PT90747B

PT90747B - Processo para a preparacao de acido r- ou s-2-hidroxi-4-fenilbutirico

Info

Publication number: PT90747B
Application number: PT90747A
Authority: PT
Inventors: Oreste Ghisalba; Gottfried Sedelmeier; Daniel Gygax; Rene Lattmann; Hans-Peter Schar; Elke Schmidt
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1988-06-06
Filing date: 1989-06-05
Publication date: 1994-10-31
Also published as: ES2059817T3; US5098841A; DK172667B1; PT90747A; ATE98697T1; IE63497B1; KR0165102B1; EP0347374B1; FI95047B; IE891821L; FI95047C; JP2873236B2; MX170725B; EP0347374A1; IL90527A0; FI892702A0; DE58906409D1; FI892702A; IL90527A; DK271289D0

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ÃCIDO R- OU S-2-HIDROXI-4-FE-2-

ou do enantiómero S do ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico de fórmula (II) /

• ·

I II « · (II) numa pureza enantiómerica muito elevada, que compreende a edu ção do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico com o enzima D-lactato-desidrogenase do Staphylococcus epidermidis ou com o enzima L-lactato-desidrogenase do coração de bovino, respectivamente, na presença de um dador de lectrões, o NAD(H), (dinucleotídeo de nicotinamida-adenina) e de um sistema de enzima/substracto para a regeneração do dador de electrões, o formato-desidroge nase/formato ou o álcool-desidrogenase/etanol, respectivamente .

processo do invento é especial mente adequado para a conversão enzimática contínua, preferen cialmente num reactor com membrana de enzima (RME).

O ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico de fórmula (I) é um intermediário valioso na preparação de inibidores de ECA (enzimas de conversão da angiotensina) ou , de seus precursores. 0 ácido S-2-hidroxi-4-fenilbutírico de fórmula (II) é usado para a preparação de compostos isoméri -3-

O presente invento relaciona-se com um processo para a preparação do enantiómero R do ácido

2-hidroxi-4-fenilbutirico de fórmula /

i fi ^0H έοΟΗ (I).

ou o enantiómero S do ácido 2-hidroxi-4-fenilbutirico de fórmula

OH .·' (II) èooH de pureza enantiomérica muito elevada, e.g. na região dos 99% ee, (excesso enantiomérico), preferencialmente superior a 99,6% ee, cujo processo compreende a redução do ácido 2-oxo-4-fenilbutirico com o enzima D-lactato desidrogenase (D-LDH) do Staphylococcus epidermidis ou' com o enzima L-lactato desidrogenase (L-LDH) do coração de bovino, respectivamente, na presença de um doador electrónico, por exemplo o NAD(H), e um sistema de enzima/substrato para a regeneração do doador elec_ trónico, por exemplo formato desidrogenase (FDH)/formato. O processo para a preparação do ácido R-2-hidroxi-4-f enilbut ír_i co de fórmula (I) é preferencialmente realizado com o enzima D-LDH do Staphylococcus epidermidis, na presença de um doador de electrões, por exemplo o NAD(H), e um sistema de enzima/ substrato para a regeneração do doador de electrões, por exem

plo de formato desidrogenase (FDH)/formato. 0 processo do invento é especialmente adequado para a conversão enzimática contínua, preferencialmente num reactor com membranas de enzi ma (RME).

O ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico de fórmula (I) é um intermediário valioso na preparação de inibidores de ECA (enzima de conversão de angiotensina) ou de seus precursores. O ácido S-2-hidroxi-4-fenilbutírico de fórmula (II) é usado para a preparação de compostos isoméricos.

A produção de compostos quinais por redução microbiológica estereoespecífica é conhecida (ver Simon et al. , Angew. Chemie 9 7, 541, 1985 para um resumo). Frequentemente, microorganismos intactos são usados como biocatalisadores, por exemplo fungos (e.g. Mucor, Geotrichum, Saccharomyces, Candida) ou bactérias (e.g. Proteus, Pseudomonas). É também possível usar extractos microbianos. Os doado res electrónicos são, por exemplo, hidratos de carbono (e.g., glucose), formato, etanol, hidrogénio ou o cátodo de uma célula electroquímica. A redução do substrato é efectuada pela chamada reductase final, e.g. por uma desidrogenase específica de um substrato. Os equivalentes de redução necessários pela reductase final são geralmente fornecidos por um coenzima, e.g., por nucleotídeos de piridina como NADH (dinucleotídeo de nicotinamido-adenina) e NADPH (dinucleotídeo de nicotinami_ do-adenina-fosfato) ou nucleotídeos de flavina como FMNH (monocleotídeo de flavina) e FADH (dinucleotídeo de flavino-adenina). Os nucleotídeos reduzidos são, por sua vez, normalmente produzidos numa série de passos catalizados com enzima, na qual aceitadores de electrões competidores são formados ou obtidos por transferência electrónica por mediadores sintéticos ou naturais (e.g. ferrodixina, viologenes). Reductases finais, que são capazes de aceitar electrões directamente dos mediadores, são também conhecidas.

Também adequado como biocatalisadores são enzimas purificados, i.e., reductases isoladas, sendo neste cada caso geralmente necessário adicionar nucleotídeos de piridina ou nucleotídeos de flavina reduzidos. Uma outra necessidade é a presença de um sistema eficaz para a regenera ção enzimática do coenzima, i.e. um segundo enzima e o seu substrato. 0 Yamazaki & Maeda (Agricol. Biol. Chem. 50 , 2621, 1986 descreve um processo descontínuo para a síntese do ácido R-(-)-mandélico a partir de formato de benzoilo com a ajuda de NADH e o formato de benzoilo desidrogenase do Streptococcus faecalis. Este processo pode também ser realizado continuamente num biorreactor, com o coenzima a ser regenerado continuamente, por meio de formato desidrogenase e formato (Yamazaki & Maeda, Agricol. Biol. Chem. 50, 3213, 1986). A especificação da Patente Europeia PE 0 024 547 descreve um processo para a conversão enzimática contínua de ácidos d-cetocarboxílicos solúveis em água aos ácidos á-hidroxi-carboxílicos correspondentes, num reactor com membrana de enzima. A conversão é realizada na presença de NAD(H) cujo peso molecular foi aumentado por ligação a poiietileno-glicol e na presença de um lactato desidrogenase com regeneração do NADH simultâneamente por formato desidrogenase e por formato.

De importância crucial em reacções enzimáticas são as propriedades e a origem do enzima usado, o mesmo é dizer neste caso, da reductase final ou da desidrogenase específica do substrato. Deve estar presente, que enzimas do mesmo tipo podem diferir no seu comportamento fisiológico se forem isolados de fontes diferentes, por exemplo, de microorganismos diferentes. Diferenças existem em relação a esses parâmetros decisivos para a bioconversão, como a especificidade da reacção, a especificidade do substrato e a estereo especificidade e factores cinéticos como a constante de Michaelis-Menten e a constante de inibição (Simon et al., loc. cit.). Por exemplo, por comparação dos dados da literatura conhecida será aparente que enquanto que o D-lactato desidrogenase do Lactobacillus confusus converte o piruvato, 2-cetobutirato e

-6fenil-piruvato, este enzima não reduz a 2-cetovalerato, 2-cetocaproato e 2-ceto-3-metil-valerato. 0 comportamento de sistemas de enzima/substrato individuais devem, por conseguinte, ser testados para cada caso e não pode ser predito por generalização, embora a PE 0 024 547 aponte para essa conclusão .

O objectivo do presente invento é descobrir os processos eficazes para a preparação dos enantiómeros R e S do ácido 2-hidroxi-4-fenil-butílico com um grau elevado de pureza enantiómerica, por redução enzimática enantiosselectiva do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico. Esta substância não foi descrita em antecedentes do ramo relativamente à redução enzimática de ácidos oi^-ceto-carboxílicos e, de acordo não foi investigado em relação à sua adequebilidade e ao seu comportamento na redução enzimática.

Descobriu-se um processo especialmente adequado para atingir esse objectivo em relação à preparação do ácido R-2-hidroxi-4-fenil-butírico que é um em que o substrato é reduzido com o enzima. D-lactato desidrogenase do Staphylococcus epidermidis, na presença de um doador de electroes e de um sistema da enzima/substrato para a regeneração do doador electrónico, porque em comparação com os lactato desidrogenases de outros microorganismos, o D-LDH do Staphylococcus epidermidis é distinguido especialmente por uma actividade específica elevada (unidades x mg de substrato convertido ou conversão em pmol/mg de proteína x min.) em relação ao substrato usado (ver Quadro 1) e tem uma enantiosselectividade elevada. Pelas mesmas razões, um processo análogo, no qual o substrato é reduzido com o enzima L-lactato desidrogenase do coração de bovino, é especialmente adequado para a preparação do ácido S-2-hidroxi-4-fenilbutírico. O método de reacção contínua, especialmente num reactor com membrana de enzima, é preferido para ambos os processos.

QUADRO 1

Comparação da actividade específica das desidrogenases comercialmente disponíveis

Fonte do enzima	U/mg de proteína basiados no	U/mg de proteína basiadas no ácido 2-ceto-4-fenilbu- tírico
D-LDH Lactobacillus leichmannii Boehringer 732737	300	-0,1
D-LDH Lactobacillus leichmannii Sigma L2011	300	0,3
D-LDH Leuconostoc	1000-1500	1,23
mensenteroides Sigma L 0513	1 (1225)
D-LDH Staphylococcus	500-1000	26
epidermidis Sigma L 9636	(625)
L-LDH do coração de bovino Fluka 61310	300	0,07
700 U = 1 mole de produto/dia

A combinação do D-LDH do 5taphylococcus epidermidis como a desidrogenase específica do substrato de enantiosselectidade elevada e do ácido 2-oxo-4-fenil-8-

butírico como substrato oferece a garantia de formas de productividade de elevada, bons rendimentos no espaço-tempo e, consequentemente, baixo custo que é de grande importância e de vantagem económica considerável em conversões enzimáticas realizadas em larga escala.

doador de electrões usado para o D-lactato desidrogenase do Staphylococcus epidermidis ou para o L-lactato desidrogenase do coração de bovino é preferencialmente o coenzima de dinucleotídeo de nicotinamido-adenina na sua forma reduzida (NADH), que é oxidado pelo D- ou L-LDH a NAD. Para a regeneração do coenzima, um sistema de enzima/substrato, que consiste num enzima de reciclização do NADH e no seu substrato, e.g. formato, etanol, isopropanol, ciclo-hexanol, etc., é usado. Um sistema de formato desidrogenase (FDH)/formato, no qual um sal do ácido fórmico, por exemplo um formato de um metal alcalino, e.g. formato de sódio ou de potássio, é usado como o formato ou um sistema de álcool desidrogenase (ADH)/etanol é preferido. Estes sistemas produzem CC^/HCO” e acetaldeído, respectivamente, como produtos segundários.

processo do invento origina o produto, o ácido R- ou S-2-hidroxi-4-fenilbutírico, num grau elevado de pureza enantiomérica. No contexto desta descrição, a expressão com rum grau elevado de pureza enantiomérica significa que o enantiómero em questão está presente com pelo menos 98% e é na mistura com o outro enantiómero, preferencial mente com mais do que 99% ee.

No processo descontínuo, uma solução aquosa do substrato, o ácido 2-oxo-4-fenil butírico, por exemplo na forma do seu sal de potássio ou de sódio, numa concentração até os 500mM, por exemplo, numa concentração de desde 20 a 200mM, preferencialmente de 50 mM, é incubada enquanto é agitada com o coenzima NAD(H), numa concentração de desde 0,01 a 10 mM, preferencialmente de aproximadamente de 0,1 mM, com o enzima de reciclização do NADH, e.g. um álcool desidrogenase ou um formato desidrogenase, e com etanol ou formato, respectivamente, numa concentração de desde 100 a 1200 mM, preferencialmente de aproximadamente de 300 mM, e com o D-lactato desidrogenase do Staphylococcus Epidermidis ou com o L-lactato desidrogenase do coração de bovino, até que a conversão esteja completa. Os enzimas são vantajosamente usados em certos quantidades de tal modo que a razão das actividades do enzima de reciclização do NADH e da desidrogenase especícica do substrato é desde de 1:0,1 a 1:5. A mistura reaccional tem um pH na gama de desde pH 6 a 9, e.g. pH 8,4, como é usual para reacções enzimáticas. A temperatura reaccional é desde os 20SC aos 402C, preferencialmente cerca da temperatura am-; biente. 0 produto é cristalizado a partir da mistura reaccional através da adição de um ácidos por exemplo de um acido mineral, como ácido clorídrico, etc...

Para o método reaccional contínuo, as enzimas usadas sâo geralmente imobilizadas. Eles podem estar, por exemplo, enclausurados em matrizes de polímero, em cápsulas ou fibras, que consistem em membranas semipermeáveis ou em membranas de ultrafiltração, ou ligadas por ligações cruzadas a reagentes bifuncionais ou multifuncionais, ou fixos por adsorção ou por ligação iónica ou covalente a suportes, que consistem em,materiais inorgânicos ou em polímeros naturais ou sintéticos. Numerosos tipos de biorreactores podem ser usados para o processo contínuo, e.g. reactores agitados, reactores de leito fixo, reactores de leito feudizado ou reactores de membrana (ver Hartmeier, Immobilisierte Biokata lysatoren, Berlin 1986 para um resumo).

Num processo de RME (processo contínuo num reactor com membrana de enzima) do invento, o vaso reaccional usado é preferêncialmente um reactor com membrana, equipado com uma membrana de ultrafiltração, que retém as enzimas usadas e o coenzima necessário para a conversão, mas permite ao produto de baixo peso molecular e ao substrato não

a utilização do NAD(H) que foi ligada a um poli-etileno-glicol de modo a aumentar o peso molecular. Contudo, esta ligação, pode resultar numa perda de actividade do enzima. Por exemplo, quando o PEG-NAD(H) é usado como coenzima, em oposição ao NAD(H) primitivo, a actividade do D-lactato desidrogenase do Staphylococcus epidermidis é tão severamente restringida que o valor V , isto é a velocidade reaccional máxima, é unicamente de

2,6 unidades/mg, quando comparada com 26 unidades/mg para o NAD(H) primitivo. Se velocidades de conversão adequadas do subs trato são para serem atingidos num processo contínuo usado PEG-NAD(H), é por conseguinte necessário usar aproximadamente dez vezes mais de enzima no RME, que resulta num aumento elevado nos custo de produção. De modo a reter eficazmente numa membrana de ultrafiltração, por exemplo, o NAD(H) cujo peso molecular foi aumentado por ligação a um poli-etileno-glicol de peso molecular de 20.000, a membrana pode ter um limite de exclusão máximo de 10.000 daltons. Por outro lado, quando quantidades catalíticas de NAD(H) primitivo são usados na corrente de substrato, o limite de exclusão de membrana é determinada unicamente pela dimensão do enzima. É por conseguinte possível usar membranas tendo limites de exclusão de desde 5.000 a 100.000 daltons, de modo que a pressão elevada no reactor, que limita o tempo de realização de reacção no reactor, possa ser evitada. Devido à baixa pressão, quando da utilização do NAD(H) primitivo, é também possível usar membranas menores e, por conseguin te, menos dispendiosas e atingir velocidades de atravessamento superiores. Quando da utilização do NAD(H) primitivo, forma cíclicas superiores na gama de desde 500 a 2.000 são também obtidos, o mesmo é dizer, por molécula de NAD(H), desde 500 a 2.000 moléculas de hidroxi ácido são formados. 0 processo do invento oferece assim vantagens económicas consideráveis em relação ao processo descrito em PE 0 024 547.

Em adição, uma solução aquosa do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico, por exemplo na forma do seu sal de sódio ou de potássio, é alimentado continuamente ao reactor como o substrato. O substrato deve estar presente numa concen-12tração não superior a 500 mM; numa concentração na gama desde de 20 a 200 mM, especialmente a cerca de 50 mM, é preferido. O formato ou o etanol são também introduzidos em contínuo, numa concentração desde de 100 a 1200 mM, preferencialmente numa concentração de cerca de 300 mM para o formato.

A mistura reaccional tem um pH na gama desde de pH 6 a 9, e.g. cercaide pH 8,4, como é usual para reacçoes enzimáticas. A temperatura reaccional é desde os 202C aos 402C, preferencialmente por volta da temperatura ambiente.

Um processo preferido do invento é um como aquele descrito acima, em que a conversão enzimática é realizada num reactor com membrana de enzima.

a) que está equipado com uma membrana de ultrafiltração tendo um limite de exclusão nominal de, por exemplo, desde os 5.000 aos 100.000 daltons, preferencialmente desde os 10.000 aos 100.000 daltons, que foi opcionalmente pré-revéstido com uma proteína não específica, e.g. albumina de soro de bovino.

b) que contém uma mistura reaccional que consiste numa solução de um formato desidrogenado ou um álcool desidrogenase, preferencialmente um formato desidrogenase, o D-lactato desidrogenase do Staphylococcus epidermidis ou o L-lactato desidrogenase do coração do bovino, e dinucleotídeo de nicotinamido-adenina (NAD(H) numa concentração de, por exemplo, desde 0,01 a 1 mM, preferencialmente de cerca de lmM,

c) ao qual existe alimentação contínua de uma solução aquc> sa do substrato, o ácido 2-oxo-4-fenilbutírico, por exemplo na forma de seu sal de potássio ou de sódio, numa concentração até os 500 mM, por exemplo numa concentração de desde 20 a 200 mM, preferencialmente de cerca de 50 mM, e formato, por exemplo formato de sódio ou de potássio, ou, respectivamente, etanol, por exemplo, numa concentração de desde 100 a 1200 mM, preferencialmente de cerca de 300 mM, e

-13d) no qual o composto formado é continuamente retirado numa corrente pelo lado inferior da membrana.

O ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico é um intermediário valioso na preparação de inibidores de ECA ou seus precursores. Esta classe de substâncias activas tem sido assunto de interesse crescente nos anos recentes. Isto alarga o potencial dos agentes anti-hipertênsicos disponíveis e com isso, as terapias possíveis para o composto de controle de pressão sanguínea elevada. Um elemento estrutural significativo num número de inibidores de ECA eficazes é o de fórmula parcial

ÇOOR² —CH2-CH2-CH-NH(III) em que R é hidrogénio ou alquilo inferior, ou seja na configuração S. 0 ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico pode ser usado para a preparação de inibidores de ECA numa maneira conhecida, e sendo atingido um grau elevado de pureza enantiomérica (ver em relação a este assunto, por exemplo, a Aplicação da Patente Europeia 206993). O valor particular do presente invento é inter alia que, na síntese dos inibidores de ECA, que compreende passos numerosos, seja possível usar um composto enantioméricamente puro num estágio relativamente cedo da síntese. De interesse particular em relação a esta matéria é a preparação do inibidor de ECA, o l-carboximetil-3S-/(lS-etoxicarbonil-3-fenilpropil)aminq7-2,3,4,5-tetra-hidro-lH-benzazepin-2-ona. O ácido S-2-hidroxi-4-fenilbutírico é adequado numa maneira aná-14-

loga, para a preparação de enantiómeros do inibidor de ECA e para estudos toxicológicos.

Os exemplos seguintes são entendidos como ilustradores de presente invento sem a aplicação de qualquer sua limitação para o âmbito dos Exemplo.

Abreviações ee - excesso enantiomérico

FDH - formato desidrogenase

CLAR- cromatografia líquida de alto rendimento

K^. - constante de inibição

K,. - constante de Michaelis-Menten

LDH - lactato desidrogenase

NADH- dinucleotídeo de nicotinamido-adenina rpm - rotações por minuto

U - unidade da actividade do enzima (definido sob as condições reaccionais, 1 U produz uma conversão de substância de 1 umol/min).

V - velocidade reaccional máxima max

-15Redução enzimática do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico com extractos em bruto microbianos (instruções gerais)

EXEMPLO 1

As estirpes teste são cultivadas com 3 g/1 de D- ou L-lactato durante 3 dias aos 282C, com agitação (250 rpm), em 200 ml da solução nutriente 148 (22 g/1 de glucose, 5 g/1 de extracto de carne de vaca Lab-Lemco /Õxoid/, g/1 de peptona-C, 5 g/1 de extracto de levedura, 3 g/1 de Bacto-caseína/Dif co_7 , 1,5 g/1 de NaCl, pH 6,5) ou solução de nutriente MV7 (2 g/1 de NH^NO^, 1,4 g/1 de NaHPO^, 0,6 g/1 de K₂HPO₄, 0,2 g/1 de MgSO₄.7H₂0, 0,01 g/1 de CaCl₂.2H₂0, 0,001 g/1 de FeSO_4>7H₂0, 1 ml de solução de elemento vestigiário /20 mg/1 de Na₂MoC>₄.2H₂0 , 20 mg/1 de Na₂B₄O^. ΙΟί/Ο , 20 mg/1 de MnSC>₄.H₂O, 20 mg/1 de CuSO₄.5H₂Q7, pH 6,5). As células são lavadas com tampão de fosfato de pH 7,0 e colhidas por centrifugação (20 min., 20.000 rpm) numa centrifugadora Sorvall, Rotor SS34. As células são depois despedaçadas, aos 42C, por tratamento com ultra-sons a 375 W, durante 45 minutos num aparelho para despedaçar células ultrassónicas W-375. Depois de centrifugar uma vez mais, o extracto em bruto do enzima é incubado com o substrato na mistura teste seguinte, aos 282C, com agitação, durante 3 a 5 dias (até que a conversão esteja completa):

ml do sobrenadante de centrifugação (extracto em bruto) ml de tampão de fosfato pH 7 (0,069 M) g/1 de ácido 2-oxo-4-fenilbutírico 18 g/1 de etanol g/1 de NAD(H)

100 U de álcool desidrogenase de levedura (Boehringer)

-16Quando a reacção estiver completa, a solução é ajustada a pH 2, com ácido clorídrico 2N. O produto, que depois cristalisa é extractado com acetato de etilo. 0 solvente é destilado e o resíduo é seco in vacuo para originar ácido 2-hidroxi-4-fenil-butírico cristalino de pureza enantiomérica diferente, dependendo do extracto microbiano testado.

ácido cristalino é dissolvido em etanol absoluto e reagido com gás de cloreto de hidrogénio, durante 24 horas, à temperatura ambiente. Depois de destilação do álcool e desgasificação breve sob um alto vácuo, um óleo amarelo claro permaneceu que é analizado por CLAR a 255C/32 bar numa coluna quiral (250 x 4,6 mm d.i., com uma velocidade de entrada de 1 ml/min, fase estacionária de Chiralcel OD /Stehelin, Basle7 do tipo OD-5-15-20925, fase móvel de 90% de hexano -10% de isopropanol -0,1% de dietilamina). As substâncias a ser analisadas estão presentes no eluente numa concentração de 1 mg/ml (quantidade:injectado 10 pl). A análise é realizada num comprimento de onda de 210 nm, e avaliação por comparação da área da superfície com um padrão externo. Os valores de ee encontrados para os extractos microbianos investigados estão indicados no Quadro 2.

QUADRO 2

Excesso enantiomérico na redução com extractos em bruto microbianos

Estirpe teste (extrato)		ee		Cultura para a fonte de C
Lactobacillus brevis DSM 20054		28 %	(R)	glucose
Staphylococcus epidermidis DSM 20042		78 %	(R)	glucose
Saccharomyces cerevisiae baker's yeast Migros 76 10	2011	96 %	(R )	glucose
Kloeckera sp. 2201 ATCC 48 180 (Candida boidinii, T. Egli	2201)	97 %	(R )	glucose
Saccharomyces cerevisiae baker's yeast Migros 76 10	2011	90 %	(R)	L-lactato
Hansenula polymorpha CBS 4732		98 %	(R )	D-lactato
	EXEMPLO 2
Redução enzimática do ácido	2-oxo·	-4-fenilbutírico com desidro

genases comercialmente disponíveis substrato é incubado com uma desidrogenase comercialmente, disponível na mistura teste se-18guinte, aos 282C, com agitação suave, durante 3 a 7 dias (até que a conversão esteja completa):

de fosfato pH 7 (0,069 M)

-oxo-4-fenilbutírico desidrogenase de levedura (Boehringer) teste (desidrogenase comercialmente di

50	ml	de	tampão
3	g/i	de	ácido 2
18	g/i	de	! etanol
20	0 u	de	álcool
20	0 u	do	enzima
1	g/i	de	NAD(H)

sponível)

O excesso enantiomérico do ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico ou de ácido S-2-hidroxi-4-fenilbutírico é determinado como descrito no Exemplo 1. Os resultados estão indicados no Quadro 3.

QUADRO 3

Excesso enantiomérico na conversão do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico com desidrogenase comercialmente disponível

-19Enzima testado ee

D-LDH	do	Lactobacillus leichmanii (Boehringer)	> 9 9%	(R)
D-LDH	do	Lactobacillus leichmannii (Sigma)	> 98%	(R)
D-LDH	do	Leuconostoc mesenteroides (Sigma)	> 98%	(R)
D-LDH	do	Staphylococcus epidermidis (Sigma)	-100%	(R)
			<0,2%	(S)
L-LDH	do	coração de bovino (Fluka)	-100%	(S )

Uma comparação dos valores ee mostram que os enzimas isolados são mais adequados do que os extractos em bruto microbianos para a redução estereospecífica do substrato, visto que o excesso enantiomérico do ácido R- ou

S-2-hidroxi-4-fenilbutírico para enzimas isoladas é significativamente superior. De modo a obter valores de ee identicamente elevadas, os enzimas seleccionados devem ser enrequecidas a partir dos extractos em bruto em adição, por passos de purificação .

EXEMPLO 3

Redução enzimática do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico com desidrogenase comercialmente disponível num reactor com membrana de enzima (RME)

-20A conversão contínua do ácido 2-οχο-4-fenilbutírico ao ácido R- ou S-2-hidroxi-4-fenilbutírico é realizada num reactor com membrana de enzima de membrana plana (RME) mantido aos 25SC, com um volume do reactor de 10 ml. A membrana de ultrafiltração de acetato de celulose de 62 mm de diâmetro tem um limite de exclusão de 10.000 daltons e foi pré-revestida com 50 mg de albumina de soro de bovino.

Um procedimento reaccional óptimo é determinado por análise com a ajuda de cinéticas de enzimas experimentalmente determinadas, i.e. por determinação das constantes cinéticas (K„,, K_ , V ) para o D- ou L-lactato desidroM' I' max genase e formato desidrogenase para concentrações de substrato de 50, 100 e 150 mM, por simulação do comportamento do reactor por cálculo dos balanços mássicos dos reagentes. O Runge-Kutta-Program é aplicado, na qual os parâmetros tempo de ocupação, concentração do educto e concentração do cofactor e as meias vidas dos enzimas são variados (ver Hoffmann & Hoffmann. Einfuhrung in die Optimierung mit Anwendungs beispielen aus dem Chemie-Ingenieurwesen, Weinheim 1971).

A solução do substrato contém 50 mM do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico, 300 mM de formato de potássio e 0,1 mM de NAD(H), 2,6 U/ml de D-LDH e 4,8 U/ml de FDH ou

1,4 U/ml de L-LDH e 2,5 U/ml de FDH são introduzidos. A solução reaccional é bombada para o reactor continuamente a uma velocidade de 10 ml/h e o produto é extraído através da membrana. O tempo de ocupação no reactor é de 60 minutos para a conversão com D-LDH e de 120 minutos para a conversão com L-LDH. As actividades dos enzimas são continuamente monotorizadas e, se neces sário, mantidas constantes por mais adição.

Os dados da produção são dados no

Quadro 4.

QUADRO 4

Dados de produção

	D-LDH	L-LDH
duração do teste (produção contínua)	450 .h	100 h
conversão:	0 84 %	0 77%
Excesso enantiomérico:	-100% ee (R)	-100% ee (S)
concentração do produto:	0 42,5 mM =	0 38,5 mM =
Produtividade:	184 g/l x d	1,6 g/l x d
	EXEMPLO 4
Síntese do l-carboximetil-3S	-/(lS-et oxi carbon il-	3-fenilpropil)-
-aminq7-2,3,4,5-tetra-hidro-	lH-benzazepin-2-ona	(inibidor de

ECA)

4.1. Síntese do éster etílico do ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico

5,0 g do ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico são dissolvidos em 50 ml de etanol absoluto e reagidos com gás de cloreto de hidrogénio durante 24 horas à temperatura ambiente. Depois de destilação do álcool e desgasificação breve sob um alto vácuo, um óleo amarelo claro (5,7 g) permanecem dos quais, de acordo com a análise por CLAR numa coluna quiral (ver Exemplo 1), ^,99,8% consistem no éster de configuração R. Menos do que 0,2% consistem no éster de configuração S. O óleo é destilado a 100 a 105SC e a 6,5 pascal, para originar 5,2 g do éster etílico do ácido (-)-R-2-hidroxiz z 20

-4-fenilbutirico com uma rotação optica de /c</_D =-20,8° (1% em clorofórmio).

4.2. Síntese do éster etílico do ácido (+)-R-2-(4-nitrobenzeno sulfoniloxi)-4-fenilbutirico

9,75 g (46,8 mmol) do éster etíli co do ácido (-)-R-2-hidroxi-4-fenilbutirico (^99,6% ee) são dissolvidos em 50 ml de tolueno, 11,4 g de cloreto de 4-nitrobenzeno-sulfonilo são adicionados e a mistura reaccional é depois arrefecida aos 0°C. Depois da adição de 6,25 g de trietilamina, a mistura reaccional é aquecida à temperatura ambiente durante um período de 30 minutos e trabalhada, obtendo-se, em rendimento quantitativo, o éster etílico do ácido (+)-R-2-(4-nitrobenzeno-sulfoniloxi)-4-fenilbutirico, tendo uma rotação , 20 optica de /c%/_D = +13,29 (3% em etanol absoluto).

4.3. Síntese do l-carboximetil-3S-/~( lS-etoxicarbonil-3-f enil propil ) - amino.7-2 ,3,4,5-tetra-hidro-lH-benzazepin-2-ona

46.1 de éter terc.-butílico do ácido 3-(S)-aminobenzazepin-2-ona-l-N-acético, 84,3 g do éster etílico do ácido (+)-R-2-(4-nitrobenzeno-sulfoniloxi-4-fenil-23butírico opticamente puro (^.99,6% ee) e 19,53 g de N-metilmorfolino são reagidos sem solventes, durante 9 horas, a 75 a 80°C. 0 sal de N-metilmorfolino do ácido 4-nitrobenzeno-sulfónico que precipita é dissolvido pela adição de 250 ml de acetato de etilo e 150 ml de água, ajustada a pH 8,8, com aproximadamente 150 ml de solução de soda 2N, e a fase de acetato de etilo é separada e lavada duas vezes mais com água. O acetato de etilo é destilado para originar um óleo (98 g) que em CLAR mostra uma relação de diastereoisómeros de pelo menos SS:SR=99,8:0,2.

A substância activa em bruto é preparada por passagem de 54 g de gás de cloreto de hidrogénio na solução de 96 g do óleo acima mencionado em 200 ml de acetato de etilo, a 0 a 10QC. Quando a solvólise do éster terc.-butílico estiver completa, a substância activa é obtida na forma de uma suspensão finamente cristalina. O excesso de cloreto de hidrogénio é removido completamente por destilação repetida do acetato de etilo, em vácuo. A suspensão de cristais altamente concentrada é depois diluída com 200 ml de acetona, filtrada aos 15SC lavada duas vezes com 50 ml de acetato de etilo de cada vez. Depois de secagem em vácuo aos 60°C até que peso constante seja atingido, 62,5 g (85,4%) de uma substância virtualmente activa, branca, tendo uma relação do diastereoisó20 meros de SS : SR=99,9 : 0,1 são isolados /e(/_D =-1382 (1% em etanol absoluto), p.f. 1812C.

EXEMPLO 5

Síntese de l-carboximetil-3S-/~(lR-etoxicarbonil-3-f enilpropil )-aminq7-2,3,4,5-tetra-hidro-lH-benzazepin-2-ona

-24O 1-carboximetil-3S-/( lR-etoxicarbonil-3-fenil propil )-aminq7~2,3,4,5-tetra-hidro-lH-benzazepin-2-ona é preparada a partir do ácido S-2-hidroxi-4-fenilbutírico numa maneira análoga ao descrito no Exemplo 4.

Claims

lã. - Processo para a preparação do enantiómero R do ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico de fórmula (I)

OH

V (I), ! Óooh ou do enantiómero S do ácido 2-hidroxi-4-fenilbutírico de fórmula (II)

Ϊ íí (II) caracterizado por compreender a redução do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico com o enzima D-lactato-desidrogenase (D-LDH) do Staphylococcus epidermidis ou com o enzima L-lactato-desidrogenase (L-LDH) do coração de bovino, respectivamente, na presença de um dador de electrões e de um sistema de enzima/substrato para a regeneração do dador de electrões.

25. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação do ácido R-2-hidroxi-4-fenilbutírico, caracterizado por compreender a redução do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico com o enzima D-lactato-desidrogenase (D-LDH) do Staphylococcus epidermidis, na presença de um dador de electrões e de um sistema de enzima/substrato para a regeneração do dador de electrões.

35. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender a prepara_ ção do ácido 2-hidroxi-4-fenilbutirico com uma pureza enantio mérica superior a 99,6% ee, (excesso enantiomérico).

45. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por compreender a utilização do dinucleotídeo de nicotinamida-adenina (NAD(H)) como um dador de electrões e formato-desidrogenase (FDH)/formato como o sistema de enzima/substrato, para a regeneração do dador de electrões.

55. - Processo de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado por compreender a utilização do dinucleotídeo de nicotinamida-adenina (NAD(H)) como o dador de electrões e álcool-desidrogenase (ADH)/etanol como o sistema de enzima/substrato, para a regeneração do dador de electrões.

65. - Processo de acordo com qual^ quer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por compreen der a realização da conversão enzimática continuamente.

7ê. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreen der a realização da conversão enzimática num reactor com membrana de enzima.

8â. - Processo de acordo com a rei^ vindicação 7, caracterizado por compreender a realização da conversão enzimática num reactor com membrana de enzima,

a) que está equipado com uma membrana de ultrafiltração,

b) que contém uma mistura reaccional, que consiste numa solução de um formato desidrogenase ou de um álcool desidrogenase, do D-Lactato desidrogena-se do Staphylococcus epidermi dis ou do L-Lactato desidrogenase do coração de bovino, e de dinucleotídeo de nicotinamida adinina (NAD(H)),

c) ao qual existe alimentação continua de uma solução aquosa do substrato do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico e formato ou etanol, respectivamente, e

d) no qual o composto formado é extraído a jusante da mem brana.

9â. - Processo de acordo com a rei^ vindicação 7 ou 8, caracterizado por compreender a realização da conversão enzimática num reactor com membrana de enzima,

a) que está equipado com uma membrana de ultrafiltração com uma exclusão nominal limite desde de 5.000 a 100.000 daltons ,

b) que contém uma mistura reaccional, que consiste numa solução de um formato-desidrogenase ou um álcool-desidrogenase, do D-lactato-desidrogenase do Staphylococcus epidermidis ou do L-Lactato-desidrogenase do coração de bovino, e desde de 0,01 a 1 mM de dinucleotídeo de nicotinamida-adenina (NAD(H))

c) ao qual existe alimentação continua de uma solução aquo sa de até 500 mM de substrato de ácido 2-oxo-4-fenilbutírico, e desde de 100 a 1200 mM de formato ou etanol, respectivamente , e

d) no qual o composto formado é continuamente extraído na jusante da membrana.

lOâ. - Processo de acordo com qual quer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado por compreender a realização da conversão enzimática num reactor com mem brana de enzima no qual a membrana de ultrafiltração foi pré -revestida com uma proteina não específica.

114. - Processo para a prepara ção de l-carboximetil-3S-l/?LR ou lS-etoxicarbonil-3-fenilpropil )-amino_/-2,3,4,5-tetrahidro-lH-benzazepin-2-ona , caracterí zado por se fazer reagir um composto de fórmula I ou II obtidos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, com etanol e cloreto de hidrogénio gasoso durante 24 horas, à tem peratura ambiente; se fazer reagir o éster etilico de ácido R- ou S-2-hidroxi-4-fenilbutírico obtido com cloreto de 4-nitrobenzenosulfonilo e trietilamina a 09C à temperatura ambieri te; se fazer reagir o éster etilico do ácido R- ou S-2-(4-nitrobenzenosulfoniloxi)-4-fenilbutírico anteriormente obtido com ester terc.-butilico do ácido S-3-aminobenzazepin-2-ona-1-N acético e N-metilmorfolina durante 9 horas a 75-802C; e

-29se fazer reagir o produto assim obtido com cloreto de hidro génio gasoso e 0-10QC em acetato de etilo.