KR0165102B1

KR0165102B1 - 2-하이드록시-4-페닐부티르산의 제조방법 및 이 화합물을 사용한 안지오텐신 전환효소 억제제의 제조방법

Info

Publication number: KR0165102B1
Application number: KR1019890007689A
Authority: KR
Inventors: 기살바 오레스테; 기가크스 다니엘; 라트만 레네; 새르 한스-페터; 쉬미트 엘케; 세델마이어 고트프리드
Original assignee: 로트 베른하르트 엠., 발덱 베르너; 노바르티스 아게
Priority date: 1988-06-06
Filing date: 1989-06-05
Publication date: 1999-01-15
Also published as: CA1336081C; EP0347374B1; PT90747B; JPH0239893A; FI892702A; KR910001065A; IE891821L; DK271289D0; IL90527A0; PT90747A; ATE98697T1; US5098841A; DK172667B1; JP2873236B2; FI95047C; IL90527A; DK271289A; FI892702A0; DE58906409D1; IE63497B1

Abstract

내용 없음.

Description

2-하이드록시-4-페닐부티르산의 제조방법 및 이 화합물을 사용한 안지오텐신전환효소 억제제의 제조방법

본 발명은 2-옥소-4-페닐부르티산을, 전자 공여체[예: NAD(H)] 및 전자 공여체의 재생을 위한 효소/기질 시스템[예: 포르메이트 데하드로게나제(FDH)/포르메이트]의 존재하에서, 각각 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)로부터의 효소 D-락테이트 데하이드로게나제(D-LDH)와 소 심장으로부터의 효소 L-락테이트 데하이드로게나제(L-LDH)로 환원시킴을 특징으로 하여, 상당히 높은 에난티오머 순도, 예를들어 에난티오머 99%ee(에난티오머 과다), 바람직하게는 99.6%ee 이상의 구조식(Ⅰ)의 2-하이드록시-4-페닐부티르산의 R-에난티오머 또는 구조식(Ⅱ)의 2-하이드록시-4-페닐부티르산의 S-에난티오머를 제조하는 방법에 관한 것이다.

구조식(Ⅰ)의 R-2-하이드록시-4-페닐부티르티산의 제조방법은 바람직하게는 전자 공여체[예: NAD(H)] 및 전자 공여체의 재생을 위한 효소/기질 시스템[예: 포르메이트 데하이드로게나제(FDH)/포르메이트]의 존재하에서 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 효소 D-LDH를 사용하여 수행한다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 효소 막반응기(EMR)에서의 연속 효소적 전환에 특히 적합하다.

구조식(Ⅰ)의 R-2-하이드록시-4-페닐부티르산은 ACE(안지오텐신 전환효소) 억제제 또는 이들의 전구체의 제조에 유용한 중간물질이다. 구조식(Ⅱ)의 S-2-하이드록시-4-페닐부티르산은 이성체성 화합물의 제조에 사용된다.

입체특이적인 미생물적 환원에 의한 키랄 화합물의 제조방법은 문헌[참조: Simon et al., Angew. Chemie 97, 541, 1985]에 공지되어 있다. 종종, 본래의 미생물, 예를들어 진균[예: 뮤코(Mucor), 게오트리컴(Geotrichum), 사카로마이세스(Saccharomyces), 캔디다(candida)] 또는 세균[예: 프로테우스(Proteus), 슈도모나스(Pseudomonas)]이 생물학적 촉매로서 사용된다. 또한 미생물 추출물도 사용할 수 있다. 전자 공여체는, 예를들어 탄수화물(예: 포도당), 포르메이트, 에탄올, 수소 또는 전기화학 전지의 음극이다. 기질은 소위 최종 환원효소, 예를들어 기질 특이성 데하이드로게나제를 사용하여 환원시킨다. 최종 환원 효소에 필요한 환원물은 일반적으로 조효소, 예를들어 피리딘 뉴클레오타이드[예: NADH(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드) 및 NADHP(니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 포스페이트)] 또는 플라빈 뉴클레오타이드[예: FMNH(플라빈 모노뉴클레오타이드) 및 FADH(플라빈 아데닌 디뉴클레오타이드)]에 의해 제공된다. 이어서, 환원된 뉴클레오타이드는 통상 경합하는 전자 수용체가 형성되는 일련의 효소-촉매된 단계에서나 천연 또는 합성 매개물(예: 페레독신, 바이올로겐)에 의한 전자 전달에 의해 생성된다. 또한, 매개물로부터 직접적으로 전자를 수용할 수 있는 최종 환원 효소도 공지되어 있다.

또한, 생물학적 촉매로서 정제된 효소, 즉 분리된 환원효소도 적합하며, 이 경우에는 일반적으로 환원된 피리딘 뉴클레오타이드 또는 플라빈 뉴클레오타이드를 가해야 한다. 또한, 조효소의 효소적 재생을 위한 효과적 시스템, 즉 제2의 효소 및 이의 기질도 필요하다. 문헌[참조: Yamazaki Maeda, Agricol. Biol. Chem. 50, 2621, 1986]에는 NADH 및 스트렙토코커스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)로부터의 벤조일 프로메이트 데하이드로게나제를 사용하여 벤조일 포르메이트로부터 R-(-)-만델산을 합성하기 위한 배취 공정이 기술되어 있다. 이 방법은 또한 포르메이트 데하이드로게나제 및 포르메이트에 의해 재생되는 조효소를 사용하여 생물학적 반응기 속에서 연속적으로 수행할 수도 있다[참조: Yamazaki Maeda, Agricol. Biol. Chem. 50 3213, 1986]. 유럽 특허 제 0 024 547호에는 효소막 반응기 속에서 수용성 α-케토카복실산을 상응하는 α-하이드록시카복실산으로 연속 효소 전환시키기 위한 방법이 기술되어 있다. 전환공정은 폴리에틸렌 글리콜에 결합되어 분자량이 증가된 NAD(H) 및 락테이트 데하이드로게나제의 존재하에 포르메이트 데하이드로게나제 및 포르메이트를 사용하여 NADH를 동시에 재생시키면서 수행한다.

효소 반응에 있어서는 사용되는 효소, 즉 본 발명의 경우에 있어서는 최종 환원 효소 또는 기질-특이적 데하이드로게나제의 특성 및 공급원이 특히 중요하다. 동일한 유형의 효소라도 상이한 공급원, 예를들어 상이한 미생물로부터 분리되는 경우 이의 생리적 거동이 상이할 수 있다는 사실을 명심해야 한다. 반응특이성, 기질특이성, 입체특이성 및 역학 인자[예: 미카엘리스-멘텐 상수(Michaelis-Mentenconstant) 및 억제상수]와 같은 생물학적 전환을 위한 결정적 변수가 상이하다[참조: Simon et al., 하기 참조]. 예를들어 공지된 문헌에 나타난 데이터와 비교하면, 락토바실루스 콘푸수스(Lactobacillus confusus)로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제는 피루베이트, 2-케토부티레이트 및 페닐피루베이트를 전환시키기는 하나, 2-케토발레레이트, 2-케토카프로에이트 및 2-케토-3-메틸발레레이트를 환원시키지는 못한다. 따라서, 유럽 특허 제0 024 547호에서 이러한 결론을 지적하였으나, 각각의 효소/기질 시스템의 거동은 각 경우마다 시험되어야 하며, 총괄적으로 예측할 수 없다.

본 발명의 목적은 2-옥소-4-페닐부티르산의 에난티오머 선택적 효소 환원에 의해 에난티오머 순도가 높은 2-하이드록시-4-페닐부티르산의 R- 및 S-에난티오머 제조에 대한 효과적 제조방법을 밝히는 것이다. 이 물질은 α-케토카복실산의 효소적 환원에 대한 선행 기술에서는 기질로서 기술되지 않았으며, 따라서 효소적 환원에서의 이의 적합성 및 거동에 대하여 연구된 바가 없었다.

R-2-하이드록시-4-페닐부티르산의 제조에 대한 이러한 목적을 이루기에 특히 적합한 방법은, 다른 미생물로부터의 락테이트 데하이드로게나제에 비해, 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-LDH는 사용된 기질에 대하여 고특이 활성(단위/mg 전환된 기질 또는 μmol 전환도/mg 단백질x분)이 특징이며(표 1), 에난티오머 선택성이 높으므로, 기질을 전자 공여체 및 전자 공여체를 재생시키기 위한 효소/기질 시스템의 존재하에서 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 효소 D-락테이트 데하이드로게나제로 환원시키는 것이다. 동일한 이유로, 기질을 소 심장으로부터의 효소 L-락테이트 데하이드로게나제로 환원시키는 유사한 방법이 S-2-하이드록시-4-페닐부티르산의 제조에 특히 바람직하다. 특히 효소막 반응기에서의 연속 반응법이 두가지 방법 모두에 대해 바람직하다.

에난티오머 선택성이 높은 기질-특이적 데하이드로게나제로서 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-LDH 및 기질로서의 2-옥소-4-페닐부티르산을 배합하면, 높은 생산성, 양호한 시공간 수율 및, 결과적으로, 대규모로 수행되는 효소 전환공정에서 상당히 중요하며 경제적으로 매우 유리한 저렴성을 수득할 수 있다.

스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제 또는 소심장으로부터의 L-락테이트 데하이드로게나제에 대해 사용되는 전자 공여체는, 환원된 형태(NADH)로 존재하며 D-또는 L-LDH에 의해 NAD로 산화되는 조효소 니코틴 아미드 아데닌 디뉴클레오타이드가 바람직하다. 조효소의 재생을 위하여, NADH-재순환 효소 및 이의 기질(예: 포르메이트, 에탄올, 이소프로판올, 사이클로헥산올등)로 이루어진 효소/기질 시스템이 사용된다. 포르메이트로서 포름산의 염, 예를 들어 알칼리 금속 포르메이트(예: 칼륨 또는 나트륨 포르메이트)가 사용되는 포르메이트 데하이드로게나제(FDH)/포르메이트 시스템 또는 알콜 데하이드로게나제(ADH)/에탄올 시스템이 바람직하다. 이들 시스템은 부산물로서 각각 CO/HCO및 아세트알데하이드를 생성한다.

본 발명의 방법은 에난티오머 순도가 높은 생성물 R- 또는 S-2-하이드록시-4-페닐부티르산을 제공한다. 본 명세서 본문에서, 에난티오머 순도가 높은이라는 표현은 본 발명의 에난티오머가 다른 에난티오머와의 혼합물 중에 적어도 98%ee, 바람직하게는 99%ee 이상 존재함을 의미한다.

배취 공정에서, 500mM 이하, 예를 들어 20 내지 200mM, 바람직하게는 50mM 농도의, 예를 들어 칼륨염 또는 나트륨염 형태로 존재하는, 기질 2-옥소-4-페닐부티르산의 수용액은, 0.01 내지 10mM, 바람직하게는 약 0.1mM 농도의 조효소 NAD(H), NADH-재순환 효소(예: 알콜 데하이드로게나제 또는 포르메이트 데하이드로게나제), 및 각각 100 내지 1200mM, 바람직하게는 약 300mM 농도의 에탄올 또는 포르메이트, 및 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제 또는 소 심장으로부터의 L-락테이트 데하이드로게나제와 함께 전환이 완결될 때까지 교반시키면서 배양시킨다. 효소는 유리하게는 NADH-재순환 효소 및 기질-특이적 데하이드로게나제의 활성비가 1:0.1 내지 1:5인 양으로 사용한다. 반응 혼합물의 pH는 효소 반응에 통상적인 pH 6 내지 9(예: pH 8.4)이다. 반응온도는 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 실온 정도이다. 생성물을 산, 예를 들어 무기산(예: 염산 등)을 가하여 반응 혼합물로부터 결정화시킨다.

연속반응법에서 사용되는 효소는 일반적으로 고정된 것이다. 이들은, 예를 들어 중합체 매트릭스내, 반투막으로 이루어진 캡슐 또는 섬유내에 함입되거나, 또는 한외 여과막에 의해 에워싸이거나, 이작용성 또는 다작용성 시약과 가교결합되거나, 무기 물질 또는 천연 또는 합성 중합체로 이루어진 담체에 흡착에 의해 또는 이온 결합 또는 공유 결합에 의해 고정될 수 있다. 여러 유형의 생물학적 반응기, 예를들어 교반 반응기, 고정상 반응기, 유동상 반응기 또는 막 반응기를 연속 공정에 사용할 수 있다(참조: Hartmeier, Immobilisierte Biokatalysatoren, Berlin 1986).

본 발명의 EMR 공정(효소막 반응기에서의 연속 공정)에 있어서, 사용되는 반응 용기는 사용되는 효소 및 전환에 필요한 조효소는 보유하나, 저분자량의 생성물 및 전환되지 않은 기질을 통과시키는 한외여과막이 장착된 막 반응기가 바람직하다. 생물학적 촉매가 천연 형태로, 즉 개질되지 않은 형태로 사용될 수 있고 통상적으로 불활성화 효과를 갖는 고정화에 필요한 어떠한 고정 단계로 수행해야 할 필요가 없는 막 반응기가 상당히 유리하다. 효소 막 반응기는, 예를 들어 편평한 막(챔버 막) 반응기 또는 중공섬유 막 반응기일 수 있다. 기질은 예를 들어 계량 펌프로 반응 챔버에 공급하고, 반응 혼합물은 교반시키거나 펌핑한 후, 막을 통과한 생성물 함유 여과물 스트림을 배출시킨다. 본 발명의 방법에 사용되는 막은 배출 한도가 5,000 내지 100,000달톤(예: 10,000 내지 100,000달톤)인 막이 바람직하다. 막으로 사용하기에 적합한 물질은, 예를 들어 아세틸셀룰로스, 폴리아미드, 폴리설폰 또는 개질된 폴리비닐 알콜이다. 반응에 수반된 효소가 막에 흡착되는 것을 방지하기 위하여, 막을 비-특이적 단백질(예: 소 혈청 알부민)로 예비 피복할 수 있다.

막 반응기중의 반응 혼합물은 NADH-재순환 효소(예: 알콜 데하이드로게나제 또는, 바람직하게는 포르메이트 데하이드로게나제, 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제, 또는 소 심장으로부터의 L-락테이트 데하이드로게나제), 및 NAD(H)를 함유한다. NADH-재순환 효소는 NADH-재순환 효소의 활성 및 기질-특이적 데하이드로게나제 활성의 비가 1:0.1 내지 1:5인 양으로 사용하는 것이 유리하다. 필요한 조효소는 0.01 내지 10mM, 바람직하게는 약 0.1mM의 농도로 분자량이 증가되지 않은 NAD(H) 형태, 즉 천연 NAD(H) 형태로 사용된다. 본 발명의 방법에서 효소막 반응기에 천연 형태의 NAD(H)를 사용하면, 유럽 특허 제0 024 547호에 기술된 선행기술보다 명백히 유리하다. 유럽 특허 제 0 024 547호에는 분자량을 증가시키기 위하여 폴리에틸렌 글리콜에 결합시킨 NAD(H)의 사용을 기술하고 있다. 그러나, 이러한 결합은 효소의 활성을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, PEG-NAD(H)를 조효소로서 사용하는 경우, 천연 NAD(H)와는 반대로, 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제의 활성은 매우 제한되어, V값, 즉 최대반응속도가 천연 NAD(H)의 26단위/mg과 비교하여 단지 2.6단위/mg이다. 기질의 적합한 전환률이 PEG-NAD(H)를 사용한 연속 공정에서 수득되는 경우, 득에 약 10배의 효소를 사용해야 하며, 이는 생산 단가를 매우 높인다. 한외여과막하에, 예를들어 분자량 20,000의 폴리에틸렌 글리콜에 결합시킴으로써 분자량을 증가시킨 NAD(H)를 효과적으로 보유하기 위하여, 막은 10,000달톤의 최대 배출 한도를 가질 수 있다. 다른 한편으로는, 촉매량의 천연 형태 NAD(H)가 기질 스트림에 사용되는 경우, 막의 배출 한도는 단지 효소의 크기에 의해서만 결정된다. 따라서, 반응기 작동 시간을 제한하는 반응기내의 고압을 피할 수 있도록 5,000 내지 100,000달톤의 배출 한도를 갖는 막을 사용할 수 있다. 천연 형태의 NAD(H)를 사용하는 경우 압력이 낮으므로 더욱 작고 따라서 더욱 저렴한 막을 사용할 수 있으며, 처리량을 더욱 높일 수 있다. 천연 형태의 NAD(H)를 사용하는 경우, 또한 500 내지 2,000 범위의 고 주기특성(cycle figures)이 수득되는데, 즉 NAD(H) 분자당 500 내지 2,000 분자의 하이드록시산이 형성된다. 따라서, 본 발명의 방법은 유럽 특허 제0 024 547호에 기술되어 있는 방법보다 경제적으로 상당히 유리하다.

또한, 예를 들어 칼륨염 또는 나트륨염 형태의 2-옥소-4-페닐부티르산의 수용액을 기질로서 반응기에 연속 공급한다. 기질은 500mM 이하의 농도로 존재해야 하며, 20 내지 200mM의 농도, 특히 약 50mM의 농도가 바람직하다. 포르메이트 또는 에탄올도 또한 100 내지 1200mM, 바람직하게는 포르메이트의 경우 약 300mM의 농도로 연속적으로 계량도입된다.

반응 혼합물의 pH는 효소 반응에서 통상적인 pH 6 내지 9, 예를 들어 약 pH 8.4이다. 반응 온도는 20 내지 40℃, 바람직하게는 약 실온 정도이다.

본 발명의 바람직한 방법은, 효소적 전환을,

(a) 임의로 비-특이적 단백질(예: 소 혈청 알부민)로 예비-코팅시킨, 예를들어 5,000 내지 100,000달톤, 바람직하게는 10,000 내지 100,000달톤의 배출한도를 갖는 한외여과막이 장착되어 있고,

(b) 포르메이트 데하이드로게나제 또는 알콜 데하이드로게나제, 바람직하게는 포르메이트 데하이드로게나제, 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제 또는 소 심장으로부터의 L-락테이트 데하이드로게나제의 용액, 및 예를 들어 0.01 내지 1mM, 바람직하게는 약 1mM 농도의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드(NAD(H))로 이루어진 반응 혼합물을 함유하며,

(c) 예를 들어 칼륨염 또는 나트륨염 형태로 존재하는 기질 2-옥소-4-페닐부티르산의 수용액이 500mM 이하, 예를들어 20 내지 200mM, 바람직하게는 약 50mM의 농도로 공급되고 포르메이트, 예를들어 칼륨 또는 나트륨 포르메이트, 또는 에탄올이 각각 예를들어 100 내지 1200mM, 바람직하게는 약 300mM의 농도로 연속 공급되고,

(d) 형성된 화합물을 막 아래로 연속 배출시키는 효소막 반응기중에서 수행하는 것이다.

R-2-하이드록시-4-페닐부티르산은 ACE 억제제 또는 이의 전구체의 제조에 중요한 중간체이다. 최근 이러한 부류의 활성물질에 대한 관심이 증가되고 있다. 이는 시판용 혈압 강하제의 효력을 강화하여 고혈압을 치료할 수 있다. 많은 효과적인 ACE 억제제 중 구조적으로 중요한 인자는 일반식(Ⅲ)의 그룹이다.

상기식에서,

R²는 S-배위에서 수소 또는 저급 알킬이다.

R-2-하이드록시-4-페닐부티르산은 공지된 방법으로 에난티오머 순도가 높은 ACE 억제제의 제조에 사용할 수 있다[참조: 유럽 특허원 제206993호]. 본 발명의 중요성은 특히 다수의 단계를 포함하는 ACE 억제제의 합성에서, 이것은 비교적 합성의 초기 단계에서 에난티오머적으로 순수 화합물을 이용할 수 있다는데 있다. 이와 관련하여, ACE 억제제 1-카복시메틸-3S-[(1S-에톡시카보닐-3-페닐프로필)아미노]-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤즈아제핀-2-온의 제조 방법이 특히 중요하다. S-2-하이드록시-4-페닐부티르산이 이와 유사한 방법에서의 ACE 억제제의 에난티오머 제조 및 독성 연구에 적합하다.

하기 실시예로 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 본 발명이 실시예의 범주로 한정되는 것은 아니다.

약어

ee-에난티오머 과다

FDH-포르메이트 데하이드로게나제

HPLC-고압 액체 크로마토그래피

K_I-억제상수

K_M-미카엘리스-멘텐 상수

LDH-락테이트 데하이드로게나제

NADH-니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드

rpm-분당 회전수

U-효소 활성 단위(소정의 반응 조건하에서의 단위로서, 1U는 분당 1μmol의 물질을 생성한다)

V_max-최대 반응 속도

[실시예 1]

미생물성 조 추출물을 사용한 2-옥소-4-페닐부티르산의 효소적 환원(일반적 설명)

시험 균주를 영양 용액 148(22g/l 포도당, 5g/l 랍-렘코(Lab-Lemco) 쇠고기 추출물[옥소이드], 5g/l 펩톤 C, 5g/l 효모 추출액, 3g/l 박토-카세인[디프코], 1.5g/l NaCl, pH 6.5) 또는 영양 용액 MV7(2g/l NH₄NO₃, 1.4g/l Na₂HPO₄, 0.6g/l K₂HPO₄, 0.2g/l MgSo₄.7H₂O, 0.01g/l CaCl₂.2H₂O, 0.001g/l FeSO₄.7H₂O, 미량 원소 용액[20mg/l Na₂MoO₄.2H₂O, 20mg/l Na₂B₄O₇. 10H₂O, 20mg/l ZnSO₄.7H₂O, 20mg/l MnSO₄.H₂O, 20mg/l CuSO₄.5H₂O] 1ml, pH 6.5) 200ml중에서 3일 동안 28℃에서 교반(250rpm)시키면서 3g/l D-또는 L-락테이트와 함께 배양시킨다. 세포를 인산염 완충액(pH 7.0)으로 세척하고 소발(Sorvall) 원심분리기(로터 SS34)를 사용하여 원심분리(20분, 20,000rpm)시켜 수거한다. 이어서, 세포를 초음파 세포 붕쇄기(Ultrasonics Celldisrupter) W-375를 사용하여 45분 동안 375W에서 초음파 처리하여 4℃에서 붕쇄시킨다. 1회 더 원심분리한 후, 효소 조 추출물을 시험 혼합물[5ml 원심분리 상등액(조 추출물), 20ml 인산염 완충액(pH 7; 0.069M), 3g/l 2-옥소-4-페닐부티르산, 18g/l 에탄올, 1g/l NAD(H), 100U 효모 알콜 데하이드로게나제(베링거)]중에서, (전환이 완결될 때까지) 3 내지 5일 동안 28℃에서 교반시키면서 기질과 함께 배양시킨다.

반응이 완결된 후, 용액을 2N 염산을 사용하여 pH 2로 조정한다. 이어서, 결정화된 생성물을 에틸 아세테이트로 추출한다. 용매를 증류시키고 잔사를 진공중에서 건조시켜 시험되는 미생물성 추출물에 따라 상이한 에난티오머 순도를 갖는 결정성 2-하이드록시-4-페닐부티르산을 수득한다.

결정성 산을 무수 에탄올에 용해시키고, 실온에서 24시간 동안 염화수소 가스와 반응시킨다. 알콜을 증류시키고 고진공하에 간단히 탈기시킨 후, 잔류 담황색 잔사를 키랄 칼럼[내부 직경 250x4.6㎜, 처리량 1ml/분, 고정상 키랄셀(Chiralcel) OD(스텔린(Stehelin), 바슬(Basle)) 타입 OD-5-15-20925, 이동상 90% 헥산-10% 이소프로판올-0.1% 디에틸아민]상에서 25℃/32바(bar)하에 HPLC로 분석한다. 분석할 물질은 1mg/ml(주입량 10μl) 농도의 용출물 중에 존재한다. 210㎚의 파장에서 스캐닝(scanning)하고, 표면적을 외부 표준치와 비교하여 평가한다. 조사된 미생물성 추출물에 대해 밝혀진 ee 량을 표2에 나타내었다.

[실시예 2]

시판용 데하드로게나제를 사용한 2-옥소-4-페닐부티르산의 효소적 환원

기질을 시험 혼합물[50ml] 인산염 완충액(pH 7;0.069M), 3g/l 2-옥소-4-페닐부티르산, 18g/l 에탄올, 200U 효모 알콜 데하드로게나제(베링거), 200U 시험 효소(시판용 데하드로게나제), 1g/l NAD(H)]중에서 (전환이 완결될 때까지) 3 내지 7일동안 완만하게 교반시키면서 28℃에서 시판용 데하드로게나제와 함께 배양시킨다. R-2-하이드록시-4-페닐부티르산 또는 S-2-하이드록시-4-페닐부티르산의 에난티오머 과량을 실시예 1에 기술한 바와 같이 측정한다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

ee값을 비교해보면, 분리된 효소에 대한 R-또는 S-2-하이드록시-4-페닐-부티르산의 에난티오머 과다도가 상당히 크므로, 분리된 효소가 기질의 입체특이적 환원에 대해 미생물성 조 추출물보다 더욱 적합함을 알 수 있다. 이와 유사하게, 높은 ee 값을 얻기 위해서는, 조 추출물로부터 추가의 정제 단게에 의해 선택적 효소를 농축시켜야 한다.

[실시예 3]

효소 막 반응기(EMR)중에서 시판용 데하드로게나제를 사용한 2-옥소-4-페닐부티르산의 효소적 환원

2-옥소-4-페닐부티르산의 R- 또는 S-2-하이드록시-4-페닐부티르산으로의 연속적 전환을 10ml의 반응기 용적을 갖고 25℃로 유지되는 막이 편평한 형태인 효소 막 반응기(EMR)중에서 수행한다. 62㎜ 직경의 셀룰로스 아세테이트 한외여과막은 10,000달톤의 배출 한도를 가지며 소 혈청 알부민 50mg으로 예비-코팅시켰다.

최적의 반응순서는, 50, 100 및 150mM의 기질 농도에 대해, D-또는 L-락테이트 데하이드로게나제 및 포르메이트 데하이드로게나제에 대해 실험적으로 측정된 효소 역학을 이용한 분석, 즉 역학 상수(K, K, V)를 측정하여, 반응물들의 질량 평형을 계산함으로써 반응물의 거동을 시뮬레이팅시켜 결정한다. 렁지-쿠타-프로그램(Runge-Kutta Program)을 적용하여, 인자 유지 시간, 추출물 농도 및 보조인자 농도 및 효소의 반감기를 변화시킨다[참조: Hoffmann Hoffmann, Einfuhrung in die Optimierung mit Anwendungs-beispielen aus dem Chemie-Ingenieurwesen, Weinheim 1971].

기질 용액은 50mM 2-옥소-4-페닐부티르산, 300mM 칼륨 포르메이트 및 0.1mM NAD(H)를 함유한다. 2.6U/ml D-LDH 및 4.8U/ml FDH 또는 1.4U/ml L-LDH 및 2.5U/ml FDH를 도입한다. 반응용액을 10ml/시간의 속도로 반응기에 연속 펌핑 도입시키고, 생성물을 막을 통과시켜 배출시킨다. 반응기에서의 체류시간은 D-LDH를 사용한 전환에 대해서는 60분이고, L-LDH를 사용한 전환에 대하여는 120분이다. 효소 활성을 계속 모니터링하고, 필요한 경우, 추가로 가하여 일정하게 유지시킨다. 결과를 표 4에 나타내었다.

[실시예 4]

1-카복시메틸-3S-[(1S-에톡시카보닐-3-페닐프로필)-아미노]-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤즈아제핀-2-온(ACE 억제제)의 합성

4.1 R-2-하이드록시-4-페닐부티르산 에틸 에스테르의 합성

R-2-하이드록시-4-페닐부티르산 5.0g을 무수 에탄올 50ml에 용해시키고, 실온에서 24시간 동안 염화수소 가스와 반응시킨다. 알콜을 증류시키고, 고진공하에 간단히 탈기시킨 후, 잔류 담황색 오일(5.7g)을 키랄 칼럼(참조: 실시예 1)상에서 HPLC 분석하면 99.8% 이상이 R-배위 에스테르로 이루어지고 0.2% 미만이 S-배위 에스테르로 이루어짐을 확인할 수 있다. 오일을 100 내지 105℃, 6.5 파스칼에서 증류시켜 [α]=-20.8°(클로로포름 중 1%)의 광회전도를 갖는 (-)-R-2-하이드록시-4-페닐부티르산 에틸 에스테르 5.2g을 수득한다.

4.2 (+)-R-2-(4-니트로벤젠설포닐옥시)-4-페닐부티르산 에틸 에스테르의 합성

(-)-R-2-하이드록시-4-페닐부티르산 에틸 에스테르(≥99.6% ee) 9.75g(46.8mmol)을 톨루엔 50ml에 용해시키고, 4-니트로-벤젠설포닐 클로라이드 11.4g을 여기에 가하고, 이어서 반응 혼합물을 0℃로 냉각시킨다. 트리에틸아민 6.25g을 가한 후, 반응 혼합물을 30분에 걸쳐 실온으로 가온시키고, 후처리하여 [α]=+13.2°(무수 에탄올 중 3%)의 광회전도를 갖는 (+)-R-2-(4-니트로벤젠설포닐옥시)-4-페닐부티르산 에틸 에스테르를 수득한다.

4.3 1-카복시메틸-3S-[(1S-에톡시카보닐-3-페닐-프로필)-아미노]-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤즈아제핀-2-온의 합성

3-(S)-아미노벤즈아제핀-2-온-1-N-아세트산 3급-부틸 에스테르 46.1g, 광학적으로 순수한(≥99.6% ee) (+)-R-2-(4-니트로벤젠설포닐옥시)-4-페닐부티르산 에틸 에스테르 84.3g 및 N-메틸모르폴린 19.53g을 75 내지 80℃에서 9시간 동안 용매의 부재하에서 반응시킨다. 침전물을 에틸 아세테이트 250ml 및 물 150ml를 가하여 용해시킨, 4-니트로벤젠설폰산의 N-메틸모르폴린 염 침전물을 2N 소다액 약 150ml로 pH 8.8로 조절하고, 에틸 아세테이트 상을 분리시킨 후, 물로 2회 이상 세척한다. 에틸 아세테이트를 증류시켜 HPLC에서 적어도 SS:SR의 부분입체이성체의 비가 99.8:0.2인 오일(98g)을 수득한다.

조 활성물질을 에틸 아세테이트 200ml 중의 상기한 오일 96g의 용액에 염화 수소 가스 54g을 0 내지 10℃에서 통과시켜 제조한다. 3급-부틸 에스테르의 가용매 분해가 완결되면, 활성 물질이 미분된 결정성 현탁액의 형태로 수득된다. 과량의 염화수소는 에틸 아세테이트를 진공중에서 반복적으로 증류시켜 완전히 제거한다. 이어서, 고농노의 결정성 현탁액을 아세톤 200ml로 희석시키고, 15℃에서 여과 분리한 후, 매번 에틸 아세테이트 50ml로 2회 세척한다. 일정 중량이 수득될 때까지 진공하에 60℃에서 건조시킨 후, SS:SR의 부분입체이성체의 비가 99.9:0.1인 가시적으로 백색인 활성물질 62.5g(85.4%)을 분리한다: [α]=-138°(무수 에탄올중 1%), 융점: 181℃.

[실시예 5]

1-카복시메틸-3S-[(1R-에톡시카보닐-3-페닐프로필)-아미노]-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤즈아제핀-2-온의 합성

1-카복시메틸-3S-[(1R-에톡시카보닐-3-페닐프로필)-아미노]-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤즈아제핀-2-온은 S-2-하이드록시-4-페닐부티르산으로부터 실시예 4에 기술된 방법과 유사한 방법으로 제조한다.

Claims

2-옥소-4-페닐부티르산을, 전자 공여체로서 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드[NAD(H)], 및 포르메이트 데하이드로게나제(FDH)/포르메이트 및 알콜 데하이드로게나제(ADH)/에탄올로부터 선택되는, 전자 공여체의 재생을 위한 효소/기질 시스템의 존재하에서, 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis)로부터의 효소 D-락테이트 데하이드로게나제(D-LDH) 또는 소 심장으로부터의 효소 L-락테이트 데하이드로게나제(L-LDH) 각각으로 환원시킴을 특징으로 하여, 구조식(Ⅰ)의 2-하이드록시-4-페닐부티르산의 R-에난티오머 또는 구조식(Ⅱ)의 2-하이드록시-4-페닐부티르산의 S-에난티오머를 제조하는 방법.
제1항에 있어서, 2-옥소-4-페닐부티르산이 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 효소 D-락테이트 데하이드로게나제(D-LDH)로 환원되는, R-2-하이드록시-4-페닐부티르산을 제조하는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 2-하이드록시-4-페닐부티르산이 99.6% ee(에난티오머 과다: enantiomeric excess) 이상의 에난티오머 순도로 제조되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드[NAD(H)]가 전자 공여체로서 사용되고, 포르메이트 데하이드로게나제(FDH)/포르메이트가 전자 공여체의 재생을 위한 효소/기질 시스템으로서의 사용되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드[NAD(H)]가 전자 공여체로서 사용되고, 알콜 데하이드로게나제(ADH)/에탄올이 전자 공여체의 재생을 위한 효소/기질 시스템으로서 사용되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 효소적 전환이 연속적으로 수행되는 방법
제6항에 있어서, 효소적 전환이 효소 막 반응기에서 수행되는 방법.
제7항에 있어서, 효소적 전환이, (a) 한외여과막이 장착되어 있고, (b) 포르메이트 데하이드로게나제 또는 알콜 데하이드로게나제, 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제 또는 소 심장으로부터의 L-락테이트 데하이드로게나제, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드[NAD(H)]의 용액으로 이루어진 반응 혼합물을 함유하며, (c) 기질 2-옥소-4-페닐부티르산의 수용액 및 포르메이트 또는 에탄올 각각이 연속 공급되고, (d) 생성된 화합물을 막 아래로 연속 배출하는 효소막 반응기에서 수행되는 방법.
제8항에 있어서, 효소적 전환이 (a) 배출 한도가 5,000 내지 100,000달톤인 한외여과막이 장착되어 있고, (b) 포르메이트 데하이드로게나제 또는 알콜 데하이드로게나제, 스타필로코커스 에피더미디스로부터의 D-락테이트 데하이드로게나제 또는 소 심장으로부터의 L-락테이트 데하이드로게나제, 및 0.01 내지 1mM의 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드의 용액으로 이루어진 반응 혼합물을 함유하며, (c) 20 내지 500mM의 기질 2-옥소-4-페닐부티르산의 수용액과 포르메이트 또는 에탄올 각각 100 내지 1200mM이 연속 공급되고, (d) 생성된 화합물을 막 아래로 연속 배출하는 효소 막 반응기에서 수행되는 방법.
제8항에 있어서, 효소적 전환이, 한외여과막이 비특이적 단백질로 예비 코팅된 효소막 반응기에서 수행되는 방법.
제1항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 따라 수득된 구조식(Ⅰ)의 화합물을 출발물질로서 사용하여, 1-카복시메틸-3S-[(1R-또는 1S-에톡시카보닐-3-페닐프로필)-아미노]-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-벤즈아제핀-2-온을 제조하는 방법.