FI95047B - Menetelmä 2-hydroksi-4-fenyylivoihapon R- tai S-enantiomeerin valmistamiseksi - Google Patents

Description

95047

Menetelmä 2-hydroksi-4-fenyylivoihapon R- tai S-enan-tiomeerin valmistamiseksi Tämän keksinnön kohteena on menetelmä 2-hydroksi-4-fenyy-livoihapon kaavan /vV" (I).

· ioOH

V

mukaisen R-enantiomeerin tai 2-hydroksi-4-fenyylivoihapon kaavan

/\ /-> -0H

ik S cooh <n)

V

mukaisen S-enantiomeerin valmistamiseksi, joiden enantio-meeripuhtaus on erittäin korkea, esim. 99 % ee (enantiomeric excess), edullisesti yli 99,6 % ee, joka menetelmä on tunnettu siitä, että 2-okso-4-fenyylivoihappo pelkistetään D-laktaattidehydrogenaasientsyymillä (D-LDH), joka on peräisin Staphylococcus epidermidis-bakteerista, tai vast. L-laktaattidehydrogenaasientsyymillä (L-LDH), joka on peräisin naudan sydämestä, elektronidonorin, esimerkiksi NAD(H):n ja elektronidonorin regeneroimiseksi tarkoitetun entsyymi-substraatti-järjestelmän, esimerkiksi formiaatti-dehydrogenaasi(FDH)-formiaatin läsnäollessa. Parhaimpana pidetään menetelmää kaavan I mukaisen • · R-2-hydroksi-4-fenyylivoihapon valmistamiseksi D-LDH-entsyymillä, joka on peräisin Staphylococcus epidermidis-bakteerista, elektronidonorin, esimerkiksi NAD(H):n ja elektronidonorin regeneroimiseksi tarkoitetun entsyymi-substraatti- järjestelmän, esimerkiksi formiaattidehydro-genaasi(FDH)-formiaatin läsnäollessa. Keksinnön mukainen 2 95047 menetelmä soveltuu erittäin hyvin jatkuvaan entsymaat-tiseen muuntoon, edullisesti entsyymi-kalvoreaktorissa (EMR).

Kaavan I mukainen R-2-hydroksi*-4-fenyylivoihappo on arvokas välituote ACE- (angiotensin converting enzyme)-inhi-biittoreiden tai niiden esiasteiden valmistamiseksi. Kaavan II mukaista S-2-hydroksi-4-fenyylivoihappoa käytetään isomeeristen yhdisteiden valmistukseen.

Kiraalisten yhdisteiden valmistus stereospesifisen mikrobiologisen pelkistyksen avulla on tunnettua (yleiskatsauksen suhteen vrt. Simon et ai., Angew. Chemie 97./ 541, 1985). Biokatalysaattoreina käytetään usein intakteja mikro-organismeja, esimerkiksi sieniä (esim. Mucor, Geotrichum, Saccharomyces, Candida) tai bakteereita (esim. Proteus, Pseudomonas). Voidaan käyttää myös mik-robiuutteita. Elektronidonoreita ovat esimerkiksi hiilihydraatit (esim. glukoosi), formiaatti, etanoli, vety tai sähkökemiallisen kennon katodi. Substraatin pelkistys tapahtuu niin kutsutun lopullisen reduktaasin (finale Reduktase), esim. substraattispesifisen dehydrogenaasin avulla. Yleensä pelkistysekvivalentit, jotka lopullinen reduktaasi tarvitsee, vapautetaan koentsyymillä, esim. pyridiininukleotideillä, kuten NADH:11a (nikotiiniamidi-adeniinidinukleotidi) ja NADPH:11a (nikotiiniamidiade-niinidinukleotidi-fosfaatti) tai flavonukleotideillä, kuten FMNH:lla (flaviinimononukleotidi) ja FADH:1la (flaviiniadeniinidinukleotidi). Pelkistetyt nukleotidit puolestaan muodostuvat tavanomaisesti useissa entsyyroika-• talysoiduissa vaiheissa kilpailevien elektroniakseptorien muodostuessa tai elektronisiirron avulla luonnollisten tai synteettisten välittäjien (esim. ferredoksiini, viologeeni) toimesta. Tunnetaan myös lopullisia reduk-taaseja, jotka voivat ottaa elektronit vastaan suoraan välittäjiltä.

3 95047

Biokatalysaattoreiksi soveltuvat myös puhdistetut entsyymit, s.o. eristetyt reduktaasit, jolloin on yleensä lisättävä pelkistettyjä pyridiini- tai vast, flaviini-nukleotidejä. Tämän lisäksi tarvitaan tehokas järjestelmä koentsyymin entsymaattista regenerointia varten, s.o. toinen entsyymi ja sen substraatti. Yamazaki & Maeda (Agricol. Biol. Chem. 50., 2621, 1986) esittävät epäjatkuvan menetelmän R-(-)-mantelihapon valmistamiseksi bentsoyyliformiaatista NADH:n ja Streptococcus faecalik-sesta peräisin olevan bentsoyyliformiaatti-dehydrogenaa-sin avulla. Tätä menetelmää voidaan käyttää myös jatkuvatoimisesta bioreaktorissa regeneroitaessa koentsyymi formiaattidehydrogenaasin ja formiaatin avulla (Yamazaki & Maeda, Agricol. Biol. Chem. 50, 3213, 1986). Eurooppalaisessa patenttijulkaisussa EP 0 024 547 esitetään menetelmä vesiliukoisten α-ketokarboksyylihappojen muuntamiseksi entsymaattisesti jatkuvatoimisesti vastaaviksi α-hydroksikarboksyylihapoiksi entsyymi-kalvoreaktorissa. Reaktio tapahtuu molekyylipainoltaan polyetyleeniglyko-liin sitomalla suurennetun NAD(H):n ja laktaattidehydro-genaasin läsnäollessa regeneroimalla samanaikaisesti NADH formiaattidehydrogenaasilla ja formiaatilla.

Ratkaisevan tärkeää entsymaattisissa reaktioissa ovat käytetyn entsyymin, tässä tapauksessa siis lopullisen reduktaasin tai vast, substraattispesifisen dehydroge-naasin ominaisuudet ja alkuperä. Tällöin on otettava huomioon, että myös samantyyppiset entsyymit voivat erota toisistaan fysiologisen käyttäytymisensä suhteen, jos ne on eristetty erilaisista lähteistä, esim. erilaisista mikro-organismeista. Tällöin vaihtelevat biomuunnolle niin tärkeät parametrit, kuten reaktio-, substraatti- ja stereospesifisyys ja kineettiset tekijät, kuten Michaelis-Menten- ja inhibitiovakiot (Simon et ai., ks. yllä). Esimerkiksi verrattaessa tietoja tunnetusta kirjallisuudesta nähdään, että Lactobacillus confusuksesta peräisin oleva D-laktaattidehydrogenaasi muuntaa tosin 4 95047 pyruvaatin, 2-ketobutyraatin ja fenyylipyruvaatin, mutta tämä entsyymi ei pelkistä 2-ketovaleraattia, 2-ketokap-roaattia eikä 2-keto-3-metyylivaleraattia. Yksittäisten entsyymi-substraatti-järjestelmien käyttäytyminen on siis kulloinkin testattava eikä sitä voida yleisesti ennustaa, vaikkakin julkaisussa EP 0 024 547 viitataan tähän johtopäätökseen .

Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan tehokkaita menetelmiä 2-hydroksi-4-fenyylivoihapon R- tai vast. S-enantiomeerin valmistamiseksi erittäin enantiomeeripuh-taana 2-okso-4-fenyylivoihapon enantioselektiivisen entsymaattisen pelkistyksen avulla. Tätä ainetta ei ole ennen kuvattu substraattina a-keto-karboksyylihappojen entsymaattisen pelkistyksen yhteydessä ja siten ei ole tutkittu, soveltuuko se entsymaattiseen pelkistykseen tai vast, miten se siinä käyttäytyy.

Tämän tehtävän ratkaisemiseksi R-2-hydroksi-4-fenyylivoi-hapon valmistuksen suhteen erittäin sopivaksi osoittautuu menetelmä, jossa substraatti pelkistetään D-laktaattide-hydrogenaasientsyymillä, joka on peräisin Staphylococcus epidermidiksestä, elektronidonorin ja elektronidonorin regeneroimiseksi tarkoitetun entsyymi-substraatti-järjestelmän läsnäollessa, koska Staphylococcus epidermidiksestä peräisin olevalle D-LDH:lie on tunnusomaista verrattuna muista mikro-organismeista peräisin oleviin lak-taattidehydrogenaaseihin ennen kaikkea korkea spesifinen aktiivisuus (yksikkö/mg muunnettua substraattia tai vast, μιηοοίΐη muunto/mg proteiinia x min.) käytetyn substraatin . suhteen (ks. taulukko 1) ja sillä on hyvä enantioselek- ' tiivisyys. Samoista syistä S-2-hydroksi-4-fenyylivoihapon valmistamiseksi soveltuu erittäin hyvin vastaava menetelmä, jossa substraatti pelkistetään naudan sydämestä peräisin olevalla L-laktaattidehydrogenaasilla. Molempien menetelmien kohdalla on edullista suorittaa reaktio jat-kuvatoimisesti, etenkin entsyymi-kalvoreaktorissa.

5 95047

Taulukko 1: Kaupallisten dehydrogenaasien spesifisen aktiivisuuden vertailu u/xng prote- u/mg prote-

Entsyymilähde iinia suhtees- iinia suh- sa pyruvaat- teessä 2- tiin keto-4-fe- nyyli-voi- __happoon__ D-LDH Lactobacillus leichmannii

Boehringer 732737 300 0,1 D-LDH Lactobacillus leichmannii

Sigma L 2011 300 0,3 D-LDH Leuconostoc mensen- teroides 1000-1500 1,23

Sigma L 0513 (1225) D-LDH Staphylococcus epi- 500-1000 26 dermidis (625) L-LDH naudan sydän 300 0,07

Fluka 61310_;__ |700 U = 1 moolia tuotetta/päivä .

Staphylococcus epidermidiksestä peräisin olevan D-LDH:n, joka toimii substraattispesifisenä dehydrogenaasina ja jolla on hyvä enantioselektiivisyys, ja substraattina toimivan 2-okso-4-fenyylivoihapon yhdistelmä takaa korkeat tuottavuusluvut, hyvät tila-aika-saannot ja siten tähän liittyvän kustannusedullisuuden, mikä on suurtuotannon entsymaattisten muuntojen suhteen erittäin merkittävää ja taloudellisesti erittäin edullista.

Staphylococcus epidermidiksestä peräisin olevan D-lak-taattidehydrogenaasin tai vast, naudan sydämestä peräisin olevan L-laktaattidehydrogenaasin elektronidonoreina käytetään etenkin nikotiiniamidiadeniinidinukleotidikoent-syymiä sen pelkistetyssä muodossa (NADH), joka hapetetaan D-tai vast. L-LDH:11a NAD:ksi. Koentsyymin regeneroimi-seksi käytetään entsyymi-substraatti-järjestelmää, joka koostuu NADH:ta kierrättävästä entsyymistä ja sen subs- 95047 6 traatista, esim. formiaatista, etanolista, isopropanolis-ta, sykloheksanolista jne. Parhaimpana pidetään formiaat-tidehydrogenaasi(FDH)-formiaatti-järjestelmää, jossa formiaattina käytetään muurahaishapon suolaa, esimerkiksi alkalimetalliformiaattia, esim. kalium- tai vast, nat-riumformiaattia, tai alkoholidehydrogenaasi(ADH)-etanoli-järjestelmää. Tällöin sivutuotteina muodostuu C02/HC03:a tai vast, asetaldehydiä.

Keksinnön mukainen menetelmä tuottaa tuotteen R- tai vast. S-2-hydroksi-4-fenyylivoihappo erittäin enantiomee-ripuhtaana. Tämän selityksen yhteydessä "erittäin enan-tiomeeri-puhdas" merkitsee sitä, että vastaava enantio-meeri esiintyy vähintään 98 %:lla ee seoksessa toisen enantiomeerin kanssa, edullisesti yli 99 %:lla ee.

Epäjatkuvassa (batch) menetelmässä substraatin 2-okso-4-fenyylivoihappo vesiliuosta, esimerkiksi sen kalium- tai natriumsuolan muodossa, inkuboidaan korkeintaan 500 mM:n, esimerkiksi 20 - 200 mM:n, edullisesti 50 mM:n konsen-traatiossa koentsyymin NAD(H), jonka konsentraatio on 0,01 - 10 Hm, etenkin n. 0,1 Mm, NADH:ta kierrättävän entsyymin, esim. alkoholi- tai formiaattidehydrogenaasin, ja formiaatin tai vast, etanolin kanssa, jonka konsentraatio on 100 - 1200 Mm, etenkin n. 300 Mm, sekä Staphylococcus epidermidiksestä peräisin olevan D-laktaattide-hydrogenaasin tai vast, naudan sydämestä peräisin olevan L-laktaattidehydrogenaasin kanssa sekoittaen, kunnes kaikki on muunnettu. Entsyymejä käytetään tarkoituksenmukaisesti sellaisia määriä, että NADHrta kierrättävän . entsyymin ja substraattispesifisen dehydrogenaasin ak tiivisuuksien suhde on 1:0,1 - 1:5. Reaktioseoksessa on entsymaattisille reaktioille tavanomainen pH-arvo, joka on 6 - 9, esim. n. 8,4. Reaktiolämpötilana on 20 - 40°C, etenkin n. huoneen lämpötila. Tuote kiteytetään reaktio-seoksesta lisäämällä happoa, esimerkiksi mineraalihappoa, kuten suolahappoa jne.

li 7 95047

Jatkuvatoimisia reaktioita varten käytetyt entsyymit immobilisoidaan yleensä. Ne voidaan sulkea esimerkiksi polymeerisiin verhoaineisiin (matriiseihin), kapseleihin tai vast, puoliläpäisevistä kalvoista oleviin kuituihin tai ultrasuodatuskalvoilla, ristisilloittaa bi- tai vast, multifunktionaalisilla reagensseilla tai kiinnittää adsorption avulla, ionisella tai kovalenttisella sidoksella epäorgaanisesta materiaalista tai luonnollisista tai vast, synteettisistä polymeereistä koostuviin kantoainei-siin. Jatkuvatoimisessa prosessissa voidaan käyttää useita bioreaktorityyppejä, esim. sekoitus-, kiintokerros-, pyörrekerros- tai kalvoreaktoreita (yleiskatsauksen suhteen vrt. Hartmeier, "Immobilisierte Biokatalysato-ren", Berliini, 1986).

Keksinnön mukainen menetelmä voidaan suorittaa EMR-mene-telmänä (jatkuvatoiminen menetelmä entsyymi-kalvoreak-torissa) käyttäen reaktioastiana edullisesti kalvoreak-toria, joka on varustettu ultrasuodatuskalvolla, joka pidättää käytetyt entsyymit ja reaktioon tarvittavan koentsyymin, mutta joka päästää läpi kuitenkin pienimolekyylisen tuotteen ja reagoimattoman substraatin. Kal-voreaktoreiden olennaisena etuna on se, että biokataly-saattoreita voidaan käyttää luontaisesti, s.o. muuntamat-tomana eikä niitä tarvitse alistaa mihinkään muutoin immobilisoinnissa tarvittavaan, tavanomaisesti inaktivoi-vasti vaikuttavaan kiinnitysvaiheeseen. Entsyymikalvo-reaktori voi olla esimerkiksi laakakalvo- (kammiokalvo-) tai onttokuitu-kalvoreaktori. Substraatti syötetään esim. annostuspumpulla reaktiotilaan, sitten reaktioseosta . sekoitetaan tai vast, pumpataan uudelleen ja kalvon läpi tuleva, tuotteen sisältävä suodosvirta johdetaan pois. Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää etenkin kalvoja, joiden nimellissulkuraja on 5.000 - 100.000 dal-tonia, esim. 10.000 - 100.000 daltonia. Kalvoihin sopivia materiaaleja ovat esimerkiksi asetyyliselluloosat, polyamidit, polysulfonit tai modifioidut polyvinyylialkoho- 95047 δ lit. Reaktioon osallistuvien entsyymien adsorption estämiseksi kalvossa kalvo voi olla esipäällystetty ei-spesifisellä proteiinilla, esimerkiksi naudan seerumi-albumiinilla.

Kalvoreaktorissa oleva reaktioseos sisältää NADH:ta kierrättävää entsyymiä, esimerkiksi 4-alkoholidehydroge-naasia tai etenkin formiaattidehydrogenaasia, Staphylococcus epidermidiksestä peräisin olevaa D-laktaattidehyd-rogenaasia tai vast, naudan sydämestä peräisin olevaa L-laktaattidehydrogenaasia ja NAD(H):ta. NADH:ta kierrättävää entsyymiä käytetään tarkoituksenmukaisesti sellaisena määränä, että NADH:ta kierrättävän entsyymin ja substraattispesifisen dehydrogenaasin aktiivisuuksien suhde on 1:0,1 - 1:5. Tarvittava koentsyymi käytetään molekyylipainoltaan suurentamattoman (luontaisen) NAD(H)-:n muodossa konsentraation ollessa 0,01 - 10 Mm, etenkin n. 0,1 Mm. Se mahdollisuus, että keksinnön mukaisessa menetelmässä myös entsyymi-kalvoreaktorissa voidaan käyttää luontaista NAD(H):ta, tarjoaa selviä etuja verrattuna julkaisussa EP 0 024 547 esitettyyn tekniikan tasoon. Julkaisussa EP 0 024 547 esitetään NAD(H):n käyttöä, joka on sidottu polyeteeniglykoliin molekyyli-painon suurentamiseksi. Tämän sitomisen johdosta entsyymit voivat kadottaa kuitenkin aktiviteettiaan. Siten esimerkiksi Staphylococcus epidermidiksestä peräisin olevaa D-laktaattidehydrogenaasia käytettäessä koentsyy-minä PEG-NAD(H):ta rajoitetaan aktiivisuudessaan luontaisen NAD(H):n suhteen niin suuressa määrin, että V^-arvo, s.o. maksimaalinen reaktionopeus on ainoastaan enää • 2,6 yksikköä/mg verrattuna luontaisen NAD(H):n arvoon 26 yksikköä/mg. Jos jatkuvatoimisessa prosessissa käytettäessä PEG-NAD(H):ta halutaan saada aikaan substraatin vastaavia reaktionopeuksia, on tästä syystä käytettävä n. 10 kertaa niin paljon entsyymiä EMRrssä, minkä johdosta tuotantokustannukset kasvavat huomattavasti. Jotta esimerkiksi NAD(H), joka on suurennettu molekyylipainoltaan 9 95047 sitomalla polyetyleeniglykoliin, jonka molekyylipaino on 20.000, voitaisiin pitää tehokkaasti ultrasuodatuskalvon takana, kalvolla saa olla 10.000 daltonin maksimaalinen sulkuraja. Käytettäessä katalyyttisiä määriä luontaista NAD(H):ta substraattivirrassa kalvon sulkuraja määrätään sitä vastoin ainoastaan entsyymikoolla. Tästä syystä voidaan käyttää kalvoja, joiden sulkuraja on 5.000 -• 100.000 daltonia, niin että voidaan välttää reaktorin korkea paine, joka vaikuttaa rajoittavasti reaktorin kulkuaikaan. Alhaisen paineen johdosta käytettäessä luontaista NAD(H):ta voidaan käyttää lisäksi pienempiä ja siten halvempia kalvopintoja ja saada aikaan korkeampia läpivirtausmääriä. Samoin käytettäessä luontaista NAD(H)-:ta saavutetaan korkeita syklilukuja, jotka ovat alueella 500 - 2.000, s.o. NAD(H):n molekyyliä kohden muodostetaan 500 - 2.000 molekyyliä hydroksihappoa. Siten keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa huomattavia taloudellisia etuja verrattuna julkaisussa EP 0 024 547 esitettyyn menetelmään.

Tämän lisäksi reaktoriin syötetään jatkuvasti substraattina 2-okso-4-fenyylivoihapon vesiliuosta, esimerkiksi sen kalium- tai natriumsuolan muodossa. Substraattia saa olla maksimaalisesti 500 mM:n konsentraatiossa. Edullisesti sen konsentraatio on 20 - 200 Mm, etenkin n. 50 Mm. Samoin lisätään jatkuvasti formiaattia tai vast, etanolia 100 - 1200 mM:n konsentraatiossa, etenkin formiaattia n. 300 mM:n konsentraatiossa.

Reaktioseoksessa on entsymaattisille reaktioille tavan-. omainen pH-arvo, joka on 6 - 9, esim. n. 8,4. Reaktioläm- pötilana on 20 - 40°C, etenkin suunnilleen huoneen lämpötila .

Edullisesti keksinnön mukaista menetelmää voidaan soveltaa siten, että entsymaattinen reaktio suoritetaan ent-syymi-kalvoreaktorissa, 10 95047 a) joka on varustettu ultrasuodatuskalvolla, jonka nimel-lissulkuraja on esimerkiksi 5.000 - 100.000 daltonia, etenkin 10.000 - 100.000 daltonia, ja joka on mahdollisesti esipäällystetty epäspesifisellä proteiinilla, esim. naudan seerumialbumiinilla, b) joka sisältää reaktioseosta, joka koostuu liuoksesta, joka sisältää formiaattidehydrogenaasia tai alkoholide-hydrogenaasia, etenkin formiaattidehydrogenaasia, Staphylococcus epidermidiksestä peräisin olevaa D-laktaat-tidehydrogenaasia tai vast, naudan sydämestä peräisin olevaa L-laktaattidehydrogenaasia ja nikotiiniamidiade-niinidinukleotidiä (NAD(H)) esim. 0,01 - 1 mM:n, etenkin n. 0,1 mM:n konsentraatiossa, c) johon syötetään jatkuvasti vesiliuosta, joka sisältää substraattina toimivaa 2-okso-4-fenyylivoihappoa, esimerkiksi sen kalium- tai natriumsuolan muodossa korkeintaan 500 mM:n konsentraatiossa, esimerkiksi 20 - 200 mM:n, etenkin n. 50 mM:n konsentraatiossa, ja formiaattia, esimerkiksi kalium- tai natriumformiaattia tai vast, etanolia 100 - 12000 mM:n, etenkin n. 300 mM:n konsentraatiossa, ja d) jossa kalvon takaa jatkuvasti poistetaan muodostunut yhdiste.

R-2-hydroksi-4-fenyylivoihappo on arvokas välituote valmistettaessa ACE-inhibiittoreita tai niiden esiasteita. Tähän vaikuttavien aineiden luokkaan on kiinnitetty viime . vuosina kasvavaa huomiota. Se laajentaa käytössä olevien antihypertensiivisten aineiden potentiaalia ja siten terapeuttisia mahdollisuuksia torjuttaessa korkeaa verenpainetta. Useissa tehokkaissa ACE-inhibiittoreissa on merkittävä osakaavan — C00R1 y-CH2-CH2-CH-NH- (III) ·=· s 11 95047 mukainen rakenne-elementti, jossa R2 merkitsee vetyä tai alempialkyyliä ja joka esiintyy S-konfiguraatiossa. R-2-hydroksi-4-fenyylivoihappoa voidaan käyttää tunnetulla tavalla ja säilyttämällä korkea enantiomeeripuhtaus ACE-inhibiittoreiden valmistamiseksi (ks. esim. eurooppalainen patenttihakemus 206993). Tämän keksinnön erityinen etu on mm. siinä, että ACE-inhibiittoreiden lukuisten vaiheiden kautta kulkevassa synteesissä voidaan käyttää jo synteesin suhteellisen varhaisessa vaiheessa enan-tiomeeripuhdasta yhdistettä. Erityisen mielenkiintoista on tällöin ACE-inhibiittorin l-karboksimetyyli-3S-[(1S-etoksikarbonyyli-3-fenyylipropyyli)amino]-2,3,4,5-tetra-hydro-lH-bentsatsepin-2-oni valmistus. S-2-hydroksi-4-fenyylivoihappo soveltuu vastaavalla tavalla ACE-inhibiittorin enantiomeerien valmistukseen ja toksikologia-tutkimuksiin.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä rajoittamatta sitä kuitenkaan esimerkkeihin.

Lyhennykset ee - enantiomeeriylimäärä ("enantiomeric excess'?) FDH - formiaattidehydrogenaasi HPLC - high pressure liquid chromatography (korkeapaine-nestekromatografia)

Kj - inhibitiovakio KM - Michaelis-Menten-vakio LDH - laktaattidehydrogenaasi NADH - nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi • rpm - kierrosta ("rotations") minuuttia kohden U - entsyymiaktiivisuuden yksikkö ("unit") (1 U saa aikaan määrätyissä reaktio-olosuhteissa 1 μιηοοίϊη/ιηϊη. muunnon) - maksimaalinen reaktionopeus 12 95047

Esimerkki 1: 2-okso-4-fenyylivoihapon entsymaattinen pelkistys mikrobiraakauutteilla (yleinen ohje)

Testikantoja kasvatetaan 200 ml:ssa ravintoliuosta 148 (22 g/1 glukoosia, 5 g/1 Lab-Lemco beef extract'ia (Oxoid), 5 g/1 peptoni C:tä, 5 g/1 hiivauutetta, 3 g/1 Bacto-Casein1ia [Difco], 1,5 g/1 NaClzä, Ph 6,5) tai ravintoliuosta MV7 (2 g/1 NH4N03:a, 1,4 g/1 Na2HP04:ä, 0,6 g/1 K2HP04:ä, 0,2 g/1 MgS04 7H20:ta, 0,01 g/1 CaCl22H20:ta, 0,01 g/1 FeS047H20:ta, 1 ml hivenaineita (20 mg/1 Na2Mo042H20:ta, 20 mg/1 Na2B410H20: ta, 20 mg/1 ZnS047H20:ta, 20 mg/1 MnS04H20:ta, 20 mg/1 CuS045H20: ta) , Ph 6,5) D- tai vast. L-laktaatin (3 g/1) kanssa 3 päivän ajan 28°C:ssa sekoittaen (250 rpm). Solut pestään fosfaattipuskurilla, Ph 7,0, ja kerätään sentrifugoimalla (20 min., 20000 rpm) Sorvall-sentrifugissa, roottori SS34. Tämän jälkeen solut liuotetaan 4°C:ssa käsittelemällä 45 minuutin ajan ultraäänellä 375 W:ssa Ultrasonics Celldisrupter W-375-lait-teessa.

Toisen sentrifugoinnin jälkeen entsyymiraakauutetta inku-boidaan substraatin kanssa seuraavassa testiseoksessa 3 -5 päivän ajan (kokonaismuuntoon asti) 28°C:ssa sekoittaen: 5 ml sentrifugoinninsupernatanttia (raakauutetta) 20 ml fosfaattipuskuria, pH 7 (0,069 M) 3 g/1 2-okso-4-fenyylivoihappoa 18 g/1 etanolia 1 g/1 NAD(H):ta 100 U hiivan alkoholidehydrogenaasia (Boehringer)

Reaktion päätyttyä liuos säädetään 2N suolahapolla pH-ar-voon 2. Tällöin kiteytynyt tuote uutetaan etikkaesteril-lä. Liuotin haihdutetaan pois ja kuivatetaan tyhjiössä, jolloin saadaan kiteistä 2-hydroksi-4-fenyylivoihappoa, jolla on erilaisia enantiomeeripuhtauksia riippuen tes- 13 95047 tatusta mikrobiuutteesta.

Kiteinen happo liuotetaan absoluuttiseen etanoliin ja se saatetaan reagoimaan kloorivetykaasun kanssa 24 tunnin ajaksi huoneen lämpötilassa. Alkoholi tislataan pois ja suoritetaan lyhyt kaasunpoisto suurtyhjiössä, jolloin jäljelle jää vaaleankeltainen öljy, joka analysoidaan kiraalisessa pylväässä (250 x 4,6 mm keskim., läpivirtaus 1 ml/min., stationäärinen faasi Chiralcel OD [Stehelin, Basel] tyyppi OD-5-15-20925, mobiili faasi: 90 % heksaa-nia -10 % isopropanolia - 0,1 % dietyyliamiinia) HPLCrllä 25°C:ssa/32 baarissa. Analysoitavat aineet esiintyvät 1 mg/ml:n konsentraatiossa liuottimessa. Skannaus suoritetaan 210 nm:n aallonpituudessa, tulkinta suoritetaan vertailemalla pintaa ulkoiseen standardiin. Tutkittujen mikrobiuutteiden selvitetyt ee-arvot on esitetty taulukossa 2.

Taulukko 2: Enantiomeeriylimäärä pelkistettäessä mikrobi-raakauutteilla

Testikanta (uute) ee kasvatuksen __C-lähde__

Lactobacillus brevis 28 % (R) glukoosi DSM 20054

Staphylococcus epidermidis 78 % (R) glukoosi DSM 20042

Saccharomyces cerevisiae 96 % (R) glukoosi leivinhiiva Migros 76 10 2011

Kloeckera sp. 2201 97 % (R) glukoosi ATCC 48 180 (Candida boidinii, • T. Egli 2201)

Saccharomyces cerevisiae 90 % (R) L-laktaatti leivinhiiva Migros 76 10 2011

Hansenula polymorpha 98 % (R) D-laktaatti CBS 4732__ 14 95047

Esimerkki 2: 2-okso-4-fenyylivoihapon entsymaattinen pelkistys kaupallisilla dehydrogenaaseilla

Substraattia inkuboidaan kaupallisen dehydrogenaasin kanssa seuraavassa testiseoksessa 3-7 päivän ajan (kokonais-muuntoon asti) 28°C:ssa hieman sekoittaen: 50 ml fosfaattipuskuria, pH 7 (0,069 M).

3 g/1 2-okso-4-fenyylivoihappoa 18 g/1 etanolia 200 U hiivan alkoholidehydrogenaasia (Boehringer) 200 U testientsyymiä (kaupallista dehydrogenaasia) 1 g/1 NAD(H):ta R-2-hydroksi-4-fenyylivoihapon tai vast. S-2-hydroksi-4-fenyylivoihapon enantiomeeriylimäärä määritetään esimerkin 1 mukaisesti. Tulokset on esitetty taulukossa 3.

Taulukko 3: Enantiomeeriylimäärä 2-okso-4-fenyylivoihapon reaktiossa kaupallisten dehydrogenaasien kanssa I testattu entsyymi ee D-LDH, Lactobacillus leichmannii (Boehringer) > 99 % (R) D-LDH, Lactobacillus leichmannii (Sigma) > 98 % (R) D-LDH, Leuconostoc mesenteroides (Sigma) > 98 % (R) D-LDH, Staphylococcus epidermidis (Sigma) 100 % (R) <0,2 % (S) L-LDH. naudan sydän (Fluka)_100 % (S) ee-arvojen vertailu osoittaa, että eristetyt entsyymit soveltuvat paremmin substraatin stereospesifiseen pelkistykseen kuin mikrobiraakauutteet, koska eristettyjen entsyymien R- tai vast. S-2-hydroksi-4-fenyylivoihapon enantiomeeriylimäärä on huomattavasti korkeampi. Jotta saataisiin vastaavan korkeita ee-arvoja, raakauutteiden selektiiviset entsyymit olisi rikastettava edelleen puhdis-tusvaiheilla.

15 95047

Esimerkki 3: 2-okso-4-fenyylivoihapon entsymaattinen pelkistys kaupallisilla dehydrogenaaseilla entsyymi-kalvo-reaktorissa (EMR) 2-okso-4-fenyylivoihapon jatkuva muunto R- tai vast. S-2-hydroksi-4-fenyylivoihapoksi suoritetaan 25°C:ssa pidetyssä laakakalvo-entsyymi-kalvoreaktorissa (EMR), jonka reaktorit!lavuus on 10 ml. Selluloosa-asetaatti-ultra-suodatus-kalvossa, jonka läpimitta on 62 mm, on nimellis-sulkurajana 10.000 daltonia ja se on esipäällystetty 50 mg:11a naudan seerumialbumiinia.

Optimaalinen reaktion ohjaus selvitetään menetelmätekni-sellä analyysillä kokeellisesti selvitetyn entsyymikinetiikan avulla·, s.o. määrittämällä D- tai vast. L-laktaat-tidehydrogenaasin ja formiaattidehydrogenaasin kineettiset vakiot (KM, K,, kulloinkin 50, 100 ja 150 mM:n substraattikonsentraatioille siten, että laskemalla lähtöaineiden massabilanssit simuloidaan reaktorin käyttäytymistä. Käytetään "Runge-Kutta-ohjelmaa", jossa vaihdellaan entsyymien oloaikaa, edukti- ja kofaktorikon-sentraatiota ja puoliintumisaikoja (ks. Hoffmann & Hoffmann, "Einfiihrung in die Optimierung mit Anwendungsbei-spielen aus dem Chemieingenieurwesen", Weinheim 1971).

Substraattiliuos sisältää 50 mM 2-okso-4-fenyylivoihap-poa, 300 mM K-formiaattia ja 0,1 mM NAD(H):ta. Siihen lisätään 2,6 U/ml D-LDH:ta ja 4,8 U/ml .FDH:ta tai vast.

1,4 U/ml L-LDH:ta ja 2,5 U/ml FDH:ta. Reaktioliuosta pumpataan jatkuvasti 10 ml/h reaktoriin ja tuote pois-. tetaan kalvon kautta. Oloaika reaktorissa on 60 min.

reaktiossa D-LDH:n kanssa tai vast. 120 min. reaktiossa L-LDH:n kanssa. Entsyymiaktiivisuuksia valvotaan jatkuvasti ja ne pidetään vakiona mahdollisesti jälkiannos-telun avulla.

Tuotantotiedot on esitetty taulukossa 4.

16 95047

Taulukko 4: Tuotantotiedot

D-LDH L-LDH

kokeen kesto (jatkuva tuotanto): 450 h 100 h muunto: 0 84 % 0 77 % enantiomeeriylimäärä: 100 % ee (R) 100 % ee (S) tuotekonsentraatio: 0 42,5 mM = 0 38,5 mM = 7,65 g/1 6,8 g/1 tuottavuus:_184 a/1 x d 1.6 q/1 x d

Esimerkki 4: l-karboksimetyyli-3S-[(lS-etoksikarbonyyli- 3-fenyylipropyyli)-amino]-2,3,4,5-tetrahydro-lH-bentsat-sepin-2-onin (ACE-inhibiittorin) synteesi 4.1 R-2-hvdroksi-4-fenvvlivoihappoetvvliesterin synteesi 5,0 g R-2-hydroksi-4-fenyylivoihappoa liuotetaan 50 ml:aan absoluuttista etanolia ja saatetaan reagoimaan kloorivety-kaasun kanssa 24 tunnin ajaksi huoneen lämpötilassa. Alkoholi tislataan pois ja suoritetaan lyhyt kaasunpoisto, jolloin jäljelle jää vaaleankeltainen öljy (5,7 g), joka koostuu HPLC-analyysin mukaisesti, joka suoritetaan kiraalisessa pylväässä (ks. esimerkki 1), > 99,8 %:isesti R-konfiguraation omaavasta esteristä. S-konfiguraation omaavaa esteriä on läsnä alle 0,2 %. Öljy tislataan 100 -105°C:ssa ja 6,5 paskalissa, jolloin saadaan 5,2 g (-)-R-2-hydroksi-4-fenyylivoihappoetyylieste-riä, jonka kiertoarvo [a]20D = -20,8° (1 % kloroformissa).

4.2 -R-2-(4-nitrobentseenisulfonvylioksi)-4-fenvvli-voihappoetvvliesterin synteesi 9,75 g (46,8 mmol) (-)-R-2-hydroksi-4-fenyylivoihappoes-teriä (> 99,6 % ee) liuotetaan 50 ml:aan tolueenia, lisätään 11,4 g 4-nitrobentseenisulfonyylikloridia ja jääh- 17 95047 dytetään sitten 0°C:seen. Lisätään 6,25 g trietyyliamii-nia 30 minuutin kuluessa ja sitten lämmitetään huoneen lämpötilaan ja suoritetaan loppuvaiheet. Saadaan kvantitatiivisena saantona (+)-R-2-(4-nitrobentseenisulfonyy-lioksi)-4-fenyylivoihappoetyyliesteriä, kiertoarvo [a]20), = +13,2° (3 % abs. etanolissa).

4.3 l-karboksimetvvli-3S-r (lS-etoksikarbonvyli-3-fenwli-propyvli)amino!-2,3,4,5-tetrahvdro-lH-bentsatsepin-2-onin synteesi 46,1 g 3-(S)-aminobentsatsepin-2-oni-l-N-etikkahappo-tert-butyyliesteriä, 84,3 g optisesti puhdasta (£ 99,6 % ee) (+)-R-2-(4-nitrobentseenisulfonyylioksi)-4-fenyylivoihappoetyyliesteriä ja 19,53 g N-metyylimorfoliiniä saatetaan reagoimaan ilman liuotinta 75 - 80°C:ssa 9 tunnin ajaksi. 4-nitrobentseenisulfonihapon saostunut N-metyylimorfoliinisuola liuotetaan lisäämällä 250 ml etik-kaesteriä ja 150 ml vettä, säädetään pH-arvoon 8,8 n. 150 ml:11a 2 N soodaliuosta, erotetaan etikkaesterifaasi ja pestään vielä kerran vedellä. Etikkaesteri tislataan pois, jolloin jäljelle jää öljy (98 g), jonka diastereo-meerisuhde HPLC:ssä on vähintään SS:SR = 99,8:0,2.

Raa'an vaikuttavan aineen valmistus tapahtuu johtamalla 54 g kloorivetykaasua 0 - 10°C:ssa liuokseen, jossa on 96 g yllä esitettyä öljyä 200 ml:ssa etikkaesteriä. Tert-butyyliesterin täydellisen solvolyysin jälkeen vaikuttava aine saostuu hienokiteisenä suspensiona. Ylimääräinen kloorivety poistetaan täysin tislaamalla etikkaesteri toistamiseen pois tyhjiössä. Tämän jälkeen erittäin väkevä kidesuspensio laimennetaan 200 ml:11a asetonia, suodatetaan l5°C:ssa ja pestään kaksi kertaa kulloinkin 50 ml:11a etikkaesteriä. Kuivatetaan tyhjiössä 60°C:ssa vakiopainoon, jolloin saadaan 62,5 g (85,4 %) käytännöllisesti katsoen valkoista vaikuttavaa ainetta, jonka diastereomeerisuhde on SS:SR = 99,1:0,1. [a]20D = -138° (1 18 95047 % abs. etanolissa), sp. 181°C.

Esimerkki 5: l-karboksimetyyli-3S-[(iR-etoksikarbonyyli-3-fenyylipropyyli)amino)-2,3,4,5-tetrahydro-lH-bentsatse-pin-2-onin synteesi Käyttämällä lähtöaineena S-2-hydroksi-4-fenyylivoihappoa valmistetaan esimerkissä 4 esitetyllä tavalla 1-karboksi-metyyli-3S-[(lR-etoksikarbonyyli-3-fenyyli-propyyli)amino] -2,3,4,5-tetrahydro-lH-bentsatsepin-2-oni.

Claims (1)

1. 95047 Patenttivaatimus Menetelmä 2-hydroksi-4-fenyylivoihapon kaavan • ·—· OH / b' U> i Ϊ ioOH V/ mukaisen R-enantiomeerin tai 2-hydroksi-4-fenyylivoihapon kaavan y ioOH (II)’ mukaisen S-enantiomeerin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että 2-okso-4-fenyylivoihappo pelkistetään D-laktaattide-hydrogenaasientsyymillä (D-LDH), joka on peräisin Staphylococcus epidermidiksestä, tai vast. L-laktaattidehydro-genaasientsyymillä (L-LDH), joka on peräisin naudan sydämestä, elektronidonorin ja elektronidonorin regeneroimi-seksi tarkoitetun entsyymi-substraatti-järjestelmän läsnäollessa. Förfarande för framställning av en R-enantiomer med formeIn I — ΌΗ V CI) ! 5 iooH V av 2-hydroxi-4-fenylsmörsyra eller en S-enantiomer med formeln II 20 9 5 0 4 7 A /"> i J ΪΟΟΗ (Π)· V av 2-hydroxi-4-fenylsmörsyra, kännetecknat därav, att 2-oxo-4-fenylsmörsyra reduceras med D-laktat-dehydrogenas-enzym (D-LDH), som härstammar frän Staphylococcus epidermidis, eller respektive med L-laktatdehydro-genas-enzym (L-LDH), som härstammar frän nöthjärta, i närvaro av en elektrondonor och ett enzym-substrat-system avsett för regeneration av en elektrondonor. Il