FI94257C - Menetelmä biokatalysaattorien valmistamiseksi - Google Patents

Description

94257

Menetelmä biokatalysaattorien valmistamiseksi Förfarande för framställning av biokatalysatorer

Keksintö koskee helmenmuotoisia, mekaanisesti erittäin lujia biokatalysaattoreita, menetelmää niiden valmistamiseksi ja menetelmää orgaanisten aineiden muuntamiseksi keksinnön mukaisten biokatalysaattoreiden avulla.

Käsite biokatalyysi käsittää laajassa merkityksessään kaikki katalyysin muodot, joissa aktivoivana aineena on biologinen järjestelmä, esim. kokonaiset solut, solun fragmentit tai soluorganellit, tai se on peräisin biologisesta järjestelmästä, esim. entsyymit. Entsyymit ovat yhdisteitä, yleensä proteiineja tai glykoproteiineja, jotka kiihdyttävät erityisesti biokemiallisia reaktioita alentamalla aktivointienergiaa. Seuraavassa termi biokatalysaat-tori ei merkitse ainoastaan itse aktivoivaa ainetta, vaan voi mahdollisesti käsittää myös komponentteja, joita käytetään aktivoivan aineen immobilisoimiseksi, lujittamiseksi, regeneroimiseksi jne.

Immobilisoidut, so. liikkuvuutensa suhteen rajoitetut biokatalysaattorit soveltuvat ennen kaikkea teollisiin tarkoituksiin. Immobilisoinnin ansiosta on mahdollista suorittaa katalysoidut prosessit yhtäjaksoisesti ja tois-’! tuvasti, saada aikaan ja ylläpitää korkeita biokatalysaat- toritiheyksiä, saada aikaan korkeita aika-tilasaantoja ja alentaa kuluja tuotteen valmistamiseksi reaktioliuoksesta.

Immobilisointia varten voidaan biokatalyyttinen materiaali sulkea esimerkiksi polymeerisiin päällysaineisiin (matriisiin), puoliläpäisevästä kalvosta koostuviin kap-seleihin tai kuituihin tai ultrasuodatuskalvon taakse, ristikytkeä bi- tai multifunktionaalisten reagenssien kanssa tai kiinnittää epäorgaanisesta aineesta tai luonnollisista tai synteettisistä polymeereistä koostuvaan kantajaan adsorptiolla tai ioni- tai kovalenttisidoksella. Myös näiden menetelmien yhdistelmä on mahdollinen.

2 94257

Immobilisoitaessa on toisaalta tärkeätä, että saadaan aikaan suurin mahdollinen biokatalyyttinen aktiivisuus ja toisaalta hyvä mekaaninen lujuus ja kemiallinen stabiliteetti, mutta samalla myös biokatalysaattorin hyvä läpäisevyys. Yleinen immobilisointimenetelmä on esimerkiksi biologisesti aktiivisen aineen sulkeminen ("entrapment") luonnon polymeraateista, kuten mm. selluloosasta, agaris-ta, gelatiinista tai synteettisistä polymeereistä, kuten mm. polyakryyliamidista, polyuretaanista tai epoksidihart-seista valmistettuun matriisiin. Erityisen hellävaraista on immobilisointi ionotrooppisen geelinmuodostuksen avulla (matriisiaineiden ioninen ristikytkentä), johon soveltuvat päällysmateriaaliksi esimerkiksi luonnon polyanionit, kuten alginaatti, pektiini, karrageeni jne. Tiputtamalla tai suihkuttamalla entsymaattisesti aktiivisesta aineesta koostuvaa suspensiota ja matriisiaineen vesiliuosta vesipitoiseen verkkoutusliuokseen, joka sisältää moniarvoisia vastaioneja, siis esimerkiksi mm. Ca2+, Co2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+ ,A13+ muodostuu kelaatteja ja helmenmuotoisia bioka-talysaattoreita.

Orgaanisten polymeerien avulla tapahtuvassa ionotroop-pisessa geelinmuodostuksessa syntyy yleensä vain hyvin pehmeitä, mekaanisesti epävakaita immobilisaatteja, joilla on taipumus paisua tai muuttaa muotoaan, jolloin esimerkik-si ilmenee vaikeuksia käytettäessä niitä täyteainereakto-reissa, joita käytetään usein entsymaattisissa reaktioissa teollisuudessa. Kovettamismenetelmiä, jotka suoritetaan joko jälkikäsittelemällä immobilisaatteja tai esikäsittele-mällä biologisesti aktiivista ainetta ennen hyytelöintiai-neen lisäämistä kulloinkin multifunktionaalisilla verkkout-tajilla, kuten polyaldehydeillä, esim. glutaarialdehydillä, tai isosyanaateilla, esim. heksametyleenidi-isosyanaatilla, voidaan käyttää vain erittäin rajoitetusti niiden soluja ja/tai entsyymejä vahingoittavan vaikutuksen vuoksi. Eräs vaihtoehto on käyttää epäorgaanisia aineita, esim. kuten saksalaisessa hakemusjulkaisussa DE 35 20 001 kuvatussa me- 3 94257 netelmässä, joka kuvaa entsymaattisen aineen immobilisoin-„ tia silikasoolilla ja alginaatilla. Myös biokatalysaatto- rihelmien kuivausta ja kutistamista käytetään kovetukseen, koska helmet eivät saavuta alkuperäistä kosteusvolyymiaan uudelleen kostuttamisen jälkeen ja pysyvät kovempina. Saksalaisessa hakemusjulkaisussa DE 28 35 875 kuvataan iono-trooppisen geelinmuodostuksen menetelmää käyttämällä poly-anioneja, esim. natriumalginaattia, ja esimerkiksi kalsium-ioneja verkkouttajina, jossa menetelmässä biokatalysaat-torihelmet, joihin on lisätty entsymaattisia aineita, kuivataan korkeintaan 80°C:n lämpötilassa. Sellaisia kuivaus-vaiheita ei kuitenkaan voida käyttää silloin, kun on tarkoitus immobilisoida erittäin herkkiä entsyymejä tai entsyymijärjestelmiä, etenkin eläviä soluja, koska kuivauksessa käytettävät korkeat lämpötilat tai kuiva tila inak-tivoivat solut tai entsyymit.

Toinen ionotrooppisella geelinmuodostuksella valmistettujen kalsiumalginaatti-immobilisaattien haitta huonojen mekaanisten ominaisuuksien lisäksi on niiden edelleen jalostamisessa mahdollisesti käytettävien reaktioväliainei-den rajallisuus. Sellaiset immobilisäätit ovat esimerkiksi kemiallisesti epävakaita tavanomaisissa puskuriliuoksissa olevien ionien, kuten natriumin ja kaliumin, läsnäollessa. Sellaisissa elektrolyyttiliuoksissa, etenkin jos ne ovat erittäin väkeviä, joutuvat kaliumalginaattigeeleissä olevat geeliä kiinnittävät kalsiumionit syrjäytetyiksi, koska natrium- tai vastaavasti kaliumionit kilpailevat alginaat-ti-ioneista. Myös fosfaatti-ionit johtavat vähitellen kalsium-alginaatti-biokatalysaattorihelmien liukenemiseen, koska fosfaatit reagoivat kalsiumin kanssa ja poistavat alginaatilta rakennetta lujittavan aineen. Liukeneminen voidaan estää käyttämällä matriisiaineina polykationeja, esim. kitosaania, jotka ristikytketään moniarvoisten anio-nien, kuten [Fe(CN)6]3”,[Fe(CN)6)]4- polyfosfaattien ym. kanssa. Saksalaiset patenttijulkaisut DE 30 05 632 ja DE 30 05 633 kuvaavat biokatalysaattorihelmien valmistusta 4 94257 kitosaania ja K3(Fe(CN)g):ta käyttämällä. Julkaisussa DE 30 05 632 kuvattu menetelmä sisältää enintään 80°C:n lämpötilassa tapahtuvan kuivausvaiheen helmien kovettamisek-si. Jotta erittäin herkkien entsymaattisten aineiden immo-bilisointi olisi mahdollista, tämä kuivausvaihe ei sisälly julkaisun DE 30 05 633 mukaiseen menetelmään, mistä kuitenkin on seurauksena biokatalysaattorihelmien huonompi mekaaninen lujuus.

Tämän keksinnön tehtävänä on saada aikaan helmenmuotoi-sia biokatalysaattoreita, - jotka ovat mekaanisesti erittäin lujia - joiden stabiliteetti säilyy varmasti myös käytettäessä tavanomaisia biologisia liuoksia ja puskurijärjestelmiä, ja - jotka takaavat erittäin herkän entsymaattisesti aktiivisen aineen entsymaattisen aktiivisuuden säilymisen.

Lisäksi keksinnön tehtävänä on osoittaa sopivia menetelmiä sellaisten biokatalysaattoreiden valmistamiseksi.

Erityisen sopiviksi näiden tehtävien ratkaisemiseksi ovat osoittautuneet helmenmuotoiset biokatalysaattorit, jotka sisältävät entsymaattisesti aktiivista ainetta, kationista polyelektrolyyttiä, mieluiten kitosaania, moniarvoisia anioneja ja piihappoa. Sellaisia biokatalysaattoreita valmistetaan hellävaraisella immobilisointimenetel-mällä ionotrooppisen geelinmuodostuksen avulla sekä käyttämällä kiinteässä muodossa olevaa piihappoa.

Tämä keksintö koskee helmenmuotoisia, mekaanisesti erittäin lujia biokatalysaattoreita, käsittäen entsymaattisesti aktiivista ainetta, kationista polyelektrolyyttiä ja moniarvoisia anioneja, joille on tunnusomaista, että keksinnönmukaiset biokatalysaattorit sisältävät piihappoa.

Keksinnön mukaisille helmenmuotoisille biokatalysaatto-reille on tunnusomaista niiden hyvä mekaaninen lujuus, joka johtuu Dual-geelimatriisirakenteen muodostumisesta. Niillä on näin ollen esimerkiksi hyvät tiivistysominaisuu-det reaktioastiaa täytettäessä ja niitä voidaan käyttää 5 94257 täytemateriaalina esimerkiksi kiinteäkerroksisissa reaktoreissa. Lievien immobilisointiolosuhteiden ansiosta, joihin ei kuulu kuivausvaihetta tai käsittelyä haitallisilla aineilla, nämä keksinnön mukaiset biokatalysaattorit soveltuvat ennen kaikkea erittäin herkälle entsymaattiselle aineelle, etenkin eläville soluille. Tekniikan tasosta tunnettuihin menetelmiin nähden helmenmuotoisten biokata-lysaattoreiden keksinnön mukaisella valmistamisella kiinteässä muodossa olevaa piihappoa käyttäen on se etu, että siinä voidaan välttää aikaa ja työtä vaativia menetelmiä kovettumisvaiheessa käytettävien verkkouttajien esivalmis-tamiseksi. Lisäksi keksinnön mukaisia biokatalysaattoreita voidaan käyttää puskurijärjestelmissä, jotka sisältävät alginaattigeelejä hajottavia ioneja. Niinpä keksinnön mukaisia biokatalysaattoreita voidaan käyttää esimerkiksi liuoksissa, jotka sisältävät fosfaatti-ioneja, esim. hinnaltaan erittäin edullisessa ja siksi teollisiin tarkoituksiin edullisessa tripolyfosfaattipuskurissa. Keksinnön mukaiset helmenmuotoiset biokatalysaattorit soveltuvat orgaanisten aineiden muuntamiseen. Koska niitä voidaan käyttää reaktiohin, jotka vaativat korkeita elektrolyytti-pitoisuuksia, soveltuvat esimerkiksi sellaiset keksinnön mukaiset biokatalysaattorihelmet, jotka sisältävät entsymaattisesti aktiivisena aineena Proteus-suvun bakteeria *; tai oksidoreduktaasia α-hydroksikarboksyylihappojen val mistamiseksi α-ketokarboksyylihapoista, esim. 2-(R)-hyd-roksi-4-fenyy1ivoihappoa 2-okso-4-fenyy1ivoihaposta.

Keksinnön mukaiset helmenmuotoiset biokatalysaattorit ovat mekaanisesti erittäin lujia. Hyvällä mekaanisella lujuudella tarkoitetaan esimerkiksi hyvää painelujuutta, t.s. että keksinnönmukaisissa, keskimäärin n. 3 mm:n kokoisissa biokatalysaattorihelmissä havaitaan korkeintaan 30 - 50 μπι:η, etenkin 40 /m:n muodonmuutos, sen jälkeen kun niihin on kohdistunut 1-5 minuutin ajan 0,01 - 0,03 N:n, etenkin 0,02 N:n kuormitus eikä muodonmuutos lisäänny lainkaan kuormituksen jatkuessa vielä 10-20 minuutin, 6 94257 etenkin 15 minuutin ajan.

Keksinnön mukaisten biokatalysaattoreiden sisältämän entsymaattisen aineen laatu määräytyy niiden reaktioiden mukaan, joihin biokatalysaattoreita on tarkoitus käyttää.

Se koostuu ensi sijassa mikro-organismin kokonaisista soluista, solufragmenteista tai soluorganelleista, entsyymeistä tai mistä tahansa tämän tyyppisten entsymaattisesti aktiivisten aineiden kombinaatiosta.

Mikro-organismi voi olla prokaryoottista tai eukaryoot-tista laatua. Sopivia mikro-organismeja ovat esimerkiksi - bakteeri, esim. maitohappobakteeri (Leuconostoc. Streptococcus, Lactobacillus), Corvnebacteriuro. Streptomvces. Pseudomonas. Xanthomonas. Bacillus. Clostridium. Escherichia . Proteus jne., - sieni, esim. Mucor. Aspergillus. Penicillium. etenkin hiivat kuten Saccharomvces. Candida jne, - levä, esim. Chlorella. Curvularia jne, tai - kasvisolu, esim. Catharanthus roseus. Daucus carota, Digitalis lanata. Morinda citrifolia jne.

Kokonaisten solujen, solufragmenttien tai soluorganel-lien, ts. kalvoilla päällystettyjen tai kalvojärjestelmistä koostuvien solualayksikköjen (kloroplastien, tylakoidien, mitokondrioiden jne) käyttö entsymaattisesti aktiivisena aineena on edullista, jos katalysoitava reaktio vaatii *; multientsyymijärjestelmää, esim. jos tarvitaan kofaktorei- ta (pyridiini- tai flaviininukleotideja jne), tai jos ka-tabolisen aineen sijasta on tarkoitus valmistaa biosyn-teettistä, esim. sekundääristä, tuotetta, johon tarvitaan monimutkaisia aineenvaihduntaketjuja.

Entsymaattisesti aktiiviseksi aineeksi soveltuvat myös eristetyt entsyymit. Tyypillisiä esimerkkejä sellaisista entsyymeistä ovat oksidoreduktaasit (mm. laktaatti-dehydrogenaasi, alkoholidehydrogenaasi, glukoosioksidaa-si), transferaasit, (mm. heksokinaasi, glutamiininitransa-minaasi), lyaasit (mm. fumaraasi, aspartaasi), isomeraasit (mm. glukoosi-isomeraasi, mannoosi-isomeraasi), ligaasit 7 94257 (mm. glutationisyntetaasi, NAD-syntetaasi) jne.

Entsymaattisesti aktiivisena aineena keksinnön mukaiset biokatalysaattorit voivat sisältää myös kuvattujen entsymaattisesti aktiivisten aineiden mitä yhdistelmiä tahansa, esimerkiksi kahden tai useamman mikro-organismilajin tai -kannan kokonaisten solujen yhdistelmän tai kokonaisten solujen ja entsyymien yhdistelmän. Pääajatus on solun biokatalyyttisten ominaisuuksien täydentäminen lisäentsyymeillä, joita solussa ei joko ole lainkaan tai vain hyvin vähän.

Erityisen edullisia entsymaattisesti aktiivisia aineita ovat bakteerin tai hiivan, erikoisesti Proteus-suvun bakteerin, mieluiten Proteus vuloaris-laiin ja/tai Proteus mirabilis-laiin bakteerin, kokonaiset solut. Erityisen edullinen on Proteus vulgaris-laji, esim. Proteus vulgaris ATCC 9484. Erityisen edullinen on myös sellainen entsymaattisesti aktiivinen aine, joka sisältää oksidore-duktaasia tai on oksidoreduktaasi.

Kationinen polyelektrolyytti on luonnollinen tai synteettinen polymeeri tai kemiallisesti modifioitu luonnollinen polymeeri, esim. protonisoituja aminoryhmiä sisältävä polymeeri, edullisesti kitosaani ([2-amino-2-deoksi-(1 -* 4) —0-D—glukopyranaani; poly(1,4-/3-D-glykopyranoosi-amiini]). Kitosaani on suuren molekyylipainon omaava li-neaarinen polymeeri, joka koostuu glukoosiamiinialayksi-köistä, ja joka saadaan kitiinistä osittaisella deasety-loinnilla väkevän lipeän ja kuumuuden avulla. Kitiiniä esiintyy laajalti levinneenä meren selkärangattomissa eläimissä, hyönteisissä ja sienissä. Kitosaanin valmistukseen käytetään yleensä taskuravuissa, katkaravuissa, hum- mereissa jne olevaa kitiiniä. Keksinnön mukaiset helmen- muotoiset biokatalysaattorit sisältävät edullisesti kito-saania, jonka molekyylipaino on n. 50 000 - n. 3 000 000.

Moniarvoisiksi anioneiksi soveltuvat moniarvoiset epäorgaaniset tai moniarvoiset orgaaniset anionit. Epäorgaanisia anioneja ovat edullisesti ortofosfaatti, metafosfaa- 8 94257 tit, esim. heksametafosfaatti, pyrofosfaatit, polyfosfaa-tit, esim. tri-, tetra- tai oktapolyfosfaatti, tai syano-ferraatit, esim. [Fe(CN)g]4- tai [Fe(CN)g]3”. Erityisen edullinen on tripolyfosfaatti. Orgaanisia anioneja ovat edullisesti polymeeriset orgaaniset karboksylaatit, sulfo-naatit tai hydroksiyhdisteet.

Piihapoksi soveltuu edullisesti saostettu piihappo, erityisen edullisesti sellainen saostettu piihappo, jonka keskimääräinen raekoko on 5 - 50 μτη ja keskimääräinen tilavuuspaino 5 - 100 g/100 ml, etenkin n. 20 - 50 g/100 ml.

Lisäksi tämä.keksintö koskee menetelmää keksinnön mukaisten helmenmuotoisten, mekaanisesti erittäin lujien biokatalysaattorien valmistamiseksi, jolle menetelmälle on ominaista, että entsymaattisesti aktiivinen aine sekoitetaan kiinteässä muodossa olevan saostetun piihapon, vesipitoisen puskuriliuoksen ja kationisen polyelektrolyytin vesiliuoksen kanssa suspensioksi välttäen vaahdonmuodos-tusta, suspensio pannaan tipoittain vesipitoiseen verkkou-tushauteeseen, joka sisältää moniarvoisia anioneja ja näin syntyneet biokatalysaattorihelmet kutistetaan ja lujitetaan verkkoutushauteessa ja erotetaan mahdollisesti verk-koutushauteesta.

Vaahdonmuodostuksen estäminen on ratkaisevan tärkeää valmistettaessa suspensiota entsymaattisesti aktiivisesta aineesta, kiinteässä muodossa olevasta saostuneesta piiha-posta, vesipitoisesta puskuriliuoksesta ja kationisen polyelektrolyytin vesiliuoksesta, koska muutoin syntyy mekaanisilta ominaisuuksiltaan huonompia katalysaattorihel-miä. Edullista on estää vaahdonmuodostus sekoittamalla eri komponentit keskenään piihapon läsnäollessa. Muutoin aineiden lisäysjärjestys voi olla mikä tahansa. Edullista on sekoittaa ensin entsymaattinen aine kiinteässä muodossa olevan piihapon kanssa ja vasta sen jälkeen lisätä se vesipitoiseen puskuriliuokseen ja sekoittaa lopuksi kationisen polyelektrolyyttiliuoksen kanssa.

Biokatalysaattorihelmien keksinnön mukaisessa valmis- 9 94257 tuksessa käytetään sellaista entsymaattista ainetta kuin edellä on kuvattu, ts. mikro-organismin kokonaisia soluja, solufragmentteja tai soluorganelleja tai entsyymejä tai näiden yhdistelmää. Kokonaiset solut voivat tällöin olla eläviä, kuolleita tai esimerkiksi lyofilisoituja tai de-hydratoituja. Solujen viljeleminen ravintoalustassa, joka sisältää kaikki lisääntymiselle välttämättömät orgaaniset ja epäorgaaniset ainesosat (C-lähteen, N-lähteen, hivenaineet, kasvuaineet jne), ja solufragmentointi solufragment-tien aikaansaamiseksi tai soluorganellien eristäminen tapahtuvat sinänsä tunnetuilla menetelmillä. Immobilisoita-vat entsyymit ovat esimerkiksi liuenneena, dispergoituna, suspendoituna, emulgoituna tai kuivattuna. Mainittua ja edellä tarkemmin määriteltyä entsymaattisesti aktiivista ainetta käytetään keksinnön mukaiseen menetelmään solu-, solufragmentti- ja soluorganellisedimenttinä, -suodoksena tai -suspensiona tai entsyyminä vesiliuoksessa. Tämän selityksen yhteydessä ilmaisu "vesiliuoksessa" tarkoittaa, että liuos voi sisältää lisäksi epäorgaanisia tai orgaanisia suoloja ja vastaavaa. Kysymyksessä voi olla myös esimerkiksi yleisesti käytetty biologinen puskuri kuten asetaatti-, fosfaatti-, Tris-puskuri.

Vesipitoiseksi puskuriliuokseksi soveltuu esimerkiksi biologinen puskuri, jonka pH-arvo on 3-7, edullisesti n. 5, esim. fosfaatti-, sitraatti- tai asetaattipuskuri.

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävät kationi-set polyelektrolyytit on kuvattu edellä. Edullisin niistä on kitosaani. Käytettäessä kitosaania biokatalysaattori-helmien valmistamiseksi se on saatettava ensin vesiliuokseen, jotta siitä tulisi immobilisointiaineen integroitunut ainesosa. Sitä varten kitosaania, joka on ei-protoni-soituneessa muodossa veteen liukenematon, pannaan laimennettuihin, vesipitoisiin, etenkin orgaanisiin happoihin, esimerkiksi muurahaishappoon, etikkahappoon, palorypäle-happoon, oraenahappoon, sitruunahappoon tai vastaavaan, edullisesti etikkahappoon, jonka pH-arvo on yhtä suuri tai 10 94257 pienempi kuin 7, edullisesti 4 - 5,5 ja kuumennetaan mahdollisesti noin 60°C:seen liukenemisprosessin tukemiseksi. Kitosaaniliuos suodatetaan lopuksi liukenemattomien osien poistamiseksi. Keksinnön mukaisten biokatalysaattorihel-mien valmistamiseksi käytetään mielellään kitosaanin vesipitoista liuosta, jonka viskositeetti on 1000 - 20 000 cP ja pitoisuus 0,5 - 5 % (w/w). Erityisen edullista on käyttää erittäin viskoosin kitosaanin vesipitoista liuosta, jonka viskositeetti on noin 10 000 cP pitoisuuden ollessa noin 1,4 % (w/w).

Näitä aineita käytetään edullisesti siten, että piiha-pon paino-osan suhde kationisen polyelektrolyytin paino-osaan on 1,5 - 50 : 1, erityisen edullisesti noin 15 : 1. Piihapon lopulliset pitoisuudet ylläkuvatussa suspensiossa ovat edullisesti 2 - 15 % (w/w), esim. 10 %. Kationisen polyelektrolyytin lopulliset pitoisuudet ylläkuvatussa suspensiossa ovat edullisesti 0,3 - 1,5 % (w/w), etenkin n. 0,7 %.

Keksinnön mukaisten biokatalysaattorihelmien valmistukseen käytettävä piihappo on kuvattu edellä. Sitä käytetään kiinteässä muodossa.

Verkkoutushauteena käytetään moniarvoisen anionin vesi-liuosta. Mahdolliset anionit on kuvattu edellä. Niitä käytetään happojen muodossa tai suoloina verkkoutushauteeseen, t Ί esim. alkalisuoloina, esim. natrium- tai kaliumsuoloina, li säksi myös ammoniumsuoloina. Edullinen on vesiliuos, johon käytetään tripolyfosforihappoa tai sen suolaa, esim. natrium- tai kaliumtripolyfosfaattia. Verkkoutushauteessa mainitut yhdisteet ovat esimerkiksi pitoisuuksina 0,5 - 10 % . (w/v), edullisesti 1,5 - 3 % (w/v). Verkkoutusliuoksen pH- * arvo on 5 - 10, edullisesti noin 8.

Entsymaattisesti aktiivisesta aineesta, piihaposta, puskuriliuoksesta ja polykationista koostuva suspensio lisätään tipoittain verkkoutusliuokseen samalla sekoittaen, ja tarkoituksenmukaisesti siten, että verkkoutushauteen volyymi on vähintään noin kolme kertaa niin suuri kuin 11 94257 suspension volyymi. Tipoittainen lisääminen tapahtuu käyttämällä pieniaukkoista suutinta, esimerkiksi ruiskua, ruiskun tapaista injektiolaitetta, huokoista levyä tai vastaavaa sopivaa laitetta. Tipat voidaan puhaltaa suuttimen kärjestä käyttämällä paineilmaa, painetyppeä tai vastaavaa. Suspensio voidaan myös ruiskuttaa verkkoutusliuokseen esimerkiksi käyttämällä sumutuslaitetta, edullisesti painesumutus-laitetta.

Ylläkuvatulla menetelmällä saadut biokatalysaattorihel-met pidetään kutistumista ja kovettumista varten vähintään noin tunnin, esimerkiksi yön yli, verkkoutushauteessa. Ne erotetaan mahdollisesti verkkoutushauteesta tavanomaisilla, kiinteiden ja nestemäisten faasien erottamiseen sopivilla menetelmillä kuten dekantoimalla, suodattamalla jne. ja ennen niiden jatkokäyttöä suoritetaan fysiologinen pesupro-sessi, esimerkiksi fysiologisella keittosuolaliuoksella.

Keksinnön kohteena ovat myös keksinnön mukaisella menetelmällä valmistettavat, mekaanisesti erittäin lujat helmenmuotoiset biokatalysaattorit.

Keksintö koskee lisäksi orgaanisten aineiden muunto-menetelmiä, joille on tunnusomaista, että reaktioon käytetään helmenmuotoisia keksinnönroukaisia biokatalysaattorei-ta.

Sen mukaan minkälaista immobilisoitua entsymaattisesti '[ aktiivista ainetta käytetään, on mahdollista tuottaa laaja valikoima tuotteita, jotka syntyvät käymisprosesseissa, primääriaineenvaihdunnassa, mikrobien transformaatiossa jne., esimerkiksi - kemikaaleja, esim. sitruunahappoa Aspergillus niaerillä. etanolia Zvmomonas mobilisilla. L-omenahappoa fumaraa- , silla, H2:ta chlorella-klostridi-koimmobilisaateilla, - elintarvikkeita, esim. soijakastiketta Pediococcus halo-philuksella.

- entsyymejä, esim. amylaaseja Aspergillus nigerillä.

- lääkkeitä, esim. penisilliinejä Penicillium chrvsogenu-milla tai 12 94257 - aminohappoja, esim. L-asparagiinihappoa L-aspartaasilla.

Edullisia ovat menetelmät a-hydroksikarboksyylihappojen valmistamiseksi α-ketokarboksyylihapoista keksinnönmukais-ten biokatalysaattoreiden avulla, joiden entsymaattisesti aktiivinen aine sisältää oksidoreduktaasia, tai on oksido-reduktaasi, tai koostuu Proteus-suvun bakteerin kokonaisista soluista, etenkin lajien Proteus vulgaris ja/tai Proteus mirabilis, mieluiten Proteus vulgaris. Substraatin pelkistys tapahtuu niin kutsutulla finaalireduktaasil-la, esim. substraatille spesifisellä dehydrogenaasilla. Yleensä finaalireduktaasin tarvitsemat pelkistysekvivalen-tit saadaan koentsyymistä, esim. pyridiininukleotideista, kuten nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi(fosfaatista) (NADH, NADPH) tai flaviininukleotideista kuten flaviini-mononukleotidista (FMNH) tai flaviiniadeniinidinukleoti-dista (FADH). Pelkistetyt nukleotidit puolestaan syntyvät elektronien siirrolla esim. luonnollisten tai synteettisten elektronien välittäjien, joilla on sopiva pelkistys-hapetuspotentiaali, kuten ferredoksiinin tai bipyridinium-johdannaisten, esim. 4,4'-bipyri-diniumjohdannaisen (vio-logeeni) tai 2,2'-bipyridiniumjohdannaisten (esimerkiksi dikvatti-dikationien, kuten dikvattidibromidin tai dikvatti-dikloridin) avulla.

Erityisen edullinen on menetelmä 2-hydroksi-4-fenyyli-voihapon, erityisesti 2-(R)-hydroksi-4-fenyylivoihapon valmistamiseksi 2-oksi-4-fenyylivoihaposta keksinnön mukaisten biokatalysaattoreiden avulla, joiden entsymaattisesti aktiivinen aine sisältää oksidoreduktaasia tai on oksidoreduktaasi tai koostuu Proteus-suvun, etenkin Proteus vulgaris- ja/tai Proteus mirabilis-lajin, mieluiten • Proteus vulgaris-lajin bakteerin kokonaisista soluista.

2-(R)-hydroksi-4-fenyylivoihappo on arvokas välituote ACE (angiotensin converting enzyme)-inhibiittorien tai niiden esiasteiden valmistamisessa. Tämä tehoaineluokka on viime vuosina saanut kasvavaa huomiota osakseen. Se laajentaa käytettävissä olevien antihypertensiivisten aineiden po- 13 94257 tentiaalia ja siten kohonneen verenpaineen hoitomahdollisuuksia. Erityisen tärkeänä pidetään tällöin ACE-estäjän 3-[[l-etoksikarbonyyli-3-fenyyli-(lS)-propyyli]-amino]-2,3,4,5-tetrahydro-2-okso-lH-l-(3S)-bentsatsepiini-1-etikkahappo-monohydro-kloridin (=Benazepril) valmistusta.

Tämä keksintö koskee erityisesti menetelmää 2-(R)-hyd-roksi-4-fenyylivoihapon valmistamiseksi 2-okso-4-fenyyli-voihaposta, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että keksinnön mukaiset helmenmuotoiset biokatalysaattorit, joiden entsymaattisesti aktiivinen aine koostuu Proteus-suvun, etenkin lajien Proteus vulgaris ja/tai Proteus mirabilis. mieluiten Proteus vulgaris, bakteerin kokonaisista soluista, pannaan kiinteäkerros- tai leijukerrosreaktoriin, mieluummin kiinteäkerrosreaktoriin, jonka läpi johdetaan jatkuvasti 2-okso-4-fenyylivoihapposubstraatin vesiliuosta, jonka pitoisuus on esimerkiksi 50 - 200 mM, formiaatin, esim. alkalimetalliformiaatin, kuten kalium- tai natrium-formiaatin vesiliuosta, jonka pitoisuus on esimerkiksi 100 - 500 mM, sekä elektronien välittäjän, esim. 4,4'-bipyri-diniumjohdannaisen, kuten metyyliviologeenin, karbamoyyli-metyyliviologeenin tai bentsyyliviologeenin, tai 2,2'-bi-pyridinium-johdannaisen, kuten dikvatti-dikationin vesili-osta, jonka pitoisuus on esim. 0,5 - 10 mM. Substraatin pelkistäminen katalysoidaan esimerkiksi Proteus vulgaris-bakteerin sisältämällä 2-oksokarboksyylihapporeduktaasilla (2-hydroksikarboksylaattiviologeeni-oksidoreduktaasilla). Koska tällä entsyymillä on hyvä enantioselektiivisyys, ja tuotteella on syntyessään yli 99,8%:n enantiomeeriylijäämä, on keksinnön mukaisella menetelmällä saadun tuotteen • käytöllä se erityinen etu, että useissa vaiheissa tapahtuvassa ACE-estäjän synteesissä voidaan jo synteesin melko varhaisessa vaiheessa käyttää enantiomeerisesti puhdasta yhdistettä. Yllä kuvatulla menetelmällä on mahdollista saada yli 99%:n saantoja.

Seuraavien esimerkkien on tarkoitus valaista keksin- 14 94257 töä, rajoittamatta sitä kuitenkaan vain esitettyihin esimerkkeihin.

Lyhenteet ee enantiomeeriylijäämä ("enantiomeric excess") HPLC korkeapa ine-nestekromatografi rpm kierrosta minuutissa

Esimerkki 1: Proteus vulgaris-bakteereita sisältävien helmenmuotoisten biokatalvsaattoreiden valmistus

Proteus vulgaris-bakteeria (ATCC 9484) viljellään täydellisessä kasvualustassa (hiivauutetta 5 g/1, glukoo-simonohydraattia 5 g/1, K2HP04 5 g/1, lihasta peräisin olevaa peptonia 20 g/1, pH-arvo 7) 24 tuntia 37°C:ssa käsittelemällä sitä kevyesti N2-kaasulla. Näin saadut solut kerätään 12°C:ssa Z 41 G-tyyppisessä CEPA-sentri-fugissa (läpisyöttöteho 300 1/h) huuhtelemalla N2:lla kierrosluvun ollessa 20 000 rpm (16 950 g). 400 litrasta viljelynestettä saadaan 580 g bakteerisedimenttiä, jonka kosteuspitoisuus on n. 80%. 1 paino-osa kosteata bakteeri-massaa ja 1 paino-osa piihappoa (Baker-tuote n:o 254; raekoko n. 20 /un, 95% >3 /im, 95% <60 /im; tilavuuspaino n.

50 g/100 ml) lietetään 3 paino-osaan 50 mM natriumasetaat-tipuskuria, jonka pH-arvo on 5, ja lisätään lopuksi voimakkaasti sekoittaen 5 paino-osaa l,4%:ista (w/w) erittäin viskoosia kitosaaniasetaattiliuosta (viskositeetti n. 10 000 cP, 20°C:ssa, 10 rpm, pH-arvo säädetty etikkahapolla arvoon 4,5; liukenemattomat ainesosat on siivilöity pois).

! Tämä suspensio (viskositeetti n. 2000 cP) lisätään tipoit-tain kevyesti sekoittaen l,5%:iseen (w/v) natriumtripoly-fosfaattiliuokseen (vähintään kolme kertaa suspension volyymi; pH-arvo on säädetty fosforihapolla arvoon 8,1). Tähän käytetään ruiskua, jonka kanyyliaukon läpimitta on 1,4 mm ja läpisyöttöteho 1 ml/min.) Tipat puhalletaan kanyy- 15 94257 lista painetypellä (pudotusinatka 10 - 15 cm) . Näin syntyy helmenmuotoisia, läpimitaltaan 2-3 mm kokoisia hiukkasia, jotka jätetään kutistumista ja kovettumista varten 2 tunniksi natriumtripolyfosfaattiverkkoutushauteeseen. 100 g:sta suspensiota saadaan n. 40 g helmiä (tilavuuspaino n.

80 ml), joiden solupitoisuus on 0,25 g kosteata bakteeri-massaa tai 0,05 g kuivasoluja yhtä helmigrammaa kohti, joita seuraavassa kutsutaan piihapon pitoisuuden suhteen ruiskutetussa suspensiossa "10%:isiksi piihappo-biokatalysaattorihelmiksi".

Vertailun vuoksi valmistetaan "kontrolli-biokataly-saattorihelmiä" ilman piihappoa. Tätä varten lietetään 1 paino-osa kosteata bakteerimassaa 4 paino-osaan nat-riumasetaattipuskuria, jonka pH-arvo on 5 ja sekoitetaan sen jälkeen 5 paino-osaan ylläkuvattua kitosaaniasetaatti-liuosta. Suspenpio lisätään tipoittain edellä kuvatulla tavalla natriumtripolyfosfaattiliuokseen helmenmuotoisten hiukkasten valmistamiseksi.

"Kontrollibiokatalysaattorihelmien" valmistuksen lie-tevaiheessa muodostuu runsaasti vaahtoa, mitä ei tapahdu valmistettaessa "10%:isiä piihappo-biokatalysaattorihel-miä", koska piihappo vaikuttaa vaahdonehkäisijänä. Vaah-donmuodostuksen vuoksi "kontrollibiokatalysaattorihelmet" ovat kevyempiä kuin helmet, joihin on lisätty piihappoa ja niillä on taipumus nousta verkkoutushauteen pinnalle.

Esimerkki 2: Biokatalvsaattorihelmien paineluiuuden määrittely

Biokatalysaattorihelmien painelujuuden määrittely suoritetaan sen jälkeen kun niitä on säilytetty yhden päivän ajan 4°C:n lämpötilassa natriumtripolyfosfaattiliuoksessa, : jonka pH-arvo on 8,1, termomekaanisissa analyyseissä käytettävällä mittausjärjestelmällä (TA 3000-järjestelmällä, jossa on mittausvalokenno TMA 40, Mettler Instrumente AG, Greifensee, Sveitsi). Kulloinkin kolme kosteassa tilassa olevaa biokatalysaattorihelmeä (läpimitta 3 mm) asetetaan koepöydälle kolmiokulmaan keskenään aivan lähekkäin ja pei- 16 94257 tetään keskiöidysti natriurotripolyfosfaattiliuoksella kostutetulla keramiikkalevyllä (läpimitta 6 mm, vahvuus 0,7 mm, kuivapaino 70 mg), jolle mittaustuntoelin asetetaan. Koekappaleen muodonmuutos (helmien paksuuden pieneneminen ilmoitettu μηκηΗ) mitataan ajan funktiona painamalla keramiikka-levyä 0,02 N:n kuormituksella tasalämpöisesti 30°C:ssa. Tulokset on esitetty taulukossa 1.

Taulukko 1: Biokatalvsaattorihelmien paineluiuuden määrittely 3 mm:n kokoisten biokatalysaattorihelmien _ muodonmuutos Γμΐηΐ__

Aika [min] Kontrolli-biokataly- 10%:isiä piihappo- saattorihelmiä biokatalysaattorihelmiä 0,5 40 10 1 80 20 2 130 30 4 200 40

Taulukosta 1 ilmenee, että "10%:iset piihappo-biokatalysaat-torihelmet ovat olennaisesti painekestävämpiä kuin "kontrol-libiokatalysaattorihelmet". 15 minuutin kuluttua "10%listen piihappo-biokatalysaattorihelmien muodonmuutos ei lisäänny enää juuri lainkaan.

Esimerkki 3: 2-fR)-hvdroksi-4-fenvvlivoihapon valmistus helmenmuotoisten biokatalvsaattoreiden : avulla laboratoriomittakaavassa 48 ml (kaatotilavuus) "10%:isiä piihappo-biokatalysaat-torihelmiä, jotka valmistetaan 60 g:sta esimerkin 1 mukaista suspensiota, erotetaan natriumtripolyfosfaattiverkkoutus-hauteesta ja ne lisätään 200 ml:aan typellä esikaasutettua liuosta, jossa on 50 mM (1,84% (w/v)) natriumtripolyfosfaat- 17 94257 tipuskuria, jonka pH-arvo on 7, 100 mM kaliumformiaattia ja 1 mM karbamoyylimetyyliviologeeniä (1,l'-dikarbamoyylimetyy-li^ ,4'-dipyridiniumdikationia). Helmiä pidetään tässä pelkistysliuoksessa tyhjiössä kaasun poistumiseen asti kunnes ne muuttuvat kokonaan violetin värisiksi, mikä johtuu Proteus vulgaris-bakteerin sisältämän formiaattidehydroge-naasin aiheuttamasta karbamoyylimetyyliviologeenin pelkistymisestä. Lopuksi helmet pannaan entsyymi-kiinteäkerrosreak-toriin, esim. vaipalla varustettuun lasipylvääseen (sisä-läpimitta 1,6 cm, kerroskorkeus 24 cm, 25°C). Typellä esi-kaasutettua substraattiliuosta (jossa on 50 mM natriumtripo-lyfosfaattipuskuria, jonka pH-arvo on 6,7, 100 mM 2-okso- 4-fenyylivoihappoa, 300 mM kaliumformaattia, 3 mM karbamoyylimetyyliviologeeniä) johdetaan jatkuvasti pylvääseen annos-telupumpun avulla 2,0-3,0 bar'in ylipaineella, läpisyöttöte-hon ollessa ensin 120 ml/h ja myöhemmin 24 ml/h. Reaktiotu-los, joka syntyy pelkistettäessä 2-okso-4-fenyylivoihappo 2-(R)hydroksi-4-fenyylivoihapoksi, joka katalysoidaan Proteus vulgaris-bakteerin sisältämällä 2-oksokarboksyyli-happoreduktaasilla (2-hydroksikarboksylaattiviologeeni-oksidoreduktaasilla), mitataan HPLC-analyysillä (pylväs: Nucleosil C18, hiukkaskoko 5 /un, pituus 12,5 cm, sisäläpi-mitta 4,6 mm; läpisyöttöteho 1,0 ml/min.; ajoaine: 3 tilavuusosaa asetonitriiliä/8 tilavuusosaa 100 mM kalium-fosfaattipuskuria, jonka pH-arvo on 3).

Samalla tavalla "kontrollibiokatalysaattorihelmiä" (kaatotilavuus 49 ml, 60 g:sta esimerkin 1 mukaista suspensiota) käytetään 2-okso-4-fenyylivoihapon pelkistykseeen. Tällöin on välttämätöntä supistaa helmikerrosta pylväsadap-terilla, koska suurin osa helmistä kelluu, jolloin pylvää-: seen syntyy tyhjätiloja.

Tuottavuusmäärittelyn tulokset on esitetty taulukossa 2.

18 94257

Taulukko 2: 2-(R)-hydroksi-4-fenvvlivoihapon valmistus kiinteäkerrosreaktorissa helmenmuotoisten biokatalvsaattoreiden avulla fsaanto)

Saanto kiinteäkerrosreaktorissa 25°C:ssa Läpisyöttöteho kontrolli- 10%:isiä piihappo- [ml/h] biokatalysaattorihelmiä biokatalysaattori- _ . ___,_helmiä_ 120 60 % 70 % 24 96 % > 99,5%

Taulukosta 2 ilmenee, että "kontrollibiokatalysaatto-rihelmillä" on selvästi huonompi tuottavuus kuin "10%:isillä piihappo-biokatalysaattorihelmillä".

Helmien lisääntyvän tiivistymisen vuoksi kontrolli-entsyymireaktorin jatkuva käyttö ei ole mahdollista, koska pylväs tukkeutuu jo päivän käytön jälkeen läpisyöttötehon ollessa 24 ml/h. "10%:isiä piihappo-biokatalysaattorihelmiä" käytettäessä jatkuva käyttö samoissa olosuhteissa ei sitä vastoin tuota mitään ongelmia.

• Esimerkki 4: 2-(R)-hvdroksi-4-fenvvlivoihapon valmistus helmenmuotoisten biokatalvsaattoreiden avulla pilot-mittakaavassa ia tuotteen eristäminen "10%:isten piihappo-biokatalysaattorihelmien" valmistaminen tapahtuu 573 g:sta esimerkin 1 mukaista bakteerisedi-‘ menttiä, jolloin tippojen muodostukseen kuitenkin käytetään ruiskun sijasta laitetta, jossa on hammaspyöräpumppu (läpisyöttöteho 1,4 1/h; paine n. 0,5 bar) ja 7-suihkeinen suihku, jonka kapillaarikoko on 0,6 mm. Tippumistiheyden nostamiseksi tai tippakoon säätämiseksi on jokaisessa kapillaarissa erillinen ilmanpoistokanava. Kutistumisen ja kovet- 19 94257 tumisen jälkeen 3%:isessa (w/v) natriumtripolyfosfaatti-liuoksessa saadaan 573 g:sta bakteerisedimenttiä n. 4 1 (kaatotilavuus) helmiä.

2-(R)-hydroksi-4-fenyylivoihappo valmistetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 3. Saadut 4 1 (kaatotilavuus) ”10%:isiä piihappo-biokatalysaattorihelmiä” erotetaan nat-riumtripolyfosfaatti-verkkoutushauteesta ja lisätään 6 l:aan typellä kaasukäsiteltyä liuosta, jossa on 100 mM (3,68%) natriumtripolyfosfaattia, jonka pH-arvo on 7, 100 mM kaliumformiaattia ja 1 mM karbamoyylimetyyliviologeeniä. Helmet pidetään tässä pelkistysliuoksessa tyhjiössä kaasun poistumiseen asti kunnes helmet ovat muuttuneet kokonaan violetin värisiksi. Lopuksi helmet pannaan kromatografiapyl-vääseen (sisäläpimitta 11,3 cm, pohjapinta-ala 100 cm2 , pituus 60 cm, kerroskorkeus 40 cm). Typellä kaasukäsitelty substraattiliuos (100 mM natriumtripolyfosfaattipuskuria, jonka pH-arvo on 6,7, 112,2 mM 2-okso-4-fenyylivoihappoa, 300 mM kaliumformiaattia, l mM karbamoyylimetyyliviologeeniä) steriilisuodatetaan ja johdetaan jatkuvasti pylvään läpi annostelupumpulla 2,0 - 3,0 bar'in ylipaineella, läpi-syöttötehon ollessa ensin 2,5 1/h. HPLC-menetelmällä mitattu saanto on > 99,5%. Pylväs on toiminnassa huoneen lämpötilassa, t.s. n. 23 - 26,5°C:ssa, keskeytymättä yötä päivää.

Saanto kontrolloidaan päivittäin HPLC-analyysillä • ja se pidetään säätelemällä pumpun nopeutta saantoarvoissa > 99,5 %. 25 päivän kuluttua on yhteensä n. 800 1 reaktio-liuosta reagoinut (keskimääräinen saanto on 99,6 % ja läpisyöttöteho on noin 1 1/h.

1160 1 reaktiossa syntynyttä reaktioliuosta sekoitetaan 250 l:aan etikkaesteriä ja säädetään 114 1:11a 42,5%:ista * ortofosforihappoa pH-arvoon 2,6. 2-(R)-hydroksi-4-fenyyli-voihappo uutetaan etikkaesteriin 94 %:n saannolla. Vesifaasiin jäänyt 2-(R)-hydroksi-4-fenyylivoihappo uutetaan vielä kaksi kertaa kulloinkin 120 1:11a etikkaesteriä. Näiden kolmen uuttamisvaiheen jälkeen 2-(R)-hydroksi-4-fenyylivoihapon uutuminen on täydellinen (99,8%). Kolmen etikkaesterifaasin 20 94257 yhdistämisen jälkeen (yhteisvolyymi 450 1) ja kun on lisätty 250 1 etikkaesteriä ja tislattu 470 1 liuotinta, liuos suodatetaan kirkkaaksi yksilevysuodattimella. 50 1 etikka-esteriä käytetään suodattimen huuhtelemiseen ja lisätään kirkkaaseen liuokseen. Kun on tislattu 200 1 liuotinta, on liuoksen lopputilavuus 80 1. Tähän liuokseen lisätään 400 1 sykloheksaania ja 200 1 liuotinta tislataan. Kiteytyneen aineen sentrifugoinnin ja kuivauksen jälkeen tyhjiössä 20 -25°C:ssa vakiopainoon asti saadaan 23,4 kg kiteistä 2-(R)-hydroks i-4-fenyy1ivo ihappoa.

Enantiomeerisen puhtauden kontrolloimiseksi liuotetaan näyte kiteistä happoa absoluuttiseen etanoliin ja saatetaan reagoimaan kloorivetykaasun kanssa 24 tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Alkoholin tislauksen ja lyhyen kaasunpoiston jälkeen suurtyhjiössä jäljelle jää vaalean keltainen öljy, joka analysoidaan kiraalisessa pylväässä (sisäläpimitta 250 x 4,6 mm, läpisyöttö 1 ml/min, kiinteä faasi Chiralcel OD [Stehelin, Basel], tyyppi OD-5-1520925, liikkuva faasi: 90 % heksaania - 10 % isopropanolia - 0,1 % dietyyliamiinia) HPLC-analyysillä 25°C:ssa, 32 bar'in paineella. Analysoitavat aineet ovat 1 mg/ml:n pitoisuuksina pyörrehauteessa (ruiskutusmäärä 10 μΐ). Mittaus (scanning) suoritetaan 210 nm:n aallonpituudella, analysointi pinta-alavertailulla käyttäen ulkoista standardia. Saatu ee-arvo on > 99,8 %.

4

Claims (7)

94257

1. Menetelmä helmenmuotoisen, mekaanisesti erittäin lujan biokatalysaattorin valmistamiseksi, joka biokatalysaatto-ri sisältää entsymaattisesti aktiivista ainetta, joka koostuu mikro-organismin kokonaisista soluista, solufrag-menteista tai soluorganelleista, tai entsyymeistä tai mistä tahansa tämäntyyppisten entsymaattisesti aktiivisten aineiden yhdistelmästä, kitosaania, moniarvoisia anioneja ja piihappoa, tunnettu siitä, että mainittu entsymaattisesti aktiivinen aine sekoitetaan kiinteässä muodossa olevan saostetun piihapon, vesipitoisen puskuri-liuoksen ja kitosaanin vesipitoisen liuoksen kanssa suspensioksi välttäen vaahdonmuodostusta, suspensio lisätään ortofosfaattia, meta-, pyro- tai polyfosfaatteja, syano-ferraatteja tai polymeerisiä orgaanisia karboksylaatteja, sulfonaatteja tai hydroksiyhdisteitä sisältävään vesipitoiseen verkkoutushauteeseen tipoittain ja syntyneet biokatalysaattorihelmet kutistetaan ja lujitetaan verk-koutushauteessa ja erotetaan mahdollisesti verkkoutushau-teesta.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaahdonmuodostus estetään suorittamalla sekoittaminen piihapon läsnäollessa. «

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että entsymaattisesti aktiivisesta aineesta, piihaposta, puskuriliuoksesta ja kitosaanista koostuvassa suspensiossa olevan piihapon lopullinen pitoisuus on 2 - 15 % (w/w) ja kitosaanin 0,3 - 1,5 % (w/w).

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä helmenmuotoisen biokatalysaattorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että biokatalysaattorin entsymaattisesti aktiivinen aine koostuu Proteus vulgaris- ja Proteus mirabilis-lajin bakteerin kokonaisista soluista. 94257

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä helmenmuo-toisen biokatalysaattorin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että biokatalysaattori sisältää moniarvoisina anioneina tripolyfosfaattia.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukaisella menetelmällä valmistetun helmenmuotoisen biokatalysaattorin käyttö 2-hydrok-si-4-fenyylivoihapon valmistamiseksi 2-okso-4-fenyylivoi-haposta.

7. Menetelmä 2-(R)-hydroksi-4-fenyylivoihapon valmistamiseksi 2-okso-fenyylivoihaposta, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 4 mukaisesti valmistetut helmenmuo-toiset biokatalysaattorit pannaan kiinteäkerrosreakto-riin, jonka läpi johdetaan jatkuvasti 2-okso-4-fenyyli-voihapposubstraatin, formiaatin ja elektronien välittäjän vesiliuosta.