr His Cys Asn Pro Arg His His Ser Leu Ala Leu 180 185 190 Thr Pro Met Pro Gly Val Arg Gly Leu His His Val Met Val Glu Val 195 200 205 Ala Glu Phe Asp Asp Val Gly Ile Ala Tyr Asp Leu Cys Met Ser Arg 210 215 220 Lys Ile Pro Leu Ser Met Thr Leu Gly Arg His Val Asn Asp Arg Met 225 230 235 240 Val Ser Phe Tyr Val Arg Thr Pro Gly Gly Phe Asp Leu Glu Tyr Gly 245 250 255 Trp Gly Ala Val Thr Val Asp Asp Glu Thr Trp Thr Val Ala Gln Tyr 260 265 270 Asp Arg Pro Ser Val Trp Gly His Gln Met Val Ala Gln Thr Pro Pro 275 280 285 Gly Ala Leu Glu Ala Val Thr Thr 290 295 <210> 5 <211> 1077 <212> DNA <213> Nocardioides sp. KP7 strain <220> <221> CDS <222> (1)..(1074) <223> Hydratase-aldorase coding gene. <400> 5 gtg aca cgc agg aca aac acg ctt gta ccg agt gac atg aag ggg ttg 48 Met Thr Arg Arg Thr Asn Thr Leu Val Pro Ser Asp Met Lys Gly Leu 1 5 10 15 tgg gcg ttc gta ccg gcc tgc tcg acc ccg gac gcg gcg gat gtc aac 96 Trp Ala Phe Val Pro Ala Cys Ser Thr Pro Asp Ala Ala Asp Val Asn 20 25 30 gcc gtc aac acg atc gac acc gaa gca ttg ctg tcc ctc gtc gac cgc 144 Ala Val Asn Thr Ile Asp Thr Glu Ala Leu Leu Ser Leu Val Asp Arg 35 40 45 ctg gtg cgc gac ggc gcc gac ggc atc gtc acc acc ggt agt gcc ggc 192 Leu Val Arg Asp Gly Ala Asp Gly Ile Val Thr Thr Gly Ser Ala Gly 50 55 60 gag tcg cac acc ctc acc acc gag gag tac cgc acg ctg gtg gcc acc 240 Glu Ser His Thr Leu Thr Thr Glu Glu Tyr Arg Thr Leu Val Ala Thr 65 70 75 80 gta gtg gag acg gtt aac ggg cgg gtt ccg gtg ttt gtc ggg gcc agc 288 Val Val Glu Thr Val Asn Gly Arg Val Pro Val Phe Val Gly Ala Ser 85 90 95 acg ctg aac acc cgc gat tcg atc gag cgt gcc cgg ctc atc gcc gac 336 Thr Leu Asn Thr Arg Asp Ser Ile Glu Arg Ala Arg Leu Ile Ala Asp 100 105 110 ctc ggg gcg gac ggg atc atg agc ggg ccg ccc atg tac ctg ccg cag 384 Leu Gly Ala Asp Gly Ile Met Ser Gly Pro Pro Met Tyr Leu Pro Gln 115 120 125 acc ccg gag aac gcg gtc cag tac tac aag gac ctc gct gag gcc gtg 432 Thr Pro Glu Asn Ala Val Gln Tyr Tyr Lys Asp Leu Ala Glu Ala Val 130 135 140 ccc gag ctc gcg atc atg atc tat cag aac ccg cac gcg ttc cgc atc 480 Pro Glu Leu Ala Ile Met Ile Tyr Gln Asn Pro His Ala Phe Arg Ile 145 150 155 160 acg cta ccg ccc gcc gcc ttc cgc gag ctg gct cag gtc aag aac gtc 528 Thr Leu Pro Pro Ala Ala Phe Arg Glu Leu Ala Gln Val Lys Asn Val 165 170 175 gtc gcg ctg aag cag acc tcg atg gac atc ttc aac gtc atc ggc gcg 576 Val Ala Leu Lys Gln Thr Ser Met Asp Ile Phe Asn Val Ile Gly Ala 180 185 190 atc aag gcg gtc aag gac aag atg gct gtc ctc gtc ctg gac cag ctg 624 Ile Lys Ala Val Lys Asp Lys Met Ala Val Leu Val Leu Asp Gln Leu 195 200 205 atg tac ccc gcg atg atg ttc ggc gcg gcc ggg ggc tgg agc atc gac 672 Met Tyr Pro Ala Met Met Phe Gly Ala Ala Gly Gly Trp Ser Ile Asp 210 215 220 gtc tgc atg ggc ccc tgg ccc gcg ctg tcg ctg cgt gac gcc tgc cag 720 Val Cys Met Gly Pro Trp Pro Ala Leu Ser Leu Arg Asp Ala Cys Gln 225 230 235 240 cgc ggg gac tgg acc gaa gcc gcc gcg atc gcc gac cag atg cag gct 768 Arg Gly Asp Trp Thr Glu Ala Ala Ala Ile Ala Asp Gln Met Gln Ala 245 250 255 ccg atg cgg tcg ctc ggg ctg acc atg gag gag ttc cag gcc atg cag 816 Pro Met Arg Ser Leu Gly Leu Thr Met Glu Glu Phe Gln Ala Met Gln 260 265 270 tcg gcc tgg tgg aag atc gcc gtc gac gtc gcg gga tac ggc cgt gcc 864 Ser Ala Trp Trp Lys Ile Ala Val Asp Val Ala Gly Tyr Gly Arg Ala 275 280 285 ggg gcg gcc cgg ccg ccc ttc gtg cac atc ccc gag gcg gtc gtc gat 912 Gly Ala Ala Arg Pro Pro Phe Val His Ile Pro Glu Ala Val Val Asp 290 295 300 tcg gcc cgc cgg tac ggc cag cgt tgg gcc ggc ctg gcg gag cgc cat 960 Ser Ala Arg Arg Tyr Gly Gln Arg Trp Ala Gly Leu Ala Glu Arg His 305 310 315 320 tac cgg tcg cgc gag gcc gcc ggg ctc aag ccc gcc gcg gcg gac ggc 1008 Tyr Arg Ser Arg Glu Ala Ala Gly Leu Lys Pro Ala Ala Ala Asp Gly 325 330 335 agc cgt gcc gga cgg ccc acg ccg gcg gac gga ggc ccg gac cag tcg 1056 Ser Arg Ala Gly Arg Pro Thr Pro Ala Asp Gly Gly Pro Asp Gln Ser 340 345 350 tcg ctc gtc acg act gcc tag 1077 Ser Leu Val Thr Thr Ala 355 <210> 6 <211> 358 <212> PRT <213> Nocardioides sp. KP7 strain <400> 6 Met Thr Arg Arg Thr Asn Thr Leu Val Pro Ser Asp Met Lys Gly Leu 1 5 10 15 Trp Ala Phe Val Pro Ala Cys Ser Thr Pro Asp Ala Ala Asp Val Asn 20 25 30 Ala Val Asn Thr Ile Asp Thr Glu Ala Leu Leu Ser Leu Val Asp Arg 35 40 45 Leu Val Arg Asp Gly Ala Asp Gly Ile Val Thr Thr Gly Ser Ala Gly 50 55 60 Glu Ser His Thr Leu Thr Thr Glu Glu Tyr Arg Thr Leu Val Ala Thr 65 70 75 80 Val Val Glu Thr Val Asn Gly Arg Val Pro Val Phe Val Gly Ala Ser 85 90 95 Thr Leu Asn Thr Arg Asp Ser Ile Glu Arg Ala Arg Leu Ile Ala Asp 100 105 110 Leu Gly Ala Asp Gly Ile Met Ser Gly Pro Pro Met Tyr Leu Pro Gln 115 120 125 Thr Pro Glu Asn Ala Val Gln Tyr Tyr Lys Asp Leu Ala Glu Ala Val 130 135 140 Pro Glu Leu Ala Ile Met Ile Tyr Gln Asn Pro His Ala Phe Arg Ile 145 150 155 160 Thr Leu Pro Pro Ala Ala Phe Arg Glu Leu Ala Gln Val Lys Asn Val 165 170 175 Val Ala Leu Lys Gln Thr Ser Met Asp Ile Phe Asn Val Ile Gly Ala 180 185 190 Ile Lys Ala Val Lys Asp Lys Met Ala Val Leu Val Leu Asp Gln Leu 195 200 205 Met Tyr Pro Ala Met Met Phe Gly Ala Ala Gly Gly Trp Ser Ile Asp 210 215 220 Val Cys Met Gly Pro Trp Pro Ala Leu Ser Leu Arg Asp Ala Cys Gln 225 230 235 240 Arg Gly Asp Trp Thr Glu Ala Ala Ala Ile Ala Asp Gln Met Gln Ala 245 250 255 Pro Met Arg Ser Leu Gly Leu Thr Met Glu Glu Phe Gln Ala Met Gln 260 265 270 Ser Ala Trp Trp Lys Ile Ala Val Asp Val Ala Gly Tyr Gly Arg Ala 275 280 285 Gly Ala Ala Arg Pro Pro Phe Val His Ile Pro Glu Ala Val Val Asp 290 295 300 Ser Ala Arg Arg Tyr Gly Gln Arg Trp Ala Gly Leu Ala Glu Arg His 305 310 315 320 Tyr Arg Ser Arg Glu Ala Ala Gly Leu Lys Pro Ala Ala Ala Asp Gly 325 330 335 Ser Arg Ala Gly Arg Pro Thr Pro Ala Asp Gly Gly Pro Asp Gln Ser 340 345 350 Ser Leu Val Thr Thr Ala 355 <210> 7 <211> 1461 <212> DNA <213> Nocardioides sp. KP7 strain <220> <221> CDS <222> (1)..(1458) <223> Aldehyde-dehydrogenase coding gene. <400> 7 gtg atc aac gca aaa ctc atc atc aac gga cgc gag gag acg tcg gac 48 Met Ile Asn Ala Lys Leu Ile Ile Asn Gly Arg Glu Glu Thr Ser Asp 1 5 10 15 cgc aca att gac gtc gtc agt ccg gcg gat acc cgg gtg gtg ctc ggg 96 Arg Thr Ile Asp Val Val Ser Pro Ala Asp Thr Arg Val Val Leu Gly 20 25 30 tcc gtc cca gac gcc acc tcc gaa cag gtc gac gag gcg gtg cag gcg 144 Ser Val Pro Asp Ala Thr Ser Glu Gln Val Asp Glu Ala Val Gln Ala 35 40 45 gcc gcg acg gcc ttc ccg gag tgg tcg tca cgg ccg ctg gaa gag cgc 192 Ala Ala Thr Ala Phe Pro Glu Trp Ser Ser Arg Pro Leu Glu Glu Arg 50 55 60 cag gga gcg ctg ttc gct gcc gcg ggc gcg atc cac gac atg atc gag 240 Gln Gly Ala Leu Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ile His Asp Met Ile Glu 65 70 75 80 gag tac gcg ccg ctg ttg agc cgg gag aac ggc aag atc ctc gag gag 288 Glu Tyr Ala Pro Leu Leu Ser Arg Glu Asn Gly Lys Ile Leu Glu Glu 85 90 95 tcg cac atc gac ctc gag ttc gcc tcc ggg atc tgc ggc tac acc gca 336 Ser His Ile Asp Leu Glu Phe Ala Ser Gly Ile Cys Gly Tyr Thr Ala 100 105 110 ggc atc tcg gcc gag gcg ctg gcg gac cag cgg atc cac gac gcc ggc 384 Gly Ile Ser Ala Glu Ala Leu Ala Asp Gln Arg Ile His Asp Ala Gly 115 120 125 ggc acc acg ctc atc cgg cgc cgg ccg atc ggg ccg gtg gcc gcg gtc 432 Gly Thr Thr Leu Ile Arg Arg Arg Pro Ile Gly Pro Val Ala Ala Val 130 135 140 aca ccg tgg aac ttc ccg gtg gtg ctg tcg ttc atg aag ctg gcg ccg 480 Thr Pro Trp Asn Phe Pro Val Val Leu Ser Phe Met Lys Leu Ala Pro 145 150 155 160 gcg ctc gtc gcc ggt aac acc gtg gtg ctc aag ccg tcg gag aac tcc 528 Ala Leu Val Ala Gly Asn Thr Val Val Leu Lys Pro Ser Glu Asn Ser 165 170 175 ccg ctg gtg ctc acc gag gtc atc cgg gcc ctg cag gag cac ttc cca 576 Pro Leu Val Leu Thr Glu Val Ile Arg Ala Leu Gln Glu His Phe Pro 180 185 190 ccg ggg gtg ctc aac atg gtt acc ggt ggc gac gcg aca ggg gaa gcg 624 Pro Gly Val Leu Asn Met Val Thr Gly Gly Asp Ala Thr Gly Glu Ala 195 200 205 ctg gtc gcg cac ccg ctg atc cgc aag atc ggc ttc acc ggc ggc atc 672 Leu Val Ala His Pro Leu Ile Arg Lys Ile Gly Phe Thr Gly Gly Ile 210 215 220 gac acc ggc cgc aaa gtg atg gcg gtg gcc gcg cag gac atc aag cgg 720 Asp Thr Gly Arg Lys Val Met Ala Val Ala Ala Gln Asp Ile Lys Arg 225 230 235 240 gtg acc ctg gag ctc ggc ggc aac gac ccc gcg gtc gtg ctc gac gac 768 Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Asn Asp Pro Ala Val Val Leu Asp Asp 245 250 255 gtg gac ctc tcg ccg gag acc atg cgg cgg atc gcc aag ggc gcc ttc 816 Val Asp Leu Ser Pro Glu Thr Met Arg Arg Ile Ala Lys Gly Ala Phe 260 265 270 agc gcg acc ggg cag gtg tgc ttc ggc ctc aag agt atc tac gtt ccc 864 Ser Ala Thr Gly Gln Val Cys Phe Gly Leu Lys Ser Ile Tyr Val Pro 275 280 285 acc cgt atc cac gac cgc ttc gtc gag gcc ttc cac gcc gcg gtc gac 912 Thr Arg Ile His Asp Arg Phe Val Glu Ala Phe His Ala Ala Val Asp 290 295 300 gag atc gtc gtc gga ccc ggg gac gac ccc cgc tcc acg atg ggt cct 960 Glu Ile Val Val Gly Pro Gly Asp Asp Pro Arg Ser Thr Met Gly Pro 305 310 315 320 ctc aac aac gcc cag cag aag ggc tcg gtc gag aag atc ctg gag gag 1008 Leu Asn Asn Ala Gln Gln Lys Gly Ser Val Glu Lys Ile Leu Glu Glu 325 330 335 gcc cgc ggc gcc ggt gcg gtg gtc acc acg ctg gga cgc aag ctc gac 1056 Ala Arg Gly Ala Gly Ala Val Val Thr Thr Leu Gly Arg Lys Leu Asp 340 345 350 acg gcg gcc tgg gag cac ggg cat ttc atg atg ccc agc gtc gtg acc 1104 Thr Ala Ala Trp Glu His Gly His Phe Met Met Pro Ser Val Val Thr 355 360 365 gac gcc gat ccc cgg ctc gcg atc gtc gag cag gag cag ttc ggc ccg 1152 Asp Ala Asp Pro Arg Leu Ala Ile Val Glu Gln Glu Gln Phe Gly Pro 370 375 380 acc gtg ccg gtg gtg cgc tac acg gag ctc gac gag gtc atc cgg ctg 1200 Thr Val Pro Val Val Arg Tyr Thr Glu Leu Asp Glu Val Ile Arg Leu 385 390 395 400 acc aac cgg tcg cag ttc gga ctg gcc gcg tcg atc tgg agc gcg gac 1248 Thr Asn Arg Ser Gln Phe Gly Leu Ala Ala Ser Ile Trp Ser Ala Asp 405 410 415 gag gac cgg gcc ttc gag ctc ggc cgc agg ctc gac acc ggc tcg gtg 1296 Glu Asp Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Arg Leu Asp Thr Gly Ser Val 420 425 430 ttc atc aac agt cac agc ttc agc tcg ctc gac ccg cgg gcc ccg ttc 1344 Phe Ile Asn Ser His Ser Phe Ser Ser Leu Asp Pro Arg Ala Pro Phe 435 440 445 ggc ggg acg aag aac agc ggt ctg ggc cgg gag ttc tcg ccg gcc agc 1392 Gly Gly Thr Lys Asn Ser Gly Leu Gly Arg Glu Phe Ser Pro Ala Ser 450 455 460 ctc gac gcc tat acc gag ctg cag acg atc agc cgc cgg acc ggc ccg 1440 Leu Asp Ala Tyr Thr Glu Leu Gln Thr Ile Ser Arg Arg Thr Gly Pro 465 470 475 480 ccc ggg ccg ccg ctg agc tga 1461 Pro Gly Pro Pro Leu Ser 485 <210> 8 <211> 486 <212> PRT <213> Nocardioides sp. KP7 strain <400> 8 Met Ile Asn Ala Lys Leu Ile Ile Asn Gly Arg Glu Glu Thr Ser Asp 1 5 10 15 Arg Thr Ile Asp Val Val Ser Pro Ala Asp Thr Arg Val Val Leu Gly 20 25 30 Ser Val Pro Asp Ala Thr Ser Glu Gln Val Asp Glu Ala Val Gln Ala 35 40 45 Ala Ala Thr Ala Phe Pro Glu Trp Ser Ser Arg Pro Leu Glu Glu Arg 50 55 60 Gln Gly Ala Leu Phe Ala Ala Ala Gly Ala Ile His Asp Met Ile Glu 65 70 75 80 Glu Tyr Ala Pro Leu Leu Ser Arg Glu Asn Gly Lys Ile Leu Glu Glu 85 90 95 Ser His Ile Asp Leu Glu Phe Ala Ser Gly Ile Cys Gly Tyr Thr Ala 100 105 110 Gly Ile Ser Ala Glu Ala Leu Ala Asp Gln Arg Ile His Asp Ala Gly 115 120 125 Gly Thr Thr Leu Ile Arg Arg Arg Pro Ile Gly Pro Val Ala Ala Val 130 135 140 Thr Pro Trp Asn Phe Pro Val Val Leu Ser Phe Met Lys Leu Ala Pro 145 150 155 160 Ala Leu Val Ala Gly Asn Thr Val Val Leu Lys Pro Ser Glu Asn Ser 165 170 175 Pro Leu Val Leu Thr Glu Val Ile Arg Ala Leu Gln Glu His Phe Pro 180 185 190 Pro Gly Val Leu Asn Met Val Thr Gly Gly Asp Ala Thr Gly Glu Ala 195 200 205 Leu Val Ala His Pro Leu Ile Arg Lys Ile Gly Phe Thr Gly Gly Ile 210 215 220 Asp Thr Gly Arg Lys Val Met Ala Val Ala Ala Gln Asp Ile Lys Arg 225 230 235 240 Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Asn Asp Pro Ala Val Val Leu Asp Asp 245 250 255 Val Asp Leu Ser Pro Glu Thr Met Arg Arg Ile Ala Lys Gly Ala Phe 260 265 270 Ser Ala Thr Gly Gln Val Cys Phe Gly Leu Lys Ser Ile Tyr Val Pro 275 280 285 Thr Arg Ile His Asp Arg Phe Val Glu Ala Phe His Ala Ala Val Asp 290 295 300 Glu Ile Val Val Gly Pro Gly Asp Asp Pro Arg Ser Thr Met Gly Pro 305 310 315 320 Leu Asn Asn Ala Gln Gln Lys Gly Ser Val Glu Lys Ile Leu Glu Glu 325 330 335 Ala Arg Gly Ala Gly Ala Val Val Thr Thr Leu Gly Arg Lys Leu Asp 340 345 350 Thr Ala Ala Trp Glu His Gly His Phe Met Met Pro Ser Val Val Thr 355 360 365 Asp Ala Asp Pro Arg Leu Ala Ile Val Glu Gln Glu Gln Phe Gly Pro 370 375 380 Thr Val Pro Val Val Arg Tyr Thr Glu Leu Asp Glu Val Ile Arg Leu 385 390 395 400 Thr Asn Arg Ser Gln Phe Gly Leu Ala Ala Ser Ile Trp Ser Ala Asp 405 410 415 Glu Asp Arg Ala Phe Glu Leu Gly Arg Arg Leu Asp Thr Gly Ser Val 420 425 430 Phe Ile Asn Ser His Ser Phe Ser Ser Leu Asp Pro Arg Ala Pro Phe 435 440 445 Gly Gly Thr Lys Asn Ser Gly Leu Gly Arg Glu Phe Ser Pro Ala Ser 450 455 460 Leu Asp Ala Tyr Thr Glu Leu Gln Thr Ile Ser Arg Arg Thr Gly Pro 465 470 475 480 Pro Gly Pro Pro Leu Ser 485 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic primer OD-1s. <220> <221> n <222> 15 <223> G or A or T or C <400> 9 tgyagytwyc ayggntgg 18 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic primer OD-1a. <220> <221> n <222> 3 <223> G or A or T or C <220> <221> n <222> 6 <223> G or A or T or C <400> 10 tcnrcngcra ayttccartt 20 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Synthetic primer T7. <400> 11 gaattgtaat acgactcact ataggg 26 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer T3. <400> 12 gaaattaacc ctcactaaag gg 22 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP101. <400> 13 tccgagaccc tggccaacgc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP102. <400> 14 gcggtgcctc gggtatcgga 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP103. <400> 15 gatcgcgtcg acgacgcgct 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP104. <400> 16 cggcctctac gtgctgctcg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP105. <400> 17 cgacgtgcag gacccggtag 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP106. <400> 18 ggatggaccc cgaaggtgcg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP107. <400> 19 tctggatcgc ggggtgccag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP108. <400> 20 aacccgctgc agaccgcgca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP109. <400> 21 tcgtgggtgt cctcgcgcac 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP110. <400> 22 ggcactgagc cgagatctcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP111. <400> 23 cggacggccg atgtcccgat 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP112. <400> 24 ccggaggaga tgatcgaggg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP113. <400> 25 cgagatgggg ctgaacgtgc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP114. <400> 26 gcccgagctc gcgatcatga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP115. <400> 27 ccgaccagat gcaggctccg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP116. <400> 28 aggagacgtc ggaccgcaca 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP117. <400> 29 ggacatcaag cgggtgaccc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP118. <400> 30 cgcgtactgc acgacatcgg 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP119. <400> 31 gttggcgatc gaggtgccga 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP120. <400> 32 ttcgagctcg gccgcaggct 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP121. <400> 33 gtgctgctgg tctccgcgga 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP122. <400> 34 ccgccgggtt atggatcgtg 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP123. <400> 35 gctcgggctc gaagtcaccg 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP124. <400> 36 cgacgagcac gtatggcgcc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP125. <400> 37 cgccatggcc gcgagctgat 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP126. <400> 38 cgagatcaag cagggggagg 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP127. <400> 39 cccgacctcg acacctacat 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP128. <400> 40 gtaggtgaac ccagcccagg 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP129. <400> 41 cccgtggagc cgcatcttgc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP130. <400> 42 gcacttgtct ccgtccgccg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP131. <400> 43 gcgctctagc cacatcgcca 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP132. <400> 44 tggcgggcgt ccaacaggca 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP133. <400> 45 gctgccactc gacgtcctgc 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP134. <400> 46 cggtcggcaa tcgcggtgtc 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP135. <400> 47 tccgaggtag cggcggcctt 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP136. <400> 48 gatgaagtcc tgcgcgcggt 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP137. <400> 49 tctctcgatg cccgtcggcg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP138. <400> 50 cgcaggtcag ccgccagaac 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP139. <400> 51 cctgctccag ctgctcgttc 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP140. <400> 52 ggggtgaagt tctaccgcgg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP141. <400> 53 actggtcgtg gcgcccgaac 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP142. <400> 54 ctcacccgtc gtcaggcggt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP143. <400> 55 gtgggggttg atgcgctctg 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP144. <400> 56 ggatcaggtg caccacgcag 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP145. <400> 57 gaccaactgc gggctgaacg 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP146. <400> 58 ggtgacccgc accgacacct 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP201. <400> 59 agctcgcccg ctgcgagatc 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP202. <400> 60 gcgcagacac tccgcggaac 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP203. <400> 61 tgaccgcctt gatcacgccg 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP204. <400> 62 gcgagaagac gtccttccgc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP205. <400> 63 cggacctgga cagcgaggag 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP206. <400> 64 ccaccggagg tgtagaagcc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP207. <400> 65 gccgagcaca ccctgcagga 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP208. <400> 66 acggcggcat ctcgtagccg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP209. <400> 67 ttcgccatcg cgcgcaccga 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP210. <400> 68 agacggttag gtcgactccg 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP211. <400> 69 tcgagagcgt ccaccgagac 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP212. <400> 70 ccgaactgct cctgctcgac 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP213. <400> 71 cgcgtaggag atccttggcc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP214. <400> 72 gccgagtggt tcgtgcgcca 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP215. <400> 73 ccggttcctg ccgtgggtct 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP216. <400> 74 ccgacggctt gagcaccacg 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP216-2. <400> 75 ggttgaccgc gcgatgcgca 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP217. <400> 76 cgtcgagcga cccgacaacc 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP218. <400> 77 tccgtatgtc gccgcgacgg 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP219. <400> 78 ccagtagcgc tcgttcggct 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP220. <400> 79 gacttcgccg acacccgcca 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP221. <400> 80 accccttgag gttctccgcg 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP222. <400> 81 accggtggac agggtccgtc 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP223. <400> 82 gtacgaggcg aacgcagccg 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP224. <400> 83 tcggatcgcc gcaggaccgt 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP225. <400> 84 ggacgatcca ctgtggtcgc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP226. <400> 85 caacgtcggg ccggcaaggt 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP227. <400> 86 tcaaccaccc cgaccgagtg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP228. <400> 87 agtgctcctg caggtcggcg 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP229. <400> 88 aagggcagcc gccgactctc 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP230. <400> 89 tacgaggtcc gcctcgcctc 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP231. <400> 90 ctgcgtggtg cacctgatcc 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP232. <400> 91 gcgcatcgta cctgcgatcg 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP233. <400> 92 cccccacctc tgacaaccgg 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP234. <400> 93 gatccggcgc tccatccagg 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP235. <400> 94 gggcggaccg atctacggac 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP236. <400> 95 tccgcccact ttccgcccac 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP237. <400> 96 ctcgtcggcc gtgatgtcgg 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP238. <400> 97 cggttcgctg taccccgagt 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP239. <400> 98 ttcgtcacca gcgacgccca 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP240. <400> 99 cggcgaggag gtgaccgaac 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP241. <400> 100 acgggcgttt gcaggacgtc 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP301. <400> 101 ctctcgtcgt cggcgtcctc 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP302. <400> 102 gctcgacgac catggcgcac 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP303. <400> 103 gtgccggagg ctggcgacta 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer KP304. <400> 104 gtactcctcg ctccacggac 20 <210> 105 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PE528. <400> 105 tttcgatctc atatggaggt agctatgg 28 <210> 106 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PE331. <400> 106 ccggaattct tgtagattag acggttaggt c 31 <210> 107 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PE527. <400> 107 atggaggtac atatgggctg gttggac 27 <210> 108 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PF547. <400> 108 ccggaattca aggagatata catatgctag cgagatcgtt gggatat 47 <210> 109 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PF330. <400> 109 cgcggatcct ccgcgcggtc acgtcgttac 30 <210> 110 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PG551. <400> 110 cgcggatccg aaggagatat acatatgaca cgcaggacaa acacgcttgt a 51 <210> 111 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PG333. <400> 111 tgctctagac gggcggggct aggcagtcgt gac 33 <210> 112 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PH536. <400> 112 gggaattcca tatgatcaac gcaaaactca tcatca 36 <210> 113 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer PH330. <400> 113 tgctctagac tgccgggctc agctcagcgg 30
【図１】pMKT177およびpMKT203に包含される24.7kb領域
の塩基配列中、芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素遺伝
子を含む領域を示す図である。
の塩基配列中、芳香族ジヒドロジオール脱水素酵素遺伝
子を含む領域を示す図である。
【図２】pMKT177およびpMKT203に包含される24.7kb領域
の塩基配列中、芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵
素遺伝子を含む領域を示す図である。
の塩基配列中、芳香族ジオール酸素添加（メタ開裂）酵
素遺伝子を含む領域を示す図である。
【図３】pMKT177およびpMKT203に包含される24.7kb領域
の塩基配列中、ヒドラターゼ-アルドラーゼ遺伝子を含
む領域を示す図である。
の塩基配列中、ヒドラターゼ-アルドラーゼ遺伝子を含
む領域を示す図である。
【図４】pMKT177およびpMKT203に包含される24.7kb領域
の塩基配列中、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ遺伝子を
含む領域を示す図である。
の塩基配列中、アルデヒド・デヒドロゲナーゼ遺伝子を
含む領域を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 足立 恭子 静岡県清水市袖師町1900番 株式会社海洋 バイオテクノロジー研究所清水研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA17 BA07 CA03 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL05
Claims (8)
- 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
をコードする遺伝子： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。 - 【請求項２】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
をコードする遺伝子： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。 - 【請求項３】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
をコードする遺伝子： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項４】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質
をコードする遺伝子： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項５】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
質： （ａ）配列番号２で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号２のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジヒドロジオー
ル脱水素酵素活性を有するタンパク質。 - 【請求項６】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
質： （ａ）配列番号４で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号４のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつ芳香族ジオール酸素添
加（メタ開裂）酵素活性を有するタンパク質。 - 【請求項７】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
質： （ａ）配列番号６で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号６のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつヒドラターゼ-アルド
ラーゼ活性を有するタンパク質。 - 【請求項８】 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク
質： （ａ）配列番号８で表わされるアミノ酸配列からなるタ
ンパク質、（ｂ）配列番号８のアミノ酸配列において１
若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加さ
れたアミノ酸配列からなり、かつアルデヒド・デヒドロ
ゲナーゼ活性を有するタンパク質。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000059523A JP2001245662A (ja) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | 多環芳香族分解経路上流に関与する遺伝子群およびタンパク質群 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000059523A JP2001245662A (ja) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | 多環芳香族分解経路上流に関与する遺伝子群およびタンパク質群 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001245662A true JP2001245662A (ja) | 2001-09-11 |
Family
ID=18579961
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000059523A Pending JP2001245662A (ja) | 2000-03-03 | 2000-03-03 | 多環芳香族分解経路上流に関与する遺伝子群およびタンパク質群 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2001245662A (ja) |
-
2000
- 2000-03-03 JP JP2000059523A patent/JP2001245662A/ja active Pending
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| JPN6010007392, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ, 200004, Ｖｏｌ．１８２， Ｎｏ．８, ｐ．２１３４−２１４１ * |
| JPN6010007395, 日本生物工学会大会講演要旨集, 1997, Ｖｏｌ．１９９７, ｐ．２５３ * |
| JPN6010007397, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｂ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ, 1997, Ｖｏｌ．１７９， Ｎｏ．２０, ｐ．６４８８−６４９４ * |
| JPN6010007400, Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ, 1999, Ｖｏｌ．３８， Ｎｏ．６, ｐ．１３３１−１３３７ * |
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