NL1009814C2 - Werkwijze voor de bereiding van een N-geacyleerd aminonitril. - Google Patents

Description

- 1 - PN 9612

WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN EEN N-GEACYLEERD 5 AMINONITRIL

De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van een N-geacyleerd aminonitril waarbij een 10 aminonitril of een zout daarvan, wordt geacyleerd met een fenyl- of fenoxy- al dan niet a-gesubstitueerd-azijnzuur of een zout daarvan, in aanwezigheid van een Pen-G of een Pen-V acylase.

Het is bekend dat via chemische N-acylering 15 beschermgroepen aan te brengen zijn. Een nadeel van deze bekende werkwijzen is dat daarbij dure en vervuilende chemicaliën nodig zijn.

Verrassenderwijze is het mogelijk gebleken om aminonitrillen enzymatisch te acyleren op de N-20 positie, door een fenyl- of een fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur of een zout daarvan, toe te passen als acyleringsmiddel en een Pen-G of een Pen-V acylase als enzym. Met behulp van deze werkwijze kon een hoge opbrengst worden gehaald, zonder gebruik te 25 maken van dure en vervuilende chemicaliën. Na de acylering wordt een stabiel aminonitril verkregen waarmee diverse interessante volgreacties kunnen worden uitgevoerd. Een ander voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat de aangebrachte beschermgroepen na 30 volgreactie(s) gemakkelijk enzymatisch verwijderd kunnen worden.

De werkwijze volgens de uitvinding is met \ name interessant voor de N-acylering van a-aminonitrillen, aangezien deze eenvoudig toegankelijk 35 zijn via de Strecker reactie. De Strecker reactie is een evenwichtsreactie die bij relatief hoge pH wordt p10 09 8 1 4 - 2 - uitgevoerd, bijvoorbeeld bij een pH tussen 7 en 10. Pen-G en Pen-V acylases worden toegepast bij een pH tussen 6 en 10, het pH optimum ligt in het algemeen tussen 7 en 9. Dit betekent dat in het pH-gebied waarin 5 Pen-G en Pen-V acylases een optimale activiteit bezitten, ook in significante mate de (ongewenste) retro-Strecker-reactie (waarbij aminonitril weer wordt omgezet in de uitgangsproducten (aldehyde, ammoniak en HCN) van de Strecker-reactie) optreedt.

10 Verrassenderwijze is gebleken dat wanneer de N- acylering van het aminonitril wordt uitgevoerd bij een pH < 7, bij voorkeur < 6, de mate waarin de retro-Strecker reactie optreedt heel laag is, en, in tegenstelling tot wat uit de literatuur bekend is voor 15 andere verbindingen, bij aminonitrillen een hoge enzymactiviteit van de Pen-G en Pen-V acylases werd waargenomen.

Bij voorkeur wordt een, eventueel ring-en/of α-gesubstitueerd, fenylazijnzuur of een zout 20 daarvan in combinatie met een Pen-G acylase, of een, eventueel ring- en/of α-gesubstitueerd, fenoxyazijnzuur of een zout daarvan in combinatie met een Pen-V acylase toegepast.

De werkwijze volgens de uitvinding vormt 25 voor een aantal aminonitrillen een interessante route om optisch actieve aminonitrillen te maken. Er zijn vrijwel geen goede methoden bekend om optisch actieve aminonitrillen te maken aangezien de nitrillen bij een pH > 6 in het bijzonder > 7 in de regel chemisch 30 instabiel d.w.z. gevoelig voor retro Strecker reactie zijn. Verder zijn aminonitrillen bijzonder racemisatiegevoelig, met name bij hogere pH-waarden. Verrassenderwijze is nu gebleken dat de acylering van een aantal aminonitrillen, bijvoorbeeld a-aryl-a- „100981 4 - 3 - aminonitrillen, enantioselectief verloopt. Bovendien bleek, met name bij aminonitrillen met op de a-plaats een H, afhankelijk van de gekozen pH-waarde het resterende, niet geacyleerde, enantiomeer al dan niet 5 te racemiseren: bij een pH-waarde groter dan 4,in het bijzonder groter dan 5 bleek het resterende enantiomeer al relatief snel te racemiseren waardoor bijvoorbeeld uitgaande van een racemisch mengsel van a-fenyl-a-aminonitril het corresponderende (L)-N-10 fenylacetylderivaat met een opbrengst van meer dan 95% en een enantiomere overmaat van meer dan 97% kon worden verkregen. Daarnaast is gebleken dat bij lagere pH-waarden, bijvoorbeeld bij een pH lager dan 4,5, geen of langzame racemisatie optreedt. In dat geval kan met de 15 werkwijze volgens de uitvinding zowel het L-N-geacyleerde aminonitril als het D- niet geacyleerde aminonitril met hoge enantiomere overmaat, respectievelijk meer dan 95% en meer dan 90%, worden verkregen. Voor de bereiding van L-N-geacyleerd 20 aminonitril wordt bij voorkeur een pH tussen 4,0 en

7,0, in het bijzonder tussen 4,5 en 6,0 gekozen,· wanneer D-aminonitril wordt beoogd wordt bij voorkeur een pH tussen 2 en 5, in het bijzonder tussen 3 en 4,5 gekozen. Overigens is het in principe ook mogelijk op 25 optisch actief D-N-geacyleerd aminonitril te bereiden I

door enzymatische hydrolyse van chemisch bereid D,L-N-geacyleerd aminonitril.

De uitvinding heeft tevens betrekking op a-amino-a-aryl-nitrillen, in het bijzonder a-amino-a-H-30 aminonitrillen, met op de N-positie een acylgroep afgeleid van een fenyl- of een fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur met een e.e. groter dan 90%, in het bijzonder groter dan 95%.

r B1009 81 4 - 4 -

Geschikte aminonitrillen die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn bijvoorbeeld α-aminonitrillen in het bijzonder α-Η-α-aminonitrillen. Zij kunnen worden ingezet als vrije 5 base of als zout. Bij voorkeur wordt het a-aminonitril als zout toegepast omdat het aminonitril als zout stabieler is bij opslag. Het aminonitril kan worden toegepast als zout met elk willekeurig zuur, bijvoorbeeld een mineraal zuur, in het bijzonder HC1, 10 H2S04 of HN03, bij voorkeur H2S04, of een organisch zuur, in het bijzonder een carbonzuur, bijvoorbeeld fenylazijnzuur, of een sulfonzuur, bijvoorbeeld p-tolueensulfonzuur.

Geschikte fenyl- of fenoxy- al dan niet 15 α-gesubstitueerde-azijnzuren die kunnen worden toegepast in de werkwijze volgens de uitvinding zijn bijvoorbeeld fenyl- of fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerde- azijnzuren met formule 1 20 Ra - R4 O Rj.

co2h 25 met n = 0 of 1

Ri = H, OH, F, Cl, Br, nitro, alkyl of alkoxy met 1-3 C-atomen R2 ....R6 elk onafhankelijk H, OH, F, Cl, Br, N02 30 alkyl» alkoxy met 1-10 C-atomen.

Bij voorkeur zijn R2 tot R6 elk gelijk aan H en staat Ri voor H of OH.

Het fenyl-of fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerde- azijnzuur kan als vrij zuur, of als

^009 8 1 A

- 5 - zout met een base worden toegepast. Geschikte basen zijn bijvoorbeeld ammonia en (aard)alkalihydroxiden.

Bij voorkeur wordt een zout van fenyl- of fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur toegepast om de 5 oplosbaarheid te verbeteren, in het bijzonder het ammoniumzout van fenylazijnzuur, of het zout van fenylazijnzuur en het te acyleren aminonitril.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt een zout van een aminonitril met een zuur, als 10 geconcentreerde oplossing in contact gebracht met een geconcentreerde oplossing van een zout van fenyl- of fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur met een base, en wordt vervolgens de enzymreactie gestart. Het maakt daarbij niet uit of de aminonitriloplossing wordt 15 toegevoegd aan de fenyl- of fenoxy- al dan niet a-gesubstitueerd-azijnzuuroplossing, of omgekeerd, of beide oplossingen tegelijk worden toegevoegd.

Als enzymen worden in de werkwijze volgens de uitvinding Pen-G of Pen-V acylases toegepast.

20 Dergelijke enzymen zijn bijvoorbeeld bekend onder de algemene aanduiding penicilline amidase of penicilline acylase en zijn bijvoorbeeld beschreven in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry, Augustus 1989 p. 146-154 en in J.G. Shewale et. al. Process Biochemistry 25 International, Juni 1990, p. 97-103. Voorbeelden van geschikte enzymen zijn enzymen afgeleid van

Acetobacter, in het bijzonder Acetobacter pasteurianum. Ξ &gromonag, Alcaliaenes. in het bijzonder Alcaliaenes t faecalis, Aohanocladium. Bacillus sp.. in het bijzonder ' 30 Bacillus meaaterium. Cephalosporium. Escherichia, in z het bijzonder Escherichia coll. Flavobacterium.

Fusarium. in het bijzonder Fusarium oxysporum en -

Fusariwn Solani, Kluyvera, WycQplana, Protaminobacter.

EXQteus, in het bijzonder Proteus rettoari. Pseudomonas I

35 en Xanthomonas. in het bijzonder Xanthomonas citrii.

¢1009814 - 6 -

Bij voorkeur wordt een geïmmobiliseerd enzym toegepast, aangezien het enzym dan eenvoudig afgescheiden en hergebruikt kan worden.

Van de geïmmobiliseerde enzymen die 5 commerciëel verkrijgbaar zijn, zijn bijvoorbeeld bijzonder geschikt gebleken het Escherichia coli enzym van Boehringer Mannheim GmbH dat onder de naam Enzygel^ commerciëel verkrijgbaar is, het geïmmobiliseerde Penicilline-G acylase van Recordati en het 10 geïmmobiliseerde Penicilline-G acylase van Pharma

Biotechnology Hannover. Daarnaast kunnen enzymen ook als gecrosslinkte enzymkristallen worden ingezet (CLEC's™).

Het verkregen aminonitril kan vervolgens op 15 bekende wijze worden omgezet in het/de overeenkomstige aminozuuramide, aminozuur of aminozure ester. Het verkregen aminonitril kan bijvoorbeeld vervolgens desgewenst op bekende wijze worden omgezet in het overeenkomstige aminozuur, bijvoorbeeld door 20 behandeling met een sterk zuur, bijvoorbeeld een mineraal zuur, in het bijzonder HC1, H2S04 of HN03, of een organisch zuur, bijvoorbeeld een sulfonzuur. Bij behandeling van L-N-acyl-a-aminonitrillen met een sterk zuur kan gedeeltelijke racemisatie optreden.

25 Behandeling met een zuur van het niet N-beschermde a-aminonitril geeft a-aminozuuramides en a-aminozuren zonder racemisatie.

De uitvinding zal nu worden toegelicht aan de hand van de voorbeelden zonder evenwel daardoor te 30 worden beperkt.

Voorbeelden

Assemblase™ is een geïmmobiliseerde Escherichia coli v ; . penicilline acylase uit E. coli ATCC 1105, zoals *100981 4 - 7 - beschreven in WO-A-97/04086. De immobilisatie is uitgevoerd als beschreven in EP-A-222462, waarbij gelatine en chitosan als gelerend agens en glutaaraldehyde als crosslinker zijn gebruikt.

5 De uiteindelijke activiteit van de

Escherichia coli penicilline acylase wordt bepaald door de hoeveelheid enzym die aan de geactiveerde bolletjes is toegevoegd en bedroeg 3 ASU/g drooggewicht waarbij l ASU (Amoxicilline Synthese Unit) is gedefinieerd als de 10 hoeveelheid enzym die per uur 1 g Amoxicilline.3H20 genereert uit 6-aminopenicillaanzuur en de methylester van p-hydroxyfenylglycine (bij 20°C); 6,5% 6-aminopenicellaanzuur en 6,5% methylester van p-hydroxyfenylglycine).

15

Voorbeeld I: Ammonium fenylacetaat

Aan een oplossing van 69,1 g (0,50 mol) fenylazijnzuur in 200 ml aceton werd 34 g (37,4 ml; 20 0,50 mol) 25% waterige ammonia toegedruppeld gedurende 5 minuten. Er ontstond een witte suspensie, welke 30 minuten werd geroerd. De witte vaste stof werd gefiltreerd, gewassen met 2 x 50 ml aceton en gedroogd tot constant gewicht.

25 Opbrengst: 75,0 g (98%).

Voorbeeld II: L-2-fenyl-2-(fenylacetamido)-acetonitril

34,8 g (0,225 mol) ammonium fenylacetaat I

30 werd opgelost in 750 ml water. M.b.v. 6,8 g geconcentreerd (96%) zwavelzuur werd de pH op 4,04 ~ gebracht; T=22 °C. Daarna werd direkt 30,0g(0,225 1 mol) (D,L) 2-amino-2-fenyl-acetonitril toegevoegd en werd de pH m.b.v. 3,9 g 25% waterige ammonia op 5,20 »10098 14 - 8 - gebracht. Aan de resulterende heldere oplossing werd 50 g Assemblase™ toegevoegd. De pH werd op 5,2 gehouden d.m.v. titratie met 20% waterige H2S04. Na 5 minuten ontstond er een witte vaste stof. Na 15 uur werd de 5 vaste stof afgefiltreerd (= Assemblase™ + het gevormde N-fenylacetyl aminonitril). De vaste stof werd gesuspendeerd in 100 ml water en de pH werd onder roeren m.b.v. H2S04 ingesteld op 2,0. Vervolgens werd de vaste stof opnieuw gefiltreerd, gewassen met 3 x 50 ml 10 water, en gesuspendeerd in 500 ml methanol. Assemblase™ werd gefiltreerd en nagewassen met 3 x 50 ml methanol. De gecombineerde methanolische filtraten werden ingedampt (T < 30 °C).

Opbrengst: 54,6 g (97%) L-2-fenyl-2-(fenylacetamido)-15 acetonitril met e.e.L = 98%

Voorbeeld III: L-2-gederivatiseerde-2-(fenylacetamido)-acetonitril verbindingen 20 De enzymatische reactie werd uitgevoerd met een aantal D,L-a-aminonitrillen, als HC1 zout, zoals beschreven in voorbeeld II (pH = 5,2). De opbrengsten aan geïsoleerde N-fenylacetyl-derivaten waren 90-98%.

De enantiomere overmaten staan weergegeven in tabel 1.

25

R C = N ( 0 J C0,H R C = N

V ^—. Y

H2N Assemblase™ HN

\

pH = 5,2 > = O

30 ^00981 4 - 9 -

Tabel 1: Enantioraere overmaat (e.e.J van 2-gesubstitueerde-2-(fenylacetamido) acetonitril verbindingen, bereid door reactie van (D,L)-a-aminonitrillen met fenylazijnzuur o.i.v. Assemblase™.

5 IR e.e.L (%) fenyl 98 p-chloorfenyl > 99 benzyl < 10 m-methoxybenzyl < 10 isopropyl < 10 fenylethyl < 10

Voorbeeld IV: D-2-amino-2-fenyl-acetonitril 10 1,53 g (0,010 mol) ammonium fenylacetaat werd opgelost in 50 ml water, en de pH werd op 4,0 gebracht m.b.v. H2S04. Er werd 1,32 g 0.010 mol (D,L)-2-amino-2-fenyl-acetonitril toegevoegd. Vervolgens werd de pH verlaagd van 4,6 naar 4,0 m.b.v. H2S04 en werd 15 24 g Assemblase™ toegevoegd. Na 24 uur werd de vaste stof afgefiltreerd en opgewerkt zoals beschreven in voorbeeld II. Het gevormde L-2-fenyl-2-(fenylacetamido)-acetonitril was zuiver (zuiverheid: 99%; e.e.L = 98%). De pH van de moederloog werd op 2,0 20 gebracht m.b.v. H2S04, waarna werd geëxtraheerd met 3 x 50 ml dichloormethaan. De waterige fase werd ingedampt " tot een witte vaste stof. M.b.v. chirale HPLC werd de

enantiomere overmaat van het gevormde 2-amino-2-fenyl- T

p1 0 0 9 8 1 4 - 10 - acetonitril.^H2S04 zout bepaald: e.e.D = 93%.

Voorbeeld V: L-fenylglycine 5 1,0 g L-2-fenyl-2-(fenylacetamido)- acetonitril (e.e.L = 98%) werd gesuspendeerd in een mengsel van 10 g water en 10 g geconcentreerd zoutzuur. De oplossing werd 18 uur geroerd bij T = 90 °C. M.b.v. HPLC en NMR werd aangetoond dat er volledige hydrolyse 10 naar fenylglycine had plaatsgevonden (uitgangsstof + bijproducten < 2%); m.b.v. chirale HPLC werd de enantiomere overmaat bepaald: e.e.L = 61%.

Voorbeeld VI: D-fenylglycine 15 1,0 g D-2-amino-2-fenyl-acetonitril (e.e.D = 93%) werd opgelost in een mengsel van 10 g water en 10 g geconcentreerd zoutzuur. De oplossing werd 18 uur geroerd bij T = 90 °C. M.b.v. HPLC en NMR werd 20 aangetoond dat er volledige hydrolyse naar fenylglycine had plaatsgevonden (uitgangsstof + bijproducten < 2%); m.b.v. chirale HPLC werd de enantiomere overmaat bepaald: e.e.D = 93%.

P}P0981 4

Claims (13)

1. Werkwijze voor de bereiding van een N-geacyleerd aminonitril waarbij een aminonitril of een zout 5 daarvan, wordt geacyleerd met een fenyl- of een fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur of een zout daarvan, in aanwezigheid van een Pen-G of een Pen-V acylase.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin een fenyl- al 10 dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur of een zout daarvan wordt toegepast in aanwezigheid van een Pen-G acylase.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2 waarin het ammoniumzout van fenoxy- al dan niet 15 α-gesubstitueerd-azijnzuur wordt toegepast.

4. Werkwijze volgens conclusie 1 waarin een zout van fenoxy- al dan niet a-gesubstitueerd-azijnzuur wordt toegepast in aanwezigheid van een Pen-V acylase.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4 waarin een zout van het aminonitril met een zuur en een : zout van het fenyl- of fenoxy- al dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur met een base wordt toegepast.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, waarbij als aminonitril een a-aminonitril wordt toegepast.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij een chiraal α-aryl-a-aminonitril wordt toegepast.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij een chiraal I 30 a-fenyl-a-aminonitril wordt toegepast. i

9. Werkwijze volgens conclusie 7 of 8, waarbij een a-H-aminonitril wordt toegepast.

10. Werkwijze volgens een der conclusies 7-9, voor de bereiding van een L-N-geacyleerd aminonitril met pi 0098 1 4 Ξ - 12 - een e.e.i, groter dan 95%, waarbij de acylering wordt uitgevoerd bij een pH ussen 3,0 en 6,0.

11. Werkwijze volgens een der conclusies 7-9 voor de bereiding van een niet geacyleerd D-aminonitril 5 met een e.e.D groter dan 90%, waarbij de acylering wordt uitgevoerd bij een pH tussen 3,0 en 4,5.

12. Werkwijze volgens een der conclusies 1-11, waarbij het verkregen aminonitril vervolgens wordt omgezet in het aminozuuramide, aminozuur of de aminozure 10 ester. 13. α-Arylaminonitril, met op de N-positie een acylgroep afgeleid van een fenyl- of een fenoxy-al dan niet α-gesubstitueerd-azijnzuur met een e.e. groter dan 90%. 15 14. α-Arylaminonitril volgens conclusie 13 met een e.e. groter dan 95%. 15. α-Η-α-arylaminonitril volgens conclusie 13 of 14. 16. 2-amino-2-fenyl-acetonitril volgens conclusie 15.

17. Werkwijze voor de bereiding van een N-geacyleerd 20 aminonitril, en N-geacyleerde aminonitrillen zoals beschreven en toegelicht aan de hand van de voorbeelden. p'100981 4 SAMENWERKINGSVERDRAG (PCT) RAPPORT BETREFFENDE NIEUWHEIDSONDERZOEK VAN INTERNATIONAAL TYPE IOENTIFIKATIE VAN DE NATIONALE AANVRAGE Kenmerk van de aanvrager of van de gemachtigde 9612NL Nederlandse aanvrage nr. Indleningsdatum 1009814 6 augustus 1998 Ingeroepen voorrangsdatum Aanvrager (Naam) DSM N.V. Datum van het verzoek voor een onderzoek van internationaal tv pa Door de Instantie voor Internationaal Onderzoek (ISA) aan het ver zoek voor een onderzoek van internationaal type toegekend nr. SN 31525 NL I. CLASSIFICATIE VAN HET ONDGRV^RPIbij toepassing van verschillende classificaties, alle dassificatiesymbolen opgeven) Volgens de Internationale classificatie (IPC) Int.Cl.6: C 12 P 13/02, C 12 P 13/04, C 12 P 41/00, C 07 C 255/44 II. ONDERZOCHTE GEBIEDEN VAN DE TECHNIEK Onderzochte minimum documentatie Classificatiesysteem Claisificatiesymbolen Int.Cl.6: C 12 P, C 07 C Onderzochte andere documentatie dan de minimum documentatie voor zover dergelijke documenten in de onderzochte gebieden zijn oogenornen HI. f I GEEN ONDERZOEK MOGELIJK VOOR BEPAALDE CONCLUSIES (opmerkingen op aanvullingsblad) Jjj' IV. | | GEBREK AAN EENHEID VAN UITVINDING (opmerkingen op aanvullingsblad) form PCT/ISA/201(j| 07.1979