CN109234325A - 一种乳酸脱氢酶在不对称合成手性羟基化合物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种乳酸脱氢酶在不对称合成手性羟基化合物中的应用。具体地，本发明提供了一种多肽在生产式A化合物或以式A化合物为前体的下游产物中的用途。本发明还提供了生产式A化合物的方法，所述方法包括培养表达所述多肽的菌株，从而得到式A化合物。本发明还提供了一种式A化合物生产菌株，以及所述式A化合物生产菌株的构建方法。利用本发明的方法可高效、低成本地产生式A化合物。本发明方法制备所得的式A化合物浓度高，并且具有产物光学纯度高、反应条件温和、对环境友好、操作简便、易于工业放大的优点。

Description

一种乳酸脱氢酶在不对称合成手性羟基化合物中的应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种乳酸脱氢酶，该乳酸脱氢酶的制备方法，以及该乳酸脱氢酶作为催化剂在不对称合成手性羟基化合物中的应用。
背景技术
(R)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(R-HPBE,CAS号：90315-82-5)是一种手性仲醇，它是合成众多血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂(即普利类药物)的关键手性砌块。
普利类药物主要用于治疗心力衰竭、高血压。目前在中国抗高血压药物市场上主要有ACE抑制剂、钙拮抗剂、血管紧张素II受体拮抗剂和β-受体阻滞剂四类抗高血压药物。普利类药物近年受到沙坦类药物的影响，销量有所下降，但由于受到欧盟新标准和国内一些厂家退出的影响，价格较为稳定。
自1977年Ondetti等研究开发了第一代的卡托普利后，普利类药物已经拓展到80多个衍生物，常见的几种普利药物如上所示。普利类药物由于具有疗效显著、不良反应小、作用时间长等优点，在临床上仍有广泛的应用前景。由于R-HPBE是该药物的关键手性中间体，对于R-HPBE合成新方法的研究仍具有较大的实用意义和工业应用前景。
合成R-HPBE的方法包括化学法和生物法。其中，化学法是由价廉易得的原料出发，经过多步反应最终合成R-HPBE。如由苯甲酸和丙酮酸经过多步反应生成2-羟基-4-苯基丁酸，再经过去消旋化和酯化作用合成(R)-HPBE；再如由乙二酸二乙酯和苯丙酸乙酯作为起始原料，合成2-羰基-4-苯基丁酸乙酯后经过不对称氢化得到(R)-HPBE。化学法在产物规模上具有较为明显的优势，可达到500公斤的生产规模，但是，化学法要用到重金属Pt等污染环境的催化剂，无法满足绿色化学的要求且成本较高。另外，化学法存在收率较低、反应条件较为苛刻、对底物的纯度要求高、得到的产物的光学活性较低等缺点，所以不适合进行规模化生产的进行。
目前生物法合成(R)-HPBE主要有两种途径，一种是利用脂肪酶来拆分rac-HPBE得到(R)-HPBE，或拆分rac-HPBA后经过乙酯化得到(R)-HPBE。另一种途径是用酮还原酶对OPBE或OPBA进行不对称还原，生成(R)-HPBE或(R)-HPBA，(R)-HPBA可经过进一步酯化合成(R)-HPBE。利用酮还原酶进行不对称还原，理论得率可以达到100％，而脂肪酶的理论得率最高只能达到50％，酮还原酶具有一定的优势，但酮还原酶催化反应通常需要额外添加价格昂贵的辅酶NAD+/NADP+。
本申请人已经就酮还原酶不对称还原制备(R)-HPBE申请过一篇专利(CN2014105418998)，其中酮酯在所述的酮还原酶的作用下可以使产物的光学纯度达到98％以上，但是原料OPBE的稳定性差，产品的分离纯化工艺较为复杂，生产成本较高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，
本发明的目的之一是提供一种多肽在生产式A化合物或以式A化合物为前体的下游产物中的用途。
本发明的另一目的是提供一种生产式A化合物的方法。
本发明的又一目的是提供一种式A化合物生产菌株。
本发明的再一目的是提供一种式A化合物生产菌株的构建方法。
在本发明的第一方面，提供了一种多肽在生产式A化合物或以式A化合物为前体的下游产物中的用途，所述多肽是：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽；
式中，
R表示氢，或1、2、3或4个选自下组的取代基：卤素、-OH、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、或取代或未取代的C3-C8环烷氧基，其中所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、-OH、-NH2、-CN、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2；
n选自0～10的任一整数。
在另一优选例中，所述式A化合物为前手性羰基酸化合物进行不对称还原反应形成。
在另一优选例中，所述前手性羰基酸化合物为式B化合物：
式中，R和n如上定义。
在另一优选例中，所述前手性羰基酸化合物包括以下化合物或其药学上可接受的盐：
在另一优选例中，R为H或Cl。
在另一优选例中，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一优选例中，R为H，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一优选例中，R为Cl，n为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
在另一优选例中，所述多肽是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性的任一多肽序列。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中，所述式A化合物包括以下化合物或其药学上可接受的盐：
在另一优选例中，所述以式A化合物为前体的下游产物包括：依那普利、贝那普利、雷米普利、西拉普利、吲哚普利、螺普利。
在本发明的第二方面，提供了一种式A化合物生产菌株，所述菌株表达以下多肽：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述多肽是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性的任一多肽序列。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中，所述生产菌株是细菌。
在另一优选例中，所述生产菌株是大肠杆菌。
在另一优选例中，所述大肠杆菌选自下组：E.coli BL21(DE3)、大肠杆菌C2566。
在本发明的第三方面，提供了一种生产式A化合物的方法，所述方法包括：
(a)在液态反应体系中，以式B化合物为底物，在辅酶存在下，在立体选择性乳酸脱氢酶(D-乳酸脱氢酶)催化下，进行反应式I所示的反应，从而形成式A化合物；
反应式I
反应式I中，R和n如上定义；
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式A化合物。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述式B化合物的浓度为1g/L-1000g/L，较佳地为5g/L-500g/L，更佳地为10g/L-100g/L，最佳地为20g/L-80g/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述立体选择性乳酸脱氢酶的浓度为1×102U-1×105U，较佳地为1×103U-1×105U，更佳地为5×103U-1×105U，又更佳地为1×104U-1×105U，最佳地为5×104U-1×105U。
在另一优选例中，所述立体选择性乳酸脱氢酶是：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述立体选择性乳酸脱氢酶是：
在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个，更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性的任一多肽序列。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中，所述式A化合物为R-HPBA。
在另一优选例中，所述式A化合物为(R)-(E)-2-羟基-4-苯基-3-丁烯酸。
在另一优选例中，所述反应体系中，还存在辅酶。
在另一优选例中，所述的辅酶选自下组：NADH、NADPH、NAD、NADP、或其组合。
在另一优选例中，所述反应体系中，所述辅酶的浓度为5mg/L-1000mg/L，较佳地为10mg/L-800mg/L，更佳地为20mg/L-600mg/L，又更佳地为50mg/L-500mg/L，最佳地为100mg/L-300mg/L。
在另一优选例中，所述反应体系中，还存在用于辅酶再生的酶。
在另一优选例中，所述用于辅酶再生的酶的浓度为1×102U-1×106U，较佳地为1×103U-1×105U，更佳地为5×103U-2×105U，最佳地为1.5×104U-1.5×105U。
在另一优选例中，所述的用于辅酶再生的酶选自下组：甲酸脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、或其组合。
在另一优选例中，所述葡萄糖脱氢酶的浓度为1×102U-1×106U，较佳地为1×103U-5×105U，更佳地为1×104U-1×105U，最佳地为4×104U-5×104U。
在另一优选例中，所述甲酸脱氢酶的浓度为1×102U-1×106U，较佳地为1×103U-5×105U，更佳地为1×104U-1×105U，最佳地为4×104U-5×104U。
在另一优选例中，步骤(a)中，温度为10℃-50℃，较佳地15℃-40℃，更佳地20℃-30℃。
在另一优选例中，步骤(a)中，pH为6-10，较佳地6.5-9.0，更佳地7.5-8.0。
在本发明的第四方面，提供了一种生产式A化合物的方法，所述方法包括：
1)采用生产条件培养在本发明的第二方面所述的生产菌株，从而得到式A化合物；
2)任选地，从1)的培养体系中分离获得式A化合物。
在本发明的第五方面，提供了一种式A化合物生产菌株的构建方法，所述方法包括：
使得所述菌株包含表达以下多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达以下多肽的基因，所述多肽是：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述多肽是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性的任一多肽序列。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选例中，所述基因的序列选自下组：
(i)SEQ ID NO.5或SEQ ID NO:7所示的序列；
(ii)与(i)限定的任一序列互补的多核苷酸；或
(iii)与(i)限定的任一序列具有至少70％(优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％)以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
在另一优选例中，所述基因的序列如SEQ ID NO:7所示。
在另一优选例中，所述基因构建在表达载体上。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
发明人经过广泛而深入的研究，出乎意料地发现一种多肽(D-乳酸脱氢酶)，其能够立体选择性地催化反应式I所示的反应，将式B化合物(例如OPBA、E-2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸)高效地转化为式A化合物(例如R-HPBA、(R)-(E)-2-羟基-4-苯基-3-丁烯酸)，转化率≥98％，手性ee值≥99％，从而极大地提高生产效率，降低生产成本。采用本发明所述的乳酸脱氢酶进行还原反应的原料易得，收率高，成本低，易于放大，适合大生产的进行。在此基础上完成了本发明。
术语定义
对映体过量(ee,enantiomeric excess)：通常用来表征手性分子中一个对映异构体相对于另一个对映异构体的过量值。
多肽
本文所用的术语“多肽”或“本发明多肽”或“本发明的多肽”或“D-乳酸脱氢酶”或“立体选择性乳酸脱氢酶”具有相同的意义，在本文可以互换使用，均是指具有催化式B化合物产生式A化合物活性的蛋白。大肠杆菌中天然不存在此多肽，其属于外源性蛋白。
基于现有技术的知识，本领域普通技术人员不难知晓，在多肽的某些区域，例如非重要区域改变少数氨基酸残基基本上不会改变生物活性，例如，适当替换某些氨基酸得到的序列并不会影响其活性(可参见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224)。因此，本领域普通技术人员能够实施这种替换并且确保所得分子仍具有所需生物活性。
因此，在具体的实施方式中，本发明的多肽可以是：(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在优选的实施方式中，所述多肽是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在优选的实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选例中，所述多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性的任一多肽序列。
在优选的实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在具体的实施方式中，本发明多肽表示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID NO:5所示。
在具体的实施方式中，本发明多肽表示氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID NO:7所示。
在本发明中，本发明多肽包括与氨基酸序列SEQ ID NO:1所示的多肽相比，有至多20个、较佳地至多10个，又佳地至多8个，再佳地至多3个，更佳地至多2个，最佳地至多1个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成的突变体。这些保守性变异的突变体可根据，例如下表所示进行氨基酸替换而产生。
初始残基 代表性的取代残基 优选的取代残基
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu Glu
Cys(C) Ser Ser
Gln(Q) Asn Asn
Glu(E) Asp Asp
Gly(G) Pro；Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu
Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu
本发明还提供了编码本发明多肽的多核苷酸。术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
因此，本文所用的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
在具体的实施方式中，所述同源性或序列相同性可以是80％以上，优选90％以上，更优选95％-98％，最优选99％以上。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；生物计算：信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects)，Smith，D.W.编，学术出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data)，第一部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编，HumanaPress，新泽西，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，von Heinje，G.，学术出版社，1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer)，Gribskov，M.与Devereux，J.编M Stockton Press，纽约，1991和Carillo，H.与Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于：GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S，F.等，1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
多肽的用途
本发明人出乎意料的发现本发明多肽具有D-乳酸脱氢酶的活性，能够用于生产式A化合物或以式A化合物为前体的下游产物。
在具体的实施方式中，所述多肽是：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽；
式中，R和n如上定义。
在优选的实施方式中，所述式A化合物为前手性羰基酸化合物进行不对称还原反应形成。
典型地，所述前手性羰基酸化合物为式B化合物：
式中，R和n如上定义。
典型地，所述前手性羰基酸化合物包括以下化合物或其药学上可接受的盐：
在优选的实施方式中，所述多肽是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
典型地，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3所示。
在具体的实施方式中，本发明多肽表示氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID NO:5所示。
在具体的实施方式中，本发明多肽表示氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的蛋白质，其编码序列如SEQ ID NO:7所示。
在优选的实施方式中，所述式A化合物包括R-HPBA或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方式中，所述式A化合物包括(R)-(E)-2-羟基-4-苯基-3-丁烯酸或其药学上可接受的盐。
在优选的实施方式中，所述以式A化合物为前体的下游产物包括：依那普利、贝那普利、雷米普利、西拉普利、吲哚普利、螺普利。
式A化合物生产菌株
本发明人出乎意料的发现表达本发明多肽的菌株能够立体选择性地催化反应式I所示的反应，将式B化合物(例如OPBA、E-2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸)高效地转化为式A化合物(例如R-HPBA、(R)-(E)-2-羟基-4-苯基-3-丁烯酸)，转化率≥98％，手性ee值≥99％。
在具体的实施方式中，所述菌株表达以下多肽：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选的实施方式中，所述多肽是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
在另一优选的实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在另一优选的实施方式中，所述多肽的氨基酸序列为与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列相同性的任一多肽序列。
在另一优选的实施方式中，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在另一优选的实施方式中，所述生产菌株是细菌，优选大肠杆菌(例如E.coliBL21(DE3)、大肠杆菌C2566)。
生产式A化合物的方法
在本发明中，所述的立体选择性乳酸脱氢酶(D-乳酸脱氢酶)可以各种形式使用。例如，可使用表达本发明所述立体选择性乳酸脱氢酶的静息细胞或湿菌体，也可以使用粗酶液、纯酶或者粗酶粉等各种不同形式，或者使用固定化酶。
在优选的实施方式中，所述生产式A化合物的方法包括：
(a)在液态反应体系中，以式B化合物为底物，在辅酶存在下，在立体选择性乳酸脱氢酶(D-乳酸脱氢酶)催化下，进行反应式I所示的反应，从而形成式A化合物；
反应式I
反应式I中，R和n如上定义；
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式A化合物。
在另一优选的实施方式中，所述生产式A化合物方法包括：
1)采用生产条件培养本发明的式A化合物生产菌株，从而得到式A化合物；
2)任选地，从1)的培养体系中分离获得式A化合物。
式A化合物生产菌株的构建方法
发明人出乎意料地发现通过使得所述菌株包含表达本发明多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达本发明多肽的基因，可构建具有高转化率的式A化合物生产菌株。
在另一具体的实施方式中，所述方法还包括测定所得菌株的转化率和/或式A化合物产量以验证所得菌株。
本发明的主要优点：
(1)采用廉价易得的原料羰基酸化合物为起始物料；
(2)采用本发明所述的乳酸脱氢酶催化得到手性纯的羟基酸化合物，例如OPBA在本发明所述的乳酸脱氢酶的催化下得到R-HPBA，能够以较高的收率得到最终产品，且产品的ee值>98％；
(3)采用本发明所述的乳酸脱氢酶进行还原反应的成本低，易于放大，适合大生产的进行。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
实施例1乳酸脱氢酶基因的获取
从NCBI数据库中检索到的Staphylococcus epidermidis ATCC 12228和Staphylococcus epidermidis strain C10C的基因组已经测序，genebank登录号分别是NC_004461和NZ_JQHC01000048.1。从基因组序列中寻找乳酸脱氢酶，发现有4个D-乳酸脱氢酶SEQ ID NO:1-4(登录号分别是NP_765629.1和NP_765676.1；WP_002484424.1和WP_002456698.1)。根据DNA序列SEQ ID NO:5-6设计引物，见SEQ ID NO:9-12：
表1：
以基因组DNA为模板，进行PCR，实验条件如下：
PCR产物纯化回收后，克隆酶连到表达载体pET28a的NdeI&HindIII位点，得到2个表达质粒。
通过基因合成得到基因序列SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。
SEQ ID NO:1
MTKIMFFGTRAYEKDMALRWGKKNNIDVTTSTELLSVDTVDQLKDYDGVTTMQFGKLEPEVYPKLESYGIKQIAQRTAGFDMYDLELAKKHEIIISNIPSYSPETIAEYSVSIALQLVRKFPTIEKRVQAHNFTWASPIMSRPVKNMTVAIIGTGRIGAATGKIYAGFGARVVGYDAYPNHSLSFLEYKETVEDAIKDADIISLHVPANKDSFHLFDNNMFKNVKKGAVLVNAARGAVINTPDLIEAVNNGTLSGAAIDTYENEANYFTFDCSNQTIDDPILLDLIRNENILVTPHIAFFSDEAVQNLVEGGLNAALSVINTGTCDTRLN
SEQ ID NO:5
ATGACAAAAATTATGTTTTTCGGCACAAGAGCATATGAGAAGGACATGGCATTACGTTGGGGAAAGAAAAATAATATCGATGTCACTACATCAACAGAACTTTTAAGTGTAGATACTGTCGATCAATTAAAAGATTATGACGGTGTTACAACAATGCAGTTCGGTAAATTAGAACCTGAAGTTTACCCTAAATTAGAGTCCTATGGTATTAAACAAATTGCACAACGTACGGCTGGATTTGATATGTATGACTTAGAACTTGCAAAAAAACATGAAATTATTATCTCGAATATACCTAGTTATTCACCTGAAACAATTGCTGAATATTCGGTATCTATCGCTCTGCAACTCGTACGAAAATTCCCAACAATTGAAAAACGTGTGCAAGCACATAATTTCACATGGGCGTCCCCTATTATGTCTCGTCCAGTAAAAAATATGACTGTAGCAATCATCGGTACAGGGCGTATTGGTGCTGCAACTGGTAAAATCTATGCTGGTTTTGGTGCGAGAGTAGTTGGTTATGATGCATATCCTAATCATTCTTTATCTTTCTTAGAATATAAAGAAACAGTAGAGGATGCAATTAAAGATGCTGATATTATCTCATTACATGTACCCGCTAATAAAGATAGTTTCCATTTATTTGATAACAATATGTTTAAAAATGTTAAAAAAGGTGCCGTTTTAGTCAATGCCGCAAGAGGAGCTGTGATAAACACGCCTGATTTAATTGAAGCAGTAAATAATGGTACATTATCAGGTGCTGCCATTGACACATATGAAAATGAAGCTAATTATTTCACATTTGATTGTTCAAATCAAACGATTGACGACCCAATATTATTAGACCTAATTAGAAATGAAAATATTTTAGTTACACCTCATATTGCCTTTTTCTCCGATGAAGCAGTACAAAATTTAGTAGAGGGTGGTTTGAATGCAGCATTATCAGTAATTAATACTGGCACATGTGATACGCGATTAAACTAA
SEQ ID NO:2
MTKIKLMGVREEDEHYIEMWSQQHEVEVDMSKEQLTEDNVQSIEGFDGLSLSQTLPLSETIYNKLNQLGIRQIAQRSAGFDGYNLELASKYGLIISNVPSYSPRSIAEFTVTQAINIVRHFNHIQRKMRLHDFRWEASILSQSIKDLKVAVIGTGHIGGIVAQIFSEGYLCDVVAYDPFPSEHVKPYVTYKQSINEAIKEADIVTIHMPSTQYNNYLFNENMFQMFKKGAVFVNCARGSLVDTKALLSAIEQGQIKGAALDTYEYEIGVYTTDRSEEGLNDPLLEELITREDIIVTPHIAFYTEEAIKHLIFDALDATMEVLNTGTTELRVN
SEQ ID NO:6
ATGACTAAAATTAAATTAATGGGTGTCAGAGAAGAAGATGAACATTATATTGAAATGTGGTCACAACAACATGAAGTGGAAGTGGATATGTCGAAAGAACAGTTAACTGAAGACAATGTCCAATCTATTGAAGGATTTGATGGACTATCATTGTCTCAAACATTACCATTATCAGAAACAATTTATAATAAATTAAATCAACTTGGAATTCGGCAGATCGCTCAACGAAGTGCTGGATTTGATGGTTATAATTTAGAGTTAGCATCTAAATATGGTCTTATTATATCTAATGTGCCTTCCTATTCACCTCGAAGCATTGCTGAGTTTACCGTGACTCAAGCCATCAATATTGTACGTCACTTTAATCATATTCAAAGAAAAATGAGATTGCACGATTTTAGGTGGGAAGCATCAATTTTATCTCAATCAATCAAAGATTTAAAGGTAGCGGTTATTGGCACGGGACATATTGGTGGCATTGTTGCACAAATATTCTCAGAAGGATATCTATGTGACGTTGTAGCGTATGATCCTTTTCCAAGTGAACATGTGAAACCTTACGTTACCTATAAACAAAGTATAAATGAGGCAATTAAAGAGGCAGATATTGTCACAATACATATGCCGTCAACACAATATAACAATTACCTGTTTAATGAAAACATGTTTCAAATGTTTAAAAAGGGTGCTGTGTTTGTAAATTGTGCTAGAGGATCCTTAGTAGATACCAAGGCTTTGTTATCTGCAATAGAGCAAGGTCAAATTAAAGGTGCAGCACTTGATACTTATGAATATGAAATTGGAGTATATACGACAGATAGAAGTGAAGAAGGTTTGAATGACCCACTTTTAGAGGAATTAATTACTAGAGAAGATATTATTGTTACACCGCATATAGCATTTTATACTGAAGAGGCAATCAAACATCTTATTTTTGATGCTTTAGATGCAACAATGGAAGTATTAAATACTGGCACGACGGAGTTAAGAGTAAATTAA
SEQ ID NO:3
MTKIMFFGTRAYEKDMALRWGKKNNIDVTTSKELLSVDTVDQLKDYDGVTTMQFGKLESEVYPKLESYGIKQIAQRTAGFDMYDLELAKKHGIIISNIPSYSPETIAEYSVSIALQLVRKFPTIEKRVQAHNFTWASPIMSRPVKNMTVAIIGTGRIGAATGKIYAGFGAKVVGYDAYPNHSLSFLEYKETVEDAIKDADIISLHVPANKDSFHLFDNNMFKKVKKGAVLVNAARGAVINTPDLIEAVNNGTLSGAAIDTYENEANYFTFDWSNQTIEDPILLELIRNENILVTPHIAFFSDEAVQNLVEGGLNAALSVINTGTCDTRLN
SEQ ID NO:7
ATGACAAAAATTATGTTTTTCGGCACAAGAGCATATGAGAAGGACATGGCATTACGTTGGGGAAAGAAAAATAATATCGATGTCACTACATCAAAAGAACTTTTAAGTGTAGATACTGTCGATCAATTAAAAGATTATGACGGTGTTACAACAATGCAGTTCGGTAAATTAGAATCTGAAGTTTACCCTAAATTAGAGTCCTATGGTATTAAACAAATTGCACAACGTACGGCTGGATTTGATATGTATGACTTAGAACTTGCAAAAAAACATGGAATTATTATCTCAAATATACCTAGTTATTCACCTGAAACAATTGCTGAATATTCGGTATCTATCGCTCTGCAACTCGTACGAAAATTCCCAACAATTGAAAAACGTGTGCAAGCACATAATTTCACATGGGCGTCCCCTATTATGTCTCGTCCAGTAAAAAATATGACTGTAGCAATCATCGGTACAGGGCGTATTGGTGCTGCAACTGGTAAAATCTATGCTGGTTTTGGTGCGAAAGTAGTTGGTTATGATGCATATCCTAATCATTCTTTATCTTTCTTAGAATATAAAGAAACAGTAGAGGATGCAATTAAAGATGCTGATATTATCTCATTACATGTACCCGCTAATAAAGATAGTTTCCATTTATTTGATAACAATATGTTTAAAAAAGTTAAAAAAGGTGCCGTTTTAGTTAATGCTGCAAGAGGAGCTGTGATAAACACGCCTGATTTAATTGAAGCAGTAAATAATGGTACATTATCAGGTGCTGCCATTGACACATATGAAAATGAAGCTAATTATTTCACATTTGATTGGTCAAATCAAACAATTGAGGACCCAATATTATTAGAACTAATTAGAAATGAAAATATTTTAGTTACACCTCATATTGCCTTTTTCTCCGATGAAGCAGTACAAAATTTAGTAGAGGGTGGTTTGAATGCAGCATTATCAGTAATTAATACTGGCACATGTGATACGCGATTAAACTAA
SEQ ID NO:4
MTKIKLMGVREEDEHYIEMWSQQHEVEVDMSKEQLTEDNVQSIEGFDGLSLSQTLPLSETIYNKLNQLGIRQIAQRSAGFDGYDLELASKYGLIISNVPSYSPRSIAEFTVTQAINIVRHFNHIQRKMRLHDFRWEASILSQSIKDLKVAVIGTGHIGGIVAQIFSEGYLCDVVAYDPFPSEHVKPYVTYKQCINEAIKDADIVTIHMPSTRYNNYLFNENIFQMFKKGVVFVNCARGSLVDTKALLSAIEQGQIKGAALDTYEYEVGVYTTDRSEQGLNDPLLEELITREDIIVTPHIAFYTEEAIKHLIFDALDATMEVLNTGTTELRVN
SEQ ID NO:8
ATGACTAAAATTAAATTAATGGGTGTCAGAGAAGAAGATGAACATTATATTGAAATGTGGTCACAACAACATGAAGTGGAAGTGGATATGTCGAAAGAACAGTTAACTGAAGACAATGTCCAATCTATTGAAGGATTTGATGGACTATCATTGTCTCAAACATTACCATTATCAGAAACAATTTATAATAAATTAAATCAACTTGGAATTCGGCAGATCGCTCAACGAAGTGCTGGATTTGATGGTTATGATTTAGAGTTAGCATCTAAATATGGTCTTATTATATCTAATGTGCCTTCCTATTCACCTCGAAGCATTGCTGAGTTTACCGTGACTCAAGCCATCAATATTGTACGTCACTTTAATCATATTCAAAGAAAAATGAGATTGCACGATTTTAGGTGGGAAGCATCAATTTTATCTCAATCGATCAAAGATTTAAAGGTAGCGGTTATTGGCACGGGACATATTGGTGGCATTGTTGCACAAATATTCTCAGAAGGATATCTATGTGACGTTGTAGCGTATGATCCTTTTCCAAGTGAACATGTGAAACCTTACGTTACCTATAAACAATGTATAAATGAGGCTATTAAAGATGCAGATATTGTCACAATACATATGCCGTCAACACGATATAACAATTACCTGTTTAATGAAAATATATTTCAAATGTTTAAAAAGGGTGTTGTGTTTGTAAATTGTGCTAGAGGATCCTTAGTAGATACCAAGGCTTTGTTATCTGCAATAGAGCAAGGTCAAATTAAAGGTGCAGCACTTGATACTTATGAATATGAAGTTGGAGTATATACGACAGATAGAAGTGAACAAGGTTTGAATGACCCACTTTTAGAGGAATTAATTACTAGAGAAGATATTATTGTTACACCGCACATAGCATTTTATACTGAAGAGGCAATCAAACATCTTATTTTTGATGCTTTAGATGCAACAATGGAAGTATTAAATACTGGCACGACGGAGTTAAGAGTAAATTAA
实施例2质粒转化筛选和菌体发酵
将实施例1中的重组表达质粒转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，转化条件42℃，热击90秒，在含有卡纳霉素抗生素的平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆。培养重组菌，即获得阳性重组转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-LDH1(NP_765629.1)，E.coli BL21(DE3)/pET28a-LDH2(NP_765676.1)，E.coliBL21(DE3)/pET28a-LDH3(WP_002484424.1)，和E.coli BL21(DE3)/pET28a–LDH4(WP_002456698.1)。
LDH的高密度发酵：将上述重组大肠杆菌接种于含有50ug/mL卡纳霉素的200mL LB培养基中，于37℃，180-220rpm培养10-16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9)中(葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，硫酸钠0.5g/L，氯化钙0.0152g/L，六水氯化镁0.41g/L)，在25-35℃，300-800rpm，空气流量2-6L/min的条件下培养。培养6-10h后，以5-20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20-40时，添加0.1-1mM IPTG开始诱导。诱导5-15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。
实施例3酶活测定
取菌体100g，加400mLPBS缓冲液，高压均质破碎三次(800-1000pa)，离心12000rpm除去碎片，得到酶液。将酶液冻干，得到冻干粉8克，-80度保存。
酶活(U)的定义为每分钟消耗1μmol NADH所需要的酶量。
酶活(U)的测定方法是：在25℃条件下，50mM磷酸盐缓冲液，OPBA的浓度为1mM，NADH的浓度为1mM，用分光光度计在340nm波长下测定NADH的消耗速度。
酶活列表
序列编号 比酶活(U/mg) Km
LDH1 8.2
LDH2 1.9
LDH3 7.5
LDH4 1.3
实施例4～7 OPBA的不对称还原反应
催化反应体系中，OPBA的浓度为0.1M，NAD+的浓度为0.02mM，D-乳酸脱氢酶1～10g/L，葡萄糖脱氢酶GDH 0.1～3g/L。反应温度：20～35℃，反应时间：1h，用1M NaOH或饱和Na2CO3控制pH值6.5～7.5之间。反应结束后用1M盐酸调pH到2～3之间，分三次用2倍体积乙酸乙酯萃取，干燥旋蒸得到HPBA。HPLC检测反应转化率，手性HPLC检测ee值。
实施例8一次性加料
1L反应体系中，加OPBA 50g，NAD+的浓度为0.1g，D-乳酸脱氢酶(序列1)30000U，甲酸脱氢酶50000U，甲酸钠50g。反应温度：20～30℃，反应时间：8h，用1M NaOH控制pH值6.5～7.5。反应结束后用1M盐酸调pH到2～3之间，分三次用2倍体积乙酸乙酯萃取，干燥旋蒸得到R-HPBA粗品。HPLC检测反应转化率99％和ee值99.9％。
实施例9分批加料
1L反应体系中，加OPBA 50g，NAD+的浓度为0.1g，D-乳酸脱氢酶(序列1)30000U，葡萄糖脱氢酶40000U，葡萄糖50g。反应温度：20～30℃，用1M NaOH控制pH值7.5～8.0之间。根据NaOH的量来监测反应进程，待pH稳定后，补加30g OPBA，继续反应至10小时。待反应结束后用1M盐酸调pH到2～3之间，分三次用2倍体积乙酸乙酯萃取，干燥旋蒸得到R-HPBA粗品。HPLC检测反应转化率100％和ee值99.9％。
实施例10一次性加料
1L反应体系中，加E-2-氧代-4-苯基-3-丁烯酸50g，NAD+的浓度为0.1g，D-乳酸脱氢酶(序列1)30000U，甲酸脱氢酶40000U，甲酸钠50g。反应温度：20～30℃，反应时间：24h，用1M NaOH控制pH值7.5～8.0之间。反应结束后用1M盐酸调pH到2～3之间，分三次用2倍体积乙酸乙酯萃取，干燥旋蒸得到(R)-(E)-2-羟基-4-苯基-3-丁烯酸粗品。HPLC检测反应转化率98％和ee值99％。
实施例11 R-HPBA酯化合成R-HPBE
将18g的R-HPBA溶于100mL乙醇中，冰水浴下滴加14.mL的SOCl2，滴加完毕后升温到80℃回流反应4～8小时，TLC检测反应完全后减压蒸馏除去溶剂，得到淡黄色油状物19.8g，收率95.2％，GC检测纯度>99.5％,ee>99.9％。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海弈柯莱生物医药科技有限公司
<120> 一种乳酸脱氢酶在不对称合成手性羟基化合物中的应用
<130> P2017-0385
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Thr Lys Ile Met Phe Phe Gly Thr Arg Ala Tyr Glu Lys Asp Met
1 5 10 15
Ala Leu Arg Trp Gly Lys Lys Asn Asn Ile Asp Val Thr Thr Ser Thr
20 25 30
Glu Leu Leu Ser Val Asp Thr Val Asp Gln Leu Lys Asp Tyr Asp Gly
35 40 45
Val Thr Thr Met Gln Phe Gly Lys Leu Glu Pro Glu Val Tyr Pro Lys
50 55 60
Leu Glu Ser Tyr Gly Ile Lys Gln Ile Ala Gln Arg Thr Ala Gly Phe
65 70 75 80
Asp Met Tyr Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys His Glu Ile Ile Ile Ser
85 90 95
Asn Ile Pro Ser Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Ala Glu Tyr Ser Val Ser
100 105 110
Ile Ala Leu Gln Leu Val Arg Lys Phe Pro Thr Ile Glu Lys Arg Val
115 120 125
Gln Ala His Asn Phe Thr Trp Ala Ser Pro Ile Met Ser Arg Pro Val
130 135 140
Lys Asn Met Thr Val Ala Ile Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Ala Ala
145 150 155 160
Thr Gly Lys Ile Tyr Ala Gly Phe Gly Ala Arg Val Val Gly Tyr Asp
165 170 175
Ala Tyr Pro Asn His Ser Leu Ser Phe Leu Glu Tyr Lys Glu Thr Val
180 185 190
Glu Asp Ala Ile Lys Asp Ala Asp Ile Ile Ser Leu His Val Pro Ala
195 200 205
Asn Lys Asp Ser Phe His Leu Phe Asp Asn Asn Met Phe Lys Asn Val
210 215 220
Lys Lys Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Ala Arg Gly Ala Val Ile Asn
225 230 235 240
Thr Pro Asp Leu Ile Glu Ala Val Asn Asn Gly Thr Leu Ser Gly Ala
245 250 255
Ala Ile Asp Thr Tyr Glu Asn Glu Ala Asn Tyr Phe Thr Phe Asp Cys
260 265 270
Ser Asn Gln Thr Ile Asp Asp Pro Ile Leu Leu Asp Leu Ile Arg Asn
275 280 285
Glu Asn Ile Leu Val Thr Pro His Ile Ala Phe Phe Ser Asp Glu Ala
290 295 300
Val Gln Asn Leu Val Glu Gly Gly Leu Asn Ala Ala Leu Ser Val Ile
305 310 315 320
Asn Thr Gly Thr Cys Asp Thr Arg Leu Asn
325 330
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Thr Lys Ile Lys Leu Met Gly Val Arg Glu Glu Asp Glu His Tyr
1 5 10 15
Ile Glu Met Trp Ser Gln Gln His Glu Val Glu Val Asp Met Ser Lys
20 25 30
Glu Gln Leu Thr Glu Asp Asn Val Gln Ser Ile Glu Gly Phe Asp Gly
35 40 45
Leu Ser Leu Ser Gln Thr Leu Pro Leu Ser Glu Thr Ile Tyr Asn Lys
50 55 60
Leu Asn Gln Leu Gly Ile Arg Gln Ile Ala Gln Arg Ser Ala Gly Phe
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Asn Leu Glu Leu Ala Ser Lys Tyr Gly Leu Ile Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Ser Tyr Ser Pro Arg Ser Ile Ala Glu Phe Thr Val Thr
100 105 110
Gln Ala Ile Asn Ile Val Arg His Phe Asn His Ile Gln Arg Lys Met
115 120 125
Arg Leu His Asp Phe Arg Trp Glu Ala Ser Ile Leu Ser Gln Ser Ile
130 135 140
Lys Asp Leu Lys Val Ala Val Ile Gly Thr Gly His Ile Gly Gly Ile
145 150 155 160
Val Ala Gln Ile Phe Ser Glu Gly Tyr Leu Cys Asp Val Val Ala Tyr
165 170 175
Asp Pro Phe Pro Ser Glu His Val Lys Pro Tyr Val Thr Tyr Lys Gln
180 185 190
Ser Ile Asn Glu Ala Ile Lys Glu Ala Asp Ile Val Thr Ile His Met
195 200 205
Pro Ser Thr Gln Tyr Asn Asn Tyr Leu Phe Asn Glu Asn Met Phe Gln
210 215 220
Met Phe Lys Lys Gly Ala Val Phe Val Asn Cys Ala Arg Gly Ser Leu
225 230 235 240
Val Asp Thr Lys Ala Leu Leu Ser Ala Ile Glu Gln Gly Gln Ile Lys
245 250 255
Gly Ala Ala Leu Asp Thr Tyr Glu Tyr Glu Ile Gly Val Tyr Thr Thr
260 265 270
Asp Arg Ser Glu Glu Gly Leu Asn Asp Pro Leu Leu Glu Glu Leu Ile
275 280 285
Thr Arg Glu Asp Ile Ile Val Thr Pro His Ile Ala Phe Tyr Thr Glu
290 295 300
Glu Ala Ile Lys His Leu Ile Phe Asp Ala Leu Asp Ala Thr Met Glu
305 310 315 320
Val Leu Asn Thr Gly Thr Thr Glu Leu Arg Val Asn
325 330
<210> 3
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Thr Lys Ile Met Phe Phe Gly Thr Arg Ala Tyr Glu Lys Asp Met
1 5 10 15
Ala Leu Arg Trp Gly Lys Lys Asn Asn Ile Asp Val Thr Thr Ser Lys
20 25 30
Glu Leu Leu Ser Val Asp Thr Val Asp Gln Leu Lys Asp Tyr Asp Gly
35 40 45
Val Thr Thr Met Gln Phe Gly Lys Leu Glu Ser Glu Val Tyr Pro Lys
50 55 60
Leu Glu Ser Tyr Gly Ile Lys Gln Ile Ala Gln Arg Thr Ala Gly Phe
65 70 75 80
Asp Met Tyr Asp Leu Glu Leu Ala Lys Lys His Gly Ile Ile Ile Ser
85 90 95
Asn Ile Pro Ser Tyr Ser Pro Glu Thr Ile Ala Glu Tyr Ser Val Ser
100 105 110
Ile Ala Leu Gln Leu Val Arg Lys Phe Pro Thr Ile Glu Lys Arg Val
115 120 125
Gln Ala His Asn Phe Thr Trp Ala Ser Pro Ile Met Ser Arg Pro Val
130 135 140
Lys Asn Met Thr Val Ala Ile Ile Gly Thr Gly Arg Ile Gly Ala Ala
145 150 155 160
Thr Gly Lys Ile Tyr Ala Gly Phe Gly Ala Lys Val Val Gly Tyr Asp
165 170 175
Ala Tyr Pro Asn His Ser Leu Ser Phe Leu Glu Tyr Lys Glu Thr Val
180 185 190
Glu Asp Ala Ile Lys Asp Ala Asp Ile Ile Ser Leu His Val Pro Ala
195 200 205
Asn Lys Asp Ser Phe His Leu Phe Asp Asn Asn Met Phe Lys Lys Val
210 215 220
Lys Lys Gly Ala Val Leu Val Asn Ala Ala Arg Gly Ala Val Ile Asn
225 230 235 240
Thr Pro Asp Leu Ile Glu Ala Val Asn Asn Gly Thr Leu Ser Gly Ala
245 250 255
Ala Ile Asp Thr Tyr Glu Asn Glu Ala Asn Tyr Phe Thr Phe Asp Trp
260 265 270
Ser Asn Gln Thr Ile Glu Asp Pro Ile Leu Leu Glu Leu Ile Arg Asn
275 280 285
Glu Asn Ile Leu Val Thr Pro His Ile Ala Phe Phe Ser Asp Glu Ala
290 295 300
Val Gln Asn Leu Val Glu Gly Gly Leu Asn Ala Ala Leu Ser Val Ile
305 310 315 320
Asn Thr Gly Thr Cys Asp Thr Arg Leu Asn
325 330
<210> 4
<211> 332
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Thr Lys Ile Lys Leu Met Gly Val Arg Glu Glu Asp Glu His Tyr
1 5 10 15
Ile Glu Met Trp Ser Gln Gln His Glu Val Glu Val Asp Met Ser Lys
20 25 30
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35 40 45
Leu Ser Leu Ser Gln Thr Leu Pro Leu Ser Glu Thr Ile Tyr Asn Lys
50 55 60
Leu Asn Gln Leu Gly Ile Arg Gln Ile Ala Gln Arg Ser Ala Gly Phe
65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Asp Pro Phe Pro Ser Glu His Val Lys Pro Tyr Val Thr Tyr Lys Gln
180 185 190
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195 200 205
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290 295 300
Glu Ala Ile Lys His Leu Ile Phe Asp Ala Leu Asp Ala Thr Met Glu
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Val Leu Asn Thr Gly Thr Thr Glu Leu Arg Val Asn
325 330
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<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgacaaaaa ttatgttttt cggcacaaga gcatatgaga aggacatggc attacgttgg 60
ggaaagaaaa ataatatcga tgtcactaca tcaacagaac ttttaagtgt agatactgtc 120
gatcaattaa aagattatga cggtgttaca acaatgcagt tcggtaaatt agaacctgaa 180
gtttacccta aattagagtc ctatggtatt aaacaaattg cacaacgtac ggctggattt 240
gatatgtatg acttagaact tgcaaaaaaa catgaaatta ttatctcgaa tatacctagt 300
tattcacctg aaacaattgc tgaatattcg gtatctatcg ctctgcaact cgtacgaaaa 360
ttcccaacaa ttgaaaaacg tgtgcaagca cataatttca catgggcgtc ccctattatg 420
tctcgtccag taaaaaatat gactgtagca atcatcggta cagggcgtat tggtgctgca 480
actggtaaaa tctatgctgg ttttggtgcg agagtagttg gttatgatgc atatcctaat 540
cattctttat ctttcttaga atataaagaa acagtagagg atgcaattaa agatgctgat 600
attatctcat tacatgtacc cgctaataaa gatagtttcc atttatttga taacaatatg 660
tttaaaaatg ttaaaaaagg tgccgtttta gtcaatgccg caagaggagc tgtgataaac 720
acgcctgatt taattgaagc agtaaataat ggtacattat caggtgctgc cattgacaca 780
tatgaaaatg aagctaatta tttcacattt gattgttcaa atcaaacgat tgacgaccca 840
atattattag acctaattag aaatgaaaat attttagtta cacctcatat tgcctttttc 900
tccgatgaag cagtacaaaa tttagtagag ggtggtttga atgcagcatt atcagtaatt 960
aatactggca catgtgatac gcgattaaac taa 993
<210> 6
<211> 999
<212> DNA
<213> 人工序列
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atgactaaaa ttaaattaat gggtgtcaga gaagaagatg aacattatat tgaaatgtgg 60
tcacaacaac atgaagtgga agtggatatg tcgaaagaac agttaactga agacaatgtc 120
caatctattg aaggatttga tggactatca ttgtctcaaa cattaccatt atcagaaaca 180
atttataata aattaaatca acttggaatt cggcagatcg ctcaacgaag tgctggattt 240
gatggttata atttagagtt agcatctaaa tatggtctta ttatatctaa tgtgccttcc 300
tattcacctc gaagcattgc tgagtttacc gtgactcaag ccatcaatat tgtacgtcac 360
tttaatcata ttcaaagaaa aatgagattg cacgatttta ggtgggaagc atcaatttta 420
tctcaatcaa tcaaagattt aaaggtagcg gttattggca cgggacatat tggtggcatt 480
gttgcacaaa tattctcaga aggatatcta tgtgacgttg tagcgtatga tccttttcca 540
agtgaacatg tgaaacctta cgttacctat aaacaaagta taaatgaggc aattaaagag 600
gcagatattg tcacaataca tatgccgtca acacaatata acaattacct gtttaatgaa 660
aacatgtttc aaatgtttaa aaagggtgct gtgtttgtaa attgtgctag aggatcctta 720
gtagatacca aggctttgtt atctgcaata gagcaaggtc aaattaaagg tgcagcactt 780
gatacttatg aatatgaaat tggagtatat acgacagata gaagtgaaga aggtttgaat 840
gacccacttt tagaggaatt aattactaga gaagatatta ttgttacacc gcatatagca 900
ttttatactg aagaggcaat caaacatctt atttttgatg ctttagatgc aacaatggaa 960
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<211> 39
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ctcgagtgcg gccgcaagct taatttactc ttaactccgt c 41

Claims (10)

1.一种多肽在生产式A化合物或以式A化合物为前体的下游产物中的用途，其特征在于，所述多肽是：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽；
式中，
R表示氢，或1、2、3或4个选自下组的取代基：卤素、-OH、取代或未取代的C1-C8烷基、取代或未取代的C3-C8环烷基、取代或未取代的C1-C8烷氧基、或取代或未取代的C3-C8环烷氧基，其中所述的取代指具有一个或多个选自下组的取代基：卤素、-OH、-NH2、-CN、C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、-NH(C1-C3烷基)、-N(C1-C3烷基)2；
n选自0～10的任一整数。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽是在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的任一端经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述式A化合物包括以下化合物或其药学上可接受的盐：
5.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述以式A化合物为前体的下游产物包括：依那普利、贝那普利、雷米普利、西拉普利、吲哚普利、螺普利。
6.一种式A化合物生产菌株，其特征在于，所述菌株表达以下多肽：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
7.一种生产式A化合物的方法，其特征在于：所述方法包括：
(a)在液态反应体系中，以式B化合物为底物，在辅酶存在下，在立体选择性乳酸脱氢酶催化下，进行反应式I所示的反应，从而形成式A化合物；
反应式I中，R和n如上定义；
(b)任选地从所述上一步骤的反应后的反应体系中分离出式A化合物。
8.一种生产式A化合物的方法，其特征在于，所述方法包括：
1)采用生产条件培养权利要求6所述的生产菌株，从而得到式A化合物；
2)任选地，从1)的培养体系中分离获得式A化合物。
9.一种式A化合物生产菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：
使得所述菌株包含表达以下多肽的表达载体或使得所述菌株的基因组中整合有表达以下多肽的基因，所述多肽是：
(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽；或
(b1)将SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个，优选1-20个、更优选1-15个、更优选1-10个、更优选1-8个、更优选1-3个、最优选1个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有(a1)所述多肽功能的由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽衍生的多肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述基因的序列选自下组：
(i)SEQ ID NO.5或SEQ ID NO:7所示的序列；
(ii)与(i)限定的任一序列互补的多核苷酸；或
(iii)与(i)限定的任一序列具有至少70％，优选至少75％、80％、85％、90％，更优选至少95％、96％、97％、98％、99％以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列。
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Address after: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200241

Applicant after: Yikelai Biotechnology (Group) Co.,Ltd.

Address before: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200241

Applicant before: Ecolab Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.

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