JPH0239893A - ヒドロキシ酸の製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、非常に高い鏡像異性純度、例えば９９％ｅｅ
　（鏡像異性超過量）の範囲、好ましくは９９．６％ｅ
ｅを上潮るそれを存している、次式（１）の２−ヒドロ
キシ−４−フェニル酪酸のＲ−鏡像体（エナンチオマー
）： 又は次式（ＩＩ）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
のＳ−鏡像体： を調製するための方法に係り、また、この本発明方法は
、電子供与体、例えばニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（ＮＡＤ　（）Ｉ）　）、及び該電子供与体を再
生させるための酵素／基質系、例えばホルマートデヒド
ロゲナーゼ（ＦＤＨ）　／ホルマートの存在下において
、それぞれ、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙ−１ｏｃｏ
ｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来の酵素である
Ｄ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤＨ）又はウシ心臓由来の
酵素であるＬ−乳酸脱水素酵素（Ｌ−ＬＤＩＩ）で２−
オキソ４−フェニル酪酸を還元することを含んでなる。

前記式（１）のＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
の製法は、好ましくは、電子供与体、例えばＮＡＤ　（
Ｈ）、及び該電子供与体を再生させるための酵素／基質
系、例えばホルマートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ）　／
ホルマートの存在下において、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由
来の酵素であるＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤＨ）を用
いて行われる。本発明方法は、好ましくは酵素膜反応器
内で連続的な酵素変換を行うのにとりわけ適している。

前記式（１）のＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
は、ＡＣＥ　（アンギオテンシン変換酵素）抑制剤又は
その前駆体を調製する場合の貴重な中間体である。また
、前記式（ＩＩ）の５−２−ヒドロキシ−４−フェニル
酪酸は異性体化合物の調製に用いられる。

〔従来の技術］ 立体特異性微生物還元によってカイラル化合物を製造す
ることは公知である（概論として、Ｓｉｍｏｎｅｔ　ａ
ｌ、八ｎｇｅｗ、ｃｈｅｍｉｓ　９７．５４Ｌ　１９８
５を参照されたい）。生物触媒として、微生物そのもの
、例えば菌類（例えばムコール、ゲオトリクム、サツカ
ロミセス、カンジダ）又はバクテリア類（プロテウス、
プソイドモナス）が屡々用いられている。

また、微生物抽出物を使用することも可能である。

電子供与体は、例えば、炭水化物（例えばグルコース、
ホルマート、エタノール、水素又は電気化学電池用のカ
ソードである。基質の還元は、いわゆるファイナルレダ
クターゼ（還元酵素）によって、例えば基質−特異的脱
水素酵素（デヒドロゲナーゼ）によって行われる。ファ
イナルレダクターゼによって要求される還元当量は、一
般に、補酵素（コエンチーム）によって、例えばピリジ
ンヌクレオチド、例えばＮＡＤＨにコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチド）及びＮＡＤＰＨにコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチドホスフエート）によって、あるいは
フラビンヌクレオチド、例えばＦ）ＩＮｌ＋　（フラビ
ンモノヌクレオチド）及びＦＡＤＨ（フラビンアデニン
ジヌクレオチド）によって、もたらされる。

さらに、還元されたヌクレオチドは、通常、一連の酵素
触媒工程（ｆｉ争電子受容体がこれらの工程において形
成される）において製造されるか、さもなければ、天然
もしくは合成のメディエタ（例えばフェレドキシン、ビ
オロゲン）による電子移動によって製造される。さらに
また、メディエタから直接に電子を受は取ることができ
るファイナルレダクターゼも知られている。

生物触媒として、精製した酵素類、すなわち分離したレ
ダクターゼもまた適当である。このような場合には、一
般に、還元されたピリジンヌクレオチド又はフラビンヌ
クレオチドを添加することが必要である。さらに必要な
ものとしては、補酵素の酵素再生に存効な系、すなわち
、第２の酵素とその基質がある。Ｙａｍａｚａｋｉ及び
Ｍａｅｄａ（Ａｇｒｉｃｏｌ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、５０．２６２Ｌ　１９８６）は、
ヘンジイルホルマートからＲ−（−）−マンデル酸を合
成するためのものであって、Ｎ　Ａ　Ｄ　ＩＩ及び糞便
連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃａｌ
ｉｓ）由来のベンゾイルホルマートデヒドロゲナーゼの
助けによりこれを行うバッチ法を記載している。この方
法もまたバイオリアクタ内で連続的に実施することがで
き、かつ、その際、ホルマートデヒドロゲナーゼ及びホ
ルマートを用いて補酵素の再生を行うことができる（Ｙ
ａｍａｚａｋｉ及びＭａｅｄａ、　Ａｇｒｉｃｏｌ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、５０３２１３、１９８６）。欧州特
許第ＥＰＯＯ２４５４７号明細書には、酵素膜反応器内
において水溶性α−ケトカルボン酸を連続的に酵素変換
して対応のα−ヒドロキシカルボン酸に変えるための方
法が記載されている。この変換は、ＮＡＤ（＋１）　（
ポリエチレングリコールに結合させることによって分子
量を増大させておく）の存在下において、かつ乳酸脱水
素酵素の存在下において、同時にホルマートデヒドロゲ
ナーゼ及びホルマートによるＮＡＤＨ再生を行うことに
よって、実施することができる。

酵素反応において決定的に重要なこととして、用いられ
る酵素の性質及び由来、すなわち、この場合にはファイ
ナルレダクターゼあるいは！’Ｊｆ特異な脱水素酵素が
ある。ここで注意しなければならないこととして、同じ
タイプの酵素であったとしても、それらの酵素が異なる
生成源、例えば異なる微生物から分離されたものである
とすると、それらの酵素の生理学的挙動はいろいろに変
化可能である。差違が存在するのは、例えば反応の特異
性、基質の特異性と立体特異性、そして運動ファクタ、
例えばＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数及び抑制
定数のような生物変換のための決定的ファクタに関して
である（先に引用のＳｉｍｏｎ　ｅｔ　ａｔ）。例えば
、すでに知られている文献からのデータを比較すると、
乳酸肝菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃｏｎｆｕｓ
ｕｓ）由来のＤ−乳酸脱水素酵素はビルバート、２−ケ
トブチラード及びフェニルピルパートを変換するけれど
も、この酵素は、しかし、２−ケトバレレート、２ケト
カプロエート及び２−ケト−３−メチルバレレートを還
元しないということが明らかとなるであろう。個々の酵
素／基質系の挙動は、そのために、それぞれのケースご
とに試験しなければならずかつ、前記ＥＰＯＯ２４５４
７はこの結論を指摘しているというものの、一般化によ
って予測することはできない。

〔発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、２−オキソ−４−フェニル酪酸の鏡像
選択的酵素還元によって、高度の鏡像異性純度を有して
いる２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸のＲ−及びＳ−
鏡像体を調製するための有効な方法を見い出すことにあ
る。この物質は、α−ケトカルボン酸の酵素還元に係る
従来技術のなかにおいて基質として記載されておらずか
つ、したがって、酵素還元におけるその適応性及び挙動
が研究されていない。

〔課題を解決するための手段〕

Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の調製に関して
、上記した目的を達成するのに特に適当であることが判
明した方法は、電子供与体及び該電子供与体を再生させ
るための酵素／基質系の存在下において表皮ブドウ球菌
（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉ
ｓ）由来の酵素、Ｄ−乳酸脱水素酵素で基質を還元する
方法である。なぜなら、その他の微生物由来の乳酸脱水
素酵素と比較して、前記表皮ブドウ球菌由来のＤ−ＬＤ
Ｈは、用いられる基質に関しての高い比活性（変換され
た基質１ｍｇ当りの単位数あるいは蛋白質の■数Ｘ分当
りの変換量μモル）によって特に区別され（第１表を参
照）、そして高い鏡像選択性を有するからである。同じ
理由から、基質をウシ心臓由来の酵素、Ｌ−乳酸脱水素
酵素で還元するタイプの同様な方法は、Ｓ２−ヒドロキ
シ−４−フェニル酪酸を調製するのにとりわけ適当であ
る。これらの両方の方法について、特に酵素膜反応器内
における連続的な反応プロセスが有利である。

男−」−一支 市販の脱水素酵素の比活性の比較 高い鏡像選択性を有している基質−特異的脱水素酵素と
しての表皮ブドウ球菌（Ｓ　ｔａｐｈｙ　ｌｏｃｏｃｃ
ｕｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＤ−ＬＤＨを基質
としての２−オキソ−４−フェニル酪酸と組み合わせる
と、高い生産性値、良好な空時収量、そしてその結果と
して、大規模で実施される酵素変換において非常に重要
でありかつかなり経済的の利点となる安価の保証が得ら
れる。

表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＤ−乳酸脱水素酵素又はウ
シ心臓由来のし乳酸脱水素酵素のために用いられる電子
供与体は、好ましくは、その還元された形にある補酵素
、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）
であり、また、この補酵素は、Ｄ−又はＬ−ＬＤＨによ
ってＮＡＤに酸化せしめられる。この補酵素の再往のた
め、ＮＡＩ）Ｉ（−リサイクル酵素とその基質、例えば
ホルマート、エタノール、イソプロパツール、シクロヘ
キサノール、その他からなる酵素／基質系が用いられる
。ホルマートデヒドロゲナーゼ（ＦＤＩ＋）　／ホルマ
ート系であってそのホルマートとして蟻酸の塩、例えば
アルカリ金属ホルマート、例えばカリウム又はナトリウ
ムホルマートを使用したもの、あるいはアルコールデヒ
ドロゲナーゼ（ＡＤＨ）　／エタノール系が有利である
。これらの系を使用すると、副産物として、それぞれＣ
Ｏ□／ＨＣＯｆｆ−及びアセトアルデヒドが生成せしめ
られる。

本発明方法によると、生成物であるＲ−又は５−２−ヒ
ドロキシ−４−フェニル醋酸が高度の鏡像異性純度でも
って得られる。ここで、“高度の鏡像異性純度°′なる
記載は、それを本願明細書において用いた場合、問題と
している鏡像体がその他の鏡像体との混合物中で最低９
８％ｅｅ、好ましくは９９％ｅｅを上廻って存在してい
ることを意味する。

ハツチ法では、ｉｔである２−オキソ−４−フェニル酪
酸の例えばそのカリウム又はナトリウム塩の形をしたも
のの５００ｍＭまでの濃度の、例えば２０〜２００ｍＭ
の、好ましくは５０ｍＭの濃度の水溶液を、変換が完結
するまでの間、０．０１〜１０ｍＭ、好ましくは約０．
１ｍＭの濃度の補酵素であるＮＡＤ（ｌ（）、１００−
１２０抛Ｈ１好ましくは約３００ｍＭの濃度のＮＡＤＨ
−リサイクル酵素、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ
又はホルマートデヒドロゲナーゼ、及びそれぞれエタノ
ール又はホルマート、そして表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙ−ｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由
来のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱
水素酵素と撹拌しながらインキュベーションする。

酵素は、有利には、ＮＡ叶−リサイクル酵素の活性と基
質−特異の脱水素酵素の活性の比がｌ　：　０．１〜１
：５であるような量でもって用いられる。反応混合物は
、酵素反応に通常用いられているように、ｐＨ６〜９の
範囲のｐＨ値、例えばｐＨ８，４を有している。反応温
度は２０〜４０”Ｃ１好ましくは室温のあたりである。

生成物は、反応混合物から、酸、例えば鉱酸、例えば塩
酸などを添加することによって結晶化させる。

連続反応法の場合には、用いられる酵素を固定化するの
が一般的である。酵素は、例えば、重合体マトリックス
中に包括したり、半透膜からなるカプセル又は繊維内に
包括したりあるいは限外濾過膜によって包括したりする
ことができ、さもなければ、２官能性又は多官能性の試
薬で架橋化したりすることができ、さもなければ、吸着
によって、あるいは無機物質からなるかもしくは天然又
は合成の重合体からなる担体に対するイオン結合又は共
有結合によって固定したりすることができる。この連続
方法のため、いろいろなタイプのバイオリアクタ、例え
ば撹拌式反応器、固定床式反応器、流動床式反応器又は
膜反応器を使用することができる（概論として、Ｈａｒ
ｔｍｅｉｅｒ、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓｉｅｒｔｅ　Ｂｉ
ｏｋａｔａｌｙｓａｔｏｒｅｎ　、　Ｂｅｒｌｉｎ　１
９８６を参照されたい）。

本発明のＥＭＲプロセス（酵素膜反応器内の連続法）に
おいて、用いられる反応容器は、好ましくは、用いられ
る酵素と変換に必要な補酵素を保持するけれども低分子
量の生成物及び未変換の基質を通過せしめる限外濾過膜
を装備した膜反応器である。膜反応器の大きな利点とし
ては、生物触媒を自然な形で、すなわち、未変性の形で
使用することができ、かつ別法で必要であった固定化の
だめの定着工程（この工程は通常不活性化作用を有した
）を実施することが不必要であるということがある。酵
素膜反応器は、例えば、フラット膜（チャンバ膜）反応
器あるいは中空繊維膜反応器であることができる。基質
を、例えば計量ポンプによって反応室に供給し、反応混
合物を撹拌するかもしくはポンプで循環させ、そして膜
を通過した生成物含有の濾液の流れを引き抜く。本発明
の目的に用いられる膜は、好ましくは、５０００〜１０
００００ダルトン、例えば１００００〜１ｏｏｏｏｏダ
ルトンの公称排斥限度（ｎｏｍｉｎａｌ　ｅｘｃｌｕｓ
ｉｏｎ　１１ｍ１ｔ）を存するものである。これらの膜
に適当な材料は、例えば、アセチルセルロース、ポリア
ミド、ポリスルホン又は変性ポリビニルアルコールであ
る。反応に含まれる酵素が膜上に吸着せしめられるのを
防止するため、その膜に非特異性蛋白質、例えばウシ血
清アルブミンを予備被覆することができる。

膜反応器内の反応混合物は、ＮＡＤＨ−リサイクル酵素
、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ又は好ましくはホ
ルマートデヒドロゲナーゼ、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来
のＤ−乳酸脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水
素酵素、モしてＮＡＤ　（Ｈ）を含をする。ＮＡＤＨ−
リサイクル酵素は、有利には、ＮＡＤＩ＋−リサイクル
酵素の活性と基質−特異的脱水素酵素の比が１　：　０
．１〜１：５となるような量でもって用いられる。必要
な補酵素は、その分子量が増大せしめられていないＮＡ
Ｄ　（Ｈ）、すなわち、自然のＮＡＤ（＋１）の形で用
いられ、また、その使用濃度は０．０１〜ＩＯＴＩＩＭ
、好ましくは約０．１ｍＭである。本発明方法では酵素
膜反応器内において自然のＮＡＤ　（Ｈ）を使用するこ
ともまた可能であるということは、前記ＥＰＯＯ２４５
４７に記載される従来技術に較べて明りょうな利点であ
る。ちなみに、前記ＥＰＯＯ２４５４７では分子量の増
大のためにポリエチレングリコールに結合せしめられた
ＮＡＤ（１１）を使用することが特定されている。この
結合は、しかし、酵素活性のロスを生じることが可能で
ある。例えば、補酵素として、自然のＮＡＤ　（Ｈ）で
はなくてそれに対照的なＰＥＧ−ＮＡＤ（Ｉ（）を使用
した場合、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃ
ｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＤ−乳酸脱水素
酵素の活性がきびしく制限され、そのために、■、１、
値、すなわち、最高反応速度はほんの２．６単位／■で
あり、これとは対照的に、自然のＮＡＤ　（旧のそれは
２６単位／■である。もしもＰＥＧ−ＮＡＤ　（Ｈ）を
使用した連続プロセスにおいて適当な基質変換速度が達
成されるべきであるならば、そのために、ＥＭＲ内にお
いてほぼ１０倍量の酵素を使用することが必要であり、
結果として製造コストの急激な増大がある。限外濾過膜
は、例えば、分子ｉ１２００００のポリエチレングリコ
ールに結合せしめることによってその分子量の増大をは
かったＮＡＤ（Ｈ）を限外濾過膜の背後で有効に保持す
るため、１００００ダルトンの最大排斥限度を有しても
よい。他方において、触媒量の自然のＮＡＤ（Ｈ）を基
質の流れの中で使用する場合、膜の排斥限度は酵素のサ
イズによってのみ定められる。

そのために、反応器の運転時間を制限する反応器内の高
圧力を避けることができるようにするため、５０００−
１０００００ダルトンの排斥限度を有する膜を使用する
ことが可能である。また、自然のＮＡＤ　（Ｈ）使用時
の低圧力に由来して、より小サイズの、がっしたがって
より安価な膜を使用することが、また、より高い処理量
を達成することが、可能である。

自然のＮＡＤ（Ｈ）を使用した場合には、また、５００
〜２０００の範囲内の高サイクル値、も達成される。す
なわち、ＮＡＤ（Ｈ）　１分子についてみた場合、５０
０〜２０００分子のヒドロキシ酸が形成せしめられる。

本発明方法は、したがって、前記ＥＰＯＯ２４５４７に
記載の方法と較べてみた場合、かなりの経済的利点を奏
することができる。

さらに加えて、例えばそのカリウム又はナトリウム塩の
形をした２−オキソ−４−フェニル酪酸の水溶液は、基
質として、反応器に連続的に供給せしめられる。基質は
５００ｍＭを上廻らない濃度で存在させるべきであり、
２０〜２００ｍＭの範囲内、特に約５０ｍＭの濃度が有
利である。同じく、ホルマート又はエタノールも１００
〜１２００ｍＭの濃度で連続的に計量供給せしめられ、
また、ホルマートの場合、約３００ｎＭの濃度が好まし
い。

反応混合物は、酵素反応の場合に通常行われているよう
に、ｐ１１６〜９の範囲のｐＨ値、例えばｐ＋＋８．４
程度を保有する。反応温度は２０〜４０°Ｃ１好ましく
は室温付近である。

本発明の好ましい１方法は、上記したようなものであっ
て、しかも酵素変換が次のような酵素膜反応器内で実施
されるものである： （ａ）公称排斥限度が例えば５０００〜１０００００ダ
ルトン、好ましくは１００００〜１０００００ダルトン
であって、任意に非特異性蛋白質、例えばウシ血清アル
ブミンが予備被覆されている限外濾過膜を装備する。

（ｂ）ホルマートデヒドロゲナーゼ又はアルコールデヒ
ドロゲナーゼ、好ましくはホルマートデヒドロゲナーゼ
、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｅｐ
ｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＤ−乳酸脱水素酵素又はウ
シ心臓由来のＬ−乳酸脱水酵素、そして例えば０．０１
〜ｌＩＩＩＭ、好ましくは約１ｍＭの濃度のニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（Ｈ））の溶液か
らなる反応混合物を含有する。

（ｃ）　　５００ｍＭまでの濃度の、例えば２０〜２０
０ｍＭ、好ましくは約５０ｍＭの濃度の、例えばそのカ
リウム又はナトリウム塩の形をした、基質である２オキ
ソ−４−フェニル酪酸、そしてそれぞれ例えば１００〜
１２００ｍＭ、好ましくは約３００ｍＭの濃度の、ホル
マート、例えばカリウム又はナトリウムホルマート、又
はエタノールの水溶液がこれに連続的に供給される。

（ｄ）形成された化合物が膜の下流側へ連続的に引き抜
かれる。

Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸は、ＡＣＥ抑制
剤又はその前駆体を調製する場合の貴重な中間体である
。近年、このクラスに属する活性物質がますます注目を
あびている。かかる物質は、入手可能な抗高血圧症の可
能性を拡張しかつそれとともに、高血圧のコントロール
のための可能な治療法を拡大する。多数の有効なＡＣＥ
抑制剤において顕著な構造を示すと、次のような部分式
のものである： 上式において、Ｒ２は、水素であるかもしくはすなわち
Ｓ−形状を有する低級アルキル基である。

Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸は公知な手法に
従ってＡＣＥ抑制剤の調製に用いることができ、また、
高度の鏡像異性純度が達成される（これに関しては、例
えば、欧州特許出願第２０６９９３号を参照されたい）
。本発明の特に評価されるべき点は、なかんずく、多数
の工程を含むＡ、　ＣＥ抑制剤の合成時に、その合成の
比較的に早い段階において鏡像異性的に純粋な化合物を
使用することが可能であることである。このことに関連
して特に興味のあるものは、ＡＣＥ抑制剤である１−カ
ルボキシメチル−３３−［（Ｉｓ−エトキシカルボニル
−３−フェニルプロピル）アミノ〕−２、３、４、５−
テトラヒドロ−ＩＨ−ベンズアゼピン−２−オンの調製
である。５−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸は、上
記と同様に、ＡＣＥ抑制剤の鏡像体を調製するためや毒
物学の研究に適している−０ 〔実施例〕 以下に記載する実施例は本発明を説明するためのもので
ある。なお、本発明はこれらの実施例の範囲に限定され
るものではないことを理解されたい。

酪ｍ肌 ｅ　ｅ　１０鏡像異性超過量（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉ
ｃ　ｅｘｃｅｓｓ）Ｆ　Ｄ　Ｈ・・・ホルマートデヒド
ロゲナーゼＨＰ　Ｌ　Ｃ・・・高圧液体クロマトグラフ
ィに、・・・抑制定数 に、４・＝Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数ＬＤ
Ｈ・・・乳酸脱水素酵素 ＮＡ叶・・・ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドｒ
ｐｍ・・・回転７分 Ｕ・・・酵素活性の単位（規定の反応条件下、ＩＵでも
って１ｇモル／分の基質変換が行われる） Ｖ　ｍａＸ・・・最高反応速度 ■± 微生物粗抽出物による２−オキソ−４−フェニル酪酸の
酵素還元 試験菌株を３ｇ／ｆｆｉのＤ−又はＬ〜乳酸塩とともに
２８°Ｃで３日間、撹拌（２５Ｏｒｐｍ）　シながら、
２００威の栄養ン夜１４８　（２２ｇ　／　ｆ！、のグ
ルコース、５ｇ／Ｉ２．のＬａｂ−Ｌｅｍｃｏ牛肉エキ
ス（Ｏｘｏｉｄ）　、５　ｇ／２のペプトンＣ１５ｇ／
ｌのイーストエキス、３ｇ／ｌのＢａｃｔｏ−Ｃａｓｅ
ｉｎ　（Ｄｉｆｃｏ〕、１．５　ｇ　／　１のＮａＣ１
、ｐＨ６、５）又は栄養液ＭＶ７（２ｇ、＃のＮ）１．
ＮＯ２、１，４ｇ　／　１のＮａｚＨＰＯ４，０，６ｇ
　／　１のに２１１ＰＯ４、０，２ｇ／ｊ２ノＭｇ５０
４−７１１２０．０．０１ｇ／４２＜７）　ＣａＣｆｆ
１ｚ−２）１ｚｏ、０．００１ｇ／ｆノＦｅ５０．・７
ＨｚＯ。

１ｒｎＩｌの微量元素溶液［２０ｍｇ／　ｌのＮａｚ）
１ｏＱａ、　２０ｑ／　ｎ　（７）Ｎａ２Ｂ４０７−１
０１１２０　、２０ｍｇ／　Ｉ！、（７）ＺｎＳＯ４・
７１１２０２０ｍｇ／　ｌ　ノＭｎ５Ｏａ　・１ｌｚＯ
、２０ｍｇ／　ｌのＣｕＳＯ４・５ｏｚｏｌ　１ｐＨ６
，５）中で培養した。細胞を燐酸塩緩衝液（ｐ＋＋７．
０）で洗浄し、５ｏｒｖａ　１１社の遠心分離機、Ｒｏ
ｔｏｒＳＳ３４中で遠心分離（２０分間、２０００Ｏｒ
ｐｍ　）することによって収穫した。次いで、これらの
細胞を０１　ｔｒａｓｏｎｉｃｓ社製のＣｅ１ｌｄｉｓ
ｔｒｕｐｅｒ　Ｗ−３７５中で３７５Ｗで４５分間にわ
たって超音波処理することによって、４　’Ｃで分裂さ
せた。もう１度遠心分離を行った後、酵素の粗抽出物を
２８°Ｃの次のような試験混合物中の基質ともども、撹
拌しながら、３〜５日間にわたって（変換が完結するま
で）インキュベーションに供した： ５ｄ　　　　遠心分離上澄み液（粗抽出物）２０／ｄ　
　　　燐酸塩緩衝液、ｐＨ７（０，０６９Ｍ　）３ｇ／
ｌ　　２−オキソ−４−フェニル酪酸１８ｇｚ！　　エ
タノール １ｇ／β　ＮＡＤ　（Ｈ） １００Ｕ　　　イーストアルコールデヒドロゲナーゼ（
Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ） 反応の完結時、溶液に２Ｎ塩酸を加えてそのｐｉ値をｐ
Ｈ２に調節した。晶出した生成物を酢酸エチルで抽出し
た。溶媒を留去し、そして残渣を真空中で乾燥した。試
験に供した微生物抽出物に応じて鏡像異性純度を異にす
る結晶の２−ヒドロキシ４−フェニル酪酸が得られた。

結晶の形をした酸を無水エタノールに溶解し、そして塩
化水素ガスと室温で２４時間にわたって反応させた。ア
ルコールを留去しかつ貰度の真空下に手早く脱ガスを行
った後、淡黄色の油状物が残留した。次いでこの油状物
をカイラルカラム（２５０Ｘ　４．６鵬内径、処理量／
　１　ｄ／分、固定相Ｃｈｉｒａｌｃｅｌ　００　（Ｓ
ｔｅｈｅｌｉｎ社、Ｂａ５ｌｅ在〕タイプ００−５−１
５−２０９２５、移動相９０％ヘキサン−１０％イソプ
ロパノ−ルー０．１％ジエチルアミン）上で２５°Ｃ／
３２バールで肝ＬＣによって分析した。被分析物質を１
■／戚（注入量１　ｍｇ　／　ｍｌ　）の濃度で溶離剤
中に存在させた。走査を２１０ｎｍの波長で実施し、そ
して外部標準との表面積比較により評価を行った。被検
微生物抽出物について見出されたｅｅ値を次の第２表に
示す。

男−」ニー表 微生物粗抽出物による還元における鏡像異性超過量るま
で）イ ０ｍ１ ３ｇ／２ １８　ｇ　／　ｆｆｉ ンキュベーションに供した： 燐酸塩緩衝液、ｐＨ７（０，０６９Ｍ）２−オキソ−４
−フェニル酪酸 エタノール １　ｇ　／　ｌ　　ＮＡＤ（Ｈ） Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸又はＳ２−ヒド
ロキシ−４−フェニル酪酸のｔＪ！　（ｉ　ｎ　性活性
を前記例Ｉに記載のようにして測定した。結果を次の第
３表に示す。

±１ 商業的に人手可能な脱水素酵素による２−オキソ−４−
フェニル酪酸の酵素還元 基質を２８°Ｃの次のような試験混合物中の商業的に入
手可能な脱水素酵素ともども、静かに撹拌しながら、３
〜７日間にわたって（変換が完結す第工β−−−表 上記したｅｅ稙を比較するに、基質の立体特異的還元に
ついてみた場合、分離酵素のほうが微生物粗抽出物に較
べてより適当であること、そしてその理由として、分離
酵素の場合のＲ−又は５−２−ヒドロキシ−４−フェニ
ル酪酸の鏡像異性超過鼠は顕著に大であることがあげら
れること、が判る。選択的酵素では、同じように高いｅ
ｅ値を得るために、精製」二程のほかに、粗抽出物から
の富化を行わなければならないであろ−う。

捌１ 酵素膜反応器（ＥＭＲ）内における商業的に入手可能な
脱水素酵素による２−オキソ−４−フェニル酪酸の酵素
還元 ２−オキソ−４−フェニル酪酸のＲ−又ハＳ２−ヒドロ
キシー４−フェニル酪酸への連続変換を２５°Ｃに保持
しかつ反応器容量が１０戒である平滑膜型酵素膜反応器
（ＥＭＲ）内で実施した。直径６２ｍの酢酸セルロース
限外濾過膜は、公称排斥限度が１００００ダルトンであ
り、また、５０１■のウシ血清アルブミンの予備被覆を
保有した。

最適な反応プロセスの決定は、実験的にもとめられた酵
素運動論の補助の下に分析を行うことによって、すなわ
ち、基質濃度５０．１００及び１５０ｍＭについてのＤ
−又はＬ−乳酸脱水素酵素とホルマートデヒドロゲナー
ゼの運動定数（ＫＭ　、　Ｋｌ　、　Ｖ−Ｘ）を測定す
ることによって、そして反応体の質量バランスの計算に
よって反応器の挙動のシミュレーションを得ることによ
って、行った。Ｒｕｎｇｅ−ＫｕｔｔａＰｒｏｇｒａｍ
”を適用するとともに、パラメータ：滞留時間、抽出物
濃度及び助因子の濃度ならびに酵素の半減期を変更した
（Ｈｏｆｆｍａｎｎ及びＨｏｆｆｍａｎｎ。

”ＥｉｎｆＴｈｈｒｕｎｇ　　ｉｎ　　ｄｉｅ　　Ｏｐ
Ｌｉｍｉｅｒｕｎｇ　　ｍｉｔ　　Ａｎｗｅｎｄｕｎｇ
−ｓｂｅｉｓｐｉｅｌｅｎ　ａｕｓ　ｄｅｍ　Ｃｈｅｍ
ｉｅ−Ｉｎｇｅｎｉｅｕｒｈｅｓｅｎ　。

Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　１９７１を参照されたい）。

基質溶液は、５０ｍＭの２−オキソ−４−フェニル酪酸
、３００１の蟻酸カリウム、そして０．１＋ｎＭのＮＡ
Ｄ　（Ｈ）を含有した。２．６　Ｕ　／　ｍｆｌのＤ−
ＬＤＨ及び４．８Ｕ　／　ｍｌのＦＤＨ又は１．４Ｕ／
ｍｌのＬ−ＬＤＩ＋及び２．５Ｕ／ｄのＦＤＨを導入し
た。この反応溶液を１０ｍ１／ｈの速度で連続的に反応
器にポンプ送入し、そしてその生成物を膜を介して引き
抜いた。反応器内の滞留時間は、Ｄ−ＬＤＩ＋を用いた
変換の場合が６０分間、そしてＬ−ＬＤＩを用いた変換
の場合が１２０分間であった。酵素活性を連続的にモニ
タリングし、そして必要に応じて、さらに添加を行って
一定に保持した。

生成物のデータを次の第４表に示す。

】−二り一表 生成物のデータ 五人 ■−カルボキシメチルー３３−［（１３−エトキシカル
ボニル−３−フェニルプロピル）アミン］２．３．４．
５−テトラヒドロ−ＩＨ−ベンズアゼピン−２−オン（
ＡＣＥ抑制剤）の合成４、Ｉ　　Ｒ−２−ヒドロキシ−
４−フェニル醋酸エチルエステルの合成 ５．０ｇのＲ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を５
０ｄの無水エタノールに溶解し、そして室温で２４時間
にわたって塩化水素ガスと反応させた。アルコールを留
去し、高真空下に手早く脱ガスを済ませた後、淡黄色の
油状物（５，７ｇ）が残留した。この油状物をカイラル
カラム（前記例１を参照）上でＩｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃに従っ
て分析したところ、２９９．８％がＲ−形のエステルで
あった。０．２％未満がＳ−形のエステルであった。こ
の油状物を１００〜１０５°Ｃ及び６，５パスカルで蒸
留したところ、５．２ｇの（−）−Ｒ−２−ヒドロキシ
−４−フェニル酪酸エチルエステル、旋光度〔α）ｏｏ
−２０，８゜（クロロホルム中１％）、が得られた。

９．７５ｇ　（４６，８ミリモル）の（−）−Ｒ−２−
ヒドロキシ−４−フェニル酪酸エチルエステル（２９９
，６％ｅｅ）を５０ｍ２のトルエンに溶解し、１１．４
　ｇの４−ニトロベンゼンスルボニルクロリドをこれに
添加し、そして次に反応混合物を０″Ｃまで冷却した。

６．２５ｇのトリエチルアミンを添加した後、反応混合
物を３０分間をかけて室温まで加温し、そして混合した
。（＋）−Ｒ−２−（４−ニトロベンゼンスルホニルオ
キシ）−４−フェニル酪酸エチルエステル、旋光度〔α
〕ｇＯ＝＋１３．２”（無水エタノール中３％）、が定
量的収率で得られた。

４６．１ｇの３−　（Ｓ）−アミノベンズアゼピン２−
オン−１１−Ｎ−酢酸ｔｅｒｔ、−ブチルエステル、８
４．３ｇの光学的に純粋な（、に９９．６％ｅｅ）　（
＋　）　　Ｒ−２−（４−ニトロベンゼンスルホニルオ
キシ）＝４−フェニル醋酸エチルエステル及び１９．５
３　ｇのＮ−メチルモルホリンを溶媒を使用しないで７
５〜８０°Ｃで９時間にわたって反応させた。沈殿した
４−ニトロベンゼンスルホン酸のＮ−メチルモルホリン
塩を２５０ａｉ！の酢酸エチル及び１５０ｄの水を添加
することによって溶解し、約１５０−の２Ｎソーダ溶液
を加えることによってｐＨ８，ｆ３に調整し、そして酢
酸エチル相を分離し、水でさらに２回洗浄した。酢酸エ
チルを留去したところ、ジアステレオ異性体ノ比カ最低
ＳＳ　：　５Ｒ＝９９．８　：　０．２　テあることが
ＩＩ　Ｐ　Ｌ　Ｃから明らかである油状物（９８ｇ）が
得られた。

粗製の活性物質を調製するため、９６ｇの上記油状物を
２００ｄの酢酸エチルに溶解して得た０〜１０°Ｃの溶
液に５４ｇの塩化水素ガスを吹き込んだ。Ｌｅｒｔ、−
ブチルエステルのソルボリシスが完了した時、微結晶懸
濁液の形をした活性物質が得られた。酢酸エチルを真空
中で繰り返し留去することによって過剰量の塩化水素を
完全に除去した。

次いで、この高度に濃縮された結晶懸濁液を２００蔵の
アセトンを加えて希釈し、１５°Ｃで濾取し、そしてそ
の都度５０戚の酢酸エチルで２回洗浄した。一定の重量
が得られるまで真空中で６０　’Ｃで乾燥した後、ジア
ステレオ異性体比がＳＳ：５Ｒ＝９９．９　：　０．１
である実質的に白色である活性物質６２．５ｇ　（８５
，４％）が分離された；　〔α〕デーー１３８゜（無水
エタノール中１％）、融点１８１°Ｃ０劃」− １−力ルボキシメチル−３１（（ＩＲ−エトキシカルボ
ニル−３−フェニルプロピル）−アミノ〕−２、３、４
、５−テトラヒドロ−ＩＨ−ベンズアゼピン−２−オン
の合成 前記例４に記載のものと同様な手法に従って、１−力ル
ボキシメチル−３３−（（ＩＲ−エトキシカルボニル−
３−フェニルプロピル）−アミノ〕２．３，４．５−テ
トラヒドロ−ＩＨ−ベンズアゼピン−２−オンを５−２
−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸から調製した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、次式（ I ）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸
   のＲ−鏡像体： ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） 又は次式（II）の２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸の
   Ｓ−鏡像体： ▲数式、化学式、表等があります▼（II） から選ばれるヒドロキシ酸を調製するための方法であっ
   て、電子供与体及び該電子供与体を再生させるための酵
   素／基質系の存在下において、それぞれ、表皮ブドウ球
   菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉ
   ｄｉｓ）由来の酵素であるＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−Ｌ
   ＤＨ）又はウシ心臓由来の酵素であるＬ−乳酸脱水素酵
   素（Ｌ−ＬＤＨ）で２−オキソ−４−フェニル酪酸を還
   元することを含んでなる、ヒドロキシ酸の製法。 ２、Ｒ−２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を調製する
   ために、電子供与体及び該電子供与体を再生させるため
   の酵素／基質系の存在下において、表皮ブドウ球菌（Ｓ
   ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ
   ）由来の酵素であるＤ−乳酸脱水素酵素（Ｄ−ＬＤＨ）
   で２−オキソ−４−フェニル酪酸を還元することを含ん
   でなる、請求項１に記載の製法。 ３、９９．６％ｅｅ（鏡像異性超過量）を上廻る鏡像異
   性純度で２−ヒドロキシ−４−フェニル酪酸を調製する
   ことを含んでなる、請求項１又は２に記載の製法。 ４、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（
   Ｈ））を電子供与体として、かつホルマートデヒドロゲ
   ナーゼ（ＦＤＨ）／ホルマートを電子供与体再生用酵素
   ／基質系として使用することを含んでなる、請求項１、
   ２又は３に記載の製法。 ５、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（
   Ｈ）を電子供与体として、かつアルコールデヒドロゲナ
   ーゼ（ＡＤＨ）／エタノールを電子供与体再生用酵素／
   基質系として使用することを含んでなる、請求項１、２
   又は３に記載の製法。 ６、酵素変換を連続的に実施することを含んでなる、請
   求項１〜５のいずれか１項に記載の製法。 ７、酵素変換を酵素膜反応器内で実施することを含んで
   なる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製法。 ８、酵素変換を、酵素膜反応器であって、 （ａ）限外濾過膜を有しており、 （ｂ）ホルマートデヒドロゲナーゼ又はアルコールデヒ
   ドロゲナーゼ、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙ−ｌｏｃ
   ｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＤ−乳酸
   脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素、そ
   してニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ（
   Ｈ））の溶液からなる反応混合物を含有し、 （ｃ）基質である２−オキソ−４−フェニル酪酸及びそ
   れぞれホルマート又はエタノールの水溶液がこれに連続
   的に供給され、そして （ｄ）形成された化合物が膜の下流側へ連続的に引き抜
   かれる、タイプの反応器内で実施することを含んでなる
   、請求項７に記載の製法。 ９、酵素変換を、酵素膜反応器であって、 （ａ）公称排斥限度が５０００〜１０００００ダルトン
   である限外濾過膜を有し、 （ｂ）ホルマートデヒドロゲナーゼ又はアルコールデヒ
   ドロゲナーゼ、表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙ−ｌｏｃ
   ｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＤ−乳酸
   脱水素酵素又はウシ心臓由来のＬ−乳酸脱水素酵素、そ
   して０．０１〜１ｍＭのニコチンアミドアデニンジヌク
   レオチド（ＮＡＤ（Ｈ））の溶液からなる反応混合物を
   含有し、 （ｃ）５００ｍＭまでの基質である２−オキソ−４−フ
   ェニル酪酸及びそれぞれ１００〜１２００ｍＭのホルマ
   ート又はエタノールの水溶液がこれに連続的に供給され
   、そして （ｄ）形成された化合物が膜の下流側へ連続的に引き抜
   かれる、タイプの反応器内で実施することを含んでなる
   、請求項７又は８に記載の製法。 １０、限外濾過膜に非特異性蛋白質が予備被覆されてい
   る酵素膜反応器内において酵素変換を実施することを含
   んでなる、請求項７〜９のいずれか１項に記載の製法。 １１、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の製法によ
   って得られる式（ I ）の化合物の、１−カルボキシメ
   チル−３Ｓ−〔（１Ｒ−又は１Ｓ−エトキシカルボニル
   −３−フェニルプロピル）−アミノ〕−２，３，４，５
   −テトラヒドロ−１Ｈ−ベンズアゼピン−２−オンの調
   製における使用。