PT92400B

PT92400B - Processo para a producao de biocatalisadores

Info

Publication number: PT92400B
Application number: PT92400A
Authority: PT
Inventors: Pierre Francois Fauquex; Gottfried Sedelmeier
Original assignee: Ciba Geigy Ag
Priority date: 1988-11-28
Filing date: 1989-11-24
Publication date: 1996-06-28
Also published as: FI94257B; IE893773L; DK596589D0; PT92400A; ES2055779T3; EP0371408A3; DK596589A; JPH02190187A; EP0371408B1; JP3042691B2; FI94257C; DE58907947D1; CA2003767A1; IE63088B1; ATE107691T1; EP0371408A2; DK173712B1; FI895635A0

Description

Este invento também se relaciona com processos para a conversão de substancias orgânicas, por exemplo para a produção de ácidos a-hidroxicarboxί1icos a partir de ácidos a-cetocarboxílicos, especialmente ácido 2-(R)-hidroxi-feni1butírico a partir de ácido 2-oxo-4-fenilbutírico, usando cs biocatalisadores do inven to.

Ο ρ r es e η t e i n v en t o r e 1 a c i ona-se com b i o c -a. t a 1 i s a d o r e s estâricos com elevada resistência mecânica, com processos para a sus orcóução e com processos psrs a conversão de substâncias

Fundamentos do invento

No seu. sentido mais amplo, a expre inclui todas as formas de catálise em que a substância activa é um sistema biológico, par exempla células totais, fragmentos de células ou. organelas celulares, ou. produtos originados a partir de um sistema biológico, por exemplo en?

imas „	En
nas,	que
ndo a	en
h i oc a	tal
ora,	ma
ham	s i d

ac 11 v a· ção. No que se vai sequir, a expressão biocatalisador refere-se não apenas à própria substância activad mas inclui também, quando aplicáveis, componentes que tenham sid.o usados para a imo b i ac tiva regeneração, etc, d a s u. fc s t S n c i a lalisadores imibi1 içados, sadores cuja mobilidade foi restringida, a ρ, □ u r i a u o s para fins m d u s t r ι ai s» uo r e s u. 1 ou seja os fciocatalis ã o pa rt i cu1 a rmente t ad o d a i mo bi 1 i z ac ão t o rn a-se ρ o s s í v e 1 r e a liz a r α s pr oc e s s o s c a. t a 1 i s a d o s c o n t ί n u a me n t e e repetidamente, criar e manter elevadas densidades hiocatalisa□ oras, conseguir rendimentos durante períodos de tempo prolonoas o 1 u. ç 3 o d a r e a c c 3 o „ « Zt ct 2. TiC= L? 2. i í ii. Ct L, Zt O !| O iTf <?

?mplo, ser incluído em substan . I .. 1 L.. Ç — T · ±. I _j _

-L ::t o. ,J-1 UL ct ct 1 -i. L L U U pU'U£f_? p L7 Γ .s de inclusão poliméricas (matriz), em cápsulas cu fibras consistindo em membranas semi-permeáveis ou por trás ds membranas de ultra-filtração, ou ser submetido a lioação cruzada com reagentes b.i- ou mui ti-furicionais, ou fixado a veículos consistindo em material inorgânico ou polímeros naturais ou sintéticos por adsorção ou por ligação iónica ou covalente. é também possível uma combinação destes métodos.

Durante a imobilização é necessário assegurar, por um lado, a preservação tão grande quanto possível da actividade biocatalítica e, por outro lado, elevada resistência mecânica e estabilidade química e também, ao mesmo tempo, boa permeabilidade do biocatalisador. Um método ds imobilização amplamente utilizado é, por exemplo, a inclusão do material biológicamente activa numa matriz de polímeros naturais, tais como, inter alia, celulose, agar ou. gelatina, ou polímeros sintéticos, tais como, inter a 1 ia, poliacrilamida, poliuretanos ou resinas epoxi. Um método de imobilização especiaimente suave consiste na formação de gel inotrópico (ligação cruzada iónica das substâncias da matriz) sendo os materiais de inclusão apropriados para esse fim, por exemplo, polianiSes naturais, tais como alginato, pectina, musgo da Irlanda, etc.. A introdução gota a gota ou a pulverização de uma suspensão de material enzimaticamente activa e uma solução aquosa da substância matriz numa solução de ligação cruzada aquosa contando contraiães multivalentes, por exemplo, inter alia,, Ca* , Co^ , Zn“ , Fe^1- , Fe''¹ , Al^r, resulta na quelatização e na formação de biocatalisadores esféricos.

Em regra, a formação de gel ionotrõpico por polímeros orgânicos produz apenas imobilizados relativamente moles, mecânicamants instáveis que revelam uma tend'ê'ncia para a tumefacção e

secaqem não ê incluído no oroce	?·=.=. o descrito ern L'E 30 0^lo 633, o
que, contudo, resulta numa res	;istê^;ncia mecânica inferior das

nérolas de biocata1isador

LÍuJeutlVu do invento
Constitui um objectivc	2 do presente invento proporcionar
biocata1isadores esféricos (em 1	^?orma de pérolas)

. que apresentam elevada resistência mecânica,

. cuja estabilidade é asseguradi	a mesmo quando se usam soluções e
s i s t e m a s t a m p ã o b i o 1 ό o i c o s c on v e	?ncionais, e
. que continuam a assegurar a i	actividade enzimática de ma.terial
en z i ma t i c amen te a.c t i. vo a 11 amen ts	; sensível.
Constitui, também um c	3□jec 11vo d ο ι rι vento p rο ρo rcio n a r
processos apropriados para a pre	jdução- desses biocatal isadores ,
3_ f ί.ΓΓ{\| ’ —··=.o <=.	cialmente apropriado para conse-
guir obter estes biocatalisadors	es de formato esférico que contêm
material enzimaticamente activo.	. um oo ]. if= 1 ec tró 1 i fo catiónira, de
_· Γ E? i bj t ív ) ? C. Í ct U. x tOS .·?» Π n ct F? A. O >” ':::· I	JU Α A, V 9. i c'h c Sc· St ct C -ΐ. tJ ÍZ5 S ct IIC i ΐ I C O °
Essas pérolas de biocatalisadot	- são produzidas num processo de
imooilização suave pela Tormaçc

ácido silícico sob uma forma sólida.

0 dresente iηvento r<	;laciona-5e com biocata1isadores
esféricos (em forma de pérolas)	c o o e 1 e v a d a r ε s i s t s n c i a m a c a n i. c a ,

compreendendo material encimaticamente activo, um pol iel ec tról .i. to catiánico e aniões polivalentes, em que os biocatalisadores do invento contêm ácido silícico.

Oo biocatalisadores esféricos do invento são caractericados por resistência mecânica elevada, a qual pode ser atribuida à formação de uma estrutura com matriz de gel duplo. Apresentam assim boas propriedades de embalagem, por exemplo quando usados para embalar um recipiente de reacção, e podem ser usados como material de enchimento, por exemplo, para reactores de camada fixa. Devido às condições suaves de imobilização, que não incluem qualquer passo da secagem ou tratamento com substâncias prejudiciais, os biocatalisadores do invento são especialmente apropriados para material enzimática altamente sensível, espeoialmente para células vivas. A produção de biocatalisadores esféricos de acorda com o invento usando ácido silicico sob uma forma sólida tem a vantagem em relação aos processos anteriores de se evitarem processos de longa duração e dispendiosos para a preparação preliminar dos agentes de ligação cruzada usados no passo de endurecimento. Além disso, os biocatalisadores do invento pedem ser usados em sistemas tampão contendo iSes que levam à dissolução de geles alginatos. Os biocatalisadores do invento podem assim ser usados, por exemplo, em soluções contendo iSes fosfato, por exemplo em tampão tripolifosfato o qual é muito barato sendo desse modo vantajoso para finalidades industriais. Ds biocatalisadores esféricos do invento e;ão apropriados para a conversão de substâncias orgSncias, visto poderem ser usados para reaccões que requerem concentraçóas electrolíticas elevadas, as parolas de biocatalisador do invento contendo uma bactéria do qénero Proteus ou uma ox ido-reduc tase oomo material enzimaticamente acti. vo são — é — apropriadas, por exemplo, para a. produção de ácidas u-hidroxicarboxílicos a partir de ácidos α-cetc-carboxί 1 icos, por exemplo ácido 2-(R>-hidroxi-4-feniIbutírico a partir de ácido 2-oxo-4-fen i 1 bu t í r i c o .

Os biocatalisadores esféricos elevada resistência mecânica. A expressão mecânica é usada para significar, por elevada à compressão, ou seja as pérolas invento tendo um tamanho médio de cerca de 3 um a cinco minutos sob uma csrga áe 0,01 a O 0,02 Muma deformação máxima de 30 a 5Ô μ/η, e, após de 10 a 20 minutos, especialmente 1 sentam qualquer aumento na deformação.

invento elevada exemplo, apresentam resistência resistência ds biocatalisador do mm a ρ r e s an t a m, cí. ρs ,03 N, especialmente especialmente 40 μ/η, 5 minutos, não apre0 tipo de material enzimaticamente activo compreendido nos biocatalisadores do invento é dicidido pela reacção para a qual os biocatalisadores são usados. De preferência, consiste em células totais, fragmentos ds células ou organslas celulares de um microoroanismo, ou em enzimas ou em qualquer combinação destes tipos de material enzimaticamente activo.

Os microorçanismospodem ser de natureza procarionte ou eucaronte. bicroorganismos apropriados são por exemplo.

uma bactéria, por exemplo a bactéria co ácido tobao i 1 Ixs ; „ OC:

'-.euc onostoc ,

Streotomyces, Pseudlmonas, Xanthomsnas, Esc bei-ichia , F^!rcteus , etc láctico

Elos tr idiutc ’

- um fungo, par exempla Mucar, Aspergi1lus, Pen ici 11ium, especialmente leveduras tais como por exemplo, Saccharoavces Candida, a to ,

- uma alga, por exemplo ChlorelI a, Curvularia, etc., ou

- uma célula de planta, por axeaiplo Catharanthus roseus, bâiíiilAs Çâteiãj Digita lie lanata, Morinda oittrifolia, etc.

A utilização de células totais, fragmentos de células ou organelas celulares, ou seja subunidades celulares envolvidas em membranas ou consistindo em sistemas de membranas ícloroplastos, tilacoides, «titocondrias, etc), como material enzimáticamente activo é vantajoso quando a reacção a ser catalisada requere um sistema multi-enzimático, por exemplo quando são necessários co-factores (nucleótidos de piridina ou nucleátidos de flavina etc.), ou quando, em vez de um produto catabólico, se pretende produzir um produto bicssintético, por exemplo secundário, para o qual são necessárias cadeias de metabolismo complícad o .

Enzimas isolados são também apropriados como material enzimaticamente activo. Exemplos típicos desses enzimas são ox ido-reduc tase (lactato de dehidrogena.se, álcool de dehidroçenase, oxidase ds glucose, etc.), transferases (hexoquinase, glutamina, transaminase, etc.), liases (fumarase, asparta.se, etc.), isomerases íisomerase de glucose, isomerase de manose,etc.), ligase (sintetase glutationa, sintetase de NAD, etc.), e tc .

Ds biocatalisadores do como material enzimaticamente a tipos de material enzimaticos invtHZu pooem também ucmpr—;eno«r ctivo qualquer combrnspãc dos descritos·,. ---- --------¹ por exemplo uma

combinação de células totais de duas ou mais; espécies ou estirpes de microorganisísos ou uma combinação da célula botai e enzima. A ideia fundamental consiste em tornar completas as propriedades fciiocataliticas de uma célula completa usando encimas adicionais que não se encontram disponíveis na célula ou que se encontram disponíveis na célula apenas em quantidades demasiadamente pequenas.

Especialmente preferidas; como material enzimático são as células totais de uma bactéria ou de levedura, de preferência uma bactéria do género Proteus,, especialmente uma bactéria da espécie Prcitous vulparis e/ou da espécie Proteu.s vu 1 qaris , por exemplo Proteus vulgaris ATCC 9484. έ também dada especial preferencia a material erszimaticamente activo que contem uma oxido-rsductase ou qus é uma oxido-reductase.

O polielectrolito catiónico é um polímero natural ou sintético ou um polímero natural após modificação química, por exemplo um polímero tendo grupos amino protonatos, de preferência quitosan ( F E-smino-dssoxi-(1--->4 5-β-D-ç1ucopiranano 5 pol i-( 1,4-fl-D-q 1 ucopi ranosamina 1 „ 0 quitosan é um polímero linear de peso molecular elevado consistindo em subunidadss ds glucosamina, as quais são isoladas a partir da quitina por' meio de desacilacão parcial com o auxilio de uma solução alcalino concentrada a de calor. A quitina é vulgar na natureza, por exemplo em invertebrados marinhos, insectos e fungos» A quitina dos caranguejos, u a ma ; o e s , 1 a u a s r a s , e c o „ , e u e f u i men te u s a d a. p a r a -a p r e ρ a r a ç a o tí e quitosan» Os biocatal isadorss esféricos; do invento comorsencem de preferencia quitosan tendo um peso molecular variando entre cerca de 5Ã,,0yÊ e cerca de 3 »004,000,,

AniSes polivalentes apropriados são aniSes inorgânicos polivalentes ou orgânicos polivalentes. Os aniSes inorgânicos são de preferência ortofosfato, metafosfato, por exemplo hexametafosfato, pirofosfatc, polifosfato, por exemplo tri-, tetra- ou _ _ Λ octa-polifosfatc, ou cianoferratos, por exemplo Lt-e(uN), j ' ou

Cr ¢., o.-,, Jn·.· * g _5Sp_ec ι .γ,_ente preferido o tripolifosfato. Os aniSes orglnciso são de preferência carboxi1 atos orgânicos po1imsricos, suifonatos ou compostos hidroxi.

ácido silicico apropriado é de preferência um ácido silícico preceipitado, mais especialmente um ácido silicido precipitado tendo um tamanho médio de partícula variando entre 5 e 5'3p.m e uma densidade média de massa variando entre 5 e g/100 ml, especialmente cerca de 20 e 50 q/lõõ ml.

presente invento relaciona-se ainda com um processo para a produção de hiocatalisadores esféricos do invento apresentado resistência mecânica elevada, processo esse que compreende a mistura do material en2imaticamente activa com ácido silicico precipitado sob a forma sólida, uma solução tampão aquosa e uma solução aquosa de um polielectromito catiónico para formar uma suspensão evitando-se entretando a formação de espuma, introduzindo a suspensão gota a gota num banho para produzir lioação cruzada contendo sniSes polivalentes e retraindo (encolhendo) e solidificando as pérolas de bicatalisador resultantes no banho para ligação cruzada, s facultativamer.te separando-se do banho para ligação cruzada.

evitar da formação ds espuma e decisiva importância na produção da suspensão a partir do material enzimaticamente sctivc,, ácido silicico prectado sob uma forma sólida, solução aquosa de tampão e uma solução aquosa de um polielectrolito catiónico, visto qus a formaçãode espuma dé origem à formação de pérolas de catalisador apresentando propriedades mecânicos menos boas, A formação de espuma é evitada de preferência misturando os vários componentes na presença de ácido silicico. A sequência em que as substâncias são combinadas é por outro lado arbitrária. De preferência, o material enzimático é misturado em primeiro lugar com ácido silicico sob uma. forma sólida e só então é misturado com 3. solução aquosa de tampão s subsequentemente misturado com □ processo do invento para a produção de pérolas de biocatalisador utiliza material enzimático do tipo anteriormente descrito, isto ê células totais, fragmentos de células ou organelas celulares de um microorganismo ou enzimas ou uma sua combinação. As células totais podem estar vivas, mortas ou, por exemplo, sob uma foram liofilizada ou deshidratada. A cultura das células num meio nutritivo contendo todos os constituintes orgânicos e inorgânicos necessários para a manutenção do metabolismo e para multiplicação (fonte de carbona, fonte de azoto, elementos vestigiais, substâncias de crescimento, etc,), e a fragmentação das células a fim de produzir fragmentas celulares e o isolamento das organelas celulares, respectivamente, sao realizados por métodos que são conhecidos per se. Os enzimas a ssr imobilizados encon trando— se, por exemplo, numa, forma dissolvida, dispersa.

suspensa, amulsifiçada ou mencionado, que foi aqui usado para o processo do sedimento, filtrado ou células ou organelas de so 1 uc ·.··.: aquosa ,

Nc? contexto seca. 0 material enzimaticamente activo anteriormente definido detalhadamente, ê invento, por exemplo, sob a forma de um suspensão de células, fragmentos de células ou sob a forma de ur enzima eni cesta descrição, a expressão em

solução aquosa siqnifica que a solução pode conter adicionalmente sais inorgânicos ou orgSnciso, etc. A solução pode ser, por exemplo, um tampão biologicamente convencional tal como tampão acetato, tampão fosfato, tampão tris, etc.

Soluções ds tampão aquosas apropriadas são, por exemplo, tampões biologicos com um pH variando entre 3 e 7, de preferência pH de cerca de 5, por exemplo fos»fato, tampão citrato, ou tampão acetato.

Os polielectrólitos catiónicos que podem ser usados no processo do invento foram aqui anteriormente descritos, é preferido o quitosan. Para utilização na produção de pérolas de biocatalisador, o quitosan deve ser primeiro levado a solução aquosa a fim de se tonar um componente integral do imobilizado. Para esse fim, o quitosan, que é insolúvel na água sob a forma não protonada, é misturado num ãcido aquoso diluido, especialmente orgânico, por exempla em ácido fórmico, ácido acético, ácido pirúvico, ácido málioo, ácido cítrico, etc., de preferência ácido acético, com um pH de 7, de preferência um oH de 4 a 5,5 e aquecido facultativamente atè cerca de è0°C a fim de promover o processo de dissolução. A solução de quitosan é então filtrada a fim ce remover os constituintes insolúveis. Para a produção das pérolas de biocais1isador do invento, usa—se de preferencia uma solução aquosa de quitosan tendo uma viscosidade variando entre 1.000 e 2.000 cP, numa concentração variando entre 0,5 e 52 ψ''ρη, é espec i a Imen te preferida. a utilização de uma solução aquosa de quitosan de alta viscosidade tendo uma viscosidade de cerca de lô.õeú cF^: numa concentração de cerca de 1,43 (p/p). As substâncias utilizadas são de preferência utilizadas sm quantidades tais que a relação em peso entre o ácido silicico e o electrolto catónico varie entre 1,5 a 5©;1, mais especialmente aproximadamente 15s 1 . As concentraçSes finais preferidas de âc:ido si lic ico na suspensão descrita anteriormente variam entre 2 e 157. (ρ/p) por exemplo IOX, Concentrações finais; preferidas de· polielectrolito catiónico na suspensão descrita anteriormente variam entre y,,3 e 1,57. ίρ/ρ), especialmente á volta de 0,77..

ácido silicicc; usado para a produção das pérolas; de biocatalisador do invento foi descrito anteriormente. έ utilizado sob uma forma sólida.

da metal alcalino, também sob a forma banho para ligação cruzada é uma solução aquosa de um anião polivalente. Os anioes; possíveis foram aqui anteriormente descritos. São usados no banho para ligação cruzada sob a forma de ácidos ou sob a forma de sais, por exemplo sob a forma de sais por exemplo sais; de sódio e de potássio, e de sais de amónio. έ dada preferência a uma solução aquosa para a qual se usa ácido tripolifosfárico ou um seu sal, por exemplo tripol if osf ato de sódio ou de potássio,, Os compostos mencionados estão presentes no banho para ligação cruzada, por exemplo, numa concentração variando entre 0,5 e 107. (p/p>, de preferência entre 1,5 e 37 (p/p>. 0 pH da solução para ligação cruzada varia entre 5 e 1©, tendo o FTi de preferência um a 1 cr de S»

A suspensão consistindo em material enzimaticamente activo, ácido silicico, solução tampão e oolioatião é introduzida gota a gota na solução para ligação cruzada com aqitação, vantajosamente numa quantidade ta 1 que o volume de banho para ligação cruzada tenha um valor de cerca de três vezes o volume da suspensão. rn adição gota a gota é realizada usando um bocal tendo uma pequena saida, por exemplo uma seringa para injecção, uct di '-ii positive? para injecção do tipo seringa, uma placa porosa ou um meio semelhante apropriado. As gctícolas são facultativamente despejadas da extremidade do bocal com ar comprimido, azoto comprimido, etc. A suspensão pode também ser pulverizada para a solução para ligação cruzada, por exemplo usando ura dispositivo para atemização, de preferência ura dispositivo para atomização pressurizada.

As pérolas de biocatalisador obtidas pelo processo descrito anteriormente permanecem na banho para ligação cruzada pelo menos durante cerca de uma hora, por exemplo durante a noite, para encolhimento e endurecimento. As pérolas são facultativamente separadas dc· banho para ligação cruzada pelos métodos habituais apropriados para a separação das fases sólida e líquida, tais como decantação, filtração, etc., e, antes de utilização posterior, sao submetidas a um processo de lavagem fisiológica, por exemplo cora solução salina fisiológica.

presente invento também se relaciona com biocatalisadores esféricos tendo uma resistência, mecânica elevada que são produzidos pelo processo do invento.

D invento relaciona-se, além disso, cora processos para a conversão de substâncias orgânicas, processos esses que compreendera a utilização para a conversão de biocatalisadores e s f é r i c o s d ο ρ r e s e n t e i η v e n t o .

Dependendo do material activo en z ima t icamen te imobilizado, é possível manufacturar uma ampla gama de produtos qua são produzidos por meio de processos de fermentação, em metabolismo primário, por transformação microbiana, etc., de, por exempla,

- produtos químicos, por exemplo ácido cítrica par AsperqiI1us i;jqer, etanol por Zvmcmonas mobilis, ácido L-málico por fumarase, H_ por co-imobi1izados de clostridia-Chioralla,

-- produtos alimentares, por exempio molho de soja por Psdiococcus h-aloohi lu.s,

-- enzimas, per exemplo amilases por Aspergi 11 us niqer,

- medicamentos, por exemplo penicilinas par Per»ici 11 ium___chrysoaenum, ou

- amino ácidos, por exemplo ácido L-aspártico por L-aspartase.

± dada preferência a processos para a produção de ácidos a-hidroxicarboxi1icos a partir de ácidos a-cetocarboxílicos usando os biocataiisadores do invento cujo material snzimaticamente activo contam uma oxido-reductase, é uma oxido-reductase ou consiste em células totais de uma bactéria do género Proteus, especialmente da espécie Proteus vu1qaris e/ou Proteus ai, rabi lis, ds preferência Proteus vulqaris Nestes processos,, a redução do substrato è efectuada pela chamada reducta.se final, por exemplo uma dehidrogenase específica do substrato,, Os equivalentes de redução requeridos pela rsductase final são geralmente fornecidos por um co-enzima, por exemplo por nucleótidos da piridina tais como dinucleótido de nicotin-amida adenina (fosfata) CNADH, NADPH) ou por nucleótidos da flavina tais como mononucleótido da flavina (FMNH) ou dinucleótido de flavina adenina (FADH). Os nucleótidos reduzidos são por sua vez produzidas, por exemplo, por transferência de electrões por meio de mediadores de electroes naturais ou sintéticos tendo um potencial rsdox apropriado, tais como ferredoxina ou derivados de bi-piridi1ium, por exempio derivados de 4,4 -bipiridi1ium (viclogénios) ou derivados de 2,2 — bipiridi1ium (por exemplo dicações de diquat tais como debrometo de diquat ou dicloreto de diquat). 82o t a m b é ííi capazí ds aceitar

CíS conhecidas reductases finais que são electrões directamente dos mediadores.

d dada especial preferência a um processo para produção de ácido 2—hidroxi-4-fenί1butírico, de preferência ãcido 2-(R)-hidroxi~4-fenilbutirico, a partir ds ácido 2~oxo--4-fenilbutírico usando biocatalisadores do invento cujo material enzimaticamente activo contem oxido-reductase, é uma oxido-raductase ou consiste em células totais de uma bactéria do género Proteus, especiaimente da espécie Proteus vu 1 garis e/ou Proteus 0ljj2é.bi_li.s de preferência Proteus vulqaris. Ácido 2-(R)-hidroxi-4-fenilbutírico constitui um intermediário valioso na produção de inibidores de (enzima de conversão da angiotensina) ou seus precursores. Esta classe de substâncias activas tem sido objecto de um interesse crescente nos últimos anos. Eia amplia o potencial dos agentes anti-hipertensivos disponíveis e, desse modo, a gama de possíveis terapêuticas para o controlo da pressão sanguínea elevada. Da especial interesse neste campo & a produção do inibidor-ACE do ácido 3--Ϊ l í-etoxicarboni 1 — 3-feni 1-( 15) — propi 1 3 amino!-2,3,4,5-te trahidro-2-oxo-ÍH-1-(3S)-benzazepine-1-acético, monoclorohidreto (- benazepril).

presente invento relaciona-se especiaimente com um processo para a produção de ácido 2-(R)-hidroxi-4-feni1butírico a partir de ácido 2--oxo-4-feni Ibutírico, cujo processo compreende a utilização de biocatalisadores esféricos do invento cujo material enzimaticamente activo consiste em células totais de uma bactéria do género Proteus, especiaimente da espécie Proteus vuIqaris e/ou Proteus mirabi lis, de preferência Pro teus vuIqaris, num reactor de camada fixa cu. de camada fluidizada, de preferência num reactor de camada fixa, através do qual se faz passar

-16contínuamente uma -solução aquosa do substrato ácido 2-oxo-4f en ί 1 butí rico , por exemple numa concentração variando entre 50 e 200 mM, formato, por exemplo um formato de metal alcalino, tal como formato de potássio ou sódio, por exemplo numa concentração variando entre 10w e 500 mM, s um mediador de electrSes, por exemplo um derivado de 4,4 -bipiridinium, tal como metilviologe·nio, carbamoiImeti1viologénio ou bensilviologénio, ou um derivado de 2,2 -bipiridi 1 iumtal como dicação de diquat, por exemplo numa concentração variando entre 0,5 e 16 mM. A redução do substrato é catalisada, por exemplo, pela reductase ácido 2-oxocarboxílico íoxido-reductase 2-bidroxicarboxilato de viologénio) presente em Proteus vuIqaris. Visto que este enzima apresenta uma elevada enantioselectividads e o produto ê obtido com um excesso enantiomêrico de mais de 99,8%, a vantagem particular da utilização co produto obtido pelo processo do invento consiste no facto de, na síntese dos inibidores-ACE, que se realiza ao longo de vários passos, ser possível. usar um composto enantioméricamente curo nua estádio relativamente precoce da síntese. 0 processo anteriormente descrito torna possível taxas de conversão elevadas, de mais de 99%.

Lis Exemplos que ss saguam pretendam ser ilustrativos do invento sem implicarem qualquer sua limitação, por exemplo, do âmbito dos Exemplos,

Abreviaturas ae s:-xssso anantiomérico

CLEF' cromatoarafia líquida de elevada pressão rpr rotaçSas por minuto

Exsmolo_1_:

Produção_de_biocatalisadores esféricos contendo vulgar is

Protstzs vulgar is (ATCC 94S4) é cultivado num meio completo (extracto de levedura 5 g/1, (acnohidrato de glucose 5 g/1, IC-HCC^ 5 g/1, peptona ds carne 2Λ g/I, pH 7,0) durante 24 horas a 37 *C com gaseificação suave com N.-,. As células assim obtidas são armazenadas a 12'^:'C numa centrifugadora CEPA do tipo Z 41 G (com passagem de 3Θ0 1/bora) a uma velocidade de 20.000 rpm (ló.95€) q) com jacto de N_,, 4CC litros de líquido de cultura deram origem a 580 g de sedimento bacteriano tendo um conteúdo de humidade de cerca de 802. 1 parte em peso da massa bacteriana húmida é suspensa juntamsnte com 1 parte em peso de ácido silícico (Produto Baker No. 254; tamanho da partícula cerca de 20pm, 952> 3 pm, 957 < ó0 um; dsnsida.de de massa cerca de 50 g/lÃO ml 5 em 3 partes em peso de 5Θ mM ds tampão acetato de sódio pH 5,0, sendo sntãa misturada, com agitação vigorosa, com 5 partes em peso de uma solução de acetato de quitosan aquosa de elevada viscosidade (viscosidade de cerca de 10.000 cr a 20 °C e 10 rpm; pH 4,5 ajustado com ácido acético; constituintes insolúveis removidos por passagem por crivo), Esta suspensão (viscosidade de cerca de 2.000 rP) é adicionada gota a gota, com agitação suave, até se obter uma solução a 1,52 de tripolifosfa to de sódio (p/v) (pelo menos trãs vezes o volume da suspensão; pH 8,1 ajustado com ácido fosfórico), Para este fim utiliza-se uma seringa tendo uma abertura na agulha de 1,4 mm de diâmetro e uma taxa de fluxo de 1 ml/min. As goticoias são despejadas da agulha (distancia da queda 10-15 cm) com azoto comprimido. São obtidas partículas esféricas tendo um diâmetro de 2-3 mm, as quais permanecem nc banho para ligação cruzada de tripolik:/ato de sódio durante 2 horas para

encolhimento e endurecimento. IDO q do suspensão dão origem a aproximadamente 4$ q de pérolas (volume de massa cerca de Rê _mj) tendo uma concentração celular de D,25 g de massa bacteriana húmida ou 0,05 q cie células secas por g de pérolas as quais, tomando em consideração a concentração do ácido silicico na suspensão feita passar pela seringa, sao aqui a seguir referidas como pérolas de biocatalisador com lan de ácido silícico.

Pérolas de biocatalisador testemunhas sao preparadas sem a adição de ácido silicico tendo como finalidade uma comparação. Rara este fim,, 1 parte em peso de massa bacteriana húmida é suspensa em 4 partas em peso de tampão acetato de sódio pH 5,θ sendo então misturada com 5 partes em peso da solução de acetato de quitosan anteriormente descrita. A suspensão & adicionada gota a gota a uma solução de tripolifosfato de sódio do modo anteriormente descrito a fim de produzir partículas esféricas.

Na produção das pérolas de biocatalisador testemunhas ocorra uma. considerável formação de espuma durante o processo de suspensão; isto não ocorre na produção das pérolas de biocatalisador com 1DD de ácido silicico visto que o ácido silícico actua como um agente anti-sspuma. Devido à formação de espuma, as pérolas de biocatalisador testemunhas são mais leves do que as pérolas às quais se adicionou ácido silícico, e tám tendencia para subir até â superfície do banho para ligação cruzada.

— 14' —

Exemolo_2; Determinarão da_resistência A compressão_das pérolas de biocataiisador

A resistência à compressão das pérolas de biocataiisador é de terminada após um dia de armazenamento a 4*C na solução da tripolifosfato de sódio pH G,1 usando um sistema de medição para análise termomecãnica (sistema TA 30Θ0 com calibre TMA 4Ú, Mettler Instruments AG, Greifensee, Switserland). Grupos de trâs pérolas de biocatai .isador (diâmetro 3 mm) no estádio húmido são colocadas numa disposição triangular, na bancada do teste e um disco de cerâmica (diâmetro 6 mm, espessura 0,7 mm, pese a seco 7y mg), que foi impregnado com solução de tripolifosfato de sódio s no qual se colocou o sensor, é colocado centralmente sobre elas. A deformação da amostra (diminuição da espessura das pérolas em pm) é medida em função do tempo fazendo pressão para baixo no disco de cerâmica sob uma carga de O,02 IM isotôrmicamente a 30 °C. Os resultados são indicados no Quadro 1.

Quadro 1; De te resis' à coiiicressão das pérolas de biocatalisador

	Deformação das pérolas de biocatalisador com 3mm /pm
Tempo / min7	pérolas de bio-catalisador testemunhas	pérolas de biocatalisador com 10% de ácido silico
0.5	40	10
1	80	20
2	130	30
4	200	40

Quadre I mostra claramente que as pérolas de biocatalisador com 10% ds ácido silícico apresentam uma resistência á compressão consideravelmente mais elevada do que as pérolas de biocatalisader testemunhas. Após 15 minutos as pérolas ds biocatalisador com 10% de ácido silíi posterior aumento da deformação.

> apresentam quase nenhum

Exemolo __3: Produção 1a bcratoria1 de ácido 2-(R)-hidroxi-4-fenilbutí usando biocatalisadores es f é r i c o s ci

4tí ml (volume de massa) de pérolas de biocatalisador com 10% de ácido silícico produzidas a partir ds óõ q de suspensão de acordo com o Exemplo 1 são separados do banho para ligação cruzada de tnípciifestafo de sódio s são adicionados a 20Θ ml de uma solução 5u mM <1·S4% p/v) de tampão tripolifosfato de sódio pH 7,0,: 100 mM de formato de potássio e 1 mrl ds car bamoi 1 meti 1 viologenio (dicação de 1,1 -dicarbamoilmeti1-4„4 -dipiridinium) a qual foi préviasente gaseificada com azoto. As pérolas permanecem nesta solução de redução, sob vácuo com d fim de as desgaseificar, até se obter uma cor completamente violeta,, resultante da redução do carbamoilmeti1viologénic pela dehidrogenase de formato presente em Pro teus r u 1 q a r i s As pérolas são então introduzidas num reactor de camada fixa de enzima, isto é numa coluna de vidro provida de um revestimento (diâmetro interno 1,6 cm, altura da camada 24 cm, 25°O» A solução substrato (50 mM de tampão tripo1ifosfato de sódio pH 6,7, 100 mM de ácido 2~oxo-4~feni1butírico,

300 mM de formato de potássio, 3 mM de carbamoilmetilviologênio) que tinha sido préviamente gaseificada com azoto é então feita passar continuamente através da coluna por meio de uma bomba de medição a uma pressão de excesso de 2,0 a 3,0 bar com uma taxa de fluxo de 12Θ ml/hora inicialmente e a 24 ml/hora subsequentemente,, 0 grau de redução do ácido 2-oxo-4-fenilbutírico para ácido 2--(R >-hidrox i~4·--f en i 1 tu t i ric o que é catalisado pela reductase de ácido 2-oxocarbcxílico (oxido-reductase de 2-hidroxicarboxilata de viologénio) presente em Preteus vulaaris é medido por análise CL.EF' (coluna: Nucleosil C18, tamanho de partícula 5 μη, comprimento 12,5 cm, diâmetro interno 4,6 mm; taxa ds fluxo 1,0 ml/min.; eluente; 3 partes por volume ds acetonitrilo/3 partes por' volume de 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 3,0).

As ”pérolas de biocatalisador testemunhas (volume de massa 43 ml de 60 g de suspensão de acordo com o Exemplo 1) são usadas para a redução de ácido 2-oxo~4-feni1butírico de um modo análogo. Para isso é necessário restringir a camada de pérolas com um adaptador da coluna porque a maior parte das pérolas flutua e, desse modo, são produzidas zonas vazias na coluna.

da análise de productividade são indicaOs resultados dos no Quadre 2.,

Quadro 2 Produção de ácido 2-?R)-hidroxi-4-fanilbutirico num reactor de camada fixa em escala laboratorial usando bíecatsllsadsrss.. esfériccs (grau, ds_conversão )

	grau de conversão em reactor de camada fixa a 25°C.
Taxa de fluxo /ml/h 7	pérolas de biocatalisador testemunha	Pérolas de biocatalisador com 10% de ácido silicico
120	60 %	70 %
24	96 %	>99.5 %

Vê-se a partir do Quadro 2 que as pérolas de biocatalisador testemunhas apresentam uma produtividade acentuadamente mais fraca do que as pérolas de biocata1isador com IOX de ácido si 1icico.

Devido ao facto das pérolas se tornarem cada vez mais compactas, nao é possivel uma. operação continua do reaccor uo enzima ds controlo visto a coluna ficar bloqueada após apenas um dia com uma taxa de fluxo de 24 ml,-'hora. Pelo contrário, pode-ss realizar uma operação contínua nas mesmas condiçSes com as pérolas de biocatalisador com IOX de ácido silicico sem qualquer problema.

Exemplo 4 : Produção de Acido 2~(R)-hidroxi-4-feniIbutírico numa escala piloto usando biocatalisadores esféricos, e iso1 acento dc produto

Pérolas de biocatalisador cora 10% de ácido silícico são produzidas a partir de 573 g de sedimento bacteriano de acordo com o Exemplo 1 exceptuando o facto de, em vez de uma seringa, se usar um dispositivo consistindo numa bomba de engrenagem (taxa de fluxo 1,4 l/hora; pressão aproximadamente 0,5 bar) e usa-se um chuveiro de jacto-7 tendo capilares com 0,6 mm para a formação de goticolas. A fim de aumentar a frequência de queda e para influenciar o tamanho das goticolas, cada capilar tem um canal de administração de ar separado. Após retracção (encolhimento) e endurecimento numa solução de tripolifosfato de sódio a 3% (p/v), obtem-se aproximadamente 4 litros (volume de massa) de pérolas a partir de 573 de sedimento bacteriano.

ácido 2-(R>—hidroxi—4-fenilbutírico é preparado de um modo análogo ao do método indicado no Exemplo 3. Os 4 litros (volume de massa) das pérolas de biocatalisador com 10% de ácido silícico são separados do banho para ligação cruzada de tripolifosfato de sódio e são adicionados a 6 litros de uma solução de 100 mM (3,62% p/v) de tripolifosfato de sódio pH 7,0, 1Θ0 mM de formato de potássio e 1 mM de carbamoiImeti1viologénio que foi préviaroente gaseificada com azoto. As pérolas permanecem nesta solução de redução, sob vácuo tendo como finalidade a desgaseificação, até se obter uma cor completamente violeta. As pérolas são então introduzidas numa coluna para cromatografia (diâmetro

-n interno 11,3 cm, área Pa base IVé cm, comprimento 60 cm, altura da camada 40 om). A solução substrato (100 mM de tampão tripolifosfato ds sódio pH 6,7, 112,2 mM de ácido 2-oxo—4-fenilbutírico,

30Θ mM de formato de potássio, 1 mM de carbamoi1 meti 1vio1ogénio), qua tinha sido praviamants gaseificada com azoto, é filtrada em condições de esterilidade e feita passar continuamente através da coluna por meie ds uma bomba da medição sob uma pressão de excesso de 2,0 a 3,0 bar com uma taxa de fluxo inicial de 2,5 l/hora„ □ grau ds conversão, medido por CLEF’, é > 99,57.. A coluna é operada dia e noite, sem .interrupção, à temperatura ambiente, isto é a cerca ds 23 a 23,0-2, grau de conversão é monitorizado por meio de análise CLEF' diária s α·=> valores de conversão são mantidos > 99,57. por regulação da velocidade da bomba. Após 25 dias, foi convertido um total de cerca de SCO litros da solução ds reacção (grau médio de conversão 99,62) e a taxa de fluxo mantem-se ainda com um valor de 1 litro/hora.

'1160 litros de solução de reacção convertidos são misturados com 25© litros de acetato de etilo e ajustados para pH 2,6 com 114 litros de acido ortofosfórico a 42,52, 0 ácido 2-(R5-hidroxi-4-feni1butírico é extraído para acetato de etilo com um rendimento ds 942, D ácido 2-(R)-hidroxi-4-feni1butírico que permaneceu na fase aquosa é pósteriormer»te extraida com duas porções de 120 litros de acetato de etilo. Após os tr'ê's passos de extracção, a extracção do ácido 2-CR)-hidroxi-4-feni1butirico fica completa (99,32). Após combinação das três fases de acetato de etilo (volume total 450 litros), adição de 252 litros de acetato· de etilo e remoção de 4/0 litros do solvente por destilação, a solução è filtrada até à transparência através de um filtro com uma placa. 5© litros de acetato de etilo são usados para a lavagem do filtro sendo adicionados à solução transparente. Após remoção cie 200 litros do solvente por destilação, o

volume final da solução è de SO litros. 4 @õ litros de c i c. 1 o hexano removidos por destilação. A centrifugação do produto, que cristã— constante proporciona '23,4 kq de ácido 2— (R> —hidroxi—4—fenilbutí— r i c o .

A fim de verificar a pureza enantiomérica, uma amostra do ácido cristalino é dissolvida em etanol absoluto e reagida com gual é analisado por CLEP a te. Após remoção do álcool por destilação e uma curta desgaseificação sob um vácuo elevado, permanece um óleo amarelo claro o -V o/ vu uar sobre uma coluna qui.ral . 7. d i e t i 1 am i n a ) /diâmetro interno 2‘οΘ x 4,6 mm, taxa de fluxo 1 ml/min, estacionária Chiralcel OD CStehelin, Baslel tipo OD-5-15-/ fase móvel; SO/Í hexano - 107C isopropanol — 0 substâncias a ser analisadas estão presente concentracão de 1 mq/ml (quantidade injeotada 1Θ ul). A varredu ci i=;

( scanninq ¹¹ > é realizada a um comprimento aval iacão é feita oor comoaracão da áre padrão externo. 0 valor ee encontrado é >

d a suρer f ície c om

Claims

Reivindicacões

I^a. - Processo para a produção de um biocatalisador esférico com elevada resistência mecânica compreendendo material enzimaticamente activo, um polielectrólito catiónico, aniões polivalentes e ácido silícico, caracterizado por o material enzimaticamente activo ser misturado com ácido silícico precipitado sob uma forma sólida, uma solução de tampão aquoso e uma solução aquosa de um polielectrólito catiónico a fim de se formar uma suspensão, evitando-se entretanto a formação de espuma, a suspensão ser introduzida gota a gota num banho para ligação cruzada aquoso contendo aniões polivalentes e as pérolas de biocatalisador resultantes serem contraídas e solidificadas no banho para ligação cruzada, e facultativamente separadas do banho para ligação cruzada.
2^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender o evitar a formação de espuma, através da realização do processo de mistura na presença de ácido silícico .
3^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por se utilizar quitosano em solução aquosa tendo uma viscosidade variando entre 1 e 20 Pa's como polielectrólito catiónico.
4⁴. - Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a relação em peso entre o ácido silícico e o polielectrólito catiónico variar entre 1,5 a 50:1.

reiνίπ5â. - Processo de acordo com qualquer uma das dicaçees 1 a 4, carac teci zado por a. concentração final na suspensão consistindo em material enzimaticamente activo, ácido sslící™ co, solução tampão e polielectrólito catiónico variar entre 2 e 15% <p/p) para o ácido silícico e entre O,3 e 1,5% Cp/p) para o electrólito catiónico.

63. - Processo da acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por o anião polivalente no banho para ligação cruzada ssr tripolifosfato.
7ã. - Processo de acorde; com a reivindicação 6, caracterizado por se utilizar ácido tripolifosfórico ou um seu sal no banho para ligação cruzada numa concentração variando entre 0,5 e 1.0% íp/v)„

Gã. - Processo de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado por o volume do banho para ligação cruzada ter um valor de pelo menos cerca de três vezes o volume da suspensão de material enzimaticamente activo, ácida silícico, solução tampão e ρ o 1 i e 1 e c t r ό 1 i t o c a t i ón ico.
9â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 para a produção de um biocatalisador esférico, caracterizado por o material enzimaticamente activo do biocatalisador consistir em células totais, fragmentos de células ou organelas celulares de um microorganismo, ou em enzimas ou. em qualquer combinação destes tipos de material enzimaticamente activo,

105., — Processo de acordo com a reivindicação 1 para a produção de um biocatalisador esférico, caracterizado por o ?·Ρ

ί η a t e r ί a 1 e η z i m a t i .camente activo do biocatalisador consistir em . 1 .. -U .í_ .· _ _c ? bactéria ou levedura.

1 1 3 , - Processo de acordo com a reivindicação 10 para a produção de um biocatalisador esférico, caracterizado por a bactéria pertence ?r ao pénero Proteus.

12é,, - Pru..«55u de acordo com a reivindicação 11 para « produção de um b i o c a t a 3. i s a d c< r e s f é r i c o, c a r a eter i. c a. d o o o r a bactéria pertença :·>·“ i ÍS F' r í j u 3 V. Ξ- ΆΐΙ^δΓΙΞ S/OG à. cBG-LiB Proteus mirabi lis

13=*«. - Processo da acordo com a reivindicação 1 para a crodução de um b i r _a t a 1 i a d o r & s f é r i r η, c a r a c t e r i c a d o o o r o material enzimat; .camente activo do biocatalisador conter oxido- —r e d u c t a s e o u é c 3Xido-reductase.

i 4 =* ~ í“ Γ i.j i_. bo G <_’ G f -ci C Γ ÍJ O L.cJiU ci Γ* SílVli ί Ό 3. ci Lr ci i_» .1 p5. Γ* ct ci p r o d u ç S o d e u m b i. a c a t a 1 i s a dor es f é r i c o, c a r a o t e r i z a d ο ρ o r o bíOCSuâ I Í SâdOT CC inter quitosano como polielactrólito catiónico.

15é. -- Processa de acordo com a reivindicação 14 para a produção de um biocatalisador esférico, caracterizado por o q u i t o s a η o t e r u m peso molecular que varia entre aproximadamente 50„00ã e aproxime ida.,ΤίΕ’Π b-3 3 « 000 000 „ 16 3» Processo de acordo com a reivindicação 1 para a produção do i.ifõ biocata1isador esférico, caracterizado por o b i o c a t a, 1 i s a. □ o r c c inter aniSes inorcãnicos polivalentes como aniSes pG 1 .1. v -A 2 tu’> ι c.—¹ o «

17ã. - Processo de acordo com a reivindicação 16 para a produção de u.m biocatal isador esférico, caracterizado por os aniões inorgân icos serem or tof osf ato, aietaf osf atos pirof osf atos, po1ifosfatos ou cianoferratos.

ISs. - Processo ds acordo com a reivindicação 17 para a produção de uai biocata 1 isador esférico, caracterizado por os aniões inorgânicos sarem triρο1ifosfato.

19é. - Processo de acordo com a reivindicação 1 para a produção ds um biocatalisador esférico, caracterizada por a biocatalisador conter aniSes orgânicos polivalentes como aniSes po1iva1en tes»

20s. - Processo de acordo coai & reivindicação 19 para a produção de um biocata1isador esférico, caracterizado por os aniões orgânicos serem carboxilatos orgânicos poliméricos, sulfonatos ou compostos hidroxi.

21â. - Processo de acordo com a reivindicação 1 para a produção de um biocatalisador esférico, caracterizado por o ácida silícico do biocatalisador ser um ácido silícico precipitado.

321. - Processo de aoordo oom a reivindicação 21 para a produção de um biocatalisador esférico, caracterizado por o ácido silícico precipitado tem um tamanho médio de particula variando entre 5 e 50 pm e uma densidade de massa média variando entre 5 e 1õy g/100 m1„ .wS· . r recesso cara a conversão de subsiáncias orçam — cas, caracterizado por se utilizar para a conversão

Uil!

y— que foi produzido oor uo processo biocatalisador esfquicc acordo com qualquer uma das raivindicaçoes 1 a 2' de

245. - Processo para a produção de ácidos u-nidroxίο arboxί1ico a partir de ácidos a-cetóniccs, caracterizado por se utilizar pare a conversão um biocatal isador esférico que foi produzido por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13.

253» - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por ser utilizado para a produção de ácido 2-hidrox i--4~'f sn i 1 but í r ico a partir de ácido 2-oxo-4~feni1butírico.

263» - Processo de acordo oom a. reivindicação 24 ou 25 para a produção tíe ácido 2-(R)-hidroxi-4-feni1butírico a partir de ácido 2-oxõ-4-f en i 1 Pu t i r ico ,, carac ter í. zado oor os biocatal isadores esféricos serem utilizados num reactor ds leito fixo através do qual ss faz passar continuamente uma solução aquosa do substrato ácido 2-oxo-4—feni1butírico, formato e um mediador de e1actrSes.