KR950012803B1 - 신규한 고정된 생체촉매의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

신규한 고정된 생체촉매의 제조방법
[발명의 상세한 설명]
본 발명은 생세포로 이루어진 미립자 형태의 신규한 고정된 수불용성 생체촉매의 제조방법에 관한 것이다.
미국 특허 제3,838,007호에 겔화 단백질 수용액에 비단백질 분해효소를 현탁시키고, 얻어진 혼합물을 물에 불충분하게 혼화하거나 혼화하지 않는 유기액체와 결합시켜 미립자 형태의 현탁액을 생산하고 결과 생긴현탁액을 겔화 단백질의 겔화가 실행되도록 처리하고 결과 생긴 겔화된 단백질을 가교결합제와 접촉시킴에 의한 반고상 또는 고상 미립자 형태의 수불용성 효소 조성물의 제조방법이 개시되어 있다.
겔화 단백질은 젤라틴이 가장 바람직하며, 효소를 원하는 크기의 수불용성 미립자 형태로 이끌기 위해서 또한 효소를 안정화시킨다. 수용성 효소-겔화 단백질 용액을 미립자 형태로 이끄는 개시되어 있는 유기 액체들은 특히 부탄올과 같은 4개 이상의 탄소원자를 갖는 지방족 알코올, 아세트산 에틸, 아세트산 부틸과 프로피온산 에틸과 같은 알코올과 저급 지방산의 에스테르 등이다.
마지막으로 여러가지 비단백질 분해효소들이 언급되어 있으며, 이들은 불용성 미립자 형태를 이끌 수 있다. 상기 미립자 형태의 조성물은 효소 반응을 위해 칼럼과 베드 반응기에서 사용될 수 있으며 최종 생성물이 사용된 효소를 함유하도록 허용되지 않는 반응에 특히 유용하다.
생세포, 예를들면 빵 효모(Saccharomyces cerevisiae : 맥주 효모균) 세포가 미국특허 제 3,838,007호에 개시된 방법에서 사용된 형태의 유기용매에 의해 순식간에 죽는다는 사실은 본 분야 숙련자에 인지되어 있을 것이다. 몇가지 유기용매가 효모에서 자가분해를 시작한다고 보고 되었다. 예를들면 아세트산 에틸은 결정성 시토크롬 c(Nature 178(1956), 629-630)와 베타-프룩토푸라노시다제(J. Bacteriol. 112(l972), 1346-1352)를 제조하기 위해 빵 효모의 처리에 사용된다.
휴와리온(Hough and Lyons, Nature 235(1972) 389)은 공유 결합에 의해 효소를 불용성화하는 방법은 살아있는 생물에게는 오히려 거칠다는 점에 주목하여, 그래서 그들은 이러한 살아있는 생물이 지지체로서 사용된다면 생존 가능성이 거의 없음을 알았다.
그후 그들은 결합제로서 티탄염과 기타 무기염을 사용하여 어떤 효소들을 살아있는 지지체, 즉 몇가지 맥주 효모균주에 공유 결합시키는 기법을 개시했다.
이 결합기법도 본래 바커일동(Barker et al., Process Biochem. 6, (1971), 11)에 의해 개시된 수법의 변형이었다.
독일공개공보 28 05 607의 9페이지 13 내지 17번째 줄에 다음 문헌(Processes Biochem. no. 7(1972),9-12)이 언급되어 있으며, 여기에는 용매로서 톨루엔 또는 염화메틸렌을 이용하여 셀룰로오스 트리아세테이트실에 미생물을 걸리도록 하는 것이 제안되었다.
상기 독일의 공개공보에 이러한 용매들은 독성이 커서 지지 기질에서 성장시킴에 의한 미생물의 재생이 거의 불가능하다고 주지되어 있다.
더욱 최근에, 해거달과 모스바흐(Haegerdal and Mosbach, Food Process Eng., Proc. Int. Congr., 2nd 1979(Pub.1980) 2,129-32, (cf. Chemical Abstracts 94(1981) 119457k))는 베타-글루코시다제와-빵 효모의 공동-고정물질을 기술하였으며, 이것은 셀로비오스로부터 에탄올의 생산을 위한 작은 칼럼 반응기에서 연구되었다.
효소는 알긴산염에 공유결합되고 그후 빵 효모세포는 알긴산염 겔에서 이 제제에 공동으로 걸리게 되며, 그러나 이러한 생세포에 유기용매나 가교결합제 어느것도 사용하지 않았다.
알긴산 칼슘은 인산염 이온 또는 다른 킬레이트제외 존재시 불안정한 결점을 가지고 있다.
생세포에서 인산염은 필수 불가결한 영양소이며 따라서 이러한 인산염 지지체는 생존 가능 세포로 이루어진 대부분의 고정계에서 사용하기에 적합하지 않다.
유럽특허출원 EP-A-O 041 610에는 효소와 효모의 공동-고정물질이 개시되어 있으며, 여기에 효소가 발효할 수 있는 살아있는 효모세포에 결합되어 그들을 직접 둘러싼다고 되어 있다. 이러한 공동-고정물질은 효모세포를 탈수하고, 수용성 효소용액으로 재수화시키고, 효모세포의 발효에 영향을 끼치지 않는 효소침전제를 가하고 그리고 바람직하게는 가교결합제를 후속 첨가함으로서 제조될 수 있다.
이러한 공동-고정물질의 제조시에 유기용매나 분산제 어느것도 사용될 수 없다. 공동-고정물질은 지지기질이 없기 때문에 칼럼 반응기 등에서 사용하기에는 부적합하다.
이러한 모든 언급들로 인해 발효력과 중식력을 보유하는 고정된 생세포 조성물의 제조시에 유기용매 그리고 특히 톨루엔, 부탄올, 아세트산 부틸 및 아세트산 에틸과 같은 유형의 용매를 사용하지 않음을 알 수 있다.
본 발명의 목적은 여러가지 목적, 예를 들면 칼럼충전, 유동층 반응기와 교반탱크 반응기에 사용될 수 있는, 생세포로 이루어진 원하는 크기의 미립자 형태로 고정된 수불용성 생체촉매를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상당히 온화한 조건하에서(즉 현탁액이 방출되는 주위의 유기용매와 비교한 미립자내의 조건) 상기 고정된 수불용성 미립자의 제조방법을 제공하는 것이며, 그리하여 생세포의 많은 양이 고정후에 생존할 수 있거나 재생될 수 있다.
본 발명의 이러한 그리고 다른 목적 및 이점이 다음의 상세한 설명으로부터 분명해질 것이다.
집중적인 연구와 실험후에, 생세포 특히 살아있는 미생물세포, 예컨대 효모의 생존가능성이, 생세포가 겔화제 수용액에서 현탁된다면 생세포가 물에 불충분하게 혼합하거나 혼합하지 않는 유기용액과 접촉될 때, 불리하게 영향을 받지 않는 것이 놀랍게도 발견되었다.
따라서 본 발명은 가교결합 겔화제에 분산된 생세포로 이루어진 미립자 형태의 고정된 수불용성 생체촉매를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어"생세포"는 상기 세포가 그들의 구조적 본질을 유지할 때만 가능한 광범위한 물질대사(또는 동화)작용을 수행할 수 있는 적합성을 갖는 세포로서 해석된다. 이러한 반응의 예들은 에너지(ATP)의 생산, 세포성분의 재순환 그리고 세포증식 등이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "미립자 형태"는 넓은 의미로 해석되어야 한다. 미립자 형태는 구형 또는 거의 구형인 미립자의 형태일 수 있으며, 그러나 본 명세서가 대체로 구형 또는 거의 구형인 미립자에 대해 언급할지라도 미립자 형태는 또한 섬유, 예컨대 압출섬유, 캐스트 필름(cast film), 용기의 도장과 함침 티슈 또는 종이 등의 형태일 수 있다.
일반적으로 "미립자 형태"는 규정된 원하는 크기의 본 발명에 따르는 조성물의 형태를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "겔화제"는 수용액이 특별한 처리, 예를들면 젤라틴 또는 한천이 사용될 때 냉각시킴으로서 고체 또는 반고체 상태로 변형될 수 있는 약제를 의미한다. 본 발명의 목적을 위한 적합한 겔화제는 예를들면 젤라틴, 한천과 같은 겔화 폴리카보 하이드레이트와 적절한 2관능성 또는 다관능성 가교결합제와 가교결합할 수 있는 키토산과 같은 유리아미노기 함유 중합체의 혼합물 및 젤라틴과 이러한 화합물들의 혼합물이다. 젤라틴 및 젤라틴과 키토산의 혼합물이 바람직한 겔화제이다.
본 발명의 목적을 위한 적절한 가교결합제외 예들은 예를들면 바람직한 글루타르 디알데히드와 탄닌산이다.
본 발명에 따르는 고정된 수불용성 생체촉매에 적합한 생세포는, 예를들면 미생물 세포와 동물 및 고등식물의 세포이다. 적절한 살아있는 미생물 세포중에서 바람직한 것은 맥주 효모균(예를들면, 빵 효모)과 초산균속(예를들면, Acetobacter pasteurianum), 클로스트리둠속(예를들면, Clostridium butyricum Clostridium thermocellum과 Clostridium acetobutylicum), 협막간균속 및 유산간균속(예를들면, Lactobacillus bavaricus) 등의 종과 같은 효모와 세균들이다.
적절한 살아있는 식물세포는 예를들면 타게테스 미누타(Targetes minuta)에 속하는 세포이다.
본 발명의 또다른 국면에 의하면, 고정된 수불용성 생체촉매는 또한 한개 이상의 효소, 특히 비단백질 분해효소를 포함할 수 있다.
효소가 생체촉매에 결합될 때 그것은 물론 생세포 및 겔화제에 적합하여야 한다.
본 발명의 생체촉매에 포함될 수 있는 효소의 예들은 예를들면 아밀로글루코시다제, 락타제, 말타제, 아밀라제, 글루코스 이소머라제, 플루라나제, 인베르타제, 리파제, 에스테라제, 글루코스옥시다제 및 탈수소효소 등이다.
효소 혼합물이 역시 사용될 수 있다. 단백질 분해효소가 본 분야 숙련자에게 명백한 어떤 일정한 환경하에서 역시 사용될 수 있다.
예를들면, 겔화제가 젤라틴과 같은 단백질 일때 단백질 분해효소의 사용은 피해야 되는데 그 이유는 단백질 분해활성이 있는 효소가 겔화 단백질을 분해시켜 물리적으로 매우 불안정한 생성물을 제공하기 때문이다.
본 발명의 또다른 국면에 의하면, 고정된 수불용성 생체촉매는 두가지 이상 유형의 생세포를 함유할 수 있으며, 임의적으로 한개 이상의 효소와 결합할 수 있다.
본 발명에 따르는 미립자 형태의 고정된 수불용성 생체촉매는 연속적인 생체촉매 반응을 위해 특히 칼럼반응기, 예를들면 유동층 반응기에서 또는 교반탱크 반응기에서 유용하다.
이러한 생체촉매는 액화 전분으로부터 유도된 과당류와 같은 어떤 탄수화물의 에탄올로 전환, 유당(예를들면, 유장에서)의 젖산 또는 에탄올로 전환 및 셀로비오스의 아세트산, 이타콘산 또는 구연산으로 전환에 사용될 수 있는 것이 적합하다.
본 발명에 따르는 고정된 수불용성 생체촉매로서 적합한 것은 맥주 효모균을 함유하는 것이며, 이것들은 부산물로서 에탄올과 함께 글리세롤을 생산하거나 또는 예를들면 락타제와 결합하여 유장을 에탄올로 전환시키거나 또는 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobills)와 결합하여 액화 전분으로부터 연속적이며 신속하게 에탄올을 생산한다.
바람직한 고정된 수불용성 생체촉매들은 맥주 효모균을 함유하는 것이며, 임의적으로 한개 이상의 전분분해효소 특히 아밀로글루코시다제와 결합한 것이다.
이러한 배합은 액화 전분, 예를들면 덱스트린으로부터 에탄올을 생산하는 발효와 저칼로리 맥주의 생산에 특히 유용하다. 본 발명에 따르는 다른 적합한 생체촉매는 탄화수소를 케톤 또는 산으로 전환하는 모노-옥시다제를 생산하는 고정된 생물(예를들면 클로스트리듐속, 협막간균속 및 호기균속의 종), 종이의 생산으로부터 아황산염액의 처리를 위한 고정된 리그니나제 생산 생물(예를들면 코리올루스속, 파네로키토속, 스포로트리쿰속 및 스트렙토마이세스속의 종), 어떤 유형의 약리학적 활성인 화합물의 제조시에 특이한 반응을 촉매 작용하는 효소를 생산하는 고정된 생물(예를들면, 스테로이드와 광학적 활성인 이성체의 제조시에 유용한 쿠르불라리아속, 미코박테륨속 및 슈도모나스속 등의 종), 전분 또는 글루코스로부터 아세트산의 제조를 위한 고정된 초산균속의 종, 그리고 단일클론성 항체의 생산을 위한 고정된 히브리도마세포 등이다.
본 발명의 또다른 목적에 따르면 상기의 고정된 수불용성 생체촉매는 다음 단계들로 구성된 방법에 의해 제조될 수 있다 : (a) 생세포를 겔화제 수용액에 현탁시키고, (b) 이렇게 얻어진 혼합물을 물에 불충분하게 혼화하거나 혼화하지 않는 유기용액과 결합시켜 생세포와 겔화제를 함유하는 수용성 입자들의 유기용액내의 현탁액을 형성하고, (c) 현탁액을 미립자내의 겔화제를 겔화시키도록 처리하고, (d) 단계(c)에서 얻어진 미립자를 2관능성 또는 다관능성 가교결합제로 처리하여 입자내에 존재하는 중합체를 가교결합시키고, 그리고 (e) 원한다면 단계(d)에서 얻어진 입자들로부터 최소한 물 성분을 제거하는 단계들이다.
본 발명에 따르는 방법은 산업상 이용에 대단히 관심을 끄는 이점을 많이 가지고 있다.
예를들면 그것은 간단해서 공정을 정확하게 제어할 수 있다. 얻어진 입자들은 고르게 분할되며 균질하다. 그들은 보통 반고상 또는 더욱 바람직하게는 고상이다. 아세트산 부틸 또는 톨루엔에 방출함으로서 고정방법이 또한 무균적이다. 마지막으로, 이 방법은 비교적 저렴하다.
겔화제는 바람직하게는 젤라틴 또는 필수적으로 젤라틴과 키토산으로 구성된 혼합물이며, 이것은 또한 생체촉매에 결합된 어떤 효소도 안정화시킨다.
미립자 형태의 생세포, 효소 및 젤화제의 혼합물은 바람직하게는 생세포와 그리고 임의적으로 효소를 겔화제 수용액에 현탁시키고, 미립자 형태가 얻어질 수 있도록 이 혼합물을 물에 불충분하게 혼화하거나 혼화하지 않는 유기용액과 결합시키고, 그리고 결과 생긴 미립자 형태의 현탁액을 겔화제외 겔화가 완수되는 방식으로, 예를들면 젤라틴이 겔화제 일때 냉각시킴에 의해 처리한다.
생세포, 임의의 효소와 겔화제를 함유하는 혼합물과 유기용액의 결합은 제어된 교반하에서 혼합하거나 생세포, 효소 및 겔화 단백질의 혼합물을 유기용액으로 침적분무(submerged spraying)함으로써 수행될 수 있다.
후자의 방법은 형성된 미립자가 가교결합제를 포함할 수 있는 유기용액에서 아래쪽으로 이동하고 있는 수직 칼럼에서 수행될 수 있다.
생세포, 임의의 효소 및 겔화제 혼합물의 가교결합은 미립자 형태의 혼합물을 유기용액으로부터 분리하고 그것을 2관능성 또는 다관능성 가교결합제로 처리함으로서 수행될 수 있다. 양자택일로, 어떤 경우에서, 예를들면 클로스트리듐속 세포들에서 유기용액에 현탁된 미립자 형태의 혼합물이 상기 약제로 처리될 수 있다.
생체촉매에 효소를 결합시키고자 할때, 효소를 가교결합 단계동안에 겔화된 현탁액으로 도입시킬 수 있다. 원한다면 그후에 고정된 생세포를 재활성화시켜 성장시킬 수 있다.
가교결합 단계후에 얻어진 입자를 건조시켜, 그들이 편리하게 저장되고 포장될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 사용전에 일반적으로 입자를 재수화시키고 고정된 생세포를 임의로 성장시킨다.
제조과정에서 출발물질로 사용되는 생세포, 효소 및 겔화제외 혼합물은 생세포와 그리고 임의적으로 효소를 겔화제 수용액에 현탁시킴으로서 제조될 수 있다.
수용성 겔화 용액의 온도는 활성 혼합물이 액형으로 얻어지는 온도이어야 한다. 그러므로 약 25℃ 내지 약 40℃의 온도가 바람직하며 최대온도는 사용되는 생존가능 세포의 내열성에 의존한다.
용액내에 있는 젤라틴은 사용된 특정한 젤라틴에 의존하며 사용된 물을 기준으로 하여 약 0.1 내지 약 25중량%의 한계내에서, 바람직하게는 약 5 내지 10중량%의 한계내에서 변화할 수 있다. 생세포와 효소(들)의 농도는 불용성화된 효소가 사용될 목적과 또한 그 활성에 따라 다르다. 젤라틴과 키토산의 혼합물이 사용될 때, 키토산 농도는 사용된 물을 기준으로하여 약 0.05 내지 약 10중량%의 한계내에서, 바람직하게는약 0.1 내지 약 1중량%의 한계내에서 변화할 수 있다.
용액의 pH는 세포가 수반된 환경하에서 그들의 최대 안정성을 지닐 때의 pH가 바람직하며, 그러나 젤라틴이 또한 존재할 때 pH는 약 2와 12의 범위내에, 바람직하게는 3 내지 10의 범위내에 존재해서 젤라틴이 젤화하도록 하여야 한다. 다른 젤화제에 대해서는 pH의 범위가 다를 수 있다.
생세포, 효소 및 겔화제외 제조중에, 겔화제 이외에 또한 존재시에 생세포 및/ 또는 효소를 안정화시키는 안정화제를 첨가시킬 수 있다.
기본적으로 냉수가 유기용액 대신에 또한 사용될 수 있음이 주목할만하나 이 방법은 만족스러운 결과를 가져오지 못함이 발견되었다. 본 발명에 따르는 제조과정에서 사용되는 안정화제의 예들은 소르비톨, 글리세롤, 사용된 생세포와 효소들에 대한 비대사성 기질이다.
생세포, 효소 및 겔화제외 수용액 또는 현탁액의 미립자 형태를 가져오기 위해 사용되는 유기용액은 물에 불충분하게 혼합되거나 혼합되지 않는 유기용액이다. 적당한 유기용액의 예로서는 4개 이상의 탄소원자를 가진 지방족 알코올, 예컨대 부탄올과 같은 알칸올 ; 아세트산 에틸, 아세트산 부틸과 프로피온산 에틸 등의 C1-4알칸산과 같은 저급 지방산과 알코올의 에스테르, 파라핀유, 가솔린과 석유 에테르 등의 분기형 또는 직쇄형 지방족 탄화수소, 벤젠과 그 동족체와 같은 방향족 탄화수소, 염화메틸렌과 트리클로로에틸렌 등의 염소화 탄화수소 및 상기 용액의 2가지 이상의 혼합물을 들 수 있다.
이들 중에서 아세트산 부틸이 바람직하며, 특히 구입이 간편하고 경제적으로 유리한 회수과정 때문이다.
수용성 생세포-선택효소-겔화제 혼합물과 유기용액의 결합중에 사용된 교반의 유형과 결과 생긴 현탁액의 냉각조작(젤라틴이 사용될 때)은 수용성 살아있는 세포-선택효소-겔화제 혼합물을 원하는 크기의 입자로 분할할 수 있는 어느것도 가능하다.
얻어진 입자는 교반의 강도, 용액의 비중의 차이, 용액의 표면장력과 점도, 그리고 어떤 경우에서는 냉각속도, 온도와 최초의 수용성 생세포-효소-겔화제 수용액 또는 현탁액의 농도에 의해 좌우된다. 일반적으로, 교반이 충분하나, 현탁액을 형성하기 위해 생세포-효소-겔화제 혼합물을 유기용액으로 분무하는 것과같은 방법이 사용될 수 있다.
유기용액내의 생세포-효소-젤라틴 혼합물의 냉각, 예를들면 약 10℃ 또는 그 이하 심지어는 상기 혼합물의 빙점 이하로 낮추는 것은 유기용액내의 혼합물 현탁액의 형성과 동시에 또는 그후에 사용될 수 있으며 냉각은 빠르게 또는 느리게 수행될 수 있다.
가교결합 단계는 아미노기 함유 중합체와 공유결합을 형성하는 2관능성 또는 다관능성 가교결합체로 수행된다. 적절한 2관능성 가교결합제외 예들은 글루타르 디알데히드와 탄닌산이다.
본 발명의 구체예는 가교졀합 단계전에 입자의 탈수를 포함한다. 탈수는 얻어진 입자의 크기를 축소하며, 이러한 작아진 입자가 2관능성 또는 다관능성 가교결합제의 수용액으로 도입될 때 가교결합 반응이 개선된다.
탈수단계는 바람직하게는 입자의 삼투성 수축, 예를들면 소르비톨 또는 글리세롤에 의해 수행된다.
가교결합 2관능성 또는 다관능성 가교결합제가 탈수단계 후 이용액에 첨가되거나 입자에 도포될 수 있다. 탈수단계는 현탁액 단계에 사용된 유기용액으로부터 입자의 분리후에 행해질 수 있다.
불용성 충전재는 최종 미립자 형태의 물리적 성질을 개선시키기 때문에 제조과정에서 사용되는 세포-임의의 효소-겔화제 혼합물에 첨가될 수 있다.
적절한 불용성 충전재의 예들로는 미세하게 쪼개진 규산염 또는 KETJENSIL(합성 산화규소), HYFLO,DICALITE, 규조토 등과 같은 산화규소가 있다.
본 발명에 따르는 고정된 생체촉매는 또한 산화지르코늄 분말과 같은 비교적 무거운 물질로 피복되어 입자들의 무게가 증가되고, 그래서 더 높은 표층 액체 속도가 유동층 반응기에서 얻어질 수 있게 되며 그 결과 산소농도가 더 높아진다.
마지막으로, 이 방법에 의해 미립자 형태로 얻어진 세포-임의의 효소-겔화제 제제를 세척시키는 것이 바람직하다. 적절한 세척액의 예들은 물 또는 생물학적 활성인 물질에 좌우되는 pH를 갖는 완충액이다. 대체로, 미립자 형태의 제제를 건조시키는 것이 바람직하다.
본 발명에서 사용되는 젤라틴과 같은 겔화제는 존재하는 어떤 효소에도 외관상의 최적 pH, 즉 효소가 최고 활성을 나타내는 pH에 아마도 영향을 줄 수 있는 고분자 전해질이다. 이외에 효소의 외관상 최적 pH에 영향을 주는 다른 화합물, 예를들면 황산 프로타민과 폴리아크릴산 등을 예로서 들 수 있는 다른 고분자 전해질이 미립자에 포함될 수 있으며, 따라서 생세포-효소-겔화제 입자의 외관상 최적 pH를 예를들면 그들의 앞으로의 목적에 적합시킬 수 있다.
효모의 고정화에서 부딪히게 되는 실제적인 문제들중의 하나는, 효소가 고정될 때 통상적으로 사용될 때의 효모의 발효 특성이 예측할 수 없는 방식으로 변하며 또 같은 효모가 고정될 때 통상적인 발효 조건하에서 관찰된 바람직한 발효 특성이 반드시 보유되는 것이 아니라는 점이다.
효모의 발효 특성이 효모가 비연속 발효 또는 연속 발효에서 사용되느냐에 따라 예측할 수 없는 방식으로 변하는 것이 역시 발견된다.
양조산업에 의해서 연속 발효의 사용에 대한 상당한 관심이 있으며 장기간 동안 연속 발효에 사용될 수 있는 고정된 효모의 생산에 대해 많은 연구와 개발이 진행되고 있다. 반면에 관심을 일으키는 문제는 장기간의 반응기간에 걸쳐서 고정된 효모의 물리적인 보전과 또한 장기간의 반응기간에 걸쳐 바람직한 당 공급재료로부터 허용가능하게 높고 허용가능하게 일정한 농도에서 에탄올을 생산할 수 있는 효모의 능력이다. 연속 발효중에 접하게 되는 또다른 문제점은 고정된 효소의 베드에서 발생된 열이다.
양조산업에서 관심이 있는 많은 효모들은 비연속 발효에서 매우 만족스럽게 수행하나 같은 효모가 연속베드 발효조에서 사용될 때 이들의 수행에 불리하게 영향을 끼치는 열적인 문제에 지배를 받게 된다. 이것은 연속베드 발효조에 대한 복합체와 값비싼 냉각장치의 준비를 번갈아 필요하게 한다.
고정화와 연속 발효 이용에 특별히 적합할지도 모르는 효모의 종류를 밝히려는 시도에서, 본 발명자들은 호열성 또는 아미도 한층 내열성으로 표현되는 꽤많은 종류의 효모를 검사했다. 효.모의 호열성은 40℃를 초과하는 온도에서, 보통 40 내지 44℃에서 여러 세대(최소한 4 내지 5)에 걸쳐 비연속 배양에서 지속된 성장능력으로부터 나타난다. 효모의 호열성은 최소한 40℃의 온도에서 제한 배지 위에서 성장되는 시험에 의해 평가했으며 성장정도는 광학밀도 판독에 의해 측정되었다. 채택된 방법은 다음과 같았다.
시험 효모 배양균을 이하에서 YEPD, 즉 효모 추출물 펩톤 덱스트로스(yeast extract peptone dextrose)로 표시되는 1%w/v 박토(bacto) 효모 추출물, 2%w/v 박트 펩톤 및 2%w/v 글루코스를 함유하는 수용성배지에서 성장시켰다.
시험 효모를 32℃의 YEPD 배지에서 미리 성장시킨 후 정상세포 1리터당 150mg의 효모 건조체에 해당하는 비율에서 접종시켰다. 배양액을 42.5℃에서 16시간 동안 성장시키고 효모세포 성장을 광학밀도 판독에 의해 측정하였다. 동일한 조건하에서 성장시킨 빵 효모 2103Ng(CBS 6131)에 대해 얻은 광학밀도 핀독보다 최소한 2.5배 큰 광학밀도 판독을 제공하는 효모는 호열성으로 간주되고, 그리고 본 명세서에서 호열성 효모는 이러한 광학밀도 판독 정의를 충족시키는 것이다.
이러한 목적을 마음속에 지니고 본 발명자들은 본 발명에 따르는 고정화에 대해 충분히 호열성이고 연속발효에 사용되는 균주를 밝히기 위해 개선된 에탄올 내성도 또한 갖는 다양한 효열성 효모를 검사했다.
검사 시험으로부터 드러난 하나의 효모는 1913년에 처음으로 기술되고 원래 사카로미세스 아나멘시스(Saccharomyces anamensis)로 명명된 것이다.
후속의 수행자들은 이 효모가 효모균속의 별개의 종이 아니라 사실상 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae)의 변종으로 결론을 내렸고 사카로미세스 아나멘시스와 맥주 효모균 사이의 동일성이 로더일동(Lodder and Kreger van Rij., The Yeasts, North Holland Publ, Co., Amsterdam)의 초판과 제이판, 그리고 후속판(by Kreger van Rij, Elsevier 발행)에 설명되어 있다.
본 발명자들은 기탁번호 IFO 0203하의 일본 오오사까의 IFO로부터 획득한 맥주 효모균변종 아나멘시스(S. cerevisiae var. anamensis)의 시료를 심사하여 놀랍게도 글루코스와 같은 물질을 발효시킬 수 있는 능력이 본 발명에 따라 그것이 고정될 때 예기치 않게 매우 유리한 방식으로 변경된다는 것을 발견하였다.
검사 시험에 있어서, 균주 IFO 0203을 여러가지 시험에서 영국 발효 생산품회사(British Fermentation Products Ltd.)에 의해 퍼미판 "레드"(Fermipan "red", Fermipan은 등록상표임)의 이름하에 영국에서 시판되는 통상의 빵 효모, 균주 227Ng와 비교했다.
본 발명자들은 40℃ 및 그 이상의 온도의 호열성 시험에서 227Ng가 음성인데 반하여 IFO 0203는 양성임을 발전했다 .37℃에서 6시간후에 생산된 에탄올의 양을 측정하기 위한 또다른 시험에서, IFO 0203는 2.67%v/v를 생산한 반면에 227Ng는 같은 조건하에서 실질적으로 같은 2.54%v/v를 생산했다.
IFO 0203가 처음 16시간 동안에 15%v/v 에탄올을 생산할 수 있고 24시간 후에는 16.5%v/v 에탄올을 생산할 수 있었던 반면에 227Ng는 같은 조건하에서 처음 16시간 동안에 18% 에탄올을 생산할 수 있고 24시간 후에는 18.5% 에탄올을 생산할 수 있었던 처음의 고세포밀도에서 비연속 발효에서 효모의 두 균주사이의 비교를 또한 실시하였다. 이러한 시험은 발효가 발효성 당의 부족의 결과로서 중단하지 않는 환경하에서 수행되었다.
이른바 당의 D가(D-value)를 측정하기 위한 균주들 사이의 또다른 비교가 실시되었다. 이것은 동독특허공개 DD 216480-A에서 도입된 개념이며 25초 이상의 D가를 갖는 알코올 내성 효모를 판정한다. D가는 58℃ 온도하일때 효모세포의 98%를 죽이는데 필요한 시간(초)이다. 25초 이하의 D가를 갖는 효모는 알코올 감수성으로 간주된다. 이 시험에서 IFO 0203는 50초의 D가를 가진 반면에 227Ng는 26초의 D가를 가졌으며, 양쪽 모두 이 시험에 의해서 알코올 내성으로 간주되었다.
통상의 발효를 기준으로 한 상기의 여러 비교시험을 토대로 하여, 본 발명에 따라 고정시키고 연속 발효에 사용될 때 효모의 두 균주사이의 수행에 있어서의 어떤 중대한 차이가 있음을 생각할 이유가 없었다.
그러나 이러한 비교가 행해졌을때, 아주 놀랍게도 IFO 0203의 수행에 있어서 매우 중대한 개선이 있었음이 발견되었다. 227Ng가 본 발명에 따라 아밀로글루시다제와 공동 고정되고 미립자 물질이 덱스트린 공급재료로 계속 공급되는 칼럼으로 적재되며 에탄올 생산 생성물 기류가 계속 회수될 때, 생성물 기류는 발효가 작동하고 있는 정상상태에 도달할 때 8.5 내지 9.5%v/v 에탄올을 함유함이 발견되었다.
균주 IFO 0203에 대한 조사는 균주를 최초로 분리한 자에 의해 보고되고 로더(Lodder)의 초판에서 보고되었듯이 균주의 발효 능력에 있어서 발표된 성질과는 반대로, 상기한 실험을 수행한 IFO 0203 균주가 맥아당을 발효시키지 않는 것이 발견된 점으로 보아 어떤 변화가 일어났다는 것을 제시해준다.
이것은 원래의 물질이 기탁된 이후로 돌연변이가 일어났음을 우리에게 시사하며 본 발명자들은 1986년 5월 7일 네덜란드의 에스카 바아른 3742, 오스터스트라트 1에 위치한 기탁기관(Centraal Bureau voor Schimmelcultures)에 맥아당을 발효시키지 않는 맥주효모균의 IFO 0203 균주를 기탁번호 CBS 252.86하에 기탁하였다.(이 균주는 또한 한국과학기술원(KAIST)에 기탁번호 KCTC 8251 P하에 1987년 5월 22일에 기탁하였다.)
게다가, 본 발명자들은 균주 IFO 0203(CBS 252.86)의 인공 돌연변이 균주를 연구했다.
본 발명자들은 효모세포를 치사량 이하량에서 공지된 변이 유발소로 펄스시킴으로서 이 균주를 변이시키기 위하려는 시도를 했다. 본 발명자들이 사용한 변이 유발소에는 아질산나트륨과 메탄술폰산 에틸이 포함된다.
균주 IFO 0203를 아질산나트륨과 메탄술폰산 에틸로 펄스시켜 얻어진 하나의 구체적인 돌연변이체는 그것의 모균주보다도 더욱 우수한 어떤 특성을 나타내는 것이 발견되었다. 본 발명자들은 이 돌연변이 균주를 2490-KI13으로 명명하였고 이 돌연변이 균주 2490-KI13를 1986년 5월 7일 동 기탁기관(Centraal Bureauvoor Schimmelcultures)에 역시 기탁하여 기탁번호 CBS 253.86을 수령했다.(이 균주는 또한 한국과학기술원(KAIST)에 기탁번호 KCTC 8252 P하에 1987년 5월 22일에 기탁하였다.)
간결하게 하기 위해서, 본 발명자들은 이 기탁된 돌연변이 균주를 돌연변이 균주 13으로 택하기로 한다.
돌연변이 균주 13에 모균주 IFO 0203에 대해 상기한 여러 비교시험을 실행했다. 내열성 성장 시험에서 돌연변이 균주 13은 모균주 CBS 252.86 보다 덜 내열성이나 227Ng 보다는 더욱 내열성임이 발견되었다. 66개 여과기를 가진 클렛-서머손(Klett-Summersom)농도계를 이용하여 광학밀도 판독이 이루어졌고, 3개의 독자적인 판독을 평균하여, 다음 결과를 얻었다.
Figure kpo00001
37℃의 통상적인 발효에서, 돌연변이 균주 13은 CBS 252.86에 있어서의 2.67%v/v와 227Ng에 있어서의 2.67%v/v와 비교할 때 3.61%v/v 에탄올을 생산했다. 16시간과 24시간 후의 알코올 생산을 측정하기 위한 시험에서, 돌연변이 균주 13은 16시간 후에 단지 13.25%v/v 알코올을 생산하고 24시간 후에는 15.5%를 생산하였으며 이것은 모균주와 227Ng 균주 양쪽에 의한 알코올 생산의 견지에서 볼 때 보다 성능이 우수한 것이다.
그러나 돌연변이 균주 13이 본 발명에 따라 가교결합 젤라틴내에서 아밀로글루코시다제와 공동 고정되고 입자들이 연속 발효조의 칼럼에 적재될 때, 생성물 기류내의 에탄올 농도가 정상상태에서 11% 내지 12%v/v에 도달했으며, 바뀌 말하면 이 균주는 이러한 알코올 고농도를 계속해서 6개월간 유지하며, 또한 더욱 빨리 알코올 생산의 평형농도에 도달한다는 점에서 모균주 CBS 252.86에 개선된 성능을 준다.
본 발명의 생체촉매의 주요한 용도는 탄수화물의 전환에 있으며, 그러나 생세포의 특성에 따라 생체촉매는 고정된 세포가 가능한 다른 미생물학적 공정에서 역시 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 또다른 국면에 의하면 알코올 생산용 기질이 수용성 효모와 아밀로글루시다제를 함유하는 발효조로 기질을 통과시키기 전에 고정된 효소/아밀로글루코시다제에 적합하게 침투될 수 있다.
또다른 국면에 의하면 본 발명에 따르는 고정된 효모 생체촉매는 알코올 생산을 위해 부분적으로 개조된 기질을 다쓰기 위해서 사용될 수 있다. 예를들면, 20DS 덱스트로스에 상당하는 기질이 처음의 반응기에서 수용성 효모와 아밀로글루코시다제로서 9% 에탄올(v/v)으로 전환된다.
이 용액을 알코올 내성효모, 예컨대 상기한 군에 속하는 효모중의 하나를 포함하는 본 발명에 따르는 고정된 효모/아밀로글루코시다제 반응기로 공급한다.
생세포가 효모세포인 경우 생체촉매의 한가지 중요한 용도는 특히 연속 발효 조건하에서 발효성 당의 발효에 의한 에탄올의 생산이다.
상기에서 지적한 바와같이, 본 발명의 생체촉매는 생체촉매가 존재하는 연속 발효조내의 효모세포를 고성층, 유동층 또는 (연속)교반탱크 반응기(CSTR)에 제공하는데 특별히 유리한 방법으로 밝혀졌다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 성체촉매가 유동층 반응기에 존재하며, 여기에 반응 혼합물이 반응기에서 균질한 유동화가 달성되는 방식으로 도입된다.
반응장소를 떠난 기체-액체-고체 혼합물의 완전한 분리를 위해서 그리고 생체촉매의 반응 장소로의 완전한 복귀를 위해 다기능 분리 구획을 반응기 장소의 상부에 위치시키는 것이 유리하다. 이러한 다기능 분리구획을 가진 유동층 반응기는 담체입자에 부착된 생물량으로 폐수의 정제를 위해 EP-A-0090450에 기재되어 있다.
같은 유형의 반응기가 특히 본 발명에 따르는 생체촉매를 사용할 때 에탄올 제조를 위해 역시 유리하게 사용될 수 있음이 놀랍게도 현재 발전되었다. 효모세포와 같은 생세포의 성장율대 잔존시간에 관한 반응기의 원리는 상기 유립특허출원에 개시된 것과 유사하며 최적 이용을 위한 특정한 조건은 특히 사용된 특정세포에 따라 숙련자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
반응기는 계속해서 발효성 당의 공급원료로 공급되고 에탄올을 포함하는 생성물 기류는 계속해서 제거된다. 효모와 공급원료의 발효성 당을 배합하는 것이 물론 필요하며 그리고 하나의 특히 유리한 구체예에서 생체촉매는 아밀로글루코시다제와 함께 우리의 기탁한 균주인 맥주 효모균 CBS 252.86 또는 CBS 253.86을 함유할 수 있고 공급원료는 덱스트린을 포함할 수 있다.
덱스트린은 전분을 예를들면 알파-아밀라제로 효소 분해에 의해 제조된 약 7 내지 10의 평균 중합도를 갖는 덱스트린이며 덱스트린의 최종 분해는 아밀로글루코시다제에 의해 생체촉매 자체로 달성되는 글루코스공급원료를 제공한다.
다음 실시예들에 본 발명을 설명하기 위한 바람직한 구체예 몇가지가 기술되어 있다. 그러나 본 발명을 특정한 구체예에 한정시키기 위한 것이 아님을 이해해야 한다.
[실시예 1]
건조 인스턴트 효모(맥주 효모균 2103Ng, CBS No.6131, 96.5% 건조 고체) 40g을 약 40℃의 온도에서 젤라틴 60g을 함유하는 수용액 960ml에 현탁시켰다. pH를 5.5로 조정했다. 미리 40℃로 가열시킨 아세트산 노르말부틸 4000ml에 이 수용성 효모-젤라틴 현탁액을 교반하면서 첨가했다. 결과 생긴 현탁액을 급속히 10℃까지 냉각시키고 그것에 의해 효모-젤라틴-함유 입자가 형성되었다. 아세트산 노르말부틸을 따라내었다. 입자(1kg 습윤 비이드)를 5℃의 온도에서 1시간동안 pH 6.5로 조정한 물 2000ml내에 글루타르디알데히드 30g이 든 용액(50%v/v용액)으로 가교결합시켰다. 아세트산 노르말부틸 냄새가 더이상 탐지되지 않을 때까지 입자를 물로 세척했다. 결과 생긴 입자들은 양호한 물리적 안정성을 가졌으며 물에 불용성이었다. 걸린 효모세포를 호기성 조건하에 공급 배지 3000ml에서 하룻밤 동안 회분식으로 배양하였다.
pH를 0.1N NaOH로서 4.5로 유지시키고 재킷에서 항온 제어수조로부터 물을 순환시킴으로서 온도를 35℃로 유지시켰다.
선택된 효모 배양균을 22% 글루코스, 2% NH4Cl, 0.5% KH2PO4, 0.1% NaCl, 1% MgSO4·7H2O, 0.2% CaCl2·2H2O, 트윈 80(1ml/ℓ), 에르고스테롤(6.5ml/ℓ),0.1% 효모 추출물, 비타민 B(7.5mg/ℓ) 및 포이제(0.5ml/ℓ)로 구성(%v/v용액)된 배지에서 성장시켰다.
고정화 과정의 후속 단계들에서 입자에 피막 형성시킨 생존 가능성 세포량(맥아 엑스 한천 위에서 평판계수)이 표 1에 요약되어 있다. 젤라틴-포매(gelatin-embedded) 효모 세포에 대한 아세트산 노르말부틸의 저하 효과는 측정될 수 없었다.
[표 1]
Figure kpo00002
[실시예 2]
효소단독의 대실에 건조 인스턴트 효모(맥주 효모군 2031Ng, CBS No. 6128,96.5% 건조고체) 40g과 아밀로글루코시다제 (AMIGASE LX, 26.000 AGT units/ml, Gist-brocades)8ml로 시작하는 것을 제외하고는 실시예 1에 기술된 바와 똑같은 방법으로 하여 가교 결합 효모-아밀로글루코시다제-젤라틴 입자를 얻었으며, 이것은 물에 불용성이었으며 양호한 물리적 안정성을 지녔다.
[실시예 3]
맥주 효모균 1777Ng, CBS No.4877, 96.5% 건조고체를 사용하는 차이점외에는 실시에 1에 기술된 방법으로 효모-젤라틴 입자를 제조하고 아세트산 노르말부틸을 따라낸 후에 얻어진 입자를 가용성 아밀로글루코시다제 존재하에 글루타르디알데히드와 가교 결합시켰다. 물 200ml내에 글루타르 디알데히드 30g(50%v/v 용액)과 아밀로글루코시다제(AMIGASE, 실시예 2 참조) 200ml가 든 용액과 습윤 비이드 1000g을 pH6.5와 5℃의 온도에서 1시간동안 가교 결합시켰다.
용액을 제거한 후 가교결합제가 완전히 제거될때까지 아밀로글루코시다제로 피복된 효모-젤라틴 입자를 여러차례 세척했다. 실시예 20에 기술된 바와 같이 에탄올 발효를 수행했다. 아밀로글루코시다제-효모-젤라틴 입자들은 실시예 2의 방법에 의해 만들어진 입자들과 비교해 볼때 휠씬 ㄴ더 큰 조작상의 안정성을 나타내었다.
[실시예 4]
불용성 미생물의 연속성 생산을 위해, 방법을 다음과 같이 변경시켰다. 미생물을 함유하는 젤라틴 용액을 다수의 협관을 통해서 5℃에서 보존된 아세트산 노르말부틸을 함유하는 칼럼내로 펌프했다. 하부끝이 아세트산 부틸 높이 아래에 위치된 관들은 아세트산 노르말부틸에 도달하자마자 작은 물방울로 분쇄되는 일정한 기류의 미생물-젤라틴 용액을 전달했다. 작은 물방울의 크기는 펌프의 속력에 좌우되었다. 아세트산 노르말부틸은 글루타르 디알데히드를 함유했다. 칼럼의 길이는 내려온 작은 물방울이 굳어지고 가교결합제와 반응할 수 있는 충분한 시간을 가질 수 있도록 5m이었다. 얻어진 비이드를 계속해서 칼럼의 하부로부터 수집하고, 아세트산 노르말부틸로부터 분리시키고 물로 세척했다. 소모된 글루타르디알데히드를 보충한 후에 아세트산 노르말부틸을 칼럼에 재순환시켰다. 칼럼은 내부 직경이 약 4cm이고 1시간당 약 8ℓ의 불용성 미생물 비이드를 생산했다.
[실시예 5]
공동고정된 미생물-효소 입자를, 효소(들)와 미생물(들)을 함유하는 젤라틴 용액을 차가운 아세트산 노르말부틸 용액으로 방출시키는 차이점외에는 실시예 4에 기술된 방식으로 계속 생산하였다.
[실시예 6]
일련의 실험에서, 다음의 유기용매가 아세트산 노르말부틸 대신에 계속해서 사용되는 차이점외에는 실시예 1에 기술된 바와 같이 효모-젤라틴 입자를 제조하였다 : 톨루엔, 가솔린, 석유에테르(고비점 분율, 70/110), 시클로헥산, 노르말펜탄 모든 경우에 이러한 유기용매내에서 최소한 1시간 배양후의 생존 가능성 세포량은 100%이었다.
[실시예 7]
효모를 아세토박터 파스퇴리아늄(Acetobactef pasteurianum) 균주 ATCC 9325로 바꾸는 것을 제외하고는 실시에 4에 기술된 방법과 똑같이 하여 불용성 입자를 얻었다.
고정화 과정의 후속 단계들에서 입자에 피막 형성된 생존 가능성 세포량(pH 7.4에서, Difco 제조의 B.H.I. 한천위에서 평판계수)이 표 2에 요약되어 있다. 젤라틴-포매 아세토박터속 세포들에 대한 아세트산노르말의 저하효과와 또한 글루타르 디알데히드에 의한 세포의 손상이 탐지되지 않았다.
[표 2]
Figure kpo00003
[실시예 8]
게껍질 키토산 20g을 40℃에서 묽은 아세트산 450ml에 용해시키고 아세트산 나트륨 30g으로 pH 6.0까지 중화시켰다. 그리고나서 아세토박터 파스퇴리아늄의 습윤세포 250g을 키토산 용액에 현탁시키고 온도를 40℃에서 보존시켰다. 별도로 한천 20g을 수도물 500ml에 용해시키고 온도를 100℃로 상승시켰다.
한천 용액을 45℃로 냉각하고 아세토박터-키토산 현탁액에 이것을 가하였다. 현탁액을 실시예 5에 기술된 바와 같이 5℃에서 아세트산 노르말부틸에 방출시켰다. 얻어진 입자를 물로 세척하고 가교결합제의 농도를 2배로 높이는 것을 제외하고는 실시예 3에 기술된 바와 같이 글루타르 디알데히드로 가교결합시켰다.
입자는 물에 불용성이었으며 양호한 물리적 안정성을 나타내었다.
[실시예 9]
세균 슬러리(Lactobacillus plantarus, 3.5% 건조고체) 250g을 약 40℃의 온도에서 젤라틴 60g을 함유하는 수용액 750ml에 현탁시켰다.
이 수용액 세포-젤라틴 현탁액을 40℃로 미리 가열시킨 아세트산 노르말부틸 4000ml에 교반하에 첨가하였다. 결과생긴 현탁액을 10℃로 재빨리 냉각시키고 세균-젤라틴 함유 입자가 형성되었다. 입자(1kg 습윤비이드)를 5℃의 온도에서 1시간동안 pH 6.5로 조정한 물 2000ml 내에 글루타르 디알데히드 30g이 든 용액(50%v/v 용액)으로 가교결합시켰다. 아세트산 노르말부틸의 냄새가 더이상 탐질될 수 없을 때까지 입자를 물로 세척했다. 결과 생긴 입자는 양호한 물리적 안정성을 가지며 물에 불용성이었다. 걸린 세균세포를 미호기성 조건하에 3000ml의 영양 배지에서 회분식으로 배양시켰다. pH를 10N NaOH로써 6.0으로 유지시키고 재킷에서 항온제어수조로부터 물을 순환시킴으로서 온도를 30℃로 유지시켰다. 선택된 세균 배양균을 10g/ℓ 펩톤, 8g/ℓ 랩-렘코(Lab-Lemco), 4g/ℓ 효모추출물, 20g/ℓ 글루코스, 1g/ℓ 트윈 80, 2g/ℓ K2HPO4, 3g/ℓ 아세트산나트륨, 2g/ℓ 구연산 트리암모늄, 0.2g/ℓ MgSO4·7H2O, 0.038g/ℓ MnSO4·H2O 및 60g/ℓ 기스텍스(GISTEX)로 구성된 배지에서 성장시켰다.
고정화 과정의 후속 단계들에서 입자에 피막형성시킨 생존가능성 세포량(MRS AGAR(OXOID CM 359)위에서 평판계수)이 표 3에 요약되어 있다. 젤라틴-포매 세균 세포에 대한 아세트산 노르말부틸의 저하효과는 측정될 수 없었다.
[표 3]
Figure kpo00004
(*9×108세균세포/g 건조체비이드)
[실시예 10]
클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) ATCC 824(Weizmann 균주) 의 활성있게 성장한 배양균을 표 4에 기술된 배지로 접종시키고(0.5%) 질소분위기하에 37℃에서 pH 조절없이 배양시켰다. 2주후, 발효조의 함유물을 거두어 들이고 포자를 무균탈염수로 2번 세척했다.
대표적인 수율은 0.43g 포자(습윤중량)/g 글루코스이었다. 1mg 포자는 2.3×1010포자에 상당한다. 선택된 조건하에서 배양균의 최대 성장율(μmax)은 0.36시간이었다. 세척된 포자를 최종농도가 15g/ℓ (약 5g/ℓ 건조중량)이 되도록 재현탁시키고 분취물을 글루타르디알데히드(1%w/w까지)의 존재하에 5℃ 이상의 온도에서 1시간 동안 배양시켰다. 무균탈염수로 세척한 후 글루코스(10g/ℓ)를 함유하는 뇌-심장 침출액으로 접종시킨 희석계열을 열처리(80℃에서 2분간)하고 37℃에서 배양시켰다. 효모/아밀로글루코시다제에 대한 표준 방법에 따라 포자를 젤라틴(6.0%w/w)에서 고정화시키고 (0.2%w/w) 글루타르디알데히드(0.75%w/w)로 가교결합시켰다. 포자 생존능력을 처리중에 이따금 검사했다. 단백질분해 효소 현탁액에 의한 젤라틴의 가수분해후에, 희석계열을 포자를 열활성화시킨 후 글루코스(10g/ℓ)와 디티오트레오톨(0.08%w/w)을 함유하는 BHI 한천 위에 덮었다. 혐기성병에서 1주일간 37℃에서 배양후에 얻은 계산치는 클로스트리듐 아세토부틸리쿰 포자의 생존능력이 사용된 고정화 과정에 의해 영향을 받지 않음을 나타내었다.
[표 4]
Figure kpo00005
[실시예 11]
유산간균속 세포를 고정시키기 위해 젤라틴(6%w/w)과 키트산(Sigma, C-3646) 0.5%w/w의 혼합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 9에 기술된 바와 같이 락토바실루스 폴란타루스(Lactobacillus Plantarus)를 고정시켰다. 고정화 과정의 후속 단계들에서 입자에 피막형성시킨 생존할 수 있는 세포량(실시예 9에 기술된 바와 같은 평판계수)이 표 5에 요약되어 있다.
[표 5]
Figure kpo00006
[실시예 12]
효모세포를 고정시키기 위해 젤라틴(6%w/w)과 폴리에틸렌이민(sp-200 Nippon Shokubai) 2%w/w의 혼합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 11에 기술된 방법을 반복했다. 고정화 방법의 후속 단계들에서 입자에 피막 형성시킨 생존할 수 있는 세포량(실시예 1에 기술된 바와 같은 평판계수)이 표 6에 요약되어 있다.
[표 6]
Figure kpo00007
[실시예 13]
젤라틴(4%w/w)과 알긴산아민(2%w/w)의 혼합물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 9에 기술된 방법을 반복했다. 상기 알긴산아민 유도체를 다음과 같이 제조했다 : 증류수 750ml 내에 마누콜 E/RE(Manucol E/RE) 20g이 든 용액(pH 3.5)에 신속하게 그러나 소량으로 증류수 200ml 내에 1,6-헥산디아민 23g(0.2몰)이 든 용액을 첨가하였으며 진한 아세트산을 첨가하여 이 용액의 pH를 10.0으로 조정하였다. 반응혼합물을 실온에서 4시간 교반시키고 그후 메탄올 1.0ℓ로 희석시켰다. 첨전물을 여과시키고 메탄올 200ml로 2번 세척했다. 50℃에서 진공건조후, 효소와 미생물에 대해 유용한 지지물로 보이는 백색분말을 얻었다. 글루타르디알데히드로 가교결합후(실시예 1 참조), 양호한 물리적 안정성을 가지며 표 6에 주어진 데이타와 필적하는 생존가능성 세포 계산치를 가진 불용성 입자를 얻었다.
[실시예 14]
약 40℃의 온도와 pH5.0에서 젤라틴 17g을 함유하는 수용액 175ml에 식물세포(Tagetes minuta : 1.5%w/w 건조물)의 슬러리 75g을 현탁시켰다. 젤라틴 용액을 함유하는 식물세포를 다수의 협관을 통해서 5℃에서 보존된 아세트산 노르말부틸을 함유하는 칼럼내로 보내었다. 하부끝이 아세트산 부틸 높이 아래에 위치된 관들은 아세트산 노르말부틸에 도달하자마자 작은 물방울로 분쇄되는 일정한 기류의 식물세포-젤라틴용액을 전달했다. 작은 물방울의 크기는 펌프의 속력에 좌우되었다. 칼럼의 길이는 내려온 작은 물방울이 굳어지기에 충분한 시간을 가질 수 있도록 5m이었다. 얻어진 비이드를 계속해서 칼럼의 하부로부터 수집하고, 아세트산 노르말부틸로부터 분리시키고 물로 세척했다. 아세트산 노르말부틸을 칼럼에 재순환시켰다.
칼럼은 내부직경이 약 4cm이고 1시간당 약 8ℓ의 불용성 식물 세포비이드를 생산했다. 얻어진 입자를 수도물로 광범위에 걸쳐서 세척했다. 이들은 물에 불용성이었으며 양호한 기계적 안정성을 가졌다.
[실시예 15]
아세트산 노르말부틸 대신에 가솔린을 사용하여 실시예 14에 가술된 방법을 반복하였다. 이 실험에서도 역시 양호한 기계적 안정성을 가지며 수불용성인 입자를 얻었다.
[실시예 16]
산화 지르코늄 분말(325메시)을 차가운 아세트산 노르말부틸로 방출시키기 전에 효모-젤라틴 현탁액에 가하는 것을 제외하고는 실시예 4에 기술된 바와 같이 일련의 실험에서 효모-젤라틴 입자를 제조했다. 첨가된 ZrO2의 양이 많을수록 얻어진 습윤 입자의 밀도가 더욱 커지는 것으로 나타났다. 대표적인 일련의 실험결과가 제 1 도에 제시되어 있다.
[실시예 17]
소량의 포스파티딜콜린(레시틴)을 실시예 4에 기술된 실험에서 아세트산 부틸에 가하였다. 이 결과 작은 비이드 대신에 가는 섬유가 생산되었다.
[실시예 18]
공동 고정된 아밀로글루코시다제와 효모의 습윤 입자 20g을 실시예 2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 저장 안정성을 증가시키기 위해 효모-아밀로글루코시다제-젤라틴 입자를 효모과립의 온도가 40℃를 초과하지 않도록 주의하면서 실험실용 비연속 유동기에서 20 내지 30분간 건조시켰다. 공기로 유동화와 입자를 초기단계에서 손으로 교반하거나 혼들어주면서 신속하게 수행되는 건조과정의 개시에 큰 관심을 기울였다. 결과 생긴 입자는 85 내지 93%의 건조체를 함유했다. 효모세포 또는 공동고정된 아밀로글루시다제의 어느것도 5℃의 진공상태에서 보존되었을때 12개월에 걸쳐 활성의 어떠한 손실도 나타나지 않았다.
[실시예 19]
실시예 1에 기술된 방법에 따라 얻어진 효모-젤라틴함유 입자를 350g의 습윤입자로 채우고 다른 유동속도에서 반응기를 통해 pH 4.5에서 서술된 성장배지에 첨가된 멸균의 20%(w/v) 글루코스 용액을 통과시킴으로써 생체 반응기(CSTR)(조작부피 : 800ml)에서 사용하였다. 온도를 32℃로 유지시켰다. 생체반응기를 계속해서 4개월간 작동시켰다. 에탄올, 글루코스 및 글리세롤의 측정을 위한 시료를 이 기간에 걸쳐 유출물로부터 취하였다. 멸균을 지속시키기 위한 예방책을 취하지 않았으나 오염이 관찰되지 않았다.
얻어진 결과는 8.0 내지 8.5부피%의 평균 에탄올 농도에서 고정된 효모세포의 조작상 안정성이 높음을 증명해준다.
[실시예 20]
실시예 2에 기술된 방법에 따라 얻어진 효모-아밀로글루코시다제-젤라틴 입자를 재생하고 글루코스 대신에 최초의 DE가 15를 갖는 맥아덱스트린(Snowflake) 20% 용액을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 19에 기술된 방법과 똑같이 사용하였다.
결과가 제 2 도에 제시되어 있으며 그 결과는 사용된 공동 고정된 아밀로글루코시다제와 효모세포의 높은 조작상 안정성과 일단계 조작에서 DE-15 맥아덱스트린 기질을 에탄올로 전환할 수 있는 가능성을 증명해준다.
[실시예 21]
실시예 7에 기술된 방법에 따라 얻어진 아세토박터속-젤라틴 함유 비이드를 습윤비이드 80g과, 5%(w/v) 글루코스용액과 2%(w/v) 효모추출물 용액을 함유하는 멸균 배지 720ml로 채움으로서 생체반응기(CSTR)(조작부피 : 800ml)에서 사용하였다. 배지를 pH 7.0의 인산염으로 완충시켰다.
30℃의 온도에서 16시간 배양후 시료를 취하여 글루코스와 아세트산에 대해 분석했다.
아세트산의 최종농도는 0.5g/ℓ이었으며 산생산 속도는 1시간당 세포(건조체) 1g마다 아세트산이 21mg인 것으로 측정되었다.
글루코스 대신에 기질로서 에탄올을 사용하여 같은 실험을 똑같이 실행하였다. 후자의 경우에 아세트산의 농도는 0.8g/ℓ였고 생산속도는 1시간당 세포(건조체) 1g마다 아세트산이 31mg이었다.
[실시예 22]
실시예 9에 기술된 방법에 따라 얻은 락토바실루스 플란타루스 세포-젤라틴 함유 입자를 실시예 10에 기술된 배지 300ml와 함께 습윤입자 140g을 채움으로서 생체반응기(CSTR)(조작부피 : 800ml)에서 사용하였다.
발효개시때 22시간 동안 16ml/hr의 속도로 48%(w/w) 글루코스 용액 352ml를 발효조에 첨가했다. 온도를 30℃로 유지시키고 pH를 10N NaOH로써 6.0으로 유지시켰다. 총 비연속식 발효시간은 6일이었고 이기간동안 글루코스와 젖산의 측정을 위해 시료를 취했다. 멸균을 지속시키기 위한 예방책을 취하지 않았으나 오염이 관찰되지 않았다. 얻어진 결과는 젖산의 고생산성과 결국 96%에 이르는 잔존 고수율을 증명해준다. 발효의 말기에 젖산의 농도는 제 3 도에 제시된 바와 같이 71.8%(w/v)이었다.
[실시예 23]
N2가스로 공급된 CSTR(배양부피 0.5리터)와 표 4에 기술된 배지를 실시예 10에 기술된 것처럼 고정된 클로스트리듐속 세포와 함께 유기용매의 발효를 위해 사용하였다. 비이드(2g/ℓ 포자를 함유하는 0.25ℓ)의 멸균과 발아의 활성화는 크로우웰의 방법(Krouwel, Biotechnol. Letts. 3(1981) 158-159)에 따라 수용성 에탄올(50%w/w)을 이용하여 달성했다. 배지 첨가전에 무균의 생리염으로 세척함으로서 에탄올을 제거했다. 발아기와 발육기만이 계속되었다. 처음 160시간 동안 얻어진 발효 결과가 제 4 도에 제시되어 있다. 글루코스가 부탄올, 낙산염, 아세트산염 및 젖산염으로 전환되었다. 미량의 아세톤이 가끔 보였다(제시되지않음). 얻어진 최대의 부탄올 생산성은 글루코스 전환속도 5g/1h에서 0.76g/1h이었다.
배양균의 여러 단계에서 비이드의 주사전자 현미경사진은 포자와 몇 잔존세포가 젤라틴 기질의 모든곳에 고르게 분포되어 있고 비이드의 완전한 전이증식이 7일후 달성되었음을 제시한다.
[실시예 24]
실시예 14와 15에 기술된 바와 같이 고정된 식물세포의 산소 소모를 2%w/v 수크로스를 함유한 무라쉬게와 스쿡(Murashige and Skoog)배지에서 측정하였다. 결과가 제 5 도에 제시되어 있다. 고정된 타게테스미누타세포의 산소 소모는 현탁액의 세포와 같은 양이었다.
[실시예 25]
맥주 효모균 IFO 0203(CBS 252.86)의 돌연변이
이 방법은 효모의 연속 배양에 입각한 것이며, 발효조(the 'phauxostat')에 신선 배지첨가 속도를 제어하기 위해 성장 의존성 pH 변화를 시켰다. 이 방법이 마르틴과 헴플링(G.A. Martin and W.P.Hempfling, Arch. Microbiol. 107(1976)41-47)에 의해 기술되었다. 1리터 갈렌캄프 발효조를 아래에 제시된 조성물을 갖는 최소 기본 배지로 채웠다. 3%v/v의 알코올 농도가 처음에 확인되었다. 모든 조작을 멸균 조건하에서 수행하였고, 그것의 복합배지 0.5리터를 함유하는 발효조에 미리 성장시킨 맥주 효모균 lFO0203(CBS 252.86)의 배양균을 살포했다. pH는 처음에 4.5에서 유지되었으며, 발효조는 pH를 4.5로 유지시키기 위해 필요할때 주입되는 N NaOH를 위한 유입구가 갖추어져 있다. 발효조는 글루코스 농도가 결코 제한되지 않도록 '파욱소스타트'('phauxostat')에 의해 제어되는 신선 배지를 위한 유입구도 역시 가지고 있다.
처음 온도는 32℃이었다. 발효조가 정상상태 작동에 도달했을때 온도가 40℃로 증가되었다. 발효조를 계속해서 7개월 동안 가동시켰다.
아래에 제시된 프로토콜에 따라, 알코올 농도가 제한되었을때 효모균체를 변이 유발소로 펄스시키고, 후속의 각 경우에 있어서 알코올 농도가 다시 제한되었을때 효모균체를 다시 변이유발소로 펄스시켰다. 처음에는 주입후 즉시 발효조의 EMS농도가 아래 지시된 백분율 w/v인 양으로 메탄술폰산에틸(EMS)을 주입했다. EMS를 3번 주입한 후, 주입후 즉시 발효조의 아질산 나트륨 농도가 아래 지시된 바와 같이 1리터당 밀리물인 양으로 아질산나트륨 수용액을 후속 투여했다.
기본 배지의 농도는 다음과 같다 :
NH4Cl 2.5g/ ℓ
KH2PO40.25g/ ℓ
MgSO4·7H2O 0.1g/ ℓ
NaCl 0.05g/ ℓ
포자성분 0.1(ml)
비타민 0.5(ml)
에르고스테롤 1.72(mg)
트윈 80 0.25g/ ℓ
글루코스 100g
변이유발소 펄스 프로토콜은 다음과 같다 :
Figure kpo00008
시료를 일정한 간격에서 회수하고 총 2490시간후 회수된 시료를 희석시켜 6% 에탄올을 함유하는 맥아한천위에 덮었다. 분리된 다양한 돌연변이균주가 37℃에서 6시간 배양후 2.53 내지 3.61%v/v에서 에탄올 농도를 상승시키는 것이 발견될때 이미 기술된 바와 같이 37℃에서 6시간 경과후 16개의 양호한 성장 집락의 알코올 생산시험에 대해 또 분석하였다.
주 배양의 발효가 계속되었고 총 4860시간 배양후에 다시 시료를 취했다.
얻어진 돌연변이체가 대략 2.69 내지 3.56v/v 에탄올을 생산한 수 있는 것이 발견될때 앞서 기술한 방법에 의해 분리된 다양한 시료를 37℃에서 6시간 경과후 알코올 생산에 대해 다시 검사했다. 3.56% 에탄올을 생산하는 시료를 돌연변이체 4860KI1로 명명하고 3.31% 에탄올을 생산하는 돌연변이체를 돌연변이체 4860 KI6로 명명했다.
[실시예 26]
제 6 도에 예시된 유형의 유도층 반응기에서 발효를 수행하였다.
발효조는 본질적으로 내부직경이 14cm인 침전부(2)와 침전기(2)내부에 가스분리부(3)가 있는 내부직경이 6cm이고 길이가 1500cm인 칼럼 형태의 유동층부(1)로 구성되어 있다. 유동층부(1)은 공급재료관(12)에 의해 아래로부터 공급되고 침전부(2)는 배출구(14)와 재순환 배출구(15)가 갖추어져 있다.
유동층부(1)는 물 재킷(4)에 의해 온도조절장치에 의해 제어된다. 물 재킷(4)은 선(6)을 경유하여 공급되고 온도제어장치(7)와 냉각수 저장기(11)에 의해 제어된다. 유동층부(1) 내부의 pH는 주입관(5)을 통한 알칼리의 공급을 제어하는 pH 제어장치(10)에 의해 제어된다. 공급원료는 유입구(12)를 통해 유동층부(1)에 공급되고, 유입구(12)는 온도지시장치(8)와 pH 지시장치(9)로 갖추어져 있다. 선(15)을 경유하여 침전부(2)를 떠난 재순환기질은 펌프(13)를 통해 다시 유입구(12)를 통해 재순환된다.
다음 조성을 가진 기질을 제조했다.
A.맥아덱스트린(DE 8-10) 160 g/ℓ
NH4Cl 2.5g/ ℓ
KH2PO40.25g/ ℓ
B.기본염
CaCl2·2H2O 2.0g/ ℓ
MgSO4·7H2O 10.0g/ ℓ
NaCl 1.0g/ ℓ
C. 포자-성분
구연산 0.250g/ ℓ
FeSO4(NH4)2SO4·6H2O 0.450g/ ℓ
ZnSO4·7H2O 0.084g/ ℓ
CuSO4·5H2O 0.013g/ ℓ
MnSO4·4H2O 0.010g/ ℓ
H3BO30.010g/ ℓ
Na2MoO4·2H2O 0.010g/ ℓ
KI 0.005g/ ℓ
D. 비타민
이노시톨 0.200g/ ℓ
니코틴산 0.010g/ ℓ
D-판토텐산칼슘 0.010g/ ℓ
비타민 B1 0.010g/ ℓ
파라아미노벤조산 0.006g/ ℓ
비타민 B6 0.001g/ ℓ
D-비오틴 0.04×10-3g/ ℓ
에르고스테롤 0.001g/ ℓ
트윈-20 0.250ml/ ℓ
포지제 0.25ml/ ℓ
맥아덱스트린 용액, 기본염 배지, 비타민 용액 및 포자-성분 용액을 따로따로 120℃에서 20분간 멸균시켰다. 멸균후 네 용액에 기술된 것과 같은 조정물을 함께 첨가했다.
유동층 반응기(제 6 도)는 50%(E=0.5)의 조작부피(ℓ)를 위해 비이드(평균직경 : 1.8mm)로 채웠다. 이러한 비이드는 실시예 2에 상세히 기술된 바와 같이 가교 결합 젤라틴 지지물로 고정시킨 WO활성화 효모세포와 아밀로글루코시다제로 구성되어 있다. 이 실시예에 제시된 실험은 다음 유형의 효모균주로 수행하였다 :
1. 맥주 효모균(빵 효모,227Ng)
2. 맥주 효모균 CBS 252.86
3. 맥주 효모균 CBS 253.86
맥아덱스트린(Morsweet, CPC)용액을 모든 과당류가 당화되고 에탄올로 전환될 수 있는 특정속도에서, 계속해서 (11)로부터 발효조에 공급한다. 온도를 32℃에서 유지시키고 4.0N NaOH를 가함으로서 pH를 4.15에서 유지시켰다.
기질은 상기 조건하에서 계속해서 발효되었다. 유동화에서 비이드를 돕기 위하여 반응 혼합물의 선속도를 순환관(12)위의 펌프(13)에 의해 0.15m/sec로 조정하였다. 유출 혼합물의 에탄올 농도, 맥아덱스트린, 맥아당 및 글루코스와 같은 당의 농도 및 글리세를 농도를 탄수화물 칼럼형 HPX 07 C Biocad를 가진 고압액체 크로마토그래피를 이용하여 매일 측정했다.
제 7 도는 사용된 3가지 다른 유형의 효모 균주로써 반응기안의 기질의 희석률과 최종 에탄올 농도의 관계를 제시한다. 각각의 정상상태는 1주일 유지되었다. 놀랍게도 효모균주 CBS 252.86과 CBS 253.86만이, 빵 효모의 경우 9% 이하의 최종 에탄올 농도가 3%v/v 이상의 글리세롤 농도와 비교해볼때, 부피의 10.5% 이상의 최종 에탄올 농도와 2% 이하의 글리세롤 농도에 도달할 수 있었다. 게다가 CBS 253.86에서 알코올 생산의 평형농도는 더 일찍 도달되었다.
[실시예 27]
맥주 효모균 CBS 253.86을 실시예 1에 기술된 바와 같이 젤라틴에 고정화시키고 산소 존재하에 실시예1의 발효 배지에서 배양시켰다. 비이드내의 효모세포의 성장은 평판계수에 의해 경시적으로 측정했다. 제 8 도에는 배양시간에 관련하여 그램건조체 비이드마다의 생존가능성 평균세포 농도가 제시되어 있다.
그램 건조물 비이드당 최소 4×109세포의 최종 농도가 얻어질 수 있었다. 실시예 26의 유동층 반응기를 이러한 활성화된 비이드로 채움으로서 반응기 부피당 고농도의 효모세포가 획득되었다. 제 9 도에는 반응기를 비이드로 채움과 관련하여 반응기 1m3당 효모세포의 숫자가 제시되어 있다. 효모세포의 농도는 세포 재순환 반응기와 같은 비고정화 반응계에서 얻어진 농도의 최소한 10배였다.
[실시예 28]
공동고정된 아밀로글루코시다제를 가진 고도로 활성화된 비이드와 맥주 효모균 CBS 253.86(실시예 27참조)을 실시예 26에 기술된 그러나 서로 연속으로 연결된 3개의 유동층 반응기의 발효계에서 사용하였다. 각 반응기를 조작 부피의 40%w/v까지 비이드로 채웠다.
제 1단계, 제 2단계 및 제 3단계의 부피는 각각, V1=500ml, V2=480ml 및 V3=800ml이었다. 이 반응기들내의 영양물의 잔존시간(T)은 T1=2.63h, T2=2.53h 및 T3=4.21h이었다. 제 2 도에 최종 에탄올농도 및 아밀로글루코시다제 잔존 활성의 결과가 주어져 있다. 이 도면은 제 3단계에서 10.4부피%의 평균 에탄올 농도로의 에탄올 생산을 위한 안정한 반응계를 나타낸다.
표 7에는 세단계들의 평균 비반응속도, 에탄올 농도, 수율 및 생산속도가 요약되어 있다.
[표 7]
Figure kpo00009

Claims (18)

  1. 다음의 (a) 내지 (e) 단계들로 구성된 미립자형태의 생세포로 이루어진 고정된 수불용성 생체촉매의 제조방법 : (a) 겔화제 수용액에 생세포를 현탁시키고, (b) 이렇게 얻어진 혼합물을 물에 불충분하게 혼화하거나 혼화하지 않는 유기용액과 결합시켜 생세포와 겔화제로 이루어진 수용성 입자의 유기용액의 현탁액을 형성시키며, (c) 입자내의 겔화제가 굳어지도록 현탁액을 처리하며, (d) 단계 (c)에서 얻어진 입자를 2관능성 또는 다관능성 가교결합제로 처리하여 입자내의 겔화제를 가교결합시키는 단계 및 (c) 단계 (d)에서 얻어진 입자로부터 최소한 물성분을 제거하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 생세포는 진균, 박테리아 및 식물세포 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생세포가 생세포 및 겔화제와 공존할 수 있는 하나 또는 하나이상의 효소와 함께 분산되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 효소는 (a) 단계의 현탁액에 도입되거나 및/ 또는 (d) 단계 가교결합한 겔화된 현탁액에 도입되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 효소는 아밀로글루코시다제, 락타제, 말타제, 아밀라제, 글루코스 이소메라제, 풀룰라나제, 인버타제, 리파제, 에스테라제, 글루코스 옥시다제 또는 탈수소효소인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 젤화제는 젤라틴이거나, 또는 겔화 폴리카보하이드레이트와 가교결합조건하에 가교결합할 수 있는 유리아미노기함유 중합체와의 혼합물인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 생세포 S. cerevisiae, 또는 가교결합된 젤라틴에 분산된 아밀로글루코시다제와 함께 사용되는 생세포 S. cerevisiae로 구성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생세포는 40℃를 초과하는 온도의 효모 추출물/펩톤/글루코스에서 지속적인 성장을 할 수 있는 내열성 S. cerevisiae 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 내열성 균주는 S. cerevisiae CBS 252.86(KCTC 8251p)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 생세포는 25초 이상의 D가 (58℃에서 생세포의 90%를 죽이는데 필요한 시간)를 가진 에탄올 감수성 S. cerevisiae 균주인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 에탄올 감수성 균주는 S. cerevisiae CBS 253.86(KCTC 8252p)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계(c)에서 얻어진 입자는 탈수 바람직하게는 삼투성 수축에 의해 탈수되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 단계(e)에서 얻어진 입자는 재수화되며 그리고 원한다면 고정된 세포가 성장되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 의한 생체촉매를 사용하는 것을 특징으로 하는 탄수화물의 전환방법.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 의한 생체촉매 존재하에 발효성 당을 발효조건에서 발효시키는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 당공급원료는 계속해서 발효조로 공급되며, 에탄올은 발효조로부터 계속해서 제거되는 연속발효조에 생체촉매를 지지시키는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 공급원료는 덱스트린이고, 생세포는 S. cerevisiae CBS 252.86(KCTC 8251p) 또는 S. cerevisiae CBS 253.86(KCTC 8252p)이며, 생체촉매에는 아밀로글루코시다제가 더 포함되는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
  18. 제 15 항, 제 16 항 또는 제 17 항에 있어서, 상부에 다기능 분리구획이 있는 유동층-반응기를 이용하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 에탄올의 제조방법.
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