JPS62118899A - Ｌ−カルニチンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は心血管系での急性ならびに慢性の心筋虚血、狭
心症、心臓性の不整脈又は、心不全の治療薬として最近
、その効果が認められるよう疋なってきたし一力ルニチ
ンの製造方法に関する。

カルニチン（β−ヒドロキシ−γ−トリメチルーアミノ
酪酸）には０体及びＬ体の２種類の立体異性体が存在す
ることはよく知られている。

Ｌ・−カルニチンは、通常生体内に存在し、活性化した
長鎖の遊離脂肪酸をミトコンドリア膜から通過させるキ
ャリアーとしての働きを有する。

カルニチンは左旋性のＬ−カルニチンのみが天然物の形
態であるにもかかわらず、ラセミ体のカルニチンが食欲
増進剤などに用いられてきた。

しかし最近、前記心血管系疾患等いくつかの治療学的使
用に対しては、Ｌ−カルニチンのみを使用する方が効果
的であることが明らかにされ、その重要性に対する関心
が高まりつつある。

（従来の技術） 光学活性り一カル二チンの製法としては、例えば下記の
方法が知られている。

（１）化学的な合成法によって得られたラセミ体のカル
ニチンを光学分割する方法。その光学分割°の方法は、
前駆体であるＤＬ−カルニチンニトリルにＮ−アセチル
−Ｄ−グルタミン酸又は、Ｎ−アセチル−し−グルタミ
ン酸を分割剤として加え塩を生成させ、溶解度の差を利
用して分割し、次いでこれを加水分解して、Ｌ−及びＤ
−カルニチンクロライドとなし、それからＬ−及びＤ−
カルニチンを得る方法。（特公昭４３−８２４８）（２
）　’　３−デヒドロカルニチンを微生物の酵素（カル
ニチンデヒドロゲナーゼ）の作用で不斉還元して、Ｌ−
カルニチンを得る方法。

（米国特許第４，２２１，８６９号） （３）　　γ−ブチロベタインに微生物の酵素（ヒドロ
キシラーゼ）を反応させることにより、Ｌ−カルニチン
を製造する方法。（特開昭５７−３９７９１　）（特開
昭５９−１８３６９４．特開昭５９−１９２０９５゜特
開昭６Ｏ−１３７２９５） （５）ＤＬ−アシルカルニチンを電気ウナギ由来のコリ
ンエステラーゼあるいは、馬血清由来のブチリルコリン
エステラーゼの作用で立体特異的に加水分解して、Ｌ−
カルニチンを得る方法。

ＬエリッＡＰ、ドロプシーら、バイオテクノロジー　ア
ンド　バイオエンジニアリング（Ｅｒ１ｃ　Ｐ。

Ｄｒｏｐｓｙ　ｅｔ　ａｌ、＋　Ｂｉｏｔｅｃｈ　、　
＆　Ｂｉｏｅｎｇ、　）第２６巻。

９１１−９１５頁、１９８４年〕 （６）　　ジエチル−３−ヒドロキシグルタレートを微
生物の酵素の作用で立体特異的に加水分解して、（Ｓ）
−二チルハイドロジエンー３−ハイドロキシグルタレー
トを得、これを（Ｒ）−４−アミノ−３−ハイドロキシ
酪酸とした後、メチル化剤でメチル化し、Ｌ−カルニチ
ンとする方法。

〔アラパムダ、Ｓ、ゴパランら、テトラヘドロンレター
ズ（Ａｒａｖａｍｕｄａｎ　Ｓ、　Ｇｏｐａｌａｎ　ｅ
ｔ　ａｌ、。

Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｉｅｔｔ、　）第２５巻、　
５２３５−５２３８頁、１９８４年〕などがある。

（発明が解決しようとする問題点） （１）は光学分割法によるし一力ル二チンの製造法とし
て代表的であるが、しかし光学分割剤として用いるＮ−
アセチル−Ｄ−グルタミン酸が高価であり、操作も複雑
で収率が悪い。

（２）は、原料の３−デヒドロカルニチンが不安定で取
扱いが困難な上、補酵素として高価なＮＡＤＨあるいは
ＮＡＤを必要とする。

（３）は、カタラーゼ、２−オキソゲルタール酸。

アスコルビン酸等の副原料を必要とし、その上原料のγ
−ブチロベタインが高価なため、Ｌ−カルニチンを経済
的に製造するには好適な方法とはいえない。

（４）は、反応混合物中に残存する未反応のクロトノベ
タインと目的物であるし一カルニチンの分離が困難であ
る。

（５）は、加水分解反応に用いる酵素が手に入シ難く、
又高価につくため、好適な方法とはいえなへ（６）は、
工程が長く複雑であるため、収率が悪い。

以上述べたように、上記の方法はいずれも工程的に又コ
スト的にみて、Ｌ−力ル二チンの工業的製造法としては
有利な方法とはいえない。

（問題を解決するための手段） そこで本発明者らは、エピクロルヒドリンより安価に製
造できる一般式、 （式中Ｘはアルキル基、アルケニル基、又は芳を 香族炭化水素を示し、骨部は不斎炭素原子を示す。）で
表される　ＤＬ−カルニチン誘導体及び／又はその塩を
原料として用いることに着目し、それからし−カルニチ
ンを得る方法について鋭意検討を行なった。

その結果、式［Ａｌで表されるＤＬ−カルニチン誘導体
及び／又４その塩に、特定の微生物あるいは該微生物よ
り得られた酵素を作用させると、Ｌ体のエステルのみが
、立体特異的に加水分解してＬ−カルニチンを与え、Ｄ
体は何らの作用も受けずにそのま＼反応液中にエステル
の形で残存するという興味ある事実を発見し本発明に至
った。

Ｌ−カルニチンの定量は、カルニチン（Ｄ−及び／又は
Ｌ−カルニチン）中のし一カルニチンのみを選択的に酵
素で定量するり、　Ｊ、ピアソンらの酵２法、【メソッ
ドインエンチモロジ−（Ｄ、Ｊ。

Ｐｅｒｒｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉ
ｎ　Ｅｎｚｙｍｏ＋、　）第１４巻、６１２頁、１９６
９年１で行なった。

又、未反応の原料即ち式（Ａｌで表される化合物とカル
ニチン（Ｄ−及び／又はＬ−カルニチン５の合計量）は
、Ｊ、Ｓ、ヘイズらの高速液体クロマトグラフィー法（
ＨＰＬＣ法）Ｃアナリテイカキミカアクタ（Ｊ、　Ｓ、
　Ｈａｙｅｓ　ｅｔ　ａｔ、、　Ａｎａｌｙｔｉｃａ　
ＣｈｉｍｉｃａＡｃｔａ、　）第８０巻、３６１頁、１
９７５年１の変法で定量した。

上記２法を組み合わせることにより、反応生成物の全量
をも、又その中のし一力ルニチンのみをも定量すること
が可能である。

前記のＬ体のエステルのみに作用して立体特異的に加水
分解する能力のある微生物としては、例えば、 エシェリヒア　コリ　（ＩＦＯ３３０１）エンテロバク
タ−クロアカニ　（ＩＦＯ３３２０）プロテウスミラビ
リス（ＡＴＣＣ１２４５３）サルモネラチフイムリウム
　（ＩＦＯ１２５２９）セ９＋７−ｒルセ、セｙｘ　（
ＩＦＯ３７３６）シトロバクタ−インターメゾウス　（
ＩＦＯ１３５３９）クレブシエラニューモニアエ（ＩＦ
Ｏ３５１２）７ラボパクテリウムエステロアロマテイカ
ム（ＩＦＯ３７５１）ミクロコツカス７ラプス　（ＩＦ
Ｏ３２４２）コリネパクテリウムファシ→ンス（ＩＡＭ
１０７９）パシラスス７アエリヵス（ＩＦＯ３，５２８
）シュードモナスコンペクサ（■Ｆｏ３７５７）プレビ
バクテリウムリネンス（ＩＦＯ１２１４１）ハフニアア
ルヘイ（ＩＦＯ３７３１） バクテリウムグラシル（ＩＦＯ３２３１）ムコールジャ
バニカス（ＩＦＯ４５７０）リゾブスオリザエ（ＩＦＯ
４７４４） アスペルギルスニガー（ＩＦＯ６６６１）ノエロスボラ
クラッサ（ＩＦ０６０６８）７ザ’Ｊ　ウム７ラニ（Ｉ
ＦＯ５２３２）などがある。

微生物の培地は使用する菌株により、多少異なるが、一
般的には炭素源、窒素源、無機イオンなどを含有する通
常の培地を用いることができる。

炭素源としてはグルコース、サッカロースなどの炭水化
物、フマル酸、酢酸などの有機酸、メタノール、エタノ
ールなどアルコール類、その他、窒素源としては硫酸ア
ンモニウム、塩化アンモニウムなどのアンモニウム塩、
ペプトン、酵母エキス。

コーンステイープリカー、その他、無機塩類としては硫
酸マグネシウム、リン酸−水素カリウム。

リン酸二水素カリウム、硫酸第一鉄、塩化マンガン、塩
化ニッケル、硫酸コバルトなどが使用できる。

又、培地に予めＤＬ−カルニチンあるいは式（Ａ）で表
される化合物を添加して菌の培養を行なうと、得られる
菌体の立体特異的な加水分解能即ち、Ｌ−カルニチンを
産生ずる能力を高めることができる。

この培地に菌を接種し、好気的あるいは嫌気的条件で培
養する。培養に適した温度は通常１５〜６０℃であるが
好ましくは２５〜４０゛Ｃであり、培地の初発ｐＩ（は
通常３〜９、好ましくは５〜８の範凹である０ 培養は通常１〜１０日間行なう。

上述の条件で得られた培養液にそのま＼原料の式［Ａ）
で表される化合物を添加するか、あるいは培養液から遠
心分離などの通常の方法により取出した菌体を式〔Ａ〕
で表される化合物を含む水溶液て添加することによって
加水分解を行なう。

この時、式ＣＡ）の化合物を分割して添加すると良好な
結果が得られる　　　＋　　− 加水分解は反応温度、通常１０〜６０’Ｃ，好ましくは
２５〜４０℃、ｐＨ１通常２〜１０．好ましくは５〜７
で行なう。反応は、静置又は攪拌下に８時間〜４日間行
なう０ 立体特異的に加水分解を受けた式（Ａ〕で表される化合
物中のし一体から生成したし一力ルニテンは反応系内に
蓄積される。

上述の加水分解反応てよって得られたし一力ルニチンを
反応液から分離するには （１）　　イオン交換樹脂を用いて直接り一カル二チン
を分取する方法・　（エリツク、Ｐ、ドロプシーら、バ
イオテクノロジーアンドノ（イオエンジニアリング（Ｅ
ｒ１ｃ　Ｐ、　Ｄｒｏｐｓｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ
ｔｅｃｈ、　＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　）　
　第２６巻、９１１−９１５頁、１９８４年Ｊ （２）　　あるいは予め未反応の式［Ａ）の化合物をｎ
−プロパツール、イソプロノくメールなどの溶媒で抽出
、除去 〔バイオキミカ　バイオフイジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈ
ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、　）　　２８０
　４２２−４３３　＊１９７２年１ しお後で上述のイオン交換樹脂法によりＬ−カルニチ／
を分取する方法。

などによって単離する。

前記の反応の酵素源としては、微生物の菌体そのものを
用いているが、この他に菌体より公知の処理方法により
得られた菌体処理物、例えば無細胞抽出液、アセトンパ
ウダーやドライセルあるいは界面活性剤処理した菌体を
用いたり、固定化菌体あるいは固定化酵素も有効である
。

固定化に用いる担体としては、カラギーナン。

アルギン酸、寒天、コラーゲン、ゼラチン、ペクチン、
などの天然化合物あるいは、ポリアクリルアミド、ポリ
アクリル酸、エチレンアクリル酸共重合体、光架橋性樹
脂などの合成高分子をも利用できる。

又、予め培地中に式〔Ａ〕の化合物を含ませておき、前
記の微生物を培養しながら加水分解反応を行なうことも
可能である。即ち、微生物の培養に必要な前記の炭素源
、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含有する培地に式
（Ａ）で表される化合物を加え、前記の培養条件で好気
的あるいは嫌気的に培養を行なえば、菌の増殖と同時に
加水分解反応が起こり目的物であるし一カルニチンが培
地中に蓄積される。

生成したし一力ル二チンを培養液から分離するには、前
述の方法と同様にして行なう。

以下に実施例をあげて本発明を具体的に説明する。なお
生成したし一力ル二チンの、定量は前述のとおり、Ｄ、
Ｊ、　　ピアソンらの酵素法により行なった０ 実施例１゜ ＫＨ２ＰＯ４０，３％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，７％、　（
ＮＨ４）２ＳＯ４０，１π、ペプトン０．５％、酵母エ
キス０．５％から成る液体培地（ｐＨ７）に予めＤＬ−
カルニチン堪酸塩を０．３％加え、全体を５−にして第
１表に示す菌を１白金耳量接種した。

３０℃で２日間振とう培養（１００ｒ、ｐ、ＩＴＬ）　
した後、得られた培養液を遠心分離し菌体を得た。

得られた菌体を５−の生理食塩水で洗浄後、ＤＬ−カル
ニチンと酢酸クロリドから常法により合成した　ＤＬ−
アセチルカルニチン塩酸塩　１％（４２ｍＭ）　　を含
む０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐｆ（７）１−に添加し、
３０℃で１８時間振とう（１００ｒ、ｐ、ｍ、）するこ
とにより加水分解反応を行なった。得られた反応液は８
０℃で５分間加熱処理を行ない、遠心分離により菌体を
取り除いて、Ｄ、　Ｊ。

ピアソンらの酵素法で生成したし一力ルニチンの定量を
行なった。Ｌ−カルニチン生成量を第１表に示した。

第　　　１　　　表 実施例２ 第１表の中からシトロバクタ−インターメゾウス（ＩＦ
Ｏ１３５３９）を選び、培養条件は実施例１゜と同様に
して１００倍のスケールで培養を行ない、々置換した式
［Ａ）で表される化合物２０ｍＭを含む０．１　Ｍ　リ
ン酸緩衝液（ｐＨ７）中にそれぞれ１０η湿菌体／７！
となるように添加し、３０’Ｃで１８時間振とうして反
応を行なった。各々の場合のし一カルニチン生成量を第
２表に示した。

第　　　２　　　表 実施例３゜ シトロバクタ−インターメゾウス（ＩＦＯ１３５３９）
をＫＨ２ＰＯ４０，３％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，７％、　
（ＮＨ４）２Ｓｏ４０．１％、ペプトン　０．５％、酵
母エキス　０．５％。

原料のＤＬ−アセチルカルニチン塩酸塩１％（４２ｍＭ
）からなる液体培地（ｐ）１７）２０−に接種し、３０
℃で２日間、嫌気的に培養し、菌の増殖と同時にＤＬ−
アセチルカルニチン塩酸塩の加水分解反応を行なった。

得られた培養液を８０℃で５分間加熱処理を行なった後
、遠心分離により菌体を取り除き、前述のり、Ｊ、　　
ピアソンらの酵素法及びＪ、　Ｓ、　ヘイズらのＨ″Ｐ
ＬＣ法により分析した。

酵素法では、１７ｍＭのし一カルニチンが定量され、一
方ＨＰＬＣ法では、１７ｍＭのカルニチン。

２１ｍＭのアセチルカルニチン、及び２ｍＭのクロトノ
ベタインが定量された。

実施例４゜ エシェリヒア　コリ（ＩＦ０３３０１）を、ＫＨ２ＰＯ
４０，３％、　Ｋ２ＨＰＯ４０，７９１；　、　　（Ｎ
Ｈ４）２ＳＯ４０，Ｉ　Ｘ　＊ペプトン０．５　’Ｘ　
、酵母エキス０．５％、ＤＬ−アセチルカルニチン０．
１％からなる液体培地（ｐＨ７）２０−に接種し、３０
℃で１日間好気的に前培養を行なった。本培養は、こう
して得られた前培養液全量を、前培養液と同様の組成の
培地２１に接種し、３０℃で２日間嫌気的に行なった。

こうして得られた本培養液から遠心分離により、１．９
Ｆの湿菌体を得ることができた。１．９Ｆの湿菌体をＤ
Ｌ−アセチルカルニチン塩酸塩３％（１２６ｍＭ）を含
む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）５００−中に添加し
、３０℃、９６時間、静置することにより反応を行なっ
た。

得られた反応液中には、５６ｍＭのし一カルニチンが含
まれていた。

反応液から遠心分離により菌体を取り除いた後、減圧濃
縮して１００−とじ、前述のイオン交換樹脂を用いる方
法によって、未反応のアセチルカルニチン画分とＬ−カ
ルニチン画分に分離した。

得られたし一カルニチン画分を陽イオン交換樹脂を用い
て脱塩後、減圧濃縮し、エタノール−アセトンでＬ−カ
ルニチンを沈殿させた。

得られたＬ−カルニチンの収量は、２．９７であシ、又
このものの比旋光度は〔α］　２５＝　−２９，５°士
０．２°（Ｃ＝０．９６７水）であった。。

（発明の効果） Ｌ−カルニチンを合成するには、原料として、安価なエ
ピクロルヒドリンから得られるＤＬ−カルニチンを用い
るのが最も経済的に有利である。

しかし従来から行なわれているラセミ体のカルニチンを
０体と５体に分割して目的物の５体を得るためには、光
学分割剤を加えて塩を生成させ、その塩を溶解度の差を
利用して分割し、さらにそれを加水分解して、Ｌ−カル
ニチンを得なければならない。この方法では原料には安
価なりＩ／−カルニチンを用いるが、分割に高価な光学
分割剤を使用しなければならず、又煩雑な操作を必要と
する。

又前述したようにエリツク、Ｐ、ドロブシーらがＤＬ−
アシルカルニチンを電気ウナギから得たコリンエステラ
ーゼあるいは馬血清中のブチリルエステラーゼを用いて
立体特異的に加水分解してＬ−力ルニチンを得る方法を
明らかにしている。

しかしながら電気ウナギのコリンエステラーゼあるいは
馬血清のブチリルコリンエステラーゼを大量にかつ安定
的に入手することは非常に困難で又高価である。

本発明の方法においては、公知の微生物を用いて原料の
ＤＬ−カルニチン誘導体を立体特異的に加水分解して、
一段で目的物のし一カルニチンを産生ずることができ、
又微生物の培養も通常の方法によって好気的あるいは嫌
気的条件下で容易に行なうことができる。

立体特異的な加水分解は、菌体あるいはその処理物を原
料のＤＬ−カルニチン誘導体に添加して行なわせても、
又菌の培養時に原料を培地に添加して菌の増殖と同時に
行なわせてもよい。又反応混合物からのし一カルニチン
の分離もイオン交換樹脂法による常法で行なうことがで
きる。

以上述べたように本発明は、従来行なわれているように
高価な光学分割剤や入手し難い酵素を用いたり、あるい
は煩雑な操作を行なう必要がなく、簡単な操作で容易に
安価なし一カルニチンを工業的規模で実施できる新規な
方法を提供するものである。

出願人　　製鉄化学工業株式会社 代表者　増　１）裕　治

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）一般式▲数式、化学式、表等があります▼〔Ａ〕 （式中Ｘはアルキル基、アルケニル基、又は芳香族炭化
   水素基を示し、＊印は不斉炭素原子を示す。）で表され
   るＤＬ−カルニチン誘導体及び／又はその塩に、微生物
   又は、該微生物より得られた酵素を作用させて立体特異
   的に加水分解することを特徴とするＬ−カルニチンの製
   造方法。
2. （２）微生物がエシエリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
   ）属、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）
   属、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）属、サルモネラ（Ｓ
   ａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ
   ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、
   クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属、フラボバク
   テリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロ
   コッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、コリネバクテ
   リウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、バシラ
   ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シユードモナス（Ｐｓｅｕ
   ｄｏｍｏｎａｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉ
   ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ハフニア（Ｈａｆｎｉａ）属
   、バクテリウム（Ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ムコール（
   Ｍｕｃｏｒ）属、リゾプス（Ｒｈｚｏｐｕｓ）属、アス
   ペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ノエロスポ
   ラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａ
   ｒｉｕｍ）属よりなる群より選ばれた属に属する少なく
   とも一種である特許請求の範囲（１）記載の方法。