DK173712B1 - Biokatalysatorer samt fremgangsmåde til fremstilling deraf og fremgangsmåde til fremstilling af alfa-hydroxycarboxylsyrer - Google Patents

Description

i DK 173712 B1

Opfindelsen angår perleformede biokatalysatorer med høj mekanisk styrke, en fremgangsmåde til fremstilling deraf samt fremgangsmåde til fremstilling af tx-hydroxycarboxylsyrer 5 ved hjælp af biokatalysatorerne ifølge opfindelsen.

Begrebet biokatalyse omfatter i bredeste betydning alle former for katalyse, ved hvilke det aktiverende stof er et biologisk system, f.eks. hele celler, cellefragmenter eller celleorganeller, eller stammer fra et biologisk 10 system, f.eks. enzymer. Enzymer er forbindelser, sædvanligvis proteiner eller glycoproteiner, der specifikt accelererer biokemiske reaktioner, idet de nedsætter aktiveringsenergien. I det følgende betegner udtrykket biokatalysator ikke blot det aktiverende stof selv, men 15 kan eventuelt også omfatte komponenter, der anvendes til immobilisering, holdbarhed, regenerering osv. af det aktiverende stof.

Immobiliserede, dvs. i deres bevægelighed indskrænkede biokatalysatorer er især egnede til industrielle formål.

20 Ved immobiliseringen bliver det muligt at udføre de katalyserede processer kontinuerligt og gentaget, at skabe og opretholde høje biokatalysatortætheder, at opnå høje tids-rum-udbytter og at sænke omkostningerne for udvinding af produktet fra reaktionsopløsningen.

25 Det biokatalytiske materiale kan til immobilisering eksempelvis indesluttes i polymere overtræksstoffer (matrix), i kapsler eller fibre af semipermeable membraner eller bag ultrafiltreringsmembraner, tværbindes med bi- eller multifunktionelle reagenser eller ved adsorption eller 30 ionisk eller covalent binding fikseres på bærere af uorganisk materiale eller naturlige eller syntetiske polymere. Også en kombination af disse metoder er mulig.

Ved immobiliseringen må på den ene side den størst mulige bevaring af den biokatalytiske aktivitet og på den anden 2 DK 1:7 571 2 B1 side høj mekanisk styrke og kemisk: stabilitet, men s-rr-tidig også god permeabilitet for biokatalysatoren sikre s.

En gængs immobiliseringsmetode er eksempelvis indeslutnirg 5 ("entrapment”) af det biologisk aktive materiale i en matrix af naturlige polymere, såsom cellulose, ag-i, gelatine og andre, eller af syntetiske polymere, såscm polyaerylamid, po lyurethaner, epoxyharpikser og andre.

Særlig skånende er immobiliseringen ved ionotrop geldcΓΙΟ nelse (ionisk tværbinding af matricestofferne), hvori il der som overtræksmateriale eksempelvis egner sig naturl i ce polyanioner, såsom alginat, pektin, carrageenan og andt e.

Ved inddrypning eller indsprøjtning af en suspension af enzymatisk aktivt materiale og en vandig opløsning af 15 matricestoffet i en vandig tværbindingsopløsning, c er indeholder polyvalente modioner, f.eks. Ca2+, Co2+, Zn:<+,

Fe2 + , Fe^ + , Al-3+ og andre, opnås chelatisering og dan nelse af perleformede biokatalysatorer.

Ved den ionotrope geldannelse af organiske polymere :iås 20 som regel kun relativt bløde, mekanisk ustabile immobil i -sater, der har tendens til kvældning og deformation, således at f.eks. deres anvendelse i fyldlegemereaktorar, således som de hyppigt anvendes industrielt til enzymatiske reaktioner, giver vanskeligheder, Hærdningsmetoder ve3 25 efterbehandling af immobilisaterne eller ved forbehandling af det biologisk aktive materiale før tilsætninga i til geleringsmidlet, i hvert tilfælde med multi -funktionelle tværbindingsreagenser, såsom polyaldehyder, f.eks. glutaraldebyd, eller isocyanater, f.eks. hexama-30 thylendiisocyanat, kan på grund af deres celle- og/ellar enzymbeskadigende virkning kun anvendes meget begrænset.

Et alternativ er anvendelsen af uorganiske stoffer, f.eks. den i tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.520.001 beskrevne fremgangsmåde, der afslører immobiliseringen af enzymatisk 35 materiale ved hjælp af silikasol og alginat. Også tørrinj og skrumpning af biokatalysatorperlerne anvendes tit hærdning, da perlerne efter genbefugtning ikke atter kai DK 173712 B1 3 indtage deres oprindelige fugtige rumfang og forbliver hårdere. Tysk offentliggørelsesskrift nr. 2.835.875 beskriver en fremgangsmåde til ionotrop geldannelse under 5 anvendelse af polyanioner, f.eks. natriumalginat, og eksempelvis calciumioner som tværbindingsmiddel, ved hvilken de med enzymatisk stof ladede biokatalysatorperler tørres ved en temperatur indtil 80°C. Sådanne tørringstrin kan dog ikke altid gennemføres, når højfølsomme enzymer 10 eller enzymsystemer, især levende celler, skal immobili-seres, da de høje temperaturer ved tørringen eller den tørre tilstand inaktiverer cellerne eller enzymerne.

Endnu en ulempe ved de ved ionotrop geldannelse fremstillede calciumalginat-immobilisater er foruden de dårlige 15 mekaniske egenskaber også indskrænkningen i mulige reaktionsmedier ved den videre forarbejdning. Sådanne immobi-lisater er f.eks. kemisk ustabile i nærvær af ioner, som de gængse pufferopløsninger indeholder, såsom natrium eller kalium. I sådanne elektrolytopløsninger, især når de 20 er højkoncentreret, fortrænges f.eks. de gelstyrkende calciumioner i calciumalginat-geler, fordi natrium- og kaliumioner konkurrerer om alginatanionen. Også phosphat-ioner fører efterhånden til opløsning af calciumalginat-biokatalysatorperler, da phosphater reagerer med calcium 25 og unddrager alginatet det strukturstyrkende middel. Opløsningen kan hindres, når der som matricestoffer anvendes polykationer, f.eks. chitosan, der tværbindes med polyvalente anioner, såsom [Fe(CN)g]3-, [Fe(CN)g]4-, polyphosphater og lignende. De tyske patentskrifter nr.

30 3.005.632 og 3.005.633 beskriver fremstillingen af biokatalysatorperler under anvendelse af chitosan og K3[Fe(CN)g ]. Fremgangsmåden ifølge tysk patentskrift nr. 3.005.632 indeholder til hærdning af perlerne et tørringstrin ved en temperatur indtil 80°C. For at muliggøre 35 immobiliseringen af høj følsomt enzymatisk stof, indeholder fremgangsmåden ifølge tysk patentskrift nr. 3.005.633 ikke dette tørringstrin, hvilket dog fører til en ringere 4 DK 1 73712 B1 mekanisk styrke af biokatalysatorperlerne.

Det er den foreliggende opfindelses opgave af stills 5 perleformede biokatalysatorer til råd.:kjhed, der har høj mekanisk styrke, hvis stabilitet også er sikret ved anvendelse af da gængse biologiske opløsninger og puffersystemer, og som endvidere sikrer høj følsomt enzymatisk aktivt 10 materiales enzymatiske aktivitet.

Endvidere er det opfindelsens opgave at påpege egneda fremgangsmåder til fremstilling af sådanne biokatalysatorer.

15

Som særlig egnede til løsning af disse opgaver viser sig perleformede biokatalysatorer, der indeholder enzymatisk aktivt materiale, ©n kationisk polyelektrolyt, fortrinsvis chitosan, polyvalente anioner og kiselsyre. Sådanne bioka-20 talysatorperler fremstilles i fast form ved en skånende immobiliseringsfremgangsmåde ved ionotrop geldannelse og ved anvendelse af kiselsyre og fremstilles ud fra en suspension af det enzymatisk aktive materiale, kiselsyren, pufferopløsning og polyelektrolytten, hvori slutkon-25 centrationen af kiselsyre ligger i et interval mellem 2 og 15 vægt-%.

Opfindelsen angår perleformede biokatalysatorer med høj mekanisk styrke omfattende enzymatisk aktivt materiale, ei 30 kationisk polyelektrolyt og polyvalente anioner, som er ejendommelige ved, at biokatalysatorerne ifølge opfindelsen indeholder kiselsyre og fremstilles ud fra en suspensior af det enzymatisk aktive materiale, kiselsyren, pufferopløsning og polyelektrolytten, hvori slutkoncentrationen cif 35 kiselsyre ligger i et interval mellem 2 og 15 vægt-%.

DK 173712 B1 5

De perleformede biokatalysatorer ifølge opfindelsen er karakteristiske ved høj mekanisk styrke, hvilket kan føres tilbage til udviklingen af en Dual-gelmatrice-struktur. De har derfor gode pakningsegenskaber, eksempelvis ved fyld-5 ning af en reaktionsbeholder, og kan anvendes som fyldmateriale til fastiejereaktorer. På grund af de milde , immobiliseringsbetingelser, der ikke omfatter noget tørringstrin eller en behandling med skadelige stoffer, er biokatalysatorerne ifølge opfindelsen navnlig egnede til 10 højfølsomt materiale, især til levende celler. Fremstillingen af de perleformede biokatalysatorer ifølge opfin- . delsen ved anvendelse af kiselsyre i fast form har i forhold til de fra teknikkens standpunkt kendte fremgangsmåder de fordele, at tids- og omkostningskrævende frem- 15 gangsmåder til forberedelse af de ved hærdningstrinnet anvendte tværbindingsmidler undgås. Endvidere kan biokatalysatorerne anvendes i puffersystemer, der indeholder ioner, der fører til opløsning af alginat-geler. Således kan biokatalysatorerne ifølge opfindelsen 20 eksempelvis anvendes i opløsninger, der indeholder, phosphationer, f.eks. i den meget billige og derfor til | industrielle formål fordelagtige tripolyphosphatpuffer. De perleformede biokatalysatorer ifølge opfindelsen egner sig til omsætning af organiske stoffer. Da de kan anvendes til 25 reaktioner, der kræver høje elektrolytkoncentrationer, egner biokatalysatorperler ifølge opfindelsen, der indeholder en bakterie af slægten Proteus eller en oxidoreduktase som enzymatisk aktivt materiale, sig eksempelvis til fremstilling af α-hydroxycarboxylsyrer ud 30 fra α-ketocarboxylsyrer, f.eks. af 2-(R)-hydroxy-4-phenyl-smørsyre ud fra 2-oxo-4-phenylsmørsyre.

De perleformede biokatalysatorer ifølge opfindelsen har 35 høj mekanisk styrke. Ved høj mekanisk styrke forstås eksempelvis høj trykstyrke, dvs. at biokatalysatorperler DK 173712 B1 6 ifølge opfindelsen med en gennemsnitlig størrelse på ca. 3 mm ved en belastning på 0,01 til 0,03 N, isser 0,02 N, efter et til fem minutter har en maksimal deformation på 30 til 50 μπι, især 40 μτη, og efter 10 til 20 minutter, ' ^ især 15 minutter ikke udviser yderligere deformations- tilvækst.

Arten af det enzymatisk aktive materiale, som biokataly-, satorerne ifølge opfindelsen omfatter, er bestemt af den reaktion, hvortil biokatalysatorerne skal anvendes. Det består fortrinsvis af hele celler, cellefragmenter eller celleorganeller af en mikroorganisme, af enzymer eller af en vilkårlig kombination af disse arter enzymatisk aktivt 15 materiale.

Mikroorganismen kan være af prokaryot eller eukaryot natur. Egnede mikroorganismer er eksempelvis - en bakterie, f.eks. en mælkesyrebakterie (Leuconostoc, 2Q Streptococcus, Lactobacillus), Corynebacterium,

Streptomyces, Pseudomonas, Xanthomonas, Bacillus, Clostridium, Escherichia, Proteus osv., p en svamp, f.eks. Mucor, Aspergillus, Penicillium, især gærarter, såsom Saccharomyces, Candida osv., __ - en alge, f.eks. Chlorella, Curvularia osv., eller Z o - en plantecelle, f.eks. Catharanthus roseus, Daucus carota, Digitalis lanata, Morinda citrifolia osv. .

Anvendelsen af hele celler, cellefragmenter eller celle-30 organeller, dvs. med membraner overtrukne eller af membransystemer bestående celleunderenheder (chloroplaster, thylakoider, mitochondrier osv.), som enzymatisk aktivt materiale er fordelagtig, når den reaktion, der skal katalyseres, kræver et multienzymsystem, f.eks. når 35 cof aktorer (pyridin- eller f lavinnukleotider osv.) er nødvendige, eller når der i stedet for et katabolsk 7 DK 173712 B1 produkt af en biosyntese f.eks. skal fremstilles et sekundært produkt, hvortil komplicerede stofskiftekæder er nødvendige.

5

Som enzymatisk aktivt materiale er også isolerede enzymer egnede. Typiske eksempler på sådanne enzymer er oxidore-duktaser (laktatdehydrogenase, alkoholdehydrogenase, glu-coseoxidase og andre), transferaser (hexokinase, glutamin- 10 transaminase og andre), lyaser (fumarase, aspartase og. andre), isomeraser (glucoseisomerase, mannoseisomerase og andre), ligaser (glutathionsyntetase, NAD-syntetase og andre) osv.

15 Som enzymatisk aktivt materiale kan biokatalysatorerne ifølge opfindelsen også omfatte en vilkårlig kombination af de beskrevne arter enzymatisk materiale, eksempelvis en kombination af hele celler af to eller flere arter eller stammer af mikroorganismer eller en kombination af hele 2 0 celler og enzymer. Grundtanken er kompletteringen af en celles biokatalytiske egenskaber med yderligere enzymer, der ikke eller kun i ringe mængde er til rådighed i cellen.

25 Som enzymatisk materiale foretrækkes især hele celler af en bakterie eller en gærart, fortrinsvis en bakterie af slægten Proteus, især en bakterie af arten Proteus vulga-: ris og/eller arten Proteus mirabilis. Især foretrækkes arten Proteus vulgaris, f.eks. Proteus vulgaris ATCC 9484.

30 Ligeledes foretrækkes især et enzymatisk aktivt materiale, der indeholder en oxidoreduktase eller er en oxidoreduk-tase.

35 8 DK17J712B1

Den kationiske polyelektrolyt er en naturlig eller syntetisk polymer eller en naturlig polymer efter kemisk modifikation, eksempelvis en polymer med protoniserede aminogrupper, fortrinsvis chitosan ([ 2-amino-2-deoxy- 5 1-+4 )-(?-D-glucopyranan; poly-( 1,4-0-D-glucopyranosainin ]).

Chitosan er en lines;r polymer med høj nolvægt af glucos-amin-underenheder, der fås ud fra chitin ved delvis deacetylering ved hjælp af koncentreret base og varme.

Chitin er vidt udbredt i naturen, f.eks. i marine! 10 invertebrater, insekter og svampe. Til produktion af! chitosan anvendes sædvanligvis chitin fra krabber, rejer, 1 hummere osv.. De perleformede biokatalysatorer ifølge opfindelsen omfatter fortrinsvis chitosan med en molvægt fra ca. 50.000 til ca. 3.000.000.

15

Som polyvalente anioner er polyvalente uorganiske eller polyvalente organiske anioner egnede. De uorganiske anioner er fortrinsvis orthophosphat, metaphosphater, f.eks. hexametaphosphat, pyrophosphater, polyphosphater, 20 f.eks. tri-, tet'ra- eller octapolyphosphat, eller cyano-ferrater, f.eks. [Fe(CN)gJ4- eller [Fe(CN)g]^“· Især foretrækkes tripolyphosphat. De organiske anioner er fortrinsvis polymere organiske carboxylater, sulfonater eller, hydroxyforbindelser„ 25

Sotn kiselsyre egner sig fortrinsvis en fældet kiselsyre, især en fældet kiselsyre med en gennemsnitlig kornstørrelse i området fra. 5 til 50 μπι og en gennemsnitlig rumvægt i området fra 5 til 100 g pr. 100 ml, især fra ca. 20 30 til 50 g pr. 100 ml.

Endvidere angår opfindelsen en fremgangsmåde til fremstilling af de perleformede biokatalysatorer ifølge opfindelsen med 35 høj mekanisk styrke, som er ejendommelig ved, at enzymatisk aktivt materiale biar.des til en suspension med fældet kisel- DK 173712 B1 9 syre i fast form, en vandig pufferopløsning og en vandig opløsning af en kationisk polyelektrolyt, idet skumdannelse undgås, suspensionen dråbevis indføres i et vandigt tværbindingsbad, indeholdende polyvalente anioner, og de fremkomne 5 biokatalysatorperler bringes til at skrumpe ind og stivne ved at forblive i tværbindingsbadet i mindst ca. 1 time, hvorpå de eventuelt skilles fra tværbindingsbadet.

Undgåelse af skumdannelse ved fremstilling af suspensionen 10 af enzymatisk aktivt materiale, fældet kiselsyre i fast form, vandig pufferopløsning og en vandig opløsning af en kationisk polyelektrolyt er af afgørende betydning, da der ellers sotn følge opstår katalysatorperler med dårligere^ mekanisk® egenskaber. Fortrinsvis undgås skumdannelse ved, 15 at blandingen af de forskellige komponenter sker i nærværelse af kiselsyren. Ellers er den rækkefølge, i hvil-; ken stofferne bringes sammen, ligegyldig. Fortrinsvis' blandes det enzymatiske materiale først med kiselsyren i fast form, først derpå optages i vandig pufferopløsning, 20 og derefter blandes med opløsningen af den kationiske polyelektrolyt.

Ved fremstillingen ifølge opfindelsen af biokatalysator-25 perler anvendes enzymatisk materiale som beskrevet ovenfor, dvs. hele celler, cellefragmenter eller celleorga-neller af en mikroorganisme eller enzymer eller en kombination deraf. Hele celler kan derved foreligge levende, døde eller eksempelvis lyofiliserede eller dehydrerede.

30 Dyrkningen af celler i et næringsmedium, der indeholder alle til opretholdelse af cellestofskiftet og til formeringen nødvendige organiske og uorganiske bestanddele (C-kilde, N-kilde, sporelementer, vækststoffer osv.), og' cellefragmenteringen til fremstilling af cellefragmenter 35 eller isolering af celleorganellerne sker ved i og for sig kendte metoder. Enzymer, der skal immobiliseres, forelig- DK 173712 B1 10 ger eksempelvis opløst, dispergeret, suspenderet, emulgeret eller tørret. Det nævnte og i det foregående nærmere definerede enzymatisk aktive materiale anvendes eksempelvis til fremgangsmåden ifølge opfindelsen scrr 5 celle-, cellefragment- eller celleorcfanelsediment, -filtrat eller -suspension eller som enzym i vandig opløsning. I sammenhæng med den foreliggende beskrivelse betyder udtrykket "i vandig opløsning", at opløsningen yderligere kan indeholde uorganiske eller organiske salte i 10 og lignende. Det kan eksempelvis dreje sig om en gænc ε biologisk puffer, såsom acetat-, phosphat-, tris-puffer cg lignende.

Som vandig pufferopløsning egner sig eksempelvis biole -15 giska puffere i et pH-interval fra pH 3 til 7, fortrins -vis ca. 5, f.eks. phosphat-, citrat- eller acetatpuffer.

De kationiske polyelektrolytter, der kan anvendes v=c fremgangsmåden ifølge opfindelsen, er beskrevet i dsi 20 foregående. Chitosan foretrækkes. Chitosan må til arvendelse til fremstilling af biokatalysatorperlerne før:= t bringes i vandig opløsning for at udgøre integrerende bestanddel af immobilisatet. Dertil optages chitosan, der i ikke-protoniseret: form er vanduopløselig, i fortyndere 25 vandige, især organiske, syrer, eksempelvis i myresyre, eddikesyre, pyrodruesyre, æblesyre, citronsyre eg lignende, fortrinsvis i eddikesyre, ved en pH-værdi i , fortrinsvis pH 4 til 5,5, og opvarmes eventuelt til ce .

60°C for at støtte opløsningsprocessen. Chitosanopløs-30 ningen filtreres derefter til fjernelse af uopløselice bestanddele. Til fremstilling af biokatalysatorperlerne; ifølge opfindelsen anvendes fortrinsvis en vandig oplø;-. ning af chitosan med en viskositet i området fra 1000 20.000 cP i en koncentration i området fra 0,5 til 5 vægtprocent. Især foretrækkes anvendelsen af en vandig opløsning af højviskøst chitosan med en viskositet på ca.

10.000 cP i en koncentration på ca. 1,4 vægtprocent.

DK 173712 B1 11

De anvendte stoffer anvendes fortrinsvis således, at vægtforholdt mellem kiselsyre og kationisk polyelektrolyt ligger i et område fra 1,5-50:1, især ved ca. 15:1. Slut-koncentrationen af kiselsyre i den ovenfor beskrevne 5 suspension ligger i et område fra 2 til 15 vægtprocent, f.eks. 10%. Foretrukne slutkoncentrationer af kationisk polyelektrolyt i den ovenfor beskevne suspen- sion er 0,3 til 1,5 vægtprocent, især ca. 0,7%.

10 Den kiselsyre, der anvendes til fremstilling af biokatalysatorperlerne ifølge opfindelsen, er beskevet ovenfor.

Den anvendes i fast form.

Ved tværbindingsbadet drejer det sig om en vandig opløs-15 ning af en polyvalent anion. De mulige anioner er beskrevet i det foregående. Dé^anvendes til tværbindingsbadet" i form af syrer eller som salte, f.eks. som alkalimetalsalte, eksempelvis natrium- eller kaliumsalte, endvidere også som ammoniumsalte. En vandig opløsning fore- 20 trækkes, til hvilken tripolyphosphorsyre eller et salt deraf, f.eks. natrium- eller kaliumtripolyphosphat, anvendes. I tværbindingsbadet foreligger de nævnte forbindelser eksempelvis i en koncentration i området fra 0,5 til 10% (v/r), fortrinsvis fra 1,5 til 3% (v/r).

25 Tværbindingsopløsningens pH-værdi ligger i et område fra pH 5 til 10, fortrinsvis på ca. pH 8.

Suspensionen af enzymatisk aktivt materiale, kiselsyre, pufferopløsning og polykation dryppes under omrøring til 30 tværbindingsopløsningen, hensigtsmæssigt således, at tværbindingsbadets rumfang udgør mindst det tredobbelte af suspensionens rumfang. Den dråbevise tilsætning sker under anvendelse af en dyse med en lille åbning, eksempelvis en injektionssprøjte, en sprøjtelignende injek-35 tionsindretning, en porøs plade eller et lignende egnet middel. Dråberne blæses eventuelt af dysens spids under DK 17:ϊ712 B1 anvendelse af komprimeret luft, komprimeret nitrogen eller lignende. Suspensionen kan også indsprøjtes i tværbindingsopløsningen, eksempelvis under anvendelse af ni; atomiseringsappetrat, fortrinsvis et trykatomisering: s-apparat.

De ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde fremstilletU 5 biokatalysatorperler forbliver mindst ca. en time, f.eks. ! natten over i tværbindingsbadet til indskrumpning og hærd- ! ning. Eventuelt skilles de fra tværbindingsbadet vue. gængse, til adskillelse af faste og flydende faser egneik metoder, såsom dekantering, filtrering osv., og underkas- 10 tes før den yderligere anvendelse en fysiologisk vaskeproces, eksempelvis med fysiologisk natriumchloridopløsning.

Perleformede biokatalysatorer med høj mekanisk styrke, dei fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ei 15 ligeledes genstand for opfindelsen. : 2o Opfindelsen angår desuden fremgangsmåder til fremstilling af a-hydroxy carboxyl syrer ud fra α-ketocarboxylsyrer, son er ejendommelige ved, at der til omsætningen anvendes perle-formede biokatalysatorer ifølge den foreliggende opfindelse, 25 Alt efter arten af det immobiliserede enzymatisk aktiva materiale er produktionen af et bredt spektrum af produkter mulig, der opstår ved fermenteringsprocesser, i primærstofskiftet, ved mikrobiel transformation osv., eksempelvis af 30 - kemikalier, f.eks. citronsyre ved Aspergillus niger, ethanol ved Zymomonas mobilis, L-æblesyre ved fuma-rase, H2 ved Chlorella-Clostridie-coimmobilisater, næringsmidler, f.eks. sojasauce ved Pediococcus hale-: philus, 35 - enzymer, f.eks. amylaser ved Aspergillus niger, medikamenter, f.eks. penicilliner ved Penicillin ir. chrosogenum, eller aminosyrer, f.eks. L-asparaginsyre ved L-aspartase.

DK 173712 B1 13

Fremgangsmåder til fremstilling af a-hydroxycarboxylsyrer ud fra cx-ketocarboxylsyrer ved hjælp af biokatalysatorer ifølge opfindelsen, hvis enzymatisk aktive materiale indeholder en oxidoreduktase, er en oxidoreduktase eller 5 består af hele celler af en bakterie af slægten Proteus, især arterne Proteus vulgaris og/eller Proteus mirabilis, fortrinsvis Proteus vulgaris, foretrækkes. Reduktionen af substratet sker derved med den såkaldte finale reduktase, f.eks. en substratspecifik dehydrogenase. Sædvanligvis 10 leveres de reduktionsækvivalenter, som den finale reduktase behøver, af et coenzym, f.eks. af pyridinnukleoti-der, såsom nikotinamidadenindinukleotid(phosphat) (NADH, NADPH) eller af flavinnukleotider, såsom flavinmononukleo-tid (FMNH) eller flavinadenindinukleotid (FADH). De redu-15 cerede nukleotider opstår atter f.eks. ved elektronoverførsel over naturlige eller syntetiske elektronmediatorer med egnet redoxpotentiale, såsom ferredoxin eller bipyri-dyliumderivater, f.eks. 4,4'-bipyridyliumderivater (Violo-gen) eller 2,2'-bipyridyliumderivater (eksempelvis diquat-20 kationer, såsom diquat-dibromid eller diquat-dichlorid).

Der kendes også finale reduktaser, der kan optage elektronerne direkte fra mediatorerne.

25 Især foretrækkes en fremgangsmåde til fremstilling af 2-hydroxy-4-phenylsmørsyre, fortrinsvis af 2-(R)-hydroxy- 4-phenylsmørsyre, ud fra 2-oxo-4-phenylsmørsyre ved hjælp af biokatalysatorerne ifølge opfindelsen, hvis enzymatisk aktive materiale indeholder en oxidoreduktase eller er en 30 oxidoreduktase eller består af hele celler af en bakterie af slægten Proteus, især af arterne Proteus vulgaris og/-eller Proteus mirabilis, fortrinsvis Proteus vulgaris.

2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyre er et værdifuldt mellemprodukt ved fremstillingen af ACE, angiotensinomdannende 35 enzym-("angiotensin converting enzyme")-inhibitorer eller deres forstadier. Dennes klasse aktive stoffer har i de 14 DK 1 7 Ϊ712 B1 forløbne år fundet voksende interesse:. Den udvider de t:.l rådighed stående antihypertensivas potentiale og dermed de terapeutiske muligheder ved bekæmpelsen af højt blodtryk.

Af særlig interesse er derved fremstillingen af ACE-ha;n-5 meren 3-{[ l-ethoxycarbonyl-3-phenyl-(lS)-propyl ]amino'>- 2,3,4,5-tetrahydro-2-oxo-lH-l-(3S)-ben:iazepin-l-eddike-syre-monohydrochlorid (= Benazepril).

Opfindelsen angår især en fremgangsmåde til fremstilliiu'j 10 af 2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyre ud fra 2-oxo-4-pheny L··' smørsyre, som er ejendommelig ved, at perleforme· kil biokatalysatorer ifølge opfindelsen, hvis enzymati sk: aktive materiale består af hele celler af en bakterie r.:\ slægten Proteus, især af arterne Proteus vulgaris og/eller.· 15 Proteus mirabilis, fortrinsvis Proteus vulgaris, anvend i en fastleje- eller hvirvellagsreaktor, fortrinsvis i sn! fastlejereaktor, gennem hvilken der kontinuerligt ledes en vandig opløsning af substratet 2-oxo-4-phenylsmørsyrϊ eksempelvis i en koncentration i området fra 50 til 2)0 20 mM, af formiat, eksempelvis et alkalimetalformiat, såson kalium- eller natriumformiat, eksempelvis i en koncentration i området fra 100 til 500 mM, og en elektronirid-diator, f.eks. et 4,4'-bipyridyliumderivat, såson methylviologen, carbamoylmethylviologen eller benzylvio-25 logen, eller et 2,2'-bipyridyliumderivat, såsom diquatd:-kation, eksempelvis i en koncentration i området fra 0, ϊ til 10 mM. Reduktionen af substratet katalyseres eksempelvis af den i Proteus vulgaris indeholdte 2-oxocarboxy:-syrereduktase (2-hydroxycarboxylat-viologen-oxidoreduk-30 tase). Da dette enzym har en høj enantiomerselektivite:, og produktet opstår med et enantiomeroverskud på mere ene 99,8% ligger der en særlig fordel ved anvendelse af d<d ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede produki i, at der ved syntesen af ACE-hæmmere, som forløber ovci 35 talrige trin, allerede i et relativt tidligt stadium ni DK 173712 B1 15 syntesen kan anvendes en enantiomerren syntese. Den oven-' for beskrevne fremgangsmåde muliggør høje omsætninger på mere end 99%.

5 De følgende eksempler skal forklare opfindelsen.

Forkortelser 10 ee enantiomeroverskud ("enantiomeric excess") HPLC high pressure liquid chromatography rpm omdrejninger ("revolutions") pr. minut 15 Eksempler

Eksempel l

Fremstilling af perleformede biokatalysatorer med Proteus 20 vulgaris.

Proteus vulgaris (ATCC 9484) dyrkes i et fuldstændigt medium (gærekstrakt 5 g/1, glucose-monohydrat 5 g/1, K2HPO4 5 g/1, pepton fra kød 20 g/1, pH 7,0) i 24 timer ved 37eC 25 under let gasning med nitrogen. De således fremkomne celler høstes ved 12°C i en CEPA-centrifuge type Z 41 G (gennemløb 300 1/time) under skyldning med nitrogen ved et omdrejningstal på 20.000 rpm (16.950 g). Ud fra 400 1 kulturvæske fås 580 g bakteriesediment med et fugtigheds-30 indhold på ca. 80%. 1 Vægtdel fugtig bakteriemasse op- slæmmes sammen med 1 vægtdel kiselsyre (Baker produkt nr.

254, kornstørrelse ca. 20 μια, 95% >3 ^m, 95% <60 μιη, rumvægt ca. 50 g/100 ml) i 3 vægtdele 50 mM natriumacetat-; puffer med pH 5,0 og blandes derefter under kraftig omrø-35 ring med 5 vægtdele af en 1,4 vægtprocents højviskøs vandig chitosan-acetat-opløsning (viskositet ca. 10.000 cP

DK 1713712 B1 16

ved 20‘C og 10 rpm; pH 4,5 indstillet med eddikesyre; uop- I løselige bestanddele siet fra). Denne suspension (visko- I

sitet ca. 2000 cP) dryppes under let omrøring til en I

1,5%'s (v/r) natriumtripolyphosphatopløsning (mindst tre- I 5 dobbelt suspensionsrumfang; pH 8,1 indstillet med phos- I phorsyre). Dertil anvendes en sprøjte med en kanyleåb-'

ning med diameter 1,4 mm og med et gennemløb på 1 ml/min. I

Dråberne blæses af kanylen med komprimeret nitrogen (fald-. I

længde 10-15 cm). Der opstår perleformede partikler med. I

10 en diameter på 2-3 mm, der forbliver i natriumtripoly-; I phosphat-tværbindingsbadet i 2 timer til indskrumpning og' I hærdning. Ud fra 100 g suspension fås ca. 40 g perler; (rysterumfang ca. 80 ml) med en cellekoncentration på; 0,25 g fugtig bakteriemasse, henholdsvis 0,05 g tørre1 15 celler pr. g perler, som i det følgende med henvisning til:

kiselsyrekoncentrationen i den sprøjtede suspension I

betegnes "10%'s kiselsyre-biokatalysatorperler". I

Til sammenligning fremstilles "kontrol-biokatalysator- I

20 perler" uden tilsætning af kiselsyre. Dertil opslæmmes 1 I vægtdel fugtig bakteriemasse i 4 vægtdele natriumacetat-, I puffer med pH 5,0 og blandes derpå med 5 vægtdele af den· I ovenfor beskrevne chitosan-acetat-opløsning. Suspensionen; I dryppes til en natriumtripolyphosphatopløsning som angivet.

25 ovenfor til fremstilling af perleformede partikler.

Ved fremstillingen af "kontrol-biokatalysatorperlerne”. I

sker der ved opslæmningen en væsentlig skumdannelse, der I udebliver ved fremstillingen af de "10%’s kiselsyre-bio- I 30 katalysatorperler", da kiselsyren virker som antiskummid-del. Ved skumdannelsen bliver "kontrol-biokatalysatorperlerne " lettere end perlerne med kiselsyretilsætning og har I

tendens til at stige til overfladen i tværbindingsbadet. I

35 17 DK 173712 B1

Eksempel 2

Bestemmelse af blokatalysatorperlernes trykstyrke 5 Biokatalysatorperlernes trykstyrke bestemmes med et målesystem til termomekaniske analyser (TA 3000-system med målecelle TMA 40, Mettler Instrumente AG, Greifensee,

Schweiz) efter en dags lagring ved 4°C i natriumtripoly-phosphatop løsning med pH 8,1. Hver tre biokatalysator-*

10 perler (diameter 3 mm) i fugtig tilstand lægges på prøve-! bordet grænsende op til hinanden i trekantorden og dækkes, centralt med en med natriumtripolyphospha topløsning! gennemvædet keramikskive (diameter 6 mm, tykkelse 0,7 mm,| tørvægt 70 mg), på hvilken måleføleren er anbragt. PrøvensJ

15 deformation (perlernes nedgang i tykkelse i /im) måles ved nedtrykning af keramikskiven under en belastning på 0,02| N isotermt ved 30°C som funktion af tiden. Resultaterne er sammenfattet i tabel 1. ' ^ Tabel 1

Bestemmelse af biokatalysatorperlernes trykstyrke

Deformation af 3 mm-biokatalysator-perlerne [ /im ]

Kontrol-bio- 10%'s kiselsyre-

Tid [min. ] katalysator- biokatalysatorperler perler 30 ___ 0,5 40 10 1 80 20 2 130 30 4 200 40 i 35 DK 173712 B1 18

Tabel 1 viser klart, at de "10%' s kiselsyre-biokataly!· a~ torperler" har en væsentlig højere trykstyrke end ”k<:n-trol-biokatalysatorperlerne”. Efter 15 minutter udviser de "10%’s kiselsyre-biokatalysatorperler" næsten incen ^ yderligere deformationstilvækst.

Eksempel 3

Fremstilling af_2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyre ved hja1p 10 af perleformede biokatalysatorer i 1aboratoriem&lestok 48 ml (rysterumfang) ,,10%'s kiselsyre-biokatalysatoi-perler”, der fremstilles ifølge eksempel 1 af 60 g suspension, skilles fra natriumtripolyphosphat-tværbindinys - .

15 badet og sættes til 200 ml af en med nitrogen forud g;s-behandlet opløsning af 50 mM (1,84% v/r) natriumtripcty -phosphatpuffer med pH 7,0, 100 mM kaliumformiat og 1 nM

carbamoylmethylviologen (1,1' -dicarbamoylmethyl-4,4' - <l: -pyridiniumdikation). I denne reduktionsopløsning f <>i -20 bliver perlerne under vakuum til afgasning indtil fuldstændig violetfarvning, der beror på reduktion af cart-amoylmethylviologenet ved den i Proteus vulgaris indeholdte formiatdehydrogenase. Derefter anbringes perlerne i en enzymfastlejereaktor, dvs. i en med kappe forsynet 25 glassøjle (indvendig diameter 1,6 cm, lejehøjde 24 mi, 250Ο, Den med nitrogen forud gasbehandlede substratopløsning (50 mM natriumtripolyphosphatpuffer pH 6,7, 1C0

mM 2-oxo-4-phenyls;mørsyre, 300 mM kaliumf ormiat, 3 nM

carbamoylmethylviologen) ledes kontinuerligt gennem s<;r -3 0 len ved hjælp af en doseringspumpe med overtryk 2,0-3,0 bar med et gennemløb på først 120 ml/time, derpå med 2 4 ml/time. Forløbet af reduktionen af 2-oxo-4-phenylsmørsyie til 2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyre, der katalyseres af (Un i Proteus vulgaris indeholdte 2-oxocarboxylsyrereduktaie 35 (2-hydroxycarboxylat-viologén-oxidoreduktase), måles '^d HPLC-analyse (søjle: Nucleosil C18, partikkelstørrels« 5 19 DK 173712 B1 μΐη, længde 12,5 cm, indvendig diameter 4,6 mm; gennemløb 1,0 ml/min.; løbemiddel: 3 rumfangsdele acetonitril/8 rumfangsdele 100 mM kaliumphosphatpuffer pH 3,0).

5 På tilsvarende måde anvendes "kontrol-biokatalysator-perlerne" (rysterumfang 49 ml ud fra 60 g suspension ifølge eksempel 1) til reduktion af 2-oxo-4-phenylsmør-syre. Derved er det nødvendigt at indskrænke perlelejet ' 10 med søjleadapteren, fordi perlerne overvejende svømmer j ovenpå, og der derfor dannes tomme zoner i søjlen.

Resultaterne af produktivitetsbestemmelsen er sammenfattet i tabel 2.

15

Tabel 2

Fremstilling af 2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyre 1 fastleje-20 reaktor ved hjælp af perleformede biokatalysatorer i labo-rietoriemålestok (omsætning)

Omsætning i fastlejereaktor ved 25°C

25 Gennemløb Kontrol-bio- 10%'s kiselsyre-bio- [ml/time] katalysatorperler katalysatorperler 120 60% 70% 24 96% >99,5% 30 ——--

Af tabel 2 fremgår, at "kontrol-biokatalysatorperlen" har en klart ringere produktivitet end de "10%'s kiselsyre-biokatalysatorperler".

35 20 DK 1173712 B i På grund af den tiltagende komprimering af perlerne er j.r varig drift af kontrol-enzymreaktoren ikke mulig, da sø; -len allerede er tilstoppet efter en dag ved et gennemlpt på 24 ml/time. Med "10%'s kiselsyre-biokatalysatorpei -5 lerne" er varig drift under de samme betingelser derimod problemløs.

Eksempel 4 10 Fremstilling af 2-(R)-hydroxy-4-phen.vlsmørsyre ved hjæ!^ af perleformede biokatalysatorer 1 pilotmålestok og isolt-ring af produktet

Fremstillingen af de "10%’s kiselsyre-biokatalysator- .

15 perler" sker ud fra 573 g bakteriesediment ifølge eksesi-pel 1, idet der dog i stedet for sprøjten anvendes ir-indretning bestående af en tandhjulspumpe (gennemløb 1,4 l/time; tryk ca. 0,5 bar) og en 7-strålet douche med 0,6 mm kapillærer til dråbedannelsen. Til forøgelse af afdryp-20 ningsfrekvensen eller til påvirkning af dråbestørrelser har hvert kapillær en separat luftudstrømningskanal. Efter indskrumpning og hærdning i en 3%'s (v/r) natriumtripoly-phosphatopløsning fås ud fra 573 g bakteriesedikent c; .

4 1 (rysterumfang) perler.

25 2-(R)-hydroxy~4~phenylsmørsyre fremstilles på tilsvarerne t måde som angivet i eksempel 3. De 4 1 (rysterumf ane) "10%'s kiselsyre-biokatalysatorperler" skilles fra natr:-umtripolyphosphat-tværbindingsbadet og sættes til 6 1 i i 30 en med nitrogen forud gasbehandlet opløsning af 100 irN ! (3,68% v/r) natriumtripolyphosphat pH 7,0, 100 mM kalium - formiat og 1 mM carbamoylmethylviologen. I denne redur -tionsopløsning forbliver perlerne unciter vakuum til afgasning indtil fuldstændig violet farvning. Derefter anbrir-25 ges perlerne i en kromatografisøjle (indvendig diameter

11,3 cm, grundareal 100 cm2, længde 60 cm, lejehøjde <C

DK 173712 B1 21 cm). Den med nitrogen forud gasbehandlede substratopløsning (100 mM natriumtripolyphosphatpuffer pH 6,7, 112,2 mM 2-oxo-4-phenylsmørsyre, 300 mM kaliumf ormiat, 1 mM carbamoylmethylviologen) sterilfiltreres og ledes kontinu-5 erligt gennem søjlen ved hjælp af en doseringspumpe med overtryk 2,0-3,0 bar med et gennemløb på først 2,5 1/time.

Den ved HPLC målte omsætning er >99,5%. Søjlen drives dag og nat uden afbrydelse ved stuetemperatur, dvs. ved ca. 23‘ til 26,5°C.

10

Omsætningen kontrolleres ved daglige HPLC-analyser og holdes ved omsætningsværdier >99,5% ved regulering af pumpehastigheden. Efter 25 dage er i alt ca. 800 l reak-; tionsopløsning omsat (gennemsnitlig omsætning 99,6%), og' 15 gennemløbet udgør endnu 1 1/time.

1160 1 omsat reaktionsopløsning blandes med 250 1 ethyl-acetat og indstilles på pH 2,6 med 114 1 42,5%'s ortho-phosphorsyre. 2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyren ekstraheres 2^ i ethylacetat med et udbytte på 94%. Den i vandfasen resterende 2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyre ekstraheres endnu to gange med hver 120 1 ethylacetat. Efter de tre ekstraktionstrin er ekstraktionen af 2-(R)-hydroxy-4-phenylsmør-syre fuldstændig (99,8%). Efter samling af de tre ethyl-25 acetatfaser (samlet rumfang 450 1), tilsætning af 250 1 ethylacetat og afdestillering af 470 1 af opløsningsmidlet klarfiltreres opløsningen gennem et enpladefilter. 50 1 ethylacetat anvendes til skyldning af filteret og sættes til den klare opløsning. Efter afdestillering af 200 1 af 30 opløsningsmidlet udgør opløsningens slutrumfang 80 1. Til! denne opløsning sættes 400 1 cyclohexan, og 200 1 af opløsningsmidlet afdestilleres. Efter centrifugering af det udkrystalliserede produkt og tørring i vakuum ved 20-25*0 indtil konstant vægt fås 23,4 kg krystallinsk

*> C

2-(R)-hydroxy-4-phenylsmørsyre.

22

DK H'^1712 B1I

Til kontrol af enantiomerrenheden opløses en prøve af den krystallinske syre i absolut ethanol og bringes til omsætning med hydrogenchloridgas i 24 timer ved stuetemperatur. Efter afdestillering af alkoholen og kort afgasning 1 5 højvakuum resterer en lysegul olie, der analyseres ve i HPLC ved 25*C/32 bar på en chiral søjle (250 x 4,6 tom i.d., gennemløb 1 ml/min., stationær fase chiralcel OD [Stehelin, Basel] type OD-5-15-2092,5, mobil fase: 90fr hexan/10% isopropanol/0,1% diethylamln). De stoffer, der; 1° skal analyseres, foreligger i en koncentration på 1 mg/ml i løbemidlet (indsprøjtet mængde 10 //1). Scanningen sker ved en bølgelængde på 210 nm, bedømmelsen ved areaisam-menligning med ekstern standard. Den bestemte ee-værdi er >99,8%.

15 20 25 30 35

Claims (10)

1. Perleformet biokatalysator med høj mekanisk styrke omfattende enzymatisk aktivt materiale, en kationisk 5 polyelektrolyt og polyvalente anioner, kendetegnet ved, at biokatalysatoren indeholder kiselsyre og fremstilles ud fra en suspension af det enzymatisk aktive materiale, kiselsyren, pufferopløsning og polyelektrolytten, hvori slutkoncentrationen af kiselsyre ligger i et interval 10 mellem 2 og 15 vaegt-%.

2. Perleformet biokatalysator ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det enzymatisk aktive materiale består af . hele celler af en bakterie eller af en gærart. 15

3. Perleformet biokatalysator ifølge krav 2, kende- tegnet ved, at bakterien hører til arten Proteus vulgaris · og/eller til arten Proteus mirabilis. -

4. Perleformet biokatalysator ifølge krav 1, kende- ; tegnet ved, at det enzymatisk aktive materiale indeholder en oxidoreduktase eller er en oxidoreduktase.

5. Perleformet biokatalysator ifølge et af kravene 1 2^ til 4, kendetegnet ved, at den kationiske polyelektrolyt er chitosan.

6. Perleformet biokatalysator ifølge et af kravene 1 til 5, kendetegnet ved, at de polyvalente anioner er tri- 30 polyphosphat.

7. Perleformet biokatalysator ifølge et af kravene 1 til 6, kendetegnet ved, at kiselsyren er en fældet kiselsyre . 35

8. Fremgangsmåde til fremstilling af perleformede biokatalysatorer ifølge et af kravene 1 til 7, kende- DKIH712B1 tegnet ved, at enzymatisk aktiv-t materiale blandes med fældet kiselsyre i fast form, an vandig pufferoplosning og en vandig oplosning af en kationisk palyelektrolyt, under undgåelse af skumdannelse, til en suspension, som dråbevis 5 indføres i et vandigt tværbindingsbad Indeholdende polyvalente anioner, og de fremkomne biokatalysatorperler bringes til at skrumpe ind og stivne ved at forblive i tværbin- dingsbadet i mindst: ca. 1 time, hvorpå de eventuelt skille; fra tværbindingsbadet. 10

9. Fremgancrsmåde til fremstilling af a-hydroxy-carboxylsyrer ud fra α-ketocarboxylsyrer, kendetegnet ved, at der til omsætningen anvendes en perleformet biokatalysator ifølge krav 3 eller 4. 15

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9 til fremstilling af 2-(R)-hydroxy-4-pher:,ylsmørsyre ud fra 2-oxo-4-phenylsmør~ syre, kendetegnet ved, at de perleformede biokatalysatorer anvendes i en fastiejereaktor, gennem hvilken der kontinuerligt ledes en vandig opløsning af substratet 2-oxo-4-phenylsmørsyre, af formiat og en elektronmedia-tor. 25 30 35